Article original

« Les biomatériaux inhibiteurs de l’adhérenceet de la prolifération bactérienne :

un enjeu pour la prévention des infections sur matériel prothétique »

Biomaterials inhibiting bacterial adhesion and proliferation: a challenge toprevent infection of prosthetic materials

G. Pavon-Djavid, G. Hélary, V. Migonney *

Laboratoire de biomatériaux et polymères de spécialité, LBPS(B2OA)-institut Galilée, CNRS UMR 7052, université Paris 13,avenue Jean-Baptiste-Clément 93430 Villetaneuse ; France

Reçu le 1 avril 2005 ; accepté le 15 avril 2005

Disponible sur internet le 08 juin 2005

Résumé

Les infections bactériennes sur matériels prothétiques implantés représentent un des problèmes majeurs de santé publique et une despremières causes de bactériémies nosocomiales. Par ailleurs, il apparaît que ces infections ne répondent pas toujours au traitement classiquepar les antibiotiques ce qui rend alors l’explantation de la prothèse nécessaire pour éradiquer l’infection. Afin de pallier ces problèmes,plusieurs stratégies sont proposées et/ou sont encore à l’étude; parmi celles-ci l’imprégnation d’antibiotiques ou d’héparine mais plus encorele greffage de polymères bioactifs présentent des solutions réellement prometteuses.© 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Abstract

Bacterial infections on implanted prosthetic materials represent one of the major problems of public health and one of the first causes ofnosocomial infections. Infections on implanted devices are extremely resistant to antibiotics as well as to host defences and frequently persistuntil the removal of the implant which remains the standard therapy. In order to prevent infection, several strategies are proposed and/ordeveloped; amongst them heparin or antibiotic impregnations were extensively studied and gave interesting results nevertheless the mostpromising solutions consists in synthesizing and/or grafting bioactive polymers able to inhibit bacterial adhesion.© 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Adhésion bactérienne ; Infection ; Polymères bioactifs ; Staphylocoques dorés ; Prothèses ; Polymères acryliques ; Silicone

Keywords: Bacterial adhesion; Infection; Bioactive polymers; Staphylococcus aureus; Prosthesis, PVC; Acrylic polymers; Silicone

1. Introduction

L’infection bactérienne est l’un des problèmes majeurs ren-contrés lors de la mise en contact de biomatériaux (cathéters,dispositifs de circulation extracorporelle, systèmes de dia-lyse rénale, lentilles de contact, implants intraoculaires) avec

les systèmes biologiques. Dans le cas de dispositifs implan-tés, ces infections s’avèrent difficiles à traiter. Les infectionssur cathéters sont en effet, une des premières causes de bac-tériémies nosocomiales et sont responsables d’une mortaliténon négligeable [1]. Les infections sur valves prothétiques etsur matériels ostéoarticulaires ne répondent souvent pas autraitement par les antibiotiques seuls. L’explantation de laprothèse est alors nécessaire pour éradiquer l’infection.* Auteur correspondant.

Adresse e-mail : vmig@galilee.univ-paris13.fr (V. Migonney).

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http://france.elsevier.com/direct/RBMRET/

1297-9562/$ - see front matter © 2005 Elsevier SAS. Tous droits réservés.doi:10.1016/j.rbmret.2005.04.012

L’adhérence bactérienne sur une surface implantée dépendde différents paramètres :• les facteurs de l’hôte (âge, immunodéficience, état physi-

que) ;• la nature la souche (les micro-organismes qui sont impli-

qués dans le développement des infections sur corps étran-gers sont très nombreux [2]) ;

• les propriétés physicochimiques de la surface.

De nombreux travaux réalisés in vitro montrent en effet,que l’attachement des bactéries sur des matériaux synthéti-ques diminue avec la réduction de l’angle de contact et l’aug-mentation de l’énergie de la surface [3]. Cependant dans desconditions in vivo, le contact des biomatériaux synthétiquesavec le sang ou les liquides physiologiques étant instantané-ment suivi de l’adsorption de nombreuses protéines plasma-tiques sur la surface [4] cette adsorption très rapide de pro-téines modifie la nature de l’interface et peut de fait altérerles propriétés du dispositif implanté.

Dans le cas des infections à staphylocoques, l’adhérencebactérienne est fortement influencée par les protéines de l’hôteadsorbées sur la surface de l’implant [5]. Les mécanismesmoléculaires à l’origine des interactions qui se développententre Staphylococcus aureus et les protéines de l’hôte adsor-bées sur les dispositifs médicaux, impliquent des protéinesspécifiques de la surface bactérienne communément appe-lées adhésines [6] ; celles-ci reconnaissent des domaines spé-cifiques de protéines telles que la fibronectine (Fn), le fibri-nogène (Fg) ou la fibrine. Cette capacité de S. aureus àreconnaître des domaines spécifiques des protéines de l’hôtejoue un rôle très important dans l’attachement de ces bacté-ries aux surfaces artificielles [2,7,8].

Outre l’amélioration des précautions d’hygiène et la miseen place de l’antibioprophylaxie, la prévention de ces infec-tions passe également par des modifications physiques et/ouchimiques de la surface des biomatériaux afin de les rendrecapables d’induire une diminution de l’adhérence et/ou de lamultiplication bactérienne.

2. Approches proposées pour réduire l’adhérencebactérienne aux surfaces polymères

Différentes approches ont été développées afin de réduirel’attachement des bactéries aux matériaux polymères. En par-ticulier, les techniques d’imprégnation du matériau par desantiseptiques et/ou des antibiotiques ou les modifications desurface par greffage chimique ou par incorporation de molé-cules biologiques telles que l’héparine, permettent d’obtenirune diminution sensible de l’adhérence bactérienne. Une autreapproche plus récente consiste à introduire, dans la chaînemacromoléculaire, des unités porteuses de groupements fonc-tionnels tels que les groupements sulfonate et carboxylate,capable d’induire une diminution sensible de l’adhérence bac-térienne.

2.1. Imprégnation et/ou greffage de polymères pardes antibiotiques

Les infections liées aux cathéters constituent la troisièmecause d’infections nosocomiales en réanimation, les cathé-ters veineux centraux étant les plus impliqués [9]. L’utilisa-tion de cathéters imprégnés de substances à caractère anti-bactérien représente une solution efficace car elle permet deralentir sensiblement leur colonisation par des bactéries. Dès1982 Greco et Harvey [10] montrent l’effet prophylactiquede l’oxacilline et du chlorure de benzalkonium dans le cas decathéters en poly(tétrafluoroéthylène) (PTFE) implantés chezle chien. Cette approche a été reprise dans une étude prospec-tive randomisée par Kamal et al. [11] Les auteurs montrentl’efficacité in vivo de l’imprégnation et du greffage de cathé-ters de poly(éthylène) (PE) par le chlorure de tridodécylmé-thylammonium et la céfazoline dans la réduction des infec-tions de cathéters centraux. Chez des patients nécessitant lapose d’un cathéter central veineux ou artériel, une réductiond’un facteur sept de l’infection a pu être observée lorsque lescathéters étaient greffés par comparaison aux cathéters nongreffés. Un autre type de combinaison a également été rap-porté : il s’agit de la minocycline associée à la rifampicine,qui donne un large spectre de protection pour un coût relati-vement faible de production des cathéters. Enfin, une protec-tion vis-à-vis de l’infection a été mise en évidence pour desbactéries Gram positives, Gram-négatives et également pourdes levures telles que Candida [12,13].

Une autre technique consiste à encapsuler des antibioti-ques dans des matrices d’hydrogel pour obtenir un relargagecontrôlé de la molécule active. Solovskii et al. ont récem-ment développé des matrices polymères contenant 10 à 25 %en masse de gentamicine et l’activité antimicrobienne de cespolymères a été mise en évidence sur Staphylococcus spp etEscherichia coli [14].

Bien que dans de nombreux cas, les études n’aient pasdépassé le stade préclinique en raison de la perte rapide del’activité antibactérienne, toute une gamme d’antibiotiques aété étudiée tant in vitro qu’in vivo pour prévenir et empêcherla colonisation et la multiplication bactérienne sur les bioma-tériaux et une partie d’entre eux est quotidiennement utiliséeà cet effet.

Enfin, certains antibiotiques sont incorporés dans lesciments osseux à base de poly(méthacrylate de méthyle)(PMMA) afin de réduire les infections lors de la posed’implants orthopédiques de reprise et/ou de première inten-tion. Les ciments additionnés d’antibiotiques ont été intro-duits par Buchholz et Engelbrecht en 1970 [15] et ils sontaujourd’hui largement utilisés et commercialisés. La genta-micine est l’antibiotique de choix pour cette utilisation enraison de son large spectre de protection et de sa solubilitédans l’eau. De nombreuses études démontrent que le cimentadditionné d’antibiotique présente une meilleure efficacitédans la prévention des infections profondes les plus graves,comparativement à l’utilisation d’un ciment ordinaire asso-cié à une antibiothérapie systématique du patient [16,17]

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Ces progrès sensibles, consécutifs à l’incorporation et/oul’imprégnation d’antibiotiques aux biomatériaux implanta-bles se sont néanmoins, accompagnés d’un problème majeurde santé publique: l’émergence de souches résistantes àl’action des antibiotiques. Celle-ci est apparue à cause notam-ment d’un usage trop large des antibiotiques mais égalementde la persistance in situ de faibles doses d’antibiotiques pen-dant plusieurs mois [18,19,20].

2.2. Greffage de polymères avec de l’héparine

L’inhibition de l’adhérence des staphylocoques par l’hépa-rine et par des polysaccharides sulfatés en solution a été miseen évidence sur des surfaces de PMMA préalablement adsor-bées de Fn [21,22]. Arciola et al. décrivent une diminutionsensible de l’adhérence bactérienne en absence des protéinesplasmatiques sur des surfaces de PMMA héparinées [23] ;d’autres polymères — polyuréthane, polyamidoamine —héparinés ou modifiés par de l’acide hyaluronique sulfaté(HyalS3.5) présentent également des capacités importantesd’inhibition de cette adhérence [24]. Le rôle des protéinesd’adhérence (Fn, Fg) dans le processus d’adhérence bacté-rienne sur les polymères héparinés est mis en évidence parZdanowski et al. ; ces auteurs montrent une diminution sen-sible de l’adhérence de S. aureus et Staphylococcus epider-midis sur le poly(chlorure de vinyle) (PVC) préadsorbéd’héparine comparé au PVC non hépariné en absence des pro-téines alors qu’en milieu plasmatique l’adhérence est plusimportante sur les surfaces héparinées [25]. Le rôle de l’hépa-rine en solution - non immobilisée sur une surface - n’estquant à elle pas clairement établie et dépend de différentsparamètres qui ne sont pas toujours contrôlés. En effet, l’hépa-rine ou encore des polysaccharides sulfatés en solution peu-vent induire in vitro une inhibition de l’adhérence des staphy-locoques sur des surfaces de PMMA préadsorbées de Fn[21,22], alors que in vivo les résultats sont contradictoires.Par ailleurs, Sakiniene et al. montrent que l’héparine de fai-ble poids moléculaire peut favoriser le développement et laprogression de l’arthrite due au S. aureus chez la souris [26].

2.3. Synthèse et greffage de polymères bioactifs

Des polymères bioactifs porteurs de groupements chimi-ques similaires à ceux de l’héparine — groupements sulfo-nate (SO3

–) et/ou carboxylate (COO–) — et présentant cer-taines des activités de celle-ci, ont été mis au point parMigonney et al. dès 1983 [27,28]. Ce concept d’abord utilisépour réaliser des tubulures dites « heparin-like » par fonction-nalisation de poly (éthylène-gr-styrène) a ensuite été élargi etappliqué à d’autres polymères présentant des propriétés méca-niques ou physiques plus appropriées pour les applicationsauxquels les matériaux étaient destinés. Des copolymères déri-vés du PVC, des copolymères à base de PMMA, des silico-nes ou encore des polymères dérivés du polystyrène, por-teurs sur leurs chaînes macromoléculaires de fonctions SO3

–

et/ou COO– ont ainsi été élaborés. Qu’il s’agisse de maté-

riaux destinés à la fabrication d’implants mais encore de dis-positifs non implantables, tous ces polymères sont capablesselon leur composition de présenter des propriétés d’inhibi-tion de la colonisation bactérienne. Ils présentent une activitémodulatrice de l’adhérence et de la prolifération des celluleseucaryotes et des cellules procaryotes à leur contact quidépend de leur composition chimique en groupements sulfo-nate et carboxylate [29-31]. Il a aussi été établi que leur acti-vité est médiée par des protéines d’adhérence telles que la Fnet que la conformation de cette protéine adsorbée sur ces poly-mères dépend également de leur composition en groupe-ments sulfonate et carboxylate [32]. Ainsi, les compositionschimiques de ces polymères vont permettre de présenter uneactivité anti-adhésive et/ou anti-proliférative vis-à-vis de sou-ches bactériennes Gram positives impliquées dans les infec-tions sur corps étrangers : S. aureus, S. epidermidis, Strep-tococcus pyogenes.

3. Polymères bioactifs inhibiteurs de l’adhérenceet de la prolifération bactérienne

Les résultats d’expériences in vitro et in vivo d’adhérenceet de prolifération bactérienne obtenus avec différents poly-mères « bioactifs » soit à base de PVC soit à base de PMMAou encore de silicone sous forme de films ou de tubuluressont reportés dans ce paragraphe.

3.1. Les copolymères à base de PVC

Le PVC est un matériau polymère largement utilisé pourla fabrication de dispositifs biomédicaux tels que les tubulu-res de circulation extra corporelle, les poches à sang ou encoreles cathéters et la colonisation du PVC par différentes sou-ches bactériennes a été observée [33,34]. En revanche, la seuledescription d’une diminution de l’adhérence in vitro de Pseu-domonas aeruginosa décrite sur du PVC biomédical a étéfaite après traitement de la surface des tubulures avec unmélange NaOH/AgNO3, composé chimique hautement toxi-que[35].

3.1.1. Rôle des groupements sulfonateDes copolymères à base de PVC ont été synthétisés par

copolymérisation radicalaire de chlorure de vinyle, de mono-mères fonctionnalisés par les groupements carboxylate, sul-fonate et hydroxyle, puis plastifiés et mis en forme pour réa-liser des films ou des tubulures [36]. L’adhérence de S. aureussur les films de copolymères à base de PVC de compositionsvariables en groupements sulfonate et carboxylate a été éva-luée en présence des protéines plasmatiques après une heurede contact de la souche bactérienne avec le matériau. Lesrésultats ont été exprimés en pourcentage de bactéries adhé-rées par rapport aux bactéries initialement introduites (inocu-lum = 1.106 – 1.107 UFC/ml) et reportés en fonction de lateneur en élément S des films de PVC fonctionnalisés (voirFig. 1) afin de montrer l’importance des groupements SO3

–

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sur les propriétés inhibitrices de l’adhérence bactérienne.L’analyse des résultats montre en effet que l’adhérence de S.aureus sur toutes les surfaces de PVC fonctionnalisée est tou-jours beaucoup plus faible que celle sur le PVC non fonction-nalisé, référencé PVC0. D’un point de vue quantitatif le pour-centage d’adhérence étant en moyenne de ~0,2 % sur les PVCfonctionnalisés comparé à 0,83 % sur PVC0 cela correspondà un taux d’inhibition moyen de l’adhérence bactérienned’environ 75 %. On remarque également que même lorsquele taux de groupements sulfonate du PVC est très faible, l’inhi-bition de l’adhérence bactérienne est toujours très impor-tante.

3.1.2. Rôle des protéinesAfin d’évaluer le rôle de l’environnement biologique et en

particulier celui des protéines dans l’adhérence de S. aureussur les polymères à base de PVC fonctionnalisé, les surfacesont été préalablement incubées avec des solutions de protéi-nes pures, Fn et Fg, ou un mélange protéique, le plasmahumain normal. L’adhérence de la souche S. aureus 8325-4fournie par le professeur P. Vaudaux [37] a été étudiée sur desfilms réalisés à partir de trois dérivés de PVC différents : desfilms de PVC porteurs de groupements sulfonate uniquement(PVC174), des films de PVC porteurs de groupes carboxy-late uniquement (PVC173) et des films porteurs des groupessulfonate et carboxylate (PVC175/7) et sur le PVC0 contrôle(PVC non modifié). Les résultats exprimés en pourcentaged’adhérence sont reportés Fig. 2.

Les résultats présentés Fig. 2 montrent que lorsque le PVCn’exhibe pas de groupements fonctionnels, c’est le cas dupolymère contrôle PVC0, l’adhérence de S. aureus est systé-matiquement plus importante et elle est fortement favoriséepar la présence de Fn ~1,4 %/cm2 par comparaison aux autresmilieux ~0,45 %/cm2 en présence de Fg et ~0,78 %/cm2 enprésence de plasma. En revanche, la fonctionnalisation pardes groupements sulfonate et/ou carboxylate conduit à unediminution très sensible de l’adhérence bactérienne ; les tauxd’inhibition observés dépendent cependant des protéinesadsorbées. En effet, le taux d’inhibition de l’adhérence bac-térienne observé avec les trois polymères fonctionnalisés parcomparaison au PVC0 varie entre 86 et 90 % lorsque la Fn estpré adsorbée sur les surfaces, de 11 à 60 % lorsque le Fg est

pré adsorbé et de 77 à 90 % en présence de plasma humainnormal. Ces résultats montrent en outre l’importance de laprésence des protéines sur l’adhérence de S. aureus sur cessurfaces modifiées et plus particulièrement la Fn mais égale-ment le rôle déterminant de la chimie de la surface puisqueles taux d’inhibition varient sensiblement d’une compositionchimique à l’autre. Ces résultats montrent également que lesinteractions bactérie–surface sont médiées par les protéinesde liaison.

3.1.3. Comparaison de deux souches de StaphylocoquesEnfin, nous avons réalisé la même expérience avec la sou-

che SA MR88244 fournie par le docteur A.C. Crémieux [38]afin de vérifier si l’effet sensible des groupements fonction-nels sur l’inhibition de l’adhérence ainsi que celui de la Fnadsorbée à la surface pouvaient être retrouvés avec autre sou-che de S. aureus plus pertinente. Cette souche est une soucheclinique résistante à la méthyciline isolée chez l’homme àpartir d’une infection sur prothèse[38]. Les résultats présen-tés Fig. 3 confirment les effets déjà observés avec la soucheSA 8325-4; cependant il est important de noter que dans lamesure où la souche S. aureus SA MR 88244, est une soucheclinique résistante à la méthyciline les résultats obtenus avecces polymères « bioactifs » sont tout à fait encourageants pour

Fig. 1. Adhérence de S. aureus Cowan I sur des films de PVC fonctionna-lisé: Influence du taux de soufre S, (n = 6).

Fig. 2. Adhérence de S. aureus 8325-4 sur des polymères dérivés du PVC :PVC0, PVC173 (COO-), PVC174 (SO3

-), PVC175 (COO- + SO3-), en pré-

sence de protéines (Fn, Fg, plasma), (n = 4).

Fig. 3. Adhérence de S. aureus 88244 résistante à la méthicilline sur despolymères à base de PVC pré-adsorbés de Fn, PVC 173 (COO–), PVC 174(SO3

–), PVC0 contrôle ; (n = 4).

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obtenir une prévention des infections à S. aureus sur matérielprothétique puisque ces polymères sont capables d’induirejusqu’à 90 % d’inhibition de l’adhérence de cette souche par-ticulièrement virulente.

Les propriétés inhibititrices de l’adhérence de S. aureusque nous avons mises en évidence nous ont conduit à quali-fier ces polymères à base de PVC fonctionnalisés par les grou-pements sulfonate et/ou carboxylate de « PVC bactériopho-bes ».

3.1.4. Conditions dynamiquesAfin d’étudier l’adhérence bactérienne dans des condi-

tions dynamiques — débit contrôlé et constant de15ml/minute — plus proches des conditions in vivo, des tubu-lures à base de de PVC fonctionnalisés d’environ 3 mm dediamètre interne ont été mises en forme par extrusion par laSociété Hüls [36]. Dans ces expériences les tubulures sontpréalablement incubées avec des solutions protéiques deconcentration connue puis le milieu de culture contenant lasouche bactérienne, ici S. pyogenes, à la concentration de108 UFC/ml est mis en circulation à 37 °C. Après une heurede circulation de la suspension bactérienne, l’adhérence,exprimée en poucentage de bactéries adhérées par rapport aunombre de bactéries initialement introduites, est mesurée. Lesrésultats d’adhérence de S. pyogenes obtenus pour des tubu-lures à base de PVC fonctionnalisé de différentes composi-tions en groupements sulfonate et carboxylate— T1fonctionnalisée par COO– uniquement, T2 et T4 fonc-tionnalisées par SO3

- uniquement, T3 fonctionnalisées parSO3

– et COO– — sont comparés à ceux obtenus pour le PVC0

non fonctionnalisé référencé T0 et sont reportés Fig. 4.Les résultats montrent que lorsque les tubulures de PVC

ne sont pas fonctionnalisées par les groupements sulfonate etcarboxylate l’adhérence bactérienne dans des conditions dyna-miques (circulation) est très importante, 1,5 % des bactériesintroduites, ce qui conduit à une colonisation rapide par lesmicroorganismes. En revanche, l’utilisation de PVC bacté-riophobes pour la réalisation de tubulures permet une fran-che diminution du nombre des bactéries adhérées à la surface

puisqu’elle est seulement de 0,05 % pour l’échantillon T2 por-teur des seuls groupes sulfonate. L’inhibition de l’adhérence,exprimée en pourcentage par rapport au PVC0, dépend de lacomposition chimique des PVC et varie de 40 à 98 %.

Un autre paramètre important des infections sur prothèseest la prolifération des bactéries une fois qu’elles ont adhéréà la surface. Pour essayer d’évaluer cette prolifération dansdes conditions dynamiques (débit de 15ml/min) nous avonsréalisé l’expérience en deux étapes : la première consiste afaire adhérer les bactéries pendant une heure à 37 °C, les bac-téries non adhérées sont alors éliminées, la seconde étapeconsiste à remplir la tubulure avec du milieu de culture et à lelaisser circuler pendant quatre heures à 37 °C afin que lesbactéries adhérées dans la première étape puissent proliférerà la surface. Le nombre de bactéries est alors compté aprèsquatre heures de prolifération. Les résultats montrent que lesbactéries prolifèrent beaucoup plus lentement sur les surfa-ces des tubulures de PVC fonctionnalisé que sur celle duPVC0. Les pourcentages d’inhibition de la prolifération bac-térienne sur les tubulures de PVC fonctionnalisé ont été cal-culés à partir des taux de croissance des bactéries sur ces sur-faces comparés au taux de croissance sur le PVC0 : lespourcentages d’inhibition varient de 60 à 65 %. Ces polymè-res à base de PVC sont bactériophobes et bactériostatiques

En conclusion, l’ensemble de ces résultats montre qu’ilest possible de synthétiser des polymères à base de PVC por-teurs de groupements sulfonate et carboxylate capable dediminuer voire d’empêcher l’adhérence et la prolifération bac-térienne dans des conditions statiques et dynamiques. Cespolymères présentent par ailleurs d’autres propriétés tellesque la cytocompatibilité (testée avec une lignée de fibroblas-tes humains), des propriétés anticoagulantes de type « heparin-like » ainsi que des propriétés mécaniques permettant leurutilisation pour la fabrication de tubulures de circulation extra-corporelle [36].

3.2. Les copolymères à base de PMMA

L’adhérence bactérienne sur le PMMA et sur des copoly-mères à base de PMMA a été très étudiée dans le cadre d’uneétude sur la réalisation d’implants intraoculaires (IOLs)« bioactifs » capables d’empêcher le développement de lacataracte secondaire et l’infection bactérienne.

Dans une étude in vivo chez le porc, Kodjikian et al. ontmontré que la nature des polymères utilisés pour la fabrica-tion des IOLs influence le comportement des bactéries adhé-rées à leur surface. Ainsi sur des surfaces en silicone et enPMMA héparinés on observe une prolifération des bactériesadhérées alors que dans le cas d’hydrogels et de polymèresacryliques hydrophiles on n’observe pas de prolifération bac-térienne et le nombre de bactéries adhérées sur l’implantdécroît avec le temps [39]. Plus récemment ces auteurs mon-trent que l’adhérence de S. epidermidis in vitro est beaucoupplus faible sur les hydrogels et les polymères acryliques hydro-philes que sur le PMMA[40].

Fig. 4. Adhérence de S. pyogenes sur des tubulures à base de PVC préadsor-bées de Fn, T1 (COO-), T2 et T4 (SO3

-), T3 (COO– et SO3–) et le contrôle

PVC0 ; (n = 4).

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3.2.1. Rôle de la composition en groupements sulfonateet carboxylate

Des copolymères à base de PMMA, de compositions chi-miques variables en groupements sulfonate et carboxylate,ont été synthétisés par copolymérisation radicalaire de métha-crylate de méthyle (MMA), d’acide méthacrylique (MA) et/oude styrène sulfonate de sodium (NaSS) [41] ; ils sont chacuncaractérisé par le rapport R = COO–/(COO– + SO3

–). Cespolymères sont destinés à la fabrication d’implants intraocu-laires car ils sont capables de moduler l’adhérence et la pro-lifération de fibroblastes et de cellules épithéliales cornéen-nes [44]. Le polymère témoin est le poly(méthacrylate deméthyle) (PMMA). Dans l’étude, nous avons reporté les résul-tats d’expériences d’adhérence de deux souches bactérien-nes, S. aureus et S. pyogenes, sur des polymères préabsorbésde Fn, à base de PMMA porteurs sur leurs chaînes macromo-léculaires de groupements sulfonate et/ou carboxylate. Lesrésultats reportés sont exprimés en pourcentage d’inhibitionde l’adhérence bactérienne calculé par rapport à l’adhérencesur le PMMA contrôle pour les différents copolymères carac-térisés par différentes valeurs de R.

3.2.2. Étude de deux souches bactériennes

3.2.2.1. Souche S. pyogenes. Les résultats de l’adhérence deS. pyogenes sur ces polymères montrent l’effet extrêmementimportant de la composition chimique de la surface. En effet,la seule présence des groupements fonctionnels permet unediminution très forte de l’adhérence puisque les valeursmoyennes d’adhérence en pourcentage sont comprises entre0,015 ± 0,006 et 0,05 ± 0,04 %/cm2 (p < 0,001 test Newman-Keuls) pour les surfaces fonctionnalisées ce qui est quasi-ment négligeable comparé au pourcentage moyen d’adhé-rence sur le PMMA contrôle qui est de 1 ± 0,2 %/cm2.Lorsque ces résultats sont exprimés en pourcentage d’inhibi-tion par rapport au PMMA (voir Fig. 5) une très forte inhibi-tion de l’adhérence, supérieure à 80 % est observée pour desvaleurs de R comprises entre 0 et 0,8.

3.2.2.2. Souche S. aureus. L’adhérence de S. aureus a étéétudiée en utilisant deux souches SA 8325-4 et SA MRSA88244. L’étude de l’adhérence a été réalisée sur trois poly-mères à base de PMMA porteurs respectivement de groupe-ments COO–, de groupements SO3

–, et des deux types de grou-pements COO– et SO3

–. Les résultats exprimés en pourcentageadhérence sont reportés sur les Fig. 6 et Fig. 7 ; ils montrentune inhibition significative de l’adhérence de S. aureus surles trois polymères fonctionnalisés par comparaison au poly-mère contrôle (p < 0,001 test Newman-Keuls).

Ces expériences ont permis de sélectionner la composi-tion optimale du polymère fonctionnalisé permettant de dimi-nuer sensiblement l’adhérence bactérienne in vitro — jusqu’à60 %. À nouveau ce sont les groupements sulfonate qui indui-sent la plus forte inhibition de l’adhérence bactérienne, commecela avait déjà été observé avec les copolymères à base dePVC fonctionnalisé.

3.3. Les silicones

Les expériences d’adhérence bactérienne décrites sur lesdérivés de PVC et les dérivés de PMMA fonctionnalisées parles groupements sulfonate et carboxylate ont été réalisées invitro ; si elles permettent de mettre en évidence l’effet sensi-

Fig. 5. Adhérence de S. pyogenes sur des copolymères à base de PMMA :influence de la composition chimique. Les films de polymère ont été pré-adsorbés de Fn (n = 6).

Fig. 6. Adhérence de S. aureus souche 8325-4 sur des films de polymèresdérivés du PMMA pré-adsorbées de Fn (n = 4).

Fig. 7. Adhérence de S. aureus souche MRSA 88244 sur des films de poly-mères dérivés du PMMA pré-adsorbées de Fn (n = 4).

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ble de ces groupements elles ne permettent cependant pas deprédire le comportement de ce type de surfaces in vivo.

3.3.1. Préparation de prothèses implantablesAfin de pouvoir évaluer les propriétés de ces copolymères

dans des conditions in vivo, des prothèses modèles en sili-cone ont été réalisées par moulage à partir d’un modèle deprothèse de doigt standard, puis revêtues par enduction d’uncopolymère fonctionnalisé compatible avec la matrice sili-cone et capable d’inhiber l’adhérence bactérienne.

La fonctionnalisation de la surface des prothèses en sili-cone a nécessité la synthèse d’un copolymère d’enductionqui présente des propriétés inhibitrices de l’adhérence bacté-rienne. Ce polymère d’enduction présente outre les groupe-ments sulfonate et carboxylate, des groupements cinnamatequi après traitement thermique ou photoréticulation permet-tent son ancrage à la matrice silicone [46]. Le polymèred’enduction a été mis en solution et déposé à l’aide d’un« spray » sur la surface des prothèses puis celles-ci ont ététraitées thermiquement (8 jours à 80 °C) afin de réaliser laréticulation des chaînes macromoléculaires. Les prothèsesainsi modifiées ont ensuite été abondamment lavées en tam-pon physiologique pour éliminer tous les résidus de synthèsepuis stérilisées. Ce traitement d’enduction a permis d’obtenirdes prothèses de silicone greffées par enduction d’un poly-mère fonctionnalisé, solidement ancré dans la matrice poly-mère. Les prothèses de silicone non traitées sont utiliséescomme contrôle.

3.3.2. Étude in vitroL’étude de l’adhérence sur les prothèses a été effectuée en

utilisant la souche de S. aureus la plus pertinente, c’est-à-dire la souche clinique MRSA 88244 fournie par le Dr A.-C.Crémieux. Dans un premier temps, les expériences d’adhé-rence ont été réalisées in vitro sur les prothèses modifiées ounon, préalablement adsorbées de Fn. Les résultats exprimésen UFC/ml adhérées ont été reportés en fonction de la quan-tité d’UFC/ml introduites (voir Fig. 8). L’analyse de la courbeFig. 8, montre que la variation est linéaire dans l’intervalledes valeurs étudiées ce qui permet de déterminer dans cha-cun des cas le pourcentage d’adhérence de la souche clinique

MRSA 88244 de S. aureus : les pourcentages d’adhérencesont respectivement de 1,4 % pour les prothèses modifiées etde 2,3 % (p < 0,005 ANOVA) pour les prothèses contrôle ensilicone. Cela met en évidence un effet inhibiteur d’environ40 % apporté par les groupements fonctionnels greffés sur lasurface des prothèses en silicone par comparaison à la pro-thèse non modifiée.

3.3.3. Étude in vivoLe comportement des prothèses modifiées vis-à-vis de

l’infection bactérienne a été étudié in vivo chez le lapin enutilisant le modèle d’infection sur prothèse développé par leDr A.-C. Crémieux [42]. Dans l’étude réalisée chez le lapinen double aveugle, l’implantation des prothèses en siliconecontrôle et en silicone modifié s’effectue dans le genou auniveau du canal intramédullaire du tibia. L’infection est pro-voquée par l’injection dans le genou, au niveau de la pro-thèse, de 107 UFC de S. aureus MRSA88244. Après 24 heu-res, l’animal est sacrifié, puis la prothèse est explantée afinde réaliser le comptage des bactéries adhérentes.

Les résultats obtenus, exprimés en UFC/ml sont reportésFig. 9. Ils montrent que 24 heures après l’infection, le nom-bre de bactéries adhérentes aux prothèses modifiées est égalà 2,26 ± 0,76 log UFC/ml (n = 6) et qu’il est significative-ment réduit lorsqu’il est comparé au nombre de bactériesadhérentes sur la prothèse en silicone non modifiée qui estégal à 3,86 ± 0,54 log UFC/ml (n = 5) (p < 0,0035). L’écartde près de deux unités de log entre les deux valeurs met enévidence un effet inhibiteur de l’adhérence bactérienne de lasurface fonctionnalisée par rapport à la surface témoin. Cerésultat est très encourageant car la souche utilisée est unesouche clinique particulièrement virulente et l’inoculum estélevé ; malgré ces conditions l’effet inhibiteur est important.Cette expérience montre qu’il est possible de retrouver in vivoles propriétés inhibitrices de l’adhérence bactérienne misesen évidence in vitro.

4. Conclusions

Pour tenter résoudre le problème de l’infection sur pro-thèse de nouvelles stratégies de recherche et d’intervention

Fig. 8. Adhérence in vitro de S. aureus souche MRSA 88244 sur des prothè-ses pré adsorbées de Fn (n = 6).

Fig. 9. Adhérence in vivo de S. aureus souche MRSA 88244 sur des prothè-ses implantées chez le lapin après 24 heures.

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se sont développées. Parmi celles-ci, les techniques d’impré-gnation des matériaux par des antiseptiques et/ou des antibio-tiques ont montré leur intérêt mais il est largement modérépar la résurgence de résistances aux antibiotiques. D’autrestechniques comme les modifications de surface par greffageou par incorporation de molécules biologiques telles quel’héparine ont permis d’obtenir une diminution sensible del’adhérence bactérienne. Ces techniques bien que prometteu-ses sont néanmoins coûteuses et posent le problème de la sta-bilité dans le temps des molécules biologiques greffées.L’approche plus récente de la fonctionnalisation des surfacespolymères ou métalliques d’implants ou de prothèses par desgroupements sulfonate et carboxylate, capable d’induire unediminution sensible de l’adhérence bactérienne est alors pro-posée.

Des copolymères fonctionnalisés par des groupements car-boxylate et sulfonate ont été synthétisés par voie radicalaireou greffés sur des supports prothétiques. Selon leur compo-sition chimique, ces polymères sont capables de modulerl’adhérence et la prolifération de différents types des celluleseucaryotes [29,43,44] mais également des bactéries [30,45,46]. Ces activités sont médiées par les protéines de liaisoncomme la Fn et la variation de la réponse biologique est asso-ciée à une variation de la conformation de la Fn avec la chi-mie de la surface.

L’effet de ces polymères a été évalué in vitro sur de filmspuis sur des polymères sous forme de tubulures. Enfin desessais in vivo ont été réalisés sur des prothèses greffées despolymères bioactifs. Les résultats de ces expérimentationsmontrent que pour certaines compositions chimiques biendéfinies des polymères, un effet bactériophobe important ainsiqu’un effet inhibiteur de la prolifération bactérienne sontobservés sur les différentes souches étudiées.

L’ensemble des résultats présentés a permis de mettre enévidence que la modification chimique de la surface des bio-matériaux à l’aide de polymères bioactifs porteurs des grou-pements fonctionnels carboxylate et sulfonate permet d’in-duire une diminution sensible de l’adhérence bactérienne tantin vitro qu’in vivo.

L’utilisation de ces polymères et/ou leur greffage sur dessurfaces prothétiques permet d’envisager la préparation desurfaces bioactives inhibitrices de l’adhérence bactérienne etde prévenir l’infection sur prothèse. Les différentes applica-tions envisagées pour ces surfaces bioactives sont très diver-ses : tubulures de circulation extracorporelle (polymères àbase de PVC), implants intraoculaires et lentilles de contact(polymères à base de PMMA), ligament synthétique, prothè-ses articulaires en titane greffés de polymère bioactifs (recher-che en cours).

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