实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

主讲：肖贵榜

实验目的：

掌握血清醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的一般原理和方法。

熟悉血清蛋白组分定量方法，并确定血清中清蛋白与球蛋白的比值。

实验实验试剂：试剂：1 、巴比妥 - 巴比妥钠缓冲液 (pH=8.6，离子强度 0.075)：称取 2.768g巴比妥和 15.458g巴比妥

钠 , 置于大烧杯中，加蒸馏水约 600ml，稍加 热溶解，冷却后用蒸馏水定溶至 1000ml。置 4 ℃ 保存，备用。2 、氨基黑 10B：氨基黑 10B 0.5克 , 甲醇 50ml,冰乙酸 10ml ,蒸馏水 40ml 。

3 、漂洗液：取无水乙醇 45ml，冰乙酸 5ml和蒸馏 水 50ml，混匀置塞试剂瓶内贮存。3 、 0.4N氢氧化钠：称取氢氧化钠 16.0g，蒸馏水 加至 1000ml

氨基黑 10B

• 氨基黑 10B , 苯胺蓝黑，酸性黑 1, 萘酚蓝黑，酸性黑 10B ， Acid Black 1

实验器材：实验器材：

1. 电泳仪：为电泳提供直流电源。2. 电泳槽：为电泳提供场所。多用有机玻璃制成，电极用铂丝。3. 血清加样器 ：可用盖玻片或 X 胶片或微量加样器。4. 醋酸纤维素薄膜： 2cm×8cm5. 其它： 培养皿（直径 9-10cm）、滤纸、玻璃板、镊子等。

DYY-5 型稳压稳流电泳仪

DYY-Ⅲ型电泳槽

一、电泳的原理

•电泳：带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。

实验原理：

•以蛋白质为例：

Pr

COO-

NH2

Pr

COO-

NH3+

Pr

COOH

NH3+

pH>pI pH=pI pH<pI

H ＋ H ＋

OH － OH －

蛋白质兼性离子 蛋白质阳离子蛋白质阴离子（等电点）

人血清中几种主要蛋白组分血清蛋白质　　　　　　　

　　　

等电点 分子量 占总蛋白的％

清蛋白　　　　 　　　　　　　　

4.64 　 69,000 57 ～ 72

α1 －球蛋白　　 　　　 　　　　

5.06 　 200,000 2 ～ 5

α2 －球蛋白　　　　　　　　　 　　　

5.06 300,000 　 4 ～ 9

β －球蛋白　　　 　　　

5.12 90,000 ～ 150,000 　　

6.5 ～ 12

γ －球蛋白　　 　　　

6.85 ～ 7.3 156,000 ～ 950,000 12 ～ 20

缓冲液 pH=8.6 pI ＜ pH

血清蛋白带负电荷 , 在电场中向正极移动。

醋酸纤维素薄膜电泳 它是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电

泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，具有均一的泡沫样的结构，厚度仅 120mm 。

优点：强渗透性，对分子移动阻力很弱，简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰和没有吸附现象。

•电泳速度 : 带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以 u 表示，即 V Q

u= =X 6πrη

V— 粒子运动的速度 X— 电场强度Q— 粒子所带电荷 r— 粒子的半径η— 介质的粘度

影响电泳速度的主要因素

1. 样品本身 :

分子带电量： Q 越多， u 越大； 分子大小 : 分子小， r 越小， u 越大； 分子形状： 形状越小，与支持物介质摩擦 越小， u 越大。

球形分子 > 纤维状分子

2. 缓冲溶液： A.pH值： (pH-pI)越大， Q 越多， u越大B. 离子强度 (I) ：

离子强度代表所有类型的离子所产生的静电力，也就是全部的离子效应，它取决于离子电荷的总数，而与溶液中盐类的性质无关。溶液的离子强度越高，带电质点的泳动速度越慢；离子强度越低，质点泳动的速度越快。

选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在 0.02 ～ 0.2 之间。

3. 电场强度 (X):

电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。

X 越大， u 越快。支持物越短，

X 越大， u 越快。 电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。 在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。

依次分为清蛋白、 α1 、 α2 、 β、 γ 球蛋白五个区带

血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 5 条区带

二 . 定量操作

• 膜条经过氨基黑 10B染色后显出清晰色带。

• 各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。

• 可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。• 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。

实验步骤：

1 ．准备与点样：取两条2.5×8cm 的膜条

充分浸透在巴比妥缓冲

液中

取出膜条 滤纸吸去多余的缓

冲液

无光面距一端 1.5cm处作点样线

点样器下端粘上薄层血

清

垂　直

点　样

点样操作示意图

2 ．电泳

放　置膜　条 点样端置于阴极

点样面向下 膜条贴紧滤纸，拉直膜条

平衡 5分钟

通电

电压： 160v

时间： 60 min

关闭电源

电泳装置

3 ．染色、脱色

通电完毕

取出膜条

浸于染色液（氨基黑10B ）中

3min 取出膜条

依次浸于漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

各5min

直至漂净

滤纸吸干薄膜

预试结果图（供参考）

４ . 定量( 两人的膜条共用 )

取试管 6 支，编号 1~6

试管编号　　　　　　　　　　

A α1 α2 β γ 0

0.4mol/LNaOH　　　　 　　　　　　　　

4.0ml 4.0ml 4.0ml 4.0ml 4.0ml 4.0ml

　蛋白条带 　　　 　　　　

清蛋白 α1 球蛋白 α2 球蛋白 β 球蛋白 γ 球蛋白 无蛋白区　

充分振荡、脱净染料

比 色、定 量15min

实验结果：

各样品吸光度值

清蛋白 α1 球蛋白 α2 球蛋白 β球蛋白 γ 球蛋白

A1

A2

A3

A

仪器型号： 吸收波长：

仪器编号：650nm

光密度总和 T ＝ A ＋ α1 ＋ α2 ＋ β＋ γ

1 ．计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。清蛋白％＝（ A / ∑T）×100 ％

α1 球蛋白％＝（ α1 / ∑T）×100 ％

α2 球蛋白％＝（ α2 / ∑T）×100 ％

β球蛋白％＝（β/ ∑T）×100 ％γ球蛋白％＝（ γ/ ∑T）×100 ％

2 ．计算出清蛋白与球蛋白之比值（ A/G ）

　　　　 G=α1 ＋ α2 ＋ β＋ γ

血清蛋白电泳结果的临床意义可能相关疾病 清蛋白 α1 球蛋白 α2 球蛋白 β 球蛋白 γ 球蛋白

骨髓瘤 ↑*肾病综合症 ↓ ↑* ↑*肾炎 ↑* ↑肝硬化 ↓ ↑*急性肝坏死 ↓* ↑ ↑ ↑ ↑传染性肝炎 ↓ ↑* ↑*急性感染初期 ↑* ↑* ↑*慢性炎症 / 感染后期 ↑*低球蛋白血症 ↓*

临床上还可用 A/G 比来表示清球蛋白的量的关系：　　　　　　　正常人 A/G ＝ 1.5 ～ 2.5

注意事项：

• 1 、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。• 2 、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤

纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。• 3 、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜 片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。

• 4 、点样后膜条的放置：区分电极正负极，膜条点样端接于负极且点样面向下。

• 5 、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。

• 6 、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀。

• 1. 电泳时为什么要将点样的一端靠近负极端？ 根据人血清中各蛋白组分的性质，如何估计它们在 pH8.6的巴比妥－巴比妥钠电泳缓冲液中的相对迁移速度？

• 2. 回顾醋酸纤维素薄膜电泳的原理和优点

思考与练习