植物の力を引き出すー未知の機能の解明・利用と新しい機能の付与を目指してー

「コメデンプンの改変」

秋田県立大学・生物資源科学部植物分子生理グループ

藤田 直子

東京農業大学先端研究シンポジウム2008年10月3日（金）

デンプン さまざまな植物に含まれる

穀類

いも類

果物

豆類

バナナ

トウモロコシ

コムギ

イネ

サツマイモ

ジャガイモ

多岐にわたって利用されている

酒類

パン、パスタ

甘味料，オリゴ糖、修飾デンプンなどの原料

糊

菓子類

コピー用紙段ボール

OCH2OH

O

OCH2

OCH2OH

Oα-1,4結合 α-1,4結合

OCH2OH

O

OCH2OH

Oα-1,4結合 α-1,4結合

OCH2OH

O

OCH2OH

Oα-1,4結合

OCH2OH

Oα-1,4結合

OCH2OH

Oα-1,4結合

α-1,6結合

アミロペクチン、グリコーゲン

・・・・・

・・・・・

OCH2OH

O

OOCH2OH

Oα-1,4結合 α-1,4結合

OCH2OH

O

OCH2OH

Oα-1,4結合 α-1,4結合

OCH2OH

Oα-1,4結合

CH2OHアミロース

・・・・・

OCH2OH

CCC

CC

OHOH

OHHO

HH

H

H H 14

3

6

のみからなる多糖 グルコース （ ブド ウ糖）

アミロペクチン

アミロース

・α-1,4グルコシド結合

・α-1,6グルコシド結合

・α-1,4グルコシド結合

デンプン

OCH2OH

OCH2OH

Oβ-1,4結合

OCH2OH

Oβ-1,4結合

OCH2OH

Oβ-1,4結合

OCH2OH

Oβ-1,4結合

OCH2OH

Oβ-1,4結合

・・・・・ セルロース

70-85％

15-30％

直鎖＋枝分かれ

直鎖

A

D

A; Nikuni (1969)

B: French (1972)

C; Hizukuri (1986)

D; Robin et al., (1974)

B

C

アミロペクチンの構造 アミロースの構造

グリコーゲンの構造

アミロペクチン特有のクラスター構造

Gallant et al., (1997) Carbohydrate Polymers 32: 177-191; Smith et al., (1997) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 67-87

デンプンの特徴①水に溶けない②水と共に熱すると糊化する

熱処理放置 放置

糊化生澱粉

老化

不可逆

デンプンのでき方

酵素の種類

少ない

多い

多糖の構造

単純

複雑

グリコーゲン

アミロペクチンイネ

ジャガイモ

シダ

コケ

クロレラ

ワカメ

海苔

ラン藻

種子植物

シダ植物

コケ植物

緑藻類

褐藻類

紅藻類

ラン藻類

原生生物

植物の進化植物の進化

SSI, SSIIa, SSIIb, SSIIcSSIIIa, SSIIIb, SSIVa, SSVIbGBSSI, GBSSII

LSUが４種類SSUが２種類 BEI, BEIIa, BEIIb

ISA1, ISA2, ISA3PUL

たくさんの酵素が関与

基質供給酵素(AGPase)

直鎖伸長酵素(SS)枝切り酵素(DBE)

アミロペクチン

イネの澱粉合成に関わる酵素

？

枝作り酵素(BE)

アミロース

デンプン生合成メカニズムの解明には・・・

SSI, SSIIa, SSIIb, SSIIcSSIIIa, SSIIIb, SSIVa, SSVIbGBSSI, GBSSII

LSUが４種類SSUが２種類 BEI, BEIIa, BEIIb

ISA1, ISA2, ISA3PUL

たくさんの酵素が関与

基質供給酵素(AGPase)

直鎖伸長酵素(SS) 枝切り酵素(DBE)

アミロペクチン

？

枝作り酵素(BE)アミロース

各アイソザイムの機能，役割の解明が必要

変異体の利用 組換体の作出単離酵素の生化学的解析

In vivo実験 In vitro実験

さまざまなデンプン変異体

・従来法（γ線、化学突然変異源処理等）

形態で選抜→どの遺伝子が破壊されているか？どの酵素がなくなっているか？

waxy ae sug-1野生型

ISA1の機能

・アミロペクチン構造が変わっている

Norm al su g ary-1 EM-5 sug ary-1 EM-91 4・sug-1変異体はデンプンではないものを種子に貯める

・イソアミラーゼ(ISA)活性バンドが無くなっている

Normal

sugary-1

EM-5

sugary-1

EM-41

2 5 10 15 2 5 10 15 2 5 10 15

・・サンプルアプライ量（μl）

ISA

PUL

・糊化開始温度が野生型に比べて10℃以上低い

sug-1 野生型

・変異体にISA1遺伝子を形質転換すると，形質が戻る。・人工的にアンチセンス法でISA1遺伝子を抑制すると短鎖が増える

Nakamura et al., (1997) Plant J. 12: 147-153 Kubo et al., (1999) Plant Physiol. 121: 399-409Fujita et al., (2003) Plant Cell Physiol. 44: 607-618 Kubo et al., (2005) Plant Physiol. 137: 43-56

BEIIbの機能amylose-extender (ae)変異体の性質

ae変異体 野生型

・糊化しにくいデンプン

・糊化開始温度が野生型に比べて10℃以上高い

・アミロペクチン構造が変わっている

・BEIIb活性バンドが無くなっている

Nishi et al., (2001) Plant Physiol. 127: 459-472

・変異体にBEIIb遺伝子を形質転換すると，BEIIb発現量に従って，アミロペクチン構造が変化し，糊化温度も変化

Tanaka et al., (2004) Plant Biotech J. 2: 507-516

形態に現れない変異体

どれが変異体？

・逆遺伝学的法（遺伝子タギング法）

特定の遺伝子が破壊→どんな変化？

特徴：葉身DNAからPCR法で選抜残存酵素活性が異なるものが複数選抜できる形態に変化がない変異体が選抜できる

トランスポゾンタギング法

Tos17

Tos17

Tos17

Tos17

カルス培養

複製

転移

Tos17

遺伝子発現が阻害される酵素ができない

イネSSアイソザイム遺伝子の系統樹

0.1

SSIIc

SSIIaSSIIb

S S I I

SSIIIa

SSIIIb

SSIVa

SSIVbGBSSI

G BSSII

G BS S

S S I

S S IV

S S I I I

(D16202)

(SSIII-2, AY100469)

SSI

＊waxy

＊Japonica rice

SSIIIa

SSI

イネ登熟胚乳の可溶性画分

60%～

20-30%

Native-PAGE/SS activity staining0.8% Oyster glycogen

Fujita et al., (2006)Plant Physiol. 140: 1070-1084

Nakamura et al., (2005)Plant Mol. Biol. 58: 213-227

Fujita et al., (2007)Plant Physiol. 144: 2009-2023

SSI変異体

OsSSI gene

ATG TGATATA

1kb1R2R

e7

i4

i2-1

E1 E2 E4 E6 E11 E15

2F1F 3F 6F

4R5R

i2-2

T1RT2R

T 1F T2F

T 1F T2F

T1F T2F

i2-1+/ + -/ -

i2-2+/ + -/ -

i4+/ + -/ -

e7+/ + -/ -

23.139.42

6.56

4.36

2.322.03

(k Da)

Nip

1.060.770.620.35

T1F, T2F/ 1R, 2R 3F, 6F/ 1R, 2R1F, 2F/ 4R, 5R

23.139.426.564.36

2.322.03

1.060.770.620.35

i2-1+/ + -/ -

i2-2+/ + -/ -

i4+/ + -/ -

e7+/ + -/ -

Nip

T 1R, T 2R/ 1F, 2F

SSI変異体系統のSS活性（Native-PAGE/SS activity staining）

8 4 2 1

-/-+ /+

i2-2

0.58 4 2 1 0.5

-/-+ /+

i2-1

8 4 2 1 0.5

-/-+ /+

i4-1e7

8 4 2 1

-/-+ /+0.5

0(ゼロ）

8 (μl)

SSI

SSIIIa

1/6 1/5 1/4

8 8 8

0=e7< i2-1 < i2-2 <i4 < <Wild-type

SSI変異体の種子の形態、重量・SSI活性を完全に欠失している系統ですら，種子形態，重量は野生型と変わらなかった。

*a n=50, b n=10, それ以外はn=20

種子重量( mg )

系統 +/+ -/-

日本晴a21.9±0.5 ー

i2-1 22.8±0.3 25.0±0.4

i2-2 18.7±0.3b18.7±0.3

i4-1 19.9±0.3 19.0±0.2

e7 21.7±0.4 22.8±0.4

日本晴

e7

+/+

-/-e7

アミロペクチンの鎖長分布解析

Δ

SSI変異体の胚乳アミロペクチンの鎖長分布（変異体からコントロールを引いた差分）

・全てのSSI変異体系統で同様の変化を示した→この変化はSSI欠失の影響！

・SSI残存活性が少ないものほど，激しい変化を示した。

0.8

67

812

17 18

i4-1i2-2i2-1e7

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

DP

9 10

-0.8

-0.4

0

0.4

ΔM

olar

(%)

SSI残存活性：0=e7< i2-1 < i2-2 <i4 < <野生型

-1.2

アミロペクチン鎖長分布解析の解釈

・SSIはアミロペクチンの非還元末端からDP6-7の鎖をDP8-12に伸長する（●部分）

アミロペクチン構造の一部を示す

DP6 -7

DP6 -7

DP8 -1 2

.......

.... ..

.

アモルファスラメラ クリスタルラメラ

A鎖の分岐点

他のSSアイソザイムによる伸長

他のSSアイソザイムによる伸長

SSIによる伸長

SSIによる伸長

A鎖

B1鎖

SSIIIa変異体

8 4 8 4

Oyster glycogen gel0.5 M Citrate

日本晴 SSIIIa変異体e1-/-

(μl)

SSIIIa

SSI

Native-PAGE/SS活性染色

・SSIIIa遺伝子のエキソン１にTos17が挿入された変異体が得られた。

・Native-PAGE/SS活性染色により，SSIIIaバンドが完全に欠失していた。

・SSI活性バンドが野生型と比べて強くなっていた。

SSIIIa変異体の種子形態，重量およびデンプン粒の形態

・SSIIIa変異体種子は，心白であった。・デンプン粒は，野生型より小さく，丸かった。

2．種子断片のSEM像

日本晴 SSIIIa変異体e1-/-

1．種子形態、重量

SSIIIa変異体e1-/-日本晴

系統 玄米重量 (m g)

日本晴 21.6±0.3 (100)

e1-/- 20.7±0.2 (95.8)n=20

SSIIIa変異体の胚乳アミロペクチンの鎖長分布（変異体からコントロールを引いた差分）

・異なる登熟ステージで，全て同じパターンを示した。・DP≦20の短鎖に変化が見られた。・野生型と比べてDP40付近の減少が顕著であった。

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

ΔMolar(%)

DAF7

DAF16

DAF25

Mature

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

DP

8

12

18

2142

短鎖領域の変化 長鎖領域の変化

枝切り後のデンプンおよびアミロペクチンのゲルろ過

日本晴

0

1

2

3

4

5

6

7

8

350

400

450

500

550

600

650

starchamylopectin

starch-λmax

Relative carbohydrat e (%)

e1-/-

0

90 120 150 180 210Elution volume(ml)

1

2

3

4

5

6

7

350

400

450

500

550

600

λmax(nm)

I II III

III III

Fr.I (%) Fr.II (%) Fr.III (%)

True amylosecontents (%) III/II

日本晴Starch 15.4 26.2 58.4 15.0 2.2

Amyloepctin 0.4 26.7 59.8 2.2

e1-/- Starch 24.8 18.0 57.3 20.0 3.2

Amyloepctin 4.8 19.4 56.1 2.9

SSIIIa変異体デンプンは野生型と比べて・・・

・アミロース含量が増加していた。

・アミロペクチンの超長鎖が増加していた。

・長いアミロペクチン鎖が少なかった。

RVAを用いた胚乳デンプンの糊化粘度特性

・SSIIIa変異体デンプンは野生型と比べて熱糊化粘度が激減していた。

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 400 800 1200

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

温度変化

日本晴

e1-/-

Temperature (℃)

Viscosity (cP)

SSIIIa欠失の他のSSアイソザイムへの影響

・SSIIIa欠失により，SSIおよびGBSSIタンパク質量が増加した。・SSIおよびGBSSIタンパク質の増加は，転写レベルで制御されていた。

SSIIIa活性の欠失

アミロペクチン長鎖DP≧30の減少

アミロース含量の増加

アミロペクチン分子量の低下

SSI活性の増加

アミロペクチン短鎖DP≦30の変化10≦DP≦15↑9≦DP, 16≦DP ≦19↓

GBSSI活性の増加

SLCの増加

デンプン物性の激変

直接要因間接要因 間接要因

他酵素への影響

デンプン構造、成分の変化

３種類のSS変異体の役割

・イネ胚乳で発現する3つのアイソザイムは，伸長する長さがそれぞれ異なる。

Ch ain len g t h o f t h e p r ecu r so r ch a inan d e lo n g a t ed ch a in b y SS iso zy m es (DP)

SSI

SSIIa

SSIIIa

6 7

1 0

4 0

8 1 2 2 0

2 4

・SSIは，DP6-7の極短鎖をDP8-12にわずかに伸長する。

・SSIIaは，DP≦12を13 ≦ DP ≦ 24に伸長する。

・SSIIIaは，クラスターをつなぐ長い鎖を伸長する。

文献

SSI: Fujita et al., (2006) Plant Physiol. 140: 1070-1084SSIIa: Nakamura et al., (2005) Plant Mol.Biol.58: 213-227SSIIIa: Fujita et al., (2007) Plant Physiol. 144: 2009-2023

DP12 ～16 DP12 ～16 8～168～16

SSI

SSIIIa

SSISSIIa Indica riceの胚乳アミロペクチン構造

クリスタル アモルファス アモルファスクリスタル

ラメラ ラメラ ラメラ ラメラ

アミロペクチン生合成メカニズム

①

②

③

④

⑤

⑥

BEI

ISA

SSI

BEIIb

SSIIIa ISA

SSIIa

SS

Nakamura, (2002) Plant Cell Physiol. 43: 718-725を一部改定

今後の課題，今進めている研究

○デンプンの構造や物性をより制御しやすくするために…

澱粉構造遺伝子 澱粉物性 利用特性

○よりユニークな構造のデンプンを開発するために…

・単離済みの変異体を用いた二重変異体の開発

澱粉変異体A(aaBB)

澱粉変異体B(AAbb)

AaBb AaBb

[AB]

P既に単離済みの変異体間の交配

F1 F1の自殖

F2 分離世代[Ab] [aB] [ab]

選抜

・単離済みの変異体をホストに遺伝子導入した形質転換体

ユニークなデンプンの応用例

難消化性澱粉→ダイエット米、大腸癌予防食品

易消化性澱粉→発酵産業、甘味料

老化しにくい澱粉→練り製品などへの添加物

高アミロース澱粉→フィルム特性、食感改善剤、クリスピー天ぷら粉

低温糊化澱粉→加工時の省エネに貢献

低分子量澱粉→エネルギー持続性ドリンク

米飯以外のコメの利用を促進→休耕田の有効利用食料自給率の向上

中小食品企業の活性化

秋田県大

謝辞

久保亜希子

Jay-lin Jane他

元CREST研究員バイテクセンター職員卒業生在学生

生物研

廣近洋彦宮尾安藝雄他

中村保典

大阪府大

アイオワ州立大

佐藤光西愛子

九州大

資金援助：秋田県立大学，JST, CREST，農水省イネゲノムプロジェクト科学研究費若手Ｂ