02 Cromosomas

2 Alteraciones cromosómicasDiagnóstico Molecular y Genético

2 Alteraciones cromosómicas

Técnicas de diagnóstico molecular para la

detección de anomalías cromosómicas


Citogenética molecular

Hibridación fluorescente in situ (FISH)

– FISH en metafase

– FISH en interfase

Cariotipo espectral (SKY)

Hibridación genómica comparada (CGH)

Otras técnicas:

– FISH en hebra (Fiber FISH)

– Mapeo óptico

– Microdisección de cromosomas


Conceptos básicos

Compactación y estructura de la cromatina

Mutaciones y polimorfismos

– genómicas,

– cromosómicas y

– génicas

Cariotipos convencionales

Mapeo de cromosomas: nomenclatura


Tipo de muestra

! Diagnóstico genético preimplantatorioen técnicas de reproducción asistida

Células de la médula ósea

Células fetales en líquidoamniótico o vellosidades

coriónicas

Células embrionarias

Sangre (o células mucosabucal)

Aplicaciones

Técnicas de diagnóstico molecular para ladetección de anomalías cromosómicas

! Evaluar a una pareja conantecedentes de abortos o infertilidad

! Evaluar una apariencia anormal delcuerpo que sugiere una anomalíagenética

! Análisis en casos de leucemia ylinfomas (el cromosoma Filadelfia estápresente en el 85% de los casos de LMC)

! Diagnóstico prenatal para evaluaranomalías cromosómicas en un fetoen desarrollo


Biopsia médula ósea

Toma de muestra


Diagnóstico prenatal

Toma de muestras


Diagnóstico preimplantatorio


Genoma humano

0

50

100

150

200

250

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

Cromosoma

Mil

lon

es

de

pa

res

de

ba

se

sComplemento haploide:

2,9 Gbases


Organizacióndel ADN

Niveles de enrollamiento:

Doble hélice 2 nm

Nucleosomas 11 nm

Solenoides 30 nm

Bucles de cromatina 300 nm

Cromátide 700 nm


Lazo de ADN Esqueleto proteico

El ADN de una célula “mide” 2 metros

Microfotografía de un cromosoma sin histonas


Organización del ADN

Heterocromatina

– ADN compacto poco accesible a la transcripción

Eucromatina

– ADN más laxo que permite la transcripción


Alteraciones en el ADN

Un cambio heredable en la secuencia de ADN es una

mutación o un polimorfismo.

Mutación: cambio presente en una pequeña proporción de

la población (variante) o del organismo.

Polimorfismo: cambio presente en al menos un 1% de la

población.

No tienen por qué producir efectos en el fenotipo.


Mutaciones

Génicas

– Afectan a un único gen y frecuentemente son cambios

pequeños en el ADN

Cromosómicas

– Afectan a la estructura de uno o varios cromosomas

Genómicas

– Cambios en el número de cromosomas


Anomalías cromosómicas

Numéricas: afectan al número de cromosomas.

Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de partedel material genético


Alteraciones cromosómicasestructurales

Duplicación

Deleción

Inversión

Translocación


Alteraciones cromosómicasestructurales

CROMOSOMA MARCADOR

Fragmento sin

identificar


Ejemplo de translocación

Esquema de la translocación(9;22) que da origen alcromosoma Filadelfia en laleucemia mieloide crónica



" Aneuploidías: trisomías (2n+1); monosomías (2n-1)

" Poliploidías: triploidía (3n); tetraploidía (4n)

Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de partedel material genético

Numéricas: afectan al número de cromosomas.



" Aneuploidías: trisomías (2n+1); monosomías (2n-1)


Frequencia de trisomíasen abortos espontáneos

Down

EdwardsPatau

Aneuploidías


Riesgo de trisomía 21con la edad materna

Aneuploidías


Síndrome de Turner:única monosomía viable

45,X

Falta de desarrollo decaracterísticas sexualessecundarias.

Cuello ancho (doble tejidoconectivo a los lados del cuello)

Pecho ancho “Anormalidadesrenales y cardiovasculares.

No afecta el IQ pero existe ciertogrado de inmadurez ycomportamiento infantil.

Aneuploidías


Individuo triploide

" Poliploidías: triploidía (3n); tetraploidía(4n)

Cariotipo 69,XXX

Poliploidías

Letal


Visualización

Tinciones convencionales tiñen específicamente el ADN

– T. de Feulgen

– T. de Wright

– Hematoxilina

– DAPI (fluorescente)

Existen tinciones que específicamente marcan distintas regiones de los

cromosomas

– bandeo Q

– bandeo G

– bandeo R

– bandeo C


! Las células deben estar endivisión

! Deben pararse en metafase

! Deben someterse a choqueosmótico para conseguirbuena separación de loscromosomas

! Hay que fijarlas

! Deben teñirse loscromosomas para que seanidentificables

Importante: máximas condiciones de esterilidad

Requisitos para el estudio del cariotipo


Método de estudio del cariotipo

1) Toma de sangre periférica y separación de los glóbulos blancos(linfocitos T)

2) Incubación en presencia de productos que inducen a la mitosis(mitógenos) tales como la fitohemoaglutinina

3) Detención de la mitosis en la metafase (utilizando colchicina, queinterfiere en la polimerización de los microtúbulos del huso mitótico)

4) Paso por un medio hipotónico que hace que las células se hinchen

5) Depositar una gota de la preparación entre porta y cubre (sobre el cualse hace presión para dispersar los cromosomas)

6) Fijar, teñir y fotografiar los núcleos estallados (10-15; 30 en mosaicos)

7) Antes había que ampliar la fotografía y recortar y ordenar loscromosomas. Hoy en día existen aparatos de captación y programas deanálisis que elaboran el cariotipo automáticamente.


Cariotipo

Representación ordenada de los cromosomas de un

individuo atendiendo a su número, forma y tamaño



Métodos de tinción

Tiñe las regiones organizadorasdel nucléolo

Tinción con nitrato de plataNOR

Resaltan las regionescentroméricas

Extracción de DNA/proteínas,tinción con Giemsa

C

Resaltan las regionesteloméricas

Varias técnicasT

Patrón inverso al Q y G, útilpara definir los extremos de

los cromosomas

Naranja de acridina, Giemsamodificado

R

Las bandas G oscurascorresponden a las Q brillantes

Tinción con Giemsa, tras pre-tratamiento del cromosoma

con tripsina

G

Bandas fluorescentes brillantesTinción con quinacrinaQ

CaracterísticasMétodoBandeo


Ejemplos de bandeo


Bandeo G

Más habitual

Se tratan previamente con

tripsina antes del Giemsa

400 bandas por genoma,

cada banda de 5 a 10 Mb

Heterocromatina en las

bandas oscuras.


Cariotipo de alta resoluciónTinción de los cromosomas en profase o en metafase

temprana (más largos y finos).

Permite distinguir el doble de bandas (800).

Se añade metotrexato además de colchicina antes de la

tinción con Giemsa.


Tipos de cromosomas


Tipos de cromosomas

Ejemplos


Ideograma


Nomenclatura

P brazo corto (petite)

q brazo largo

del deleción

inv inversión

dup duplicación

ins inserción

+ ganancia

- pérdida

I,iso isocromosoma

r cromosoma en anillo

t translocación

tel telómero

ISCN: International System for Human

Cytogenetic Nomenclature

http://www.iscn1995.org/


Fórmulas cromosómicas

46,XX

46,XY

47,XXY

47,XX,+21

46,XY,19p+

46,XX,del(7)(q13)

46,XY,t(5;17)(p13.3;p13)

46,X,i(X)

48,XX,+15,+16 [8]/46,XX [27]

Corrector de sintaxis:

http://www.mcndb.org/iscn/index.jsp


Fluorescent In Situ

Hybridization: FISHHibridación in situ fluorescente

Es la detección de sondas fluorescentes

altamente específicas que se han

hibridado a cromosomas en interfase o

metafase.

Las sondas de ADN pueden marcarse

con moléculas fluorescentes (método

directo) o no fluorescentes que se

detectan con anticuerpos fluorescentes

(método indirecto).


FISH

Primero, las sondas hibridan a regiones específicas.

Después se tiñen los núcleos con un color de

contraste inespecífico (generalmente DAPI).

Finalmente se visualiza en el microscopio.


Protocolo básico

Los portaobjetos con los núcleos fijados:

1 Desnaturalización del ADN (70% en formamida).

2 Se añade la sonda, se cubre y se sella. Se incuba de 2 a

12 horas a 37º.

3 Se quita el cubre y se lava con detergente y sales.

4 Se añade colorante para el fondo.


FISH en metafase

Tipos de sonda:

– Cósmidos

– Satélites alfa

– Sondas completas

(painting probes)


Sondas específicas

Cósmidos:

– Secuencias únicas que

hibridan en segmentos

pequeños

– Se usan en estudios de

microdeleciones

Sonda de 1,4 kb cromosoma 11


Sondas específicas

Sonda específicapara el síndromeWilliams-Beuren(Elastina: 7q11.23)y control


Sondas específicas

Sonda específica(22q11.2) para elsíndrome diGeorge:microdelecióncromosoma 22Control (22q13)


Sondas específicas

Sondas consecuenciacentromérica ytelomérica delcromosoma 12


Sondas específicas

Sonda consecuenciatelomérica delcromosoma 4q


Sondas específicas

FISH de bandamulticolor


Sondas satélite

Satélites alfa:

– Sonda formada por secuencias altamente repetidas que se

encuentran cerca de los centrómeros.

– En la mayoría de los casos son específicos para cada cromosoma

– Se usan para determinar aneuploidías o para identificar el origen

de cromosomas marcadores.


Sondas satélite

Sondas para

cromosomas 14 y 22:

se detecta un

cromosoma marcador

dicéntrico


Sondas satélite

Sonda para secuencia Alu


Sondas completasSonda para el cromosoma 1

Sonda para el cromosoma 19.Marca el extremo de otrocromosoma identificando elmaterial de un cromosomamarcador.


Sondas completas

Caso de una translocación

desequilibrada, una porción del

brazo 4 reemplaza el extremo

del cromosoma 1


Sondas completas

sonda

cromosoma 1

sonda

cromosoma 4



FISH en interfase

No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para poder

realizar el FISH.

Normalmente cuando se fija una célula sin tratar el núcleo se encuentra

en interfase, con los cromosomas descondensados.

De todas maneras es posible realizar el FISH aunque los resultados no

sean tan específicos. Se utiliza sobretodo para detectar aneuploidías o

grandes deleciones, duplicaciones o translocaciones en células fetales

o tumorales


FISH en interfase

DXZ1 DYZ3 D18Z1

X

Y

1818

Metafase Interfase


FISH en interfase:aneuploidías

Aneuploidías en células embrionarias

1ª ronda

– sonda 13

– sonda 21

2ª ronda:

– sonda 18

– sonda X

– sonda Y

Feto varón normal*


FISH en interfase:aneuploidías

Aneuploidías en células embrionarias

1ª ronda

– sonda 13

– sonda 21

2ª ronda:

– sonda 18

– sonda X

– sonda Y

Feto femenino con trisomía 21


FISH en interfase:traslocaciones recíprocas

46,XY 46,XX,t(12;17)(p13;p13)

sondas subteloméricas y centroméricas



Primero se prueban las sondas en linfocitos de ambos

progenitores para comprobar su correcta hibridación

tel 12

tel 17

ctr 17



tel 12

tel 17

ctr 17


FISH en interfase:traslocaciones recíproca

tel 12

tel 17

ctr 17



tel 12

tel 17

ctr 17


FISH en linfocitos:

186 93%

7 3,5%

5 2,5%

1 0,5%

1 1,5%


FISH en interfase:traslocaciones robertsonianas

Robertsonian translocation der(13;21)(q10;q10)

miscarriage

chromosome 13

chromosome 21

male female

Carrier Normal

Down syndrome Carrier Down syndrome Normal


FISH multicolor: SKY

SKY (Spectral Karyotyping) es una técnica que permite

visualizar los 23 pares cromosomas a la vez teñidos con

diferentes sondas fluorescentes.

Se utiliza sobre todo en el estudio de células tumorales. Las

sondas para cada cromosoma es de un color (o

combinación; solo hay 5 colores) distinto.

Se utilizan programas informáticos para analizar las

imágenes y formar el cariotipo.





Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes

Schröck et al. SCIENCE 1996; 273 (5274):494



Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes

Schröck et al. SCIENCE 1996; 273 (5274):494



Traslocación entre el 1 y el 11


Trisomía parcial del extremo 4q

(derivativo)








FISH en hebra

Fiber FISH o Halo FISH

Es un FISH en el que se extiende linealmente en un porta el

fragmento de cromosoma que nos interesa estudiar.

Permite distinguir pequeñas reorganizaciones sin tener que

clonar y secuenciar (habitualmente hasta 20 pb).

Se forman rosarios debido a las roturas de las hebras de

cromatina y el enrollamiento de los extremos.


FISH en hebra

Al extenderse se consigue un 130% de su tamaño teórico

34 µm / 1 kb


FISH en hebra

Se usa bastante para detectar deleciones en

clones o para estimar huecos en los proyectos

genoma


Microdisección decromosomas y FISH inverso

Se puede recortar un fragmento de cromosoma por

micromanipulación (láser y micropipetas) teñido con

Giemsa o con una sonda.

Esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva

sonda.

Se utiliza para detectar el origen de un ADN marcador o

fabricar sondas inespecíficas que hibriden con

determinada región.



1 aislamiento del cromosoma marcador y marcaje

2 hibridación con linfocito de donante sano: es un

fragmento del cromosoma 16 (16)(p13.1!q12.2)




Búsquedas bibliográficas: Pubmed/ISI Web of knowledge

Artículos / revisiones

Índice de impacto

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CGH

Comparative genomic hybridization

Detecta pérdida o duplicación de regiones genómicas.

Es un FISH de dos colores.

Se utiliza sobretodo para determinar las reorganizaciones

cromosómicas de las células tumorales y predecir la

severidad del cáncer. No requiere cultivo de las células.


CGH

1 El ADN-M del tejido a estudiar se marca con un

fluorescente (usualmente verde; Cy3 550 nm).

2 ADN-C de un tejido con un cariotipo normal se marca con

otro fluorescente (rojo; Cy5 660 nm).

El marcaje se realiza por desplazamiento de mella (nick-

translation )

3 Una misma cantidad de ADN de cada muestra se hibrida

con metafases de células normales (linfocitos).


CGH

1 Si no existe reorganización de la zona la

relación entre ambas sondas será 1:1

2 Si el ADN-M presenta una duplicación habrá

proporcionalmente más sonda marcada y el

cromosoma fijado teñirá de verde.

3 Si el ADN-M presenta una deleción habrá

proporcionalmente menos sonda y el

cromosoma fijado teñirá de rojo

Requiere de software específico y experiencia

del operador.


CGH

DAPI


CGH

Cy3


CGH

Cy5


CGH

Superposición


CGH


CGH


CGH


CGH: una metafase


CGH: 8 metafases


CGH: 8 metafases


CGH: limitaciones

Detecta bien deleciones y duplicaciones.

Es ineficaz para detectar traslocaciones o inversiones.

Depende de la población de células originales, si hay

mosaicismo la detección se verá contaminada por

contaminación (>50%).

La sensibilidad es de alrededor de las 2-20 Mb


Array CGH

La resolución es mucho mayor hasta 150 kb o incluso genes.

Celdillas de fragmentos genómicos conocidos (BAC, cDNA,

oligonucleótidos) inmobilizados sobre una superficie

sustituyen la metafase del CGH. Aumenta por tanto el

número de copias diana.

Puede distinguir con precisión los puntos de corte de las

alteraciones cromosómicas.


Array CGH


Array CGH

Se suele añadir ADN Cot-1

Es ADN de origen placentario de 50

a 300 pb enriquecido en

secuencias repetitivas (Alu o

Kpn).

Se usa para bloquear hibridación

no específica en los microarrays.


Array CGH


Array CGH

Se analizan 120 x 60 = 7200 fragmentos


Array CGH

Los microarrays se

preparan a partir

de clones

genómicos:

BACs o YACs


Array CGH

El tipo de clon nos

va a limitar la

sensibilidad y el

tipo de

resultados


Array CGH

Se suele representar la señal en forma de perfil lineal.

Control normal 46XX


Array CGH

El marcaje de XX sobre XY permite distinguir el doble

cromosoma X


Array CGH

Deleción en 7q11.23 heterocigoto

Flecha indica fluorescencia reducida en 3 BACs

Zona gris indica el centrómero

FISH de confirmación:

sonda verde BAC gen LIMK1,

sonda roja BAC 7q11.21


Aplicaciones clínicas FISH

Preparación del tejido diana FISH SKY CGH CGHa

Metafase + + + +

Interfase + - + +

Cultivo previo -/+ + - -


Aneuploidías + + + +

Traslocaciones eq, inversiones + +/- - -

Microdeleciones/duplicaciones + - - +


Cáncer

Suele haber alteraciones cromosómicas en las células

somáticas. Algunas son heredables entre generaciones y

pueden causar predisposición al cáncer.

Las alteraciones cromosómicasa son marcadores diagnósticos

y de valor pronóstico.

La evaluación citogenética molecular de los cánceres es de

gran importancia.


Cáncer

el cáncer surge tras una acumulación de mutaciones que

confieren a la célula una ventaja selectiva puntual

Muchos tumores exhiben altos niveles de inestabilidad

genómica.

¿Son estas mutaciones cromosómicas causas o efectos del

cáncer?


Cáncer

Existen determinadas traslocaciones asociados a cánceres

específicos

– Sobreexpresión o desregulación de un protooncogen porque se une

a un fuerte promotor o enhancer.

– Generación de una gen quimera que codifica una proteína de

fusión desregulada


Cáncer

Sobreexpresión de BCL2 debido al enchancer IG en un

linfoma folicular


Cáncer

Linfoma de Burkitt

- non Hodgkins

- Cancer agresivo de células B

- también aparece en el

mieloma múltiple

Traslocación IG-MYC


Cáncer

Un FISH con dos sondas específicas es suficiente

para distinguir la traslocación IG-MYC


Cáncer

Esquema de la translocación(9;22) que da origen alcromosoma Filadelfia en laleucemia mieloide crónica


Cáncer

Normal 2 + 2

Proteína de fusión BCR-ABL

Fusíon 1 + 1 + 2

2 + 2 + 1

1 + 1 + 1


Cáncer

Proliferación

Apoptosis

Estabilidad genómica

Angiogénesis

Invasión

Metastasis


Cáncer


Cáncer

Origen de los cromosomas marcadores de una línea tumoral

de cáncer de mama.


Cáncer

Perdida del der(17)

Dos zonas de

amplificaciónTraslocación 17;22


Cáncer

Amplificación. Células de un cáncer de mama.– sonda verde cromosoma 17 (centrómero)– sonda roja gen HER2/ERBB2 (17q11.2-q12)


Cáncer

Amplificación.

– De 100 a 1000 kb pocas veces incluyen un único gen

– Sobreexpresión y se asocia con mala prognosis o estadío final

– Dos formas:

• Partículas pequeñas (double minutes DMs)

• Regiones de tinción homogénea (homogeneously staining

regions HSR


Cáncer

Amplificación. Glioblastoma (DMs)– sonda verde cromosoma 17– sonda roja gen EGFR (17q25)


Cáncer

Amplificación. Leucemia linfoide/mieloide (HSRs)– sonda amarilla gen MLL (11q23)


Cáncer

Amplificación. Leucemia linfoide/mieloide (HSRs)– sonda amarilla gen MLL (11q23)


Cáncer

Las reorganizaciones suelen implicar a genes relacionados con el cáncer.

Linfoma de células B alargadas/difusas

IL6R,MCL1, SKI REL MYC

ABL,TAN1 CDK2,GLI,SAS,CDK4,MDM2

IL4R BCL2 SIS,YES2


Cáncer

En los estadíos avanzados y de mal pronóstico se acumulan las anomalíascromosómicas.

GGH de linfoma de Hodgkin


Cáncer

Combinación

restricción

PCR y

array de CGH

para detectar

patrones de

metilación en células

de cáncer de pulmón


Cáncer

El gen

MINT26 está

metilado en

las células de

este tumor


FISH bases de datos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/

Base de datos de resultados de SKY y CGH


FISH bases de datos

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