Embed Size (px)
Citation preview
1
D E T E R M I N A C I Ó N D E L A S P O B L A C I O N E S M I C R O B I O L Ó G I C A S E N E L P R O C E S O D E
E X T R A C C I Ó N D E J U G O D E C A Ñ A D E A Z Ú C A R E N E L I N G E N I O M A N U E L I T A S . A .
LAURA SERRANO GALVIS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C., Febrero de 2006
2
D E T E R M I N A C I Ó N D E L A S P O B L A C I O N E S M I C R O B I O L Ó G I C A S E N E L P R O C E S O D E
E X T R A C C I Ó N D E J U G O D E C A Ñ A D E A Z Ú C A R E N E L I N G E N I O M A N U E L I T A S . A .
LAURA SERRANO GALVIS
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C., Febrero de 2006
3
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N 13 de Julio de 1946
“ La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis.
Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.
4
D E T E R M I N A C I Ó N D E L A S P O B L A C I O N E S M I C R O B I O L Ó G I C A S E N E L P R O C E S O D E
E X T R A C C I Ó N D E J U G O D E C A Ñ A D E A Z Ú C A R E N E L I N G E N I O M A N U E L I T A S . A .
LAURA SERRANO GALVIS
APROBADO
___________________________ __________________________ María Luisa Guzmán; Microbióloga Ana Karina Carrascal, Docente CENICAÑA Universidad Javeriana Director Asesor ____________________________ ___________________________ Andrea Aguirre, Docente Adriana Matiz, Docente Universidad Javeriana Universidad Javeriana Jurado Jurado
5
D E T E R M I N A C I Ó N D E L A S P O B L A C I O N E S M I C R O B I O L Ó G I C A S E N E L P R O C E S O D E
E X T R A C C I Ó N D E J U G O D E C A Ñ A D E A Z Ú C A R E N E L I N G E N I O M A N U E L I T A S . A .
LAURA SERRANO GALVIS
APROBADO
_____________________________ _____________________________ Dra. Angela Umaña M. Phil Dr. David Gómez M.Sc Decano Académico Director de Carrera
6
“Si le han dicho
como a mí,
siempre hay alguien
más pequeño y más
grande que usted,
entonces haga lo que yo:
abrace al más
pequeño y
déjese abrazar
por el mayor.”
Ángela Botero
7
AGRADECIMIENTOS
Al Ingenio Manuelita S.A., especialmente al Ingeniero Jaime H. Cardona, por o el
apoyo y el respaldo brindado para desarrollar mi trabajo de grado, y por la oportunidad de ser parte de la empresa.
Al Centro de investigación de la caña de azúcar de Colombia, CENICAÑA, especialmente a María Luisa Guzmán, por la dirección en el desarrollo y
culminación del proyecto, y a Alberto Palma por la asesoría y el respaldo para el análisis estadístico.
A Ana Karina Carrascal, docente de la Pontificia Universidad Javeriana, por la
asesoría en la realización del proyecto.
Al personal del laboratorio central del Ingenio Manuelita S.A. por la amistad y la confianza, porque creyeron siempre en mí y en el éxito del proyecto.
A mis padres y mis hermanos, que a pesar de la distancia estuvieron siempre conmigo, porque fueron mi apoyo y mi fortaleza.
A Víctor Manuel, por entenderme, apoyarme y por confiar en mí.
A mi familia caleña, por acogerme y apoyarme.
A todos los que aportaron de una u otra forma a la realización de este proyecto,
GRACIAS!
8
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RESUMEN
1
1. INTRODUCCIÓN
5
2. MARCO TEÓRICO
8
2.1. Generalidades del proceso de producción de azúcar 8 2.1.1. Procesamiento de la caña en fábrica 8 2.1.2. Microorganismos en el proceso 10 2.2. Pérdidas de sacarosa 10 2.2.1. Características físico-químicas de los jugos 11 2.2.1.1. Pureza 11 2.2.1.1.1. Pol 11 2.2.1.1.2. Grados Brix 11 2.2.1.2. Azúcares Reductores 12 2.2.2. Pérdidas indeterminadas 12 2.2.3. Contaminación microbiológica 14 2.2.4. Determinación de pérdidas por contaminación
microbiológica y sus implicaciones
16 2.2.5. Polisacáridos bacterianos 17 2.2.5.1. Dextranos 18 2.2.5.2. Levanos 19 2.3. Control de la actividad microbiológica 20 2.3.1. Agentes biocida 21 2.3.1.1. Busan 881® 22 2.3.1.2. Lipesa 106C® 23 2.3.1.3. Nalco 5581® 23 2.3.2. Beneficios en los subproductos
23
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
25
4. OBJETIVOS 26 4.1. General 26 4.2. Específicos
26
5. MATERIALES Y MÉTODOS 28 5.1. Lugar de muestreo 28 5.2. Población de estudio y muestra 28 5.2.1. Análisis directo de caña (DAC) 30 5.2.2. Jugo de primera extracción 30
9
Pág.
5.2.3. Jugo de 4° molino 30 5.2.4. Jugo de 2° molino 30 5.2.5. Jugo del colador 31 5.2.6. Jugo diluido 31 5.3. Unidad de muestreo 32 5.4. Muestreo 32 5.5. Variables del estudio 32 5.6. Variables respuesta y unidades de medida 33 5.7. Variables independientes a tener en cuenta 33 5.8. Métodos 35 5.8.1. Recuento de microorganismos 35 5.8.1.1. Mesófilos 35 5.8.1.2. Bacterias ácido-lácticas productoras de
exopolisacáridos (BALPE)
35 5.8.1.3. Mohos y levaduras 36 5.8.1.4. Bacterias aerobias termófilas esporuladas 36 5.8.2. Aislamiento y clasificación de microorganismos 36 5.8.3. Análisis físico-químico 37 5.8.3.1. pH 37 5.8.3.2. Temperatura (°C) 37 5.8.3.3. % de Pureza 37 5.8.3.3.1. Determinación de grados brix 37 5.8.3.3.2. Análisis de POL (Sacarosa aparente) 37 5.8.3.4. Determinación de azúcares reductores: Método de Eynon y Lane
38
5.8.3.5. Concentración de dextranos: Método de Roberts 38 5.8.4. Evaluación de los bactericidas 39 5.9. Recolección de la información 40 5.10. Análisis de la información
40
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 42 6.1. Población de microorganismos 42 6.2. Análisis físico-químico 42 6.2.1. Temperatura y pH 42 6.3. Variables de respuesta 44 6.3.1. Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas y los parámetros físico-químicos en la muestra de DAC
44
6.3.1.1. Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas en la muestra de DAC
45
6.3.1.2. Influencia de las características de la caña sobre los parámetros físico-químicos
51
10
Pág.
6.3.2. Poblaciones microbiológicas y su correlación con las características físico-químicas en los puntos de muestreo
53
6.3.2.1. Cuantificación de las poblaciones de mesófilos, BALPE, levaduras, mohos y termófilas aerobias
53
6.3.2.2. Dextranos, % de azúcares reductores, ºBrix, POL, %Sacarosa y Pureza
59
6.3.3. Clasificación de los microorganismos 60 6.3.3.1. Mesófilos 60 6.3.3.2. Bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos (BALPE)
63
6.3.3.3. Levaduras y mohos 65 6.3.3.4. Bacterias termófilas aerobias 68 6.4. Evaluación de desinfectantes 69 6.4.1. Busan 881® 70 6.4.2. Lipesa 106C ® 72 6.4.3. Nalco 5581® 74 6.4.4. Hipoclorito de calcio
76
7. CONCLUSIONES
79
8. RECOMENDACIONES
81
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
82
ANEXOS 89
11
ÍNDICE DE TABLAS Pág.
Tabla 1. Características de la caña que entró a la fábrica durante el estudio
34
Tabla 2. Bactericidas evaluados, sus concentraciones y los tiempos de contacto
39
Tabla 3. Promedios de temperatura y pH en cada punto de muestreo
43
Tabla 4. Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas y los parámetros físico-químicos en la muestra de DAC. Análisis estadístico (SAS) (10% de significancia). n = 40
46
Tabla 5. Test de Tukey. Comparación de los valores medios de poblaciones microbiológicas y características físico-químicas de la muestra de DAC, por tipo de caña y tipo de cosecha, y sus diferencias. n = 40
47
Tabla 6. Correlaciones entre las poblaciones microbiológicas y las características físico-químicas de los jugos en cada punto de muestreo.
55
Tabla 7. Evaluación de Busan 881®. Promedio de los porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. n = 3
70
Tabla 8. Evaluación de Busan 881®. Promedio de los parámetros físico-químicos.
71
Tabla 9. Evaluación de Lipesa 106C®. Promedios de los porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. n = 3
73
Tabla 10. Evaluación de Lipesa 106C®. Promedio de los parámetros físico-químicos.
73
Tabla 11. Evaluación de Nalco 5581®. Promedio de los porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. n = 3
75
Tabla 2. Evaluación de Nalco 5581®. Promedio de los parámetros físico-químicos. n = 3
75
12
Pág.
Tabla 13. Evaluación del hipoclorito de calcio. Porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto.
77
Tabla 14. Evaluación del hipoclorito de calcio. Parámetros físico-químicos
78
13
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Estructura del dextrano 18
Figura 2. Estructura del levano 19
Figura 3. Puntos de muestreo: muestra 1, muestra directa de caña (DAC)
28
Figura 4. Puntos de muestreo en el proceso de extracción: muestra 2, jugo de 1era extracción; muestra 3, 2º molino; muestra 4, 4º molino; muestra 5, jugo del colador; muestra 6, jugo diluido
29
Figura 5. Diferencias entra las poblaciones microbiológicas de acuerdo al tipo de caña
48
Figura 6. Tendencias de las poblaciones microbiológicas de acuerdo al incremento de los tiempos de permanencia de la caña en campo en caña larga (cosecha manual)
49
Figura 7. Influencia del % de materia extraña sobre las poblaciones de microorganismos en caña larga (cosecha manual)
50
Figura 8. Influencia del tipo de caña y el tiempo de permanencia sobre la concentración de dextranos en caña cosechada manualmente
52
Figura 9. Promedio de las poblaciones microbiológicas por punto de muestreo. n = 40
54
Figura 10. Promedio del % de azúcares reductores, y de la concentración de dextranos por punto de muestreo. n = 40
57
Figura 11. Promedio de los parámetros físico-químicos por punto de muestreo. n = 40
60
Figura 12. Clasificación por tinción de Gram de la población de mesófilos por punto de muestreo
61
Figura 13. Morfología y coloración de las colonias de mesófilos. Vista al microscopio (100X)
62
Figura 14. Clasificación de la población de BALPE en cada punto de muestreo
64
14
Pág.
Figura 15. Colonias de BALPE en agar MRS hipersacarosa
64
Figura 16. Colonias de BALPE en agar MRS hipersacarosa
65
Figura 17. Colonias de levaduras y mohos en agar YGC
66
Figura 18. Colonias de mohos al estereoscopio 20X en agar YGC
67
Figura 19. Visión microscópica de mohos (1000X). Coloración con azul de lacto-fenol
68
Figura 20. Clasificación de la población de bacterias termófilas aerobias en cada punto de muestreo
69
15
ÍNDICE DE ANEXOS
Pág.
Anexo 1: Formato de evaluación
89
Anexo 2: Promedio de las poblaciones microbiológicas y los parámetros físico-químicos en cada punto de muestreo
90
Anexo 3: Descripción de las colonias aisladas 91
Anexo 4: Ensayo adicional de la efectividad de los agentes biocida a concentraciones máximas permitidas
95
Anexo 5: Medios de cultivo 96
Anexo 6: Concentración del hipoclorito de calcio 97
16
RESUMEN
Las pérdidas en la producción de azúcar en los ingenios se cuantifican mediante
balances de sacarosa entre el contenido en la caña que entra a la fábrica, la presente
en los jugos procesados y la que se pierde en el bagazo y aguas de procesamiento;
parte de la sacarosa no detectada se atribuye a pérdidas por actividad microbiológica
y a características físico-químicas del proceso que favorecen la inversión de la
molécula. El objetivo de la investigación fue evaluar las poblaciones microbiológicas
de los jugos en diferentes puntos de los molinos, para establecer medidas que
permitan controlar las pérdidas de azúcar por actividad microbiológica en el ingenio
Manuelita S.A. Se realizó una cuantificación y clasificación mediante tinción de
Gram de los microorganismos presentes en los jugos, partiendo de las poblaciones
con que ingresa la caña a la fábrica (muestra de DAC) y determinando su
comportamiento en el molino, hasta el jugo diluido; los recuentos se correlacionaron
con las características físico-químicas de los jugos. Posteriormente, se evaluó la
efectividad de 3 biocidas: Busan 881®, Lipesa 106C® y Nalco 5581®; en tres
concentraciones, y a 5, 10 y 15 minutos de tiempo de contacto. La población más alta
en DAC correspondió a bacterias mesófilas (107UFC/ml), seguida de la población de
bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos (105), levaduras (105), mohos
(103) y termófilas (102), y dependieron del tipo de caña procesada, del tipo de
cosecha, del tiempo de permanencia y del % de materia extraña. Después de ingresar
a la fábrica, las poblaciones se incrementaron significativamente en el jugo de 1era
extracción, siendo éste el punto más crítico del proceso, y se mantuvieron
relativamente constantes en los siguientes puntos de muestreo. Predominaron los
bacilos Gram negativos y Gram positivos y en menor proporción los cocos Gram
negativos y Gram positivos. De los bactericidas evaluados en muestras de jugo de
1era extracción ninguno fue efectivo, incluso a dosis máximas permitidas. Un ensayo
adicional con hipoclorito de calcio mostró una alta efectividad ante poblaciones de
BALPE y levaduras especialmente, con un 72% de inhibición. Los resultados
17
microbiológicos mostraron poca correlación con las características físico-químicas
de los jugos.
18
ABSTRACT
Sugar losses in Sugar refineries are calculated by balances between cane entering the
factory, sucrose on processed juices, and sucrose on waste pulp and final water of the
process; part of not detected sucrose is attributed to microbiological degradation and
to characteristics of the process, that favor the sucrose inversion. The aim of this
investigation was to evaluate the microbiological population of the juices at diferent
points of milling station, to adopt routines that permit the control of microbiological
losses in Manuelita S.A. sugar refinery. It was made a quantification and
classification by Grams dye of diverse groups of microorganisms that are present in
the cane juice, starting off cane populations that enters to the grinding (DAC sample),
and determining the behavior of the same ones during mills up to diluted juice; the
microbiological counts were correlated with physic-chemistries juice characteristics.
Later, the effectiveness of 3 bactericidal was evaluated: Busan 881®, Lipesa 106C®
and Nalco 5581®; each one was evaluated at 3 different concentrations, and 5, 10 and
15 minutes of time of contact on a sample of juice of the point in which was greater
contamination. The highest population in the DAC sample corresponds to
mesophiles (107 CFU/ml), followed of the EPALB population (105 CFU/ml ), yeast
(105 CFU/ml), moulds (103 CFU/ml) and termophiles (102 UFC/ml), that depends on
kind of processed cane, type of harvest, dwell time and percentage of strange matter.
When entering the factory, populations are significantly increased in the first
extraction, considered this one the most critical point of the process; the populations
stay relatively constant in the following points of compilation of samples. The Gram
negative and Gram positive bacilli prevail, and, in minor proportion, the Gram
negative and Gram positive coccus. The bactericides evaluated in samples of juice of
first extraction were not effective, even to maximun authorized doses. An additional
test with calcium hypochlorite showed high effectiveness in the diminution of the
populations of BALPE and yeast, specially, with 72 percent of inhibition. The
19
microbiological results showed little interrelation with physic-chemistries
characteristics of the juices.
20
1. INTRODUCCIÓN
La industria azucarera colombiana es una de las principales agroindustrias del país; el
sector está conformado por 13 ingenios ubicados en el valle geográfico del río Cauca
con aproximadamente 200.000ha cultivadas, que se extienden desde el norte del
departamento del Cauca, pasando por el Valle del Cauca hasta el sur del
departamento de Risaralda, territorio donde se producen alrededor de 20.4 millones
de toneladas de azúcar anuales. Para este importante sector de la economía, el
crecimiento en la producción ha cobrado protagonismo en los últimos años, tanto por
el cumplimiento de la demanda del mercado, como por la importancia biotecnológica
que han adquirido los subproductos del proceso, para lo cual se adelantan proyectos
de investigación y desarrollo en un mejoramiento continuo y optimización de los
rendimientos en la producción.
El mantenimiento de niveles altos de sacarosa depende de múltiples factores, algunos
relacionados con la planta en el campo como son: el clima, el suelo, disponibilidad
de agua y nutrimentos, la variedad sembrada, prácticas agronómicas, presencia de
enfermedades y plagas, además de otros factores relacionados con los sistemas de
recuperación de la sacarosa en fábrica; de acuerdo a la eficiencia de éstos se
obtendrá un mejor rendimiento en la producción de azúcar.
En los ingenios, las pérdidas de azúcar se cuantifican mediante balances que tienen
en cuenta la sacarosa que ingresa a la fábrica en la caña de azúcar, la sacarosa
presente en los jugos obtenidos del proceso de molienda de la caña y la sacarosa que
finalmente abandona la fábrica en el bagazo de caña y aguas de procesamiento; el
azúcar no detectado mediante el balance se registra como “pérdidas indeterminadas”
las cuales se atribuyen a factores como la actividad microbiológica y a características
físico-químicas del proceso que favorecen la inversión de la molécula en sus azúcares
reductores.
21
El seguimiento del contenido de sacarosa desde la caña en pie hasta los procesos
fabriles es de gran importancia para los ingenios, razón por la cual, controlar y
disminuir las pérdidas de sacarosa ha sido tema de muchas investigaciones en el
mundo azucarero.
Numerosos estudios, realizados en Colombia y el mundo, relacionan gran parte de
las pérdidas indeterminadas y formación de productos metabólicos no deseados a la
actividad de la microflora presente en la caña, favorecida por condiciones de
operación como el corte y quema de la caña, condiciones de temperatura y humedad,
tiempos prolongados entre corte y molienda; sin embargo, el proceso de extracción
del jugo representa un punto importante de contaminación, pues a nivel de molinos,
las pérdidas de azúcar corresponden: un 13% a inversión química por efectos de pH
y temperatura de los jugos de caña; un 25% a efecto enzimático, por la procedencia
biológica de la materia prima que sintetiza y metaboliza la sacarosa, y un 62% a
inversión microbiológica, pues se presentan las condiciones favorables para el
crecimiento de los microorganismos, tanto por la presencia de nutrientes y factores
ambientales como por la falta de asepsia generalizada en los molinos de caña.
Tal como se entregan a los molinos, los tallos de la caña de azúcar presentan una gran
cantidad de microorganismos (bacterias, levaduras, mohos) provenientes del suelo,
aguas de lavado de caña, condiciones de cosecha, tiempo de permanencia de la caña
después de la cosecha y condiciones de operación, agua de extracción y por el aire; la
mayoría quedan en el jugo extraído, donde, si la temperatura es adecuada para el
crecimiento, el desarrollo microbiano se presenta inmediatamente, disminuyendo así
la pureza de los jugos en cuanto a sacarosa y produciendo cantidades apreciables de
gomas y sus subproductos metabólicos y, por ende, pérdidas para la industria.
El control bacteriano es una práctica común y se realiza mediante la adición de
agentes biocida en cantidades definidas, aunque el control en ausencia de estas
sustancias se practica en numerosas industrias productoras de azúcar, haciendo
22
énfasis en los procesos de limpieza para eliminar los microorganismos contaminantes.
Para lograr el control microbiológico en una fábrica productora de azúcar se hace
necesario realizar una cuantificación y clasificación de los microorganismos presentes
en los jugos de caña, que permita establecer qué tipos de microorganismos se
encuentran en los diferentes puntos de recorrido, cuáles se presentan más
frecuentemente y reconocer los puntos de mayor contaminación en el proceso, de tal
manera que los procedimientos de limpieza que se realicen en la fábrica sean más
efectivos contra estos grupos microbiológicos y contribuyan a mejorar la calidad de
los jugos y subproductos posteriores del proceso, controlando las pérdidas de
sacarosa por actividad microbiológica.
23
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Generalidades del proceso de producción de azúcar
La savia de la caña de azúcar (Saccharum officinarum, S. spontaneum, S. sinense,
etc.) y de la remolacha (Beta vulgaris) contiene alrededor de 17% de sacarosa, un
carbohidrato disacárido de fórmula general C12H22O11, compuesto de los
monosacáridos D-glucosa y D-fructosa que se condensan en grupos glucosídicos,
formado por un proceso fotosintético de asimilación. Mediante el proceso de
extracción realizado en Ingenios azucareros, se obtiene el jugo de caña o remolacha,
que es purificado por medios físicos y químicos, evaporando luego el agua y
separando los cristales de azúcar para obtener finalmente el azúcar comercial
refinado, que contiene alrededor de 99.99% de sacarosa (Honig, 1969).
2.1.1 Procesamiento de la caña en fábrica
La caña que llega a la fábrica se descarga sobre las mesas de alimentación al
conductor de caña, y luego es sometida a un proceso de preparación que consiste en
romper o desfibrar las celdas de los tallos por medio de picadoras y desfibradoras;
posteriormente, unas bandas transportadoras la conducen al tándem de molinos,
donde se realiza el proceso de extracción de la sacarosa, consistente en exprimir y
lavar el colchón de bagazo. El lavado de este colchón se hace con el jugo extraído en
el molino siguiente y el lavado en el último molino se hace con agua caliente, que
facilita la desinfección y la extracción de la sacarosa en el bagazo.
El bagazo del último molino es usado como combustible en las calderas para generar
vapor o como materia prima en la elaboración de papel.
El jugo proveniente del primer molino se conoce como jugo de 1era extracción, jugo
24
crudo o jugo puro, puesto que proviene únicamente de la molienda de la caña, sin
agua o algún componente adicional. Puede considerarse como la corriente que aporta
mayor cantidad de sacarosa al jugo diluido y portador de la carga microbiana que
ingresa a la fábrica procedente de la materia prima de los molinos. Una vez sale el
bagazo del 1er molino es conducido al 2º molino, el cual realiza una segunda
extracción; luego pasa al 3er molino, de éste al 4º y así sucesivamente hasta el 6to
molino, donde finalmente el bagazo es llevado a las calderas. En dirección inversa,
es decir, del 6to molino al 2º, se aplica agua de maceración a altas temperaturas para
extraer la cantidad máxima de sacarosa posible del bagazo y el jugo así obtenido pasa
el 5to molino ayudando también al proceso de extracción en los molinos posteriores.
El jugo de 1era extracción y el de los molinos posteriores se reúne en el colador
donde se retira parte del bagacillo. Finalmente el jugo es conducido por tuberías
hacia los tanques báscula que descargan en el tanque de jugo mezclado donde se
alcaliniza para regular su acidez y evitar la destrucción de la sacarosa; luego pasa a
clarificadores continuos a altas temperaturas, donde se sedimentan las impurezas y el
jugo claro que sobrenada es extraído por la parte superior. Las impurezas
sedimentadas pasan a los filtros rotatorios al vacío que dejan pasar el jugo y retienen
la cachaza que es utilizada como abono. El jugo clarificado pasa a los evaporadores,
en donde se le extrae el 80% del contenido de agua hasta obtener el jarabe.
La cristalización de la sacarosa que contiene el jarabe se lleva a cabo en tachos al
vacío; los cristales de sacarosa se separan de la miel en las centrífugas. Las mieles
vuelven a los tachos para ser agotadas y finalmente son utilizadas como materia
prima en la producción de alcohol etílico en la destilería. El azúcar de primera calidad
retenido en las mallas de las centrífugas, se disuelve con agua caliente y recibe el
nombre de licor, el cual se envía a la refinería para continuar el proceso (Honig,
1959; Manuelita S.A, 2005).
25
2.1.2. Microorganismos en el proceso
Las condiciones favorables para el desarrollo de los microorganismos en las fábricas
están limitadas a un área particular: el ciclo de extracción, puesto que las altas
temperaturas y el bajo contenido de agua, característicos de la mayor parte del
proceso de fabricación, se consideran como las principales condiciones adversas para
una actividad microbiológica excesiva. La extracción comprende una operación de
molienda en la que se obtiene el jugo mixto de la caña o jugo crudo, cuyas
características físicas y químicas lo convierten en un excelente sustrato para el
desarrollo de una gran variedad de microorganismos (Cerutti de Guglielmone et al.,
2000; Honig, 1969).
Las etapas de operación posteriores a la extracción consisten en cierta forma de
tratamiento químico a alta temperatura (clarificación), seguido de sedimentación y
filtración, la concentración de jugo clarificado y la cristalización del producto
comercial. El número de microorganismos presente en cualquier punto desde el
clarificador hasta el azúcar bruto, es relativamente bajo en comparación con el jugo
de caña crudo (Antier, 1996; Hoing, 1969).
2.2 Pérdidas de sacarosa
En las fábricas de azúcar se presentan pérdidas que son definidas dependiendo del
esquema de operación, realizando balances que incluyen la cuantificación de la
sacarosa según las características físico-químicas de los jugos y productos
intermedios del proceso. Teniendo en cuenta las sacarosa que ingresa en la caña, la
sacarosa presente en el bagazo, en la melaza final, en los efluentes, y el azúcar final
obtenido, estos balances muestran un porcentaje de azúcar que se pierde en el proceso
y que se conoce como “pérdidas indeterminadas” (Broadfoot, 2001).
26
2.2.1 Características físico-químicas de los jugos
Las poblaciones microbiológicas que degradan la sacarosa y los azúcares reductores
presentes en el jugo determinan las características físico/químicas de los mismos e
influyen en el desarrollo posterior del proceso de extracción; por esta razón, los
subproductos metabólicos son tomados como indicadores indirectos de las pérdidas
de sacarosa en el proceso, aunque las pérdidas reales son mayores que las que se
pueden calcular con base en estos indicadores debido a que están influenciados por
factores ajenos a la actividad microbiana. (Duarte et al., 1982; Hernández, 1978).
2.2.1.1 Pureza
La relación de la lectura del polarímetro (Pol) con los ºbrix permite determinar la
pureza de una solución en términos de sacarosa.
2.2.1.1.1 Pol
Los azúcares diluidos gozan de la propiedad de desviar el plano de vibración de la luz
polarizada. Esta propiedad se utiliza en la industria azucarera para determinar la
riqueza de los jugos de caña mediante un aparato óptico llamado polarímetro, de
donde se deriva la expresión de POL; este aparato envía un rayo de luz polarizada a
través de una solución de sacarosa y mide la rotación de la luz después de pasar por el
líquido. Con el valor de rotación resultante se estima el % de sacarosa en el jugo
mediante fórmulas y tablas establecidas (Engelke, 2002).
2.2.1.1.2. Grados Brix
Los ºbrix determinan la concentración de sólidos disueltos en una solución de
sacarosa, basándose en una relación entre los índices refractivos a 20ºC y el % de
masa total de sólidos solubles de una solución acuosa de sacarosa pura (Laboratory
Manual for South African sugar factories, 1985).
27
2.2.1.2 Azúcares reductores
La sacarosa puede ser invertida por efecto enzimático o físico-químico en sus
azúcares reductores, glucosa y fructosa. Su poder reductor se debe al grupo carbonilo
que queda libre en su molécula. Este carácter reductor puede ponerse de manifiesto
mediante diversos métodos, entre los cuales el más utilizado en los Ingenios
Azucareros es el método de Eynon y Lane, en que se produce una reacción redox
entre los azúcares reductores y el sulfato de Cobre (II). Las soluciones de esta sal
tienen color azul y tras la reacción con el azúcar reductor se forma óxido de Cobre (I)
de color rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha producido la
reacción y que, por lo tanto, el azúcar reductor está presente (Laboratory Manual for
South African sugar factories, 1985).
Los azúcares reductores son el producto intermedio de la descomposición de la
sacarosa y son el índice más empleado para la detección de pérdidas en jugos; sin
embargo, estos azúcares son utilizados por la gran variedad de microorganismos
encontrados en los jugos como fuente de carbono para desarrollarse y generar otros
productos metabólicos como etanol, ácidos orgánicos y CO2. Por esta razón, algunos
autores sugieren la cuantificación de otros productos finales del metabolismo como el
ácido láctico, que son indicadores más precisos de pérdidas de sacarosa por actividad
microbiológica en el tándem de molinos, pero se hace necesario realizar estudios que
permitan tener criterios de selección entre los indicadores que muestren mayor
correlación con el metabolismo de los microorganismos (McMaster, 1990; Ravnö,
2001).
2.2.2 Pérdidas indeterminadas
En el lapso en que la caña va desde el campo hasta el ingenio, las pérdidas de
sacarosa por inversión de la molécula en sus azúcares reductores se dan por causas
físicas, químicas y microbiológicas.
28
Las causas físicas incluyen pérdidas directas debidas a las pobres técnicas de corte de
la caña, almacenamiento y o transporte, dispersión, pérdidas de sacarosa en aguas y
productos residuales y absorbentes (Clarke et al., 1996).
Las pérdidas influenciadas por la descomposición química incluyen la
descomposición térmica, la acidez del jugo y la presencia de la enzima invertasa
(Anónimo, 1993; Clarke et al., 1996). El jugo tiene una acidez natural que es
neutralizada pocos minutos después de la extracción, disminuyendo la incidencia de
este factor en la inversión de la molécula, y por lo general se mantiene a temperatura
ambiente durante le proceso de extracción, lo que indica que cuando estos factores se
mantienen en valores óptimos que aseguren una inversión mínima, el factor de mayor
incidencia está relacionado con la actividad enzimática (Anónimo, 1993).
La enzima invertasa (β -D fructofuranósido fructohidrolasa, E.C 3.2.1.26 ó β-
fructofuranosidasa) en el jugo de caña tiene 2 orígenes: la caña de azúcar y la
actividad microbiológica. La caña de azúcar sintetiza y cataboliza la sacarosa
mediante esta enzima para obtener la energía necesaria para sus funciones fisiológicas
y la producción enzimática varía de acuerdo a los requerimientos nutricionales y el
tiempo entre corte (cosecha) y molienda. La planta produce 2 tipos de enzima
diferentes: una es más activa bajo condiciones ácidas y está presente en células
inmaduras como las del cogollo, mientras que la otra es más activa en condiciones
normales y se encuentra en tejidos maduros; sin embargo, esta actividad enzimática
se da en pequeña proporción por lo cual las pérdidas atribuidas a este factor son poco
significativas (Pulido et al., 1977).
El deterioro microbiológico causa entonces la mayoría de las pérdidas por inversión,
disminuyendo la producción de azúcar blanco y aumentando la producción de
melazas; los microorganismos encuentran en la sacarosa un buen sustrato para su
crecimiento y excretan la enzima invertasa (Anónimo, 1993; Hollaus, 1978; Van der
Poel et al., 1998).
29
2.2.3 Contaminación microbiológica
Desde el momento que se corta la caña hasta que se clarifica el jugo extraído a altas
temperaturas, la sacarosa está expuesta a la acción enzimática de una multitud de
microorganismos que pueden provenir del suelo que se adhiere a tallos y hojas de la
caña o del aire contaminante, y que se ven favorecidos por factores como las
operaciones de quema, corte, condiciones de temperatura, humedad alta y tiempos
entre corte y molienda (Cerutti de Guglielmone et al., 2000; Van der Poel, 1998).
Cuando la caña entra en el molino, sus jugos circulan a través de los mismos y entran
en contacto con los microorganismos que se encuentran adheridos a las superficies de
concreto y metal; sin embargo, la presencia de éstos en cualquier azúcar particular o
producto intermedio de su fabricación, no significa necesariamente que se estén
produciendo cambios perjudiciales, ni tendrán significado desde el punto de vista
económico, a menos que factores del medio, como temperatura, agua, O2 y elementos
nutritivos sean favorables para el rápido crecimiento (Anónimo, 1993; Honig, 1969).
Entre estos microorganismos, que encuentran el medio ideal para su crecimiento en el
jugo de caña, se han identificado 3 grupos principales de bacterias: productoras de
exopolisacáridos, donde se encuentra Leuconostoc sp.; aerobios esporo-formadores,
como Bacillus sp., y aerobios no esporo-formadores, como Escherichia coli; las
levaduras son igualmente importantes , sobre todo las osmofílicas capaces de
desarrollarse en medios muy concentrados por su resistencia a elevadas presiones
osmóticas, como las mieles y el azúcar; también se encuentran, en menor proporción
ciertas especies de mohos (Duarte et al., 1982; Honig, 1969; Van der Poel, 1998).
Las principales especies identificadas en caña de azúcar y sus jugos son:
• Bacterias: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Bacillus
megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus sterereotermophilus, Leuconostoc
30
mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Escherichia coli, Enterobacter
aerógenes, Citrobacter freundii, Pseudomonas sp., Klebsiella sp.,
Corynebacterium sp., Micrococcus luteus, Staphilococcus fragilis y Clostridium
sp. En este grupo se destacan los bacilos que tienen la capacidad de formar
endosporas y sobrevivir cuando las condiciones del medio no son favorables, y
son importantes productores de levanos y otros heteropolisacáridos. Skole y
colaboradores en 1977, reconocieron 2 vías de degradación de sacarosa por
especies de Bacillus: forman levano y azúcares reductores o forman ácidos
(Honig, 1969; Hernández et al., 1978).
• Levaduras: Saccharomyces cereviseae, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces
pombe, Candida tropicalis, Candida mycoderma, C. Intermedia, Kloeckera
apiculata, Pichia membranofaciens, P. farinosa, Kluyvoromyces fragilis y
Hansenula anomala.
• Mohos: Penicillium citrovorus, Penicillium funiculosum, Aspergillus variatum,
Aspergillus niger, Trichoderma viride y Monilia sitophila. (Sais, 1977; Duarte et
al., 1982; Tallgren et al., 1999).
Este gran número de especies demuestra la diversidad de la microflora presente en los
jugos de caña; sin embargo, hay algunas especies que se desarrollan en el jugo con
más frecuencia que otras y que por lo tanto, adquieren una gran importancia
económica al consumir la sacarosa entrada en fábrica y formar exopolisacáridos.
Entre ellas encontramos especies de Leuconostoc mesenteroides y L. dextranicum, y
miembros de bacterias coliformes, tales como Enterobacter amnigenus, Rahnella sp.
o Enterobacter aerógenes, siendo la primera de mayor incidencia en los ingenios
azucareros, aunque la última se ha encontrado frecuentemente en estudios de
microflora asociados con la caña de azúcar (Duarte et al., 1982; Pulido et al., 1977;
Tallgren et al., 1999).
31
Otras especies notables debido a los productos a los que dan lugar hallados en los
azúcares son levaduras de la especie Sacharomyces sp., que produce etanol, y
Clostridium thermosaccharolyticum, productora de ácido butírico (Clarke et al.,
1996).
2.2.4 Determinación de pérdidas por contaminación microbiológica y sus
implicaciones
Los principales productos de la actividad microbiológica, además de la masa celular y
los polisacáridos, son los azúcares reductores como productos intermedios, el
manitol, ácidos orgánicos como el ácido láctico que sirve como indicador de la
pérdida de azúcar, ácido acético, etanol, nitrito, H2 y CO2, dependiendo de la
composición microbiana determinada por condiciones de diseño y operación de las
plantas, así como de ciertas propiedades de la materia prima; estos productos
metabólicos disminuyen el pH, producen componentes coloreados y permanecen en
el proceso afectando la calidad de subproductos posteriores teniendo todos ellos un
efecto “melazogénico”, es decir, que arrastran sacarosa con ellos a las melazas,
disminuyendo la cantidad de sacarosa recuperada (Honig, 1969; Van der Poel, 1998).
Numerosos estudios han intentado determinar las pérdidas de sacarosa por
microorganismos, estableciendo una relación entre la cantidad de ácidos producidos
y la cantidad de sacarosa degradada. Con una disminución de los valores de pH de
0.5 puntos, se calcula una pérdida de 0.10 - 0.13 % de sacarosa, teniendo en cuenta la
capacidad buffer del jugo en el caso de contaminación por Clostridium sp. y de 0.16 –
0.19 % en contaminación por Bacillus sp. (Hollaus, 1978). Sin embargo, teniendo en
cuenta que los ácidos no se producen únicamente de la degradación de sacarosa sino
también de azúcares reductores, las pérdidas podrían ser menores. Los azúcares
reductores constituyen el índice más empleado para la detección de las pérdidas en
los jugos, pues el incremento de la relación de éstos con los sólidos solubles significa
32
pérdidas por inversión microbiana (Duarte et al., 1982; Hollaus, 1978).
Los métodos para determinar actividad microbiológica pueden ser directos, mediante
análisis polarimétrico y cromatográfico de la sacarosa, o indirectos como el recuento
de microorganismos capaces de reproducirse generalmente en cultivos en placa en
diferentes medios con pH y temperatura variables, la formación de subproductos
metabólicos como el incremento de dextranas, ácidos y la formación de nitritos,
concentración de manitol y cambios en los valores de pH o potencial redox en los
jugos de caña; el objetivo principal de estas mediciones es monitorear las pérdidas de
azúcar (Duarte et al., 1982; Van der Poel, 1998; Appling et al., 1959; Eggleston,
2001).
2.2.5 Polisacáridos Bacterianos
Los polisacáridos en el jugo, especialmente de dextranos y levanos, afectan el
proceso de producción de azúcar bloqueando lo equipos
El primer reporte de producción de polisacáridos bacterianos en líquidos ricos en
azúcar por parte de microorganismos en forma de cocos data de 1861 y en 1878 se
sugirió especies de Leuconostoc sp. como el principal responsable de la producción
de polisacáridos en las fábricas de azúcar. El dextrano es el polisacárido más
estudiado y algunas investigaciones incluyen también el levano, ambos causantes de
problemas en la fabricación, pues generan pérdidas de sacarosa, obstruyen tuberías,
coladores y bombas, afectan la polarización de la sacarosa resultando en lecturas
falsas de pureza, aumentan la viscosidad de los licores causando una mala
cristalización, generan alargamiento de los cristales, reducen su crecimiento y
aumentan la formación de grano falso, y forman biopelículas que se convierten en
reservorio de gran diversidad de microorganismos que se agrupan en comunidades
sinérgicas. (Cuddihy et al.,1996; Honig, 1969; Hollaus, 1978; Trost et al., 2002;
33
Van der Poel, 1998). En menor proporción se producen también otros polisacáridos
compuestos de moléculas de glucosa, galactosa, fucosa y manosa como
monosacáridos estructurales (Tallgren et al., 1999).
2.2.5.1 Dextranos
“Dextrano” es el nombre genérico para los polisacáridos que son polímeros de
glucosa; químicamente, son polímeros homólogos de D-glucopiranosa (glucanos) y, a
pesar de que cada bacteria produce un único glucano, éstos contienen
predominantemente enlaces α 1,6 glucosídicos (>95%) con menor proporción de
enlaces α1,2, α 1,3 o α1,4. Se forman extracelularmente por la acción de la enzima
dextrano-sucrasa, una glucosiltransferasa que cataliza la transferencia de residuos
glucosídicos obtenidos de la hidrólisis de la sacarosa a un polímero de dextrano,
liberando D-fructosa. Esta es una enzima inducible por su propio sustrato, capaz de
catalizar la formación de muchos tipos de enlaces permitiendo la formación de
polímeros ramificados (Figura 1)(Dols et al., 1998).
Fig 1. Estructura del dextrano. Fuente: www.offer21.com/.../ 20050701152600855451.jpg
La estructura y propiedades del dextrano varían según el microorganismo, las
condiciones de cultivo, la concentración de sacarosa, pH, temperatura y aireación
(Cuddihy et al., 1996; Duarte et al., 1982; Trost et al., 2002). Son producidos por
34
bacterias ácido lácticas entre las que se encuentran Lactobacillus sp., Leuconostoc sp.
y Streptococcus sp., dentro de los cuales Leuconostoc mesenteroides y L.
dextranicum son los más conocidos; en este género se agrupan microorganismos
anaerobios facultativos que tienen su hábitat natural en el cañaveral y que, al
producirse cualquier fisura en la superficie externa de la caña, la invaden y se
reproducen rápidamente formando fácilmente polisacáridos bajo las condiciones de
temperatura (20°C - 40°C), pH (5 - 6) y concentración de sacarosa (10% - 15%)
encontrada en la caña de azúcar cosechada (Van der Poel, 1998; Zhennai, 2000).
2.2.5.2 Levanos
Los levanos son polifructosanos unidos por enlaces β (2,6) de alto peso molecular,
solubles en agua con rotación óptica negativa, formados por la acción de la enzima
levano-sacarasa que hidroliza la sacarosa y transfiere la D-fructosa a cadenas
crecientes de fructanos para formar levanos producidos por microorganismos como
Pseudomonas fluorecens, Corynebacterium beticola y especies de Bacillus sp. (B.
subtilis, B. mesentericus, B. vulgatus), entre otros. Son polímeros que se originan en
fábrica más que en campo, a diferencia de los dextranos que se originan en ambos
ambientes (Figura 2),(Honig, 1969; Tallgren, 1999; Zhennai, 2000).
Figura 2: Estructura del levano. Fuente: www.chem.qmul.ac.uk/.../ polygif/levan.gif
35
2.3 Control de la actividad microbiológica
La formación de polisacáridos es fácilmente encontrada en molinos de caña donde
se da poca atención a la limpieza, pues es este un factor fundamental para controlar
las pérdidas de azúcar en los tándem de molinos, que deben lavarse con vapor a
intervalos regulares y ser totalmente sanitizados cuando la molienda se detenga para
evitar la acumulación de bagazo que permita la proliferación de los microorganismos
(Van der Poel, 1998).
La limpieza frecuente y minuciosa del equipo de molienda permite reducir la fuente
de inóculo de microorganismos por medio de limpiezas con vapor, que ayuda a
controlar las poblaciones mientras está en contacto con ellos; sin embargo, el jugo
permanece desprotegido durante el proceso de molienda (Pulido et al., 1977). Por
esta razón, se han llevado a cabo numerosos estudios con el fin de encontrar
compuestos que puedan emplearse en ingenios azucareros y que posean actividad
bacteriostática o bactericida ante los grupos microbiológicos con mayor incidencia en
el proceso de extracción, teniendo en cuenta la relación costo-efectividad.
Chen y Rauh en 1996, encontraron el mayor potencial de recuperación de sacarosa
aplicando apropiadamente un programa de sanitización del molino utilizando
limpieza física y agentes biocidas como tratamiento preventivo a la pérdida de
sacarosa, que mejoran el proceso mediante la reducción de coloides y otros no
azúcares que pueden causar ineficiencias en el proceso de clarificación, evaporación
y calentamiento (Day et al., 1995; Van der Poel, 1998). En teoría, mediante la
implementación de un programa adecuado de limpieza y desinfección en el área de
molinos, es posible recuperar entre 1 y 8 Kg. de azúcar por tonelada de caña molida,
lo que significa que para niveles de molienda cercanos a 6000 Ton diarias, puede
representar una recuperación económica mínima (para 1 Kg. recuperado) de US
76.800 mensuales.
36
2.3.1 Agentes biocida
Los agentes biocidas aplicados en ingenios azucareros en el mundo deben cumplir
con 3 especificaciones:
- Estar aprobados por la normatividad vigente de regulación en alimentos.
- Ser relativamente económicos y de fácil aplicación
- No deben ser volátiles y funcionar a las temperaturas que se presenten en el proceso
(Ravnö, 2001).
La aplicación debe ser adaptada a las condiciones de la fábrica, para que tenga
impacto sobre los grupos de microorganismos que muestren tendencia a desarrollarse
en lugares específicos del proceso; para la aplicación de un agente biocida
económicamente viable es necesario determinar el punto más apropiado de aplicación
y la dosis más apropiada con el fin de optimizar la actividad (Antier, 1996; Hollaus,
1978), así como tener en cuenta la forma de aplicación, temperaturas del proceso y
diseño de la planta de extracción (Van der Poel et al., 1998).
El más clásico y probablemente el más efectivo de los agentes biocida que afectan la
actividad microbiológica es la formalina, aplicada en una solución de 30% a 50% con
metanol formando formaldehído. Este compuesto es el más simple de los aldehídos y
altamente reactivo ya que se combina fácilmente con compuestos orgánicos
reduciendo ciertos grupos básicos como los amino e imidazol de las enzimas y ácidos
nucleicos, esenciales para su actividad (Van der Poel et al., 1998; Rincón et al.,
1996). Sin embargo, su uso se ve limitado porque forma uniones irreversibles con
los aminoácidos presentes en el jugo, se evapora como metanol durante la
purificación del jugo y se precipita como formato en las melazas, aumentando la
proporción de no azúcares en las mismas. Además, se cree que la formalina gaseosa
tiene efecto carcinogénico (Van der Poel et al., 1998; Saye, 1993).
Un compuesto evaluado en la industria Tucumana (Provincia Argentina) es el
hipoclorito de calcio, aprovechando las propiedades del cloro utilizado como
37
sanitizante químico en la industria alimenticia (Cerutti et al., 1999). Se cree que el
cloro es capaz de producir reacciones letales en o cerca de la membrana celular
microbiana, causando mutaciones en las células vivas, remueve proteínas y altera la
permeabilidad de la cubierta de las esporas, ocasionando pérdidas de iones calcio,
ácido dipicolínico, RNA y DNA (Cerutti et al., 1999).
Entre otros compuestos utilizados en la industria azucarera se encuentran el dióxido
de azufre, compuestos de amonio cuaternario, sustancias catiónicas, tiocarbamatos,
anfóteros, iodóforos, glutaraldehido y peróxido de hidrógeno, sólo este último con
resultados similares a los obtenidos con formalina.
2.3.1.1 Busan 881 ® (Buckman Labs)
En 1957 en Cuba se introdujo un nuevo bactericida, Busan 881®, para reducir la
inversión de sacarosa en los jugos; luego se introdujo en grandes ingenios en los
Estados Unidos y más tarde se implementó en México, Perú y Brasil (Appling y
Ugarte, 1959). Es un bactericida de amplio espectro compuesto por
cianoditiocarbamato disodio y N-metilditiocarbamato de potasio, corrosivo a los ojos
y la piel por lo que debe manejarse con precaución (Anónimo, 1993).
En los ensayos realizados por Appling y Ugarte en agosto1959 en el ingenio de
Pucalá (Perú), aplicaron por gravedad 10ppm al jugo al salir del último molino y
5ppm al jugo mixto inicialmente, pero luego se aplicaron las 15ppm al jugo del
último molino. Las determinaciones de pureza y azúcares reductores en jugos
primarios y mixtos en muestras continuas durante la primera semana de tratamiento
presentaron un importante rendimiento del azúcar, disminución en la formación de
exopolisacáridos y compensación del costo del bactericida. La dosis recomendada de
aplicación se determina con base a las toneladas de caña molidas en el ingenio,
generalmente cercanas a 20ppm (base caña molida) (Anónimo, 1993).
38
2.3.1.2 Lipesa 106C® (Glutaraldehído)
El glutaraldehido (1,5-pentadial) ha sido empleado exitosamente como desinfectante
o agente esterilizante en aplicaciones industriales, clínicas y en agricultura (Anónimo,
1992). Las propiedades antimicrobianas de este compuesto están bien establecidas
por sus reacciones de oxidación, reducción y condensación; en condiciones normales,
el glutaraldehido reacciona con grupos amino y residuos de lisina de las proteínas,
haciendo un entrecruzamiento de las proteínas localizadas en la superficie de las
bacterias, desnaturalizándolas y ocasionando la muerte celular. Es un producto
estable a altas temperaturas y bajos pH, condiciones que fácilmente se pueden
encontrar en las fábricas de azúcar. Se ha utilizado en industrias azucareras de
remolacha a concentraciones de 250ppm de ingrediente activo, con base en las
toneladas de materia prima molidas por unidad de tiempo (Saye, 1993).
2.3.1.3 Nalco 5581® (Ditiocarbamato)
Los tiocarbamatos son compuestos pertenecientes al grupo de los organosulfurados,
soluble en agua y solventes polares, y su mecanismo de acción se basa en la
sustitución y/o copulación de grupos enzimáticos claves del metabolismo microbiano;
son considerados compuestos de baja toxicidad, bactericidas y fungicidas de amplio
espectro (Widmer et al., 1993 citado por Cerutti et al., 2000). El componente activo
de este biocida es el etileno ditiocarbamato de sodio (8%) y sus dosis pueden variar
de acuerdo a la severidad de la contaminación entre 10 y 30 ppm, aplicado en forma
continua y en lugares donde se homogenice fácilmente.
2.3.2 Beneficios en los subproductos
Las melazas obtenidas como subproductos del proceso de producción son un efluente
final de la preparación del azúcar que se ha cristalizado repetidamente y representan
una alternativa biotecnológica para la industria azucarera como materia prima en la
producción de alcohol mediante destilación. Para tal fin, debe reunir una serie de
39
requisitos microbiológicos y físico-químicos que permitirá un proceso eficiente de
fermentación por parte de las levaduras que se verán inhibidas por factores
perjudiciales como el contenido excesivo de ácido sulfuroso, los nitratos, los ácidos
volátiles, el color anormalmente oscuro, las materias coloidales y en suspensión y las
infecciones serias, factores que, en su mayoría, son consecuencia de malas
condiciones de higiene y limpieza durante el proceso de producción (Honig, 1969).
40
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN
Los análisis de rutina realizados al jugo de caña extraído en el Ingenio Manuelita
S.A. muestran aumento en las concentraciones de subproductos del metabolismo
microbiano como dextranas y porcentaje de azúcares reductores , caídas de pureza de
dos puntos o mayores y concentraciones altas de ácidos orgánicos, lo cual disminuye
la calidad de los subproductos del proceso de producción de azúcar. Esto indica que
se requieren medidas de sanitización más efectivas a las actualmente empleadas para
el control de la contaminación microbiológica presente en la fábrica.
Mediante la cuantificación y clasificación por tinción de Gram de los
microorganismos presentes en los jugos de caña se determinó qué tipo de
microorganismos se encuentran durante el proceso de molienda, qué factores tienen
mayor influencia en la variación sus poblaciones y se obtuvo la información necesaria
para establecer puntos en los que la limpieza debe ser más minuciosa y es necesario
utilizar agentes químicos para controlar las cargas bacterianas que implican pérdidas
económicas.
Finalmente, se obtuvieron criterios para tomar medidas de control de las poblaciones
de microorganismos detectadas, lo cual puede representar una disminución de las
pérdidas de azúcar asociadas a microorganismos y un mejoramiento de la calidad de
los subproductos del proceso de producción.
41
4. OBJETIVOS
4.1 General
Determinar las poblaciones microbiológicas presentes en el proceso de extracción de
jugos de caña de azúcar, y así establecer criterios reales que permitan tomar medidas
para controlar las pérdidas microbiológicas de sacarosa en el Ingenio Manuelita S.A.
4.2 Específicos
• Cuantificar la carga microbiológica con que ingresa la caña del campo al molino
en cuanto a: bacterias mesófilas, bacterias ácido-lácticas productoras de
exopolisacáridos, mohos, levaduras y bacterias termófilas aerobios esporuladas
mediante la evaluación de muestra directa de la caña (DAC).
• Determinar la variación de las poblaciones de microorganismos durante el
recorrido de los jugos de caña en diversos puntos del molino mediante muestreos
puntuales de los mismos.
• Realizar aislamientos de los microorganismos más frecuentemente encontrados en
los muestreos para obtener cultivos puros, describir las colonias y la clasificación
mediante tinción de Gram.
42
• Determinar parámetros físico-químicos de los jugos evaluados como son valores
de pH, concentración de dextranos (ppm) / ºbrix, % de azúcares reductores /ºbrix y %
de pureza de los jugos para establecer correlaciones con los resultados
microbiológicos.
• Focalizar los puntos críticos de acuerdo a las cargas microbiológicas encontradas
en los diferentes puntos de muestreo del proceso de extracción, para sugerir
procedimientos de limpieza y desinfección más minuciosos en estos sitios que
permitan controlar dichas cargas.
• Realizar pruebas en el laboratorio con agentes biocidas sobre las muestras de jugo
que permitan evaluar su eficiencia en el control de las cargas de microorganismos con
mayor incidencia en el proceso.
43
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Lugar de muestreo
Este estudio se realizó en el Ingenio Manuelita, ubicado al sur-occidente del país, en
jurisdicción del municipio de Palmira, en el departamento del Valle del Cauca (Km. 7
vía Palmira-Buga). La fábrica cuenta con 2 series de molinos agrupados en tándem; el
estudio se centra específicamente en el tándem N°2 compuesto por una serie de 6
molinos consecutivos, en donde el 1er molino aporta la mayor proporción de jugo,
mientras los 5 restantes continúan la extracción de jugo de la caña con adición de
agua de maceración a 70°C.
5.2. Población de estudio y muestra
Se tomaron 6 muestras en diferentes puntos del proceso de extracción (figuras 3 y 4).
Fig 3. Puntos de muestreo: Muestra 1, muestra directa de caña (DAC)
29
Fig 4. Puntos de muestreo en el proceso de extracción: Muestra 2, jugo de primera extracción; Muestra 3, 2º molino; muestra 4, 4ºmolino; muestra 5, jugo del colador; muestra 6, jugo diluido.
30
5.2.1 Análisis Directo de Caña (DAC)
La muestra de DAC se obtuvo en los patios de caña del ingenio donde un
muestreador mecánico tomó una muestra representativa de la caña que ingresa en
tracto-mulas o dumper; se llevó la muestra a un molino experimental previamente
desinfectado con hipoclorito de sodio al 2.6% (v/v) y lavado con agua. Después de
pasar suficiente caña por este molino, se tomó la muestra de jugo en un frasco de
polipropileno previamente esterilizado y se llevó a refrigeración hasta el momento del
análisis. En este punto se tomó la información de la caña muestreada: variedad, edad,
procedencia, sistema de cosecha, tiempo de permanencia, etc.
5.2.2 Jugo de primera extracción
Después de 5 min, contabilizados desde el momento en que la caña muestreada fue
colocada sobre la banda transportadora y entró a la molienda, se tomó la muestra de
jugo de la primera extracción en frascos de polipropileno previamente esterilizados
(Cerutti et al., 2000).
5.2.3 Jugo del 4º molino
El jugo del 4º molino es un punto intermedio que permitió determinar qué carga
microbiológica se aporta en los 3 últimos molinos. La muestra se tomó del jugo que
sale del 4º molino hacia el 3ero, en frascos plásticos estériles con un muestreador
diseñado para tal fin.
5.2.4 Jugo del 2º molino
31
En este punto se reúne todo el jugo obtenido de la extracción de los molinos
posteriores y permitió determinar qué carga aporta todo el tándem de molinos al jugo.
Se tomó a la salida del 2º molino, antes de pasar al tanque del colador, en frascos
plásticos previamente esterilizados mediante un muestreador diseñado para tal fin.
5.2.5 Jugo del colador
Este punto de muestreo se tomó en el tanque del colador en frascos plásticos
previamente esterilizados mediante un muestreador diseñado para tal fin.
5.2.6 Jugo diluido
En la descarga de la báscula al tanque de jugo mezclado se tomó el jugo diluido en
frascos plásticos previamente esterilizados con un muestreador diseñado para tal fin.
Esta muestra permitió determinar si las cargas se aumentaban en este trayecto en que
el jugo está en contacto con diferentes superficies.
En el muestreo se tuvieron en cuenta dos factores: el tamaño de la muestra y la
representatividad:
• Tamaño de Muestra: La muestra se tomó de manera puntual en cada uno de los
puntos definidos anteriormente, durante 40 días de muestreo para asegurar
normalidad en el análisis de los datos.
• Representatividad: Se puso atención especial en la representatividad de las
muestras obtenidas, teniendo en cuenta todos los factores que puedan afectar las
condiciones como la trazabilidad de la caña muestreada, el clima, la acumulación
de bagazo en los puntos de muestreo, los lavados, los paros de molienda, entre
otros, de tal manera que las evaluaciones son estadísticamente significativas.
32
5.3 Unidad de muestreo
250 ml de jugo de cada punto de muestreo.
5.4 Muestreos
El muestreo se realizó en las horas de la mañana, entre 8 y 9 a.m., salvo en los días
en que se presentaron irregularidades en el proceso de molienda en la fábrica; en esos
casos se tomaron las muestras en la tarde.
Para la toma de muestras, se utilizó un muestreador que consiste en un tubo largo con
un soporte de PVC en uno de sus extremos el cual rodea los frascos permitiendo el
intercambio de los mismos entre las muestras, sin estar en contacto directo con ellas;
de esta manera, se elimina la posibilidad de contaminación cruzada. Las muestras
tomadas en cada sitio se conservaron en refrigeración hasta su análisis. Se tomaron
muestras en los seis puntos del proceso de molienda: DAC, jugo de 1era extracción,
2º molino, 4º molino, jugo del colador y jugo diluido durante los meses de agosto a
diciembre de 2005.
5.5 Variables del estudio
• Población de bacterias mesófilas
• Población de bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos
• Población de levaduras
• Población de mohos
• Población de bacterias termófilas formadoras de esporas
33
• pH
• Determinación de pureza
• Determinación de dextranos (ppm)
• Determinación de % de azúcares reductores
• % de inhibición del bactericida según la fòrmula sugerida por González en 1993:
UFC/ml inicial – UFC/ml final x 100 Fórmula (1)
UFC/ml final
5.6 Variables respuesta y unidades de medida
• Carga microbiológica : UFC/ml
• pH
• Purezas: Diferencias de pureza entre los jugos
• Concentración de dextranas: Dext (ppm)
• Azúcares reductores: % Azúcares Red
• % de inhibición
5.7 Variables independientes a tener en cuenta (Características de la caña que
ingresa Tabla 1)
• Hora de muestreo
• Procedencia de la caña
• Temperatura de las muestras.
34
Tabla 1: Características de la caña que entró a la fábrica durante el estudio.
Variables
Tipo
Descripción
% en el estudio
Verde
Se refiere a la caña madura con todo su cuerpo foliar, que se corta sin ser quemada previamente.
37.5%
Tipo de caña
Quemada
Es la caña en la que se hace una quema controlada antes de la cosecha para eliminar el follaje y facilitar el corte posterior.
62.5%
Manual
Los corteros de caña realizan la cosecha con machete en la base del tallo y los organizan en hileras llamadas chorras; posteriormente, se carga a los vehículos de transporte con alzadoras mecánicas.
52.5%
Tipo de Cosecha
Mecánica
En la cosecha mecánica la caña es descogollada por las máquinas, cortada por la base y trozada en pedazos de 30 centímetros.
47.5%
CC 85-92 55.0% PR 61-63 17.5% CC 84-75 7.5% V 71-51 10.0% MZC 74-275 5.0% RD 75-11 2.5%
Variedades de caña evaluadas
Mezcla 2.5% Muestra directa de caña (DAC) 16.7% Jugo de 1ª extracción 16.7% Jugo del 2º molino 16.7% Jugo del 4º molino 16.7% Jugo del colador 16.7%
Puntos de muestreo
Jugo diluido 16.7%
35
Tipo de caña por punto
Se relacionaron todas las variables en caña verde y quemada por cada punto de muestreo.
Edad
Corresponde a la edad del cultivo. Actualmente, la caña se corta entre 12 a 14 meses de edad, dependiendo de la variedad. En estudio se presentó un rango de edad entre 10.4 y 16 meses de edad, con un promedio de 13.5.
Tiempo de
permanencia (TP)
Es el tiempo que permanece la caña en el campo, desde el momento en que se hace la cosecha, hasta que llega a la fábrica para ingresar a la molienda. En el estudio se determinó un rango de TP entre 1.8 y 104.5 horas, con un promedio de 28 h.
Porcentaje de materia extraña
(%ME)
La materia extraña es todo aquel material diferente a los tallos de caña que ingresan a la molienda, entre los que se encuentran los residuos verdes como cogollos, porciones de caña, hojas verdes y secas, y terrones de suelo. En el estudio se presentó un rango entre 0 y 15.6% de ME, con un promedio de 6.4%.
*El “% en el estudio” corresponde al % en que se presentó cada característica en las muestras tomadas
para el estudio.
Fuente: Manuelita S.A; CENICAÑA.
5.8 Métodos
5.8.1 Recuento de microorganismos
5.8.1.1 Mesófilos
Las muestras se diluyeron en agua peptonada al 0.1% (p/v) en diluciones seriadas
base 10 hasta 106; se sembraron 0.1ml de las dos últimas diluciones por duplicado
en la superficie de agar nutritivo solidificado (Anexo 5) y se incubaron las placas
invertidas a 37°C durante 24 a 48 h después de las cuales se hicieron los recuentos
(Duarte, 1982; Cerutti, 2000).
36
5.8.1.2 Bacterias ácido lácticas productoras de exopolisacáridos (BALPE)
Las muestras se diluyeron en agua peptonada al 0.1% (p/v), haciendo diluciones
seriadas base 10 hasta 105; se sembraron 0.1ml de las dos últimas diluciones por
duplicado en la superficie de agar Man Rogosa Sharpe (MRS) adicionado con 20% de
sacarosa previamente solidificado (Anexo 5) y se incubaron las placas invertidas a
37°C durante 24 a 48 h. Posteriormente se realizaron los recuentos (Cerutti et al.,
2000).
5.8.1.3 Mohos y levaduras
Las muestras se diluyeron en agua peptonada al 0.1% (p/v), haciendo diluciones
seriadas base 10 hasta 105; se sembraron 0.1ml de las dos últimas diluciones por
duplicado en la superficie de agar extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YGC)
previamente solidificado (Anexo 5) y se incubaron las placas invertidas a 30°C por 3
a 4 días. Posteriormente se hicieron los recuentos (Duarte, 1982; Cerutti et al., 2000).
5.8.1.4 Bacterias aerobias termófilas esporuladas
Se tomaron 50ml de la muestra y 50ml de agua estéril a pH 7, para un volumen final
de 100ml. Mediante choque térmico se activaron las esporas de bacterias aerobias
termófilas formadoras de esporas, llevando la dilución anterior a ebullición durante
cinco minutos luego de los cuales, se completó el volumen restante de diluyente que
se evaporó y se sembró por duplicado 0.1ml en la superficie del medio de cultivo
glucosa-peptona de caseína (Anexo 5); se incubaron las placas invertidas a 55°C
durante 24 - 48h después de las cuales se realizaron los recuentos (Duarte, 1982;
Hoing, 1969).
5.8.2 Aislamiento y clasificación de microorganismos
A partir de las placas empleadas para recuento se aislaron las colonias más
37
frecuentemente encontradas, tomando un inóculo con asa estéril y trazando varias
líneas rectas sobre el medio respectivo solidificado. Posteriormente se realizó
coloración por tinción de Gram, para hacer la clasificación de las bacterias aisladas, y
coloración con azul de lactofenol para observar las estructuras de hongos
filamentosos y levaduras (Duarte, 1982).
5.8.3 Análisis físico-químico
5.8.3.1 pH
Se midieron aproximadamente 80ml de la muestra en un vaso, dejando enfriar a
temperatura ambiente (dependiendo de la muestra); se esperó lectura estable del
Peachímetro Fischer de electrodo combinado (Procedimiento muestreo y análisis de
jugos pspcca 16, Manuelita S.A. 2003).
5.8.3.2 Temperatura (°C)
Se determinó la temperatura del jugo en el momento del muestreo mediante
termómetro.
5.8.3.3 % de Pureza
Determinación de grados brix y POL mediante métodos estandarizados en laboratorio
central.
5.8.3.3.1 Determinación de grados brix
Se midieron 100ml de la muestra, se agregaron 4g de tierra de infusoria (supercell).
Se filtró, desechando los primeros ml del filtrado; se realizó la lectura de dos gotas de
la muestra filtrada en el refractómetro y se registró el valor de los °brix
(Procedimiento muestreo y análisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A. 2003).
5.8.3.3.2 Análisis de POL (Sacarosa aparente)
38
Se midieron 150 ml de la muestra mezclando bien con 0.5g de cal apagada. Se
adicionó un gramo de sulfato de aluminio y potasio (alumbre); se agregaron 5g de
supercell, se filtró desechando los primeros ml de filtrado. Se cuadró el tubo del
polarímetro a cero por ambos lados con agua destilada y luego se puso un poco de
muestra filtrada a analizar. Luego se llenó el tubo con la muestra para lectura de la
polarización en el sacarímetro. Se determinaron los valores de sacarosa según los
valores de Brix y Polarización obtenidos utilizando las tablas de “Expansión de
Schmitz”. Finalmente, la pureza se calculó mediante la siguiente fòrmula:
P = % sacarosa x 100 Fòrmula (2)
° Brix refractométrico
(Procedimiento muestreo y análisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A., 2003)
5.8.3.4 Determinación de azúcares reductores: Método de Eynon y Lane.
Para determinar el porcentaje de reductores en las muestras se transfirieron 50 ml de
la muestra sin bagacillo a una bureta. Aparte, se transfirieron 5ml de Fehling A y 5ml
de Fehling B a un erlenmeyer, agregando 15ml de agua destilada y 5ml de la muestra
y se mezcló. Se colocó el erlenmeyer sobre la plancha agitadora calentando hasta
ebullición y agitando suavemente; se mantuvo la ebullición durante 2min; luego se
agregaron 4 gotas de azul de metileno a la solución que tomó este color. Se colocó la
bureta que contenía le muestra a 2cm de la boca del erlenmeyer y, mientras la
solución estuvo en ebullición se añadió el jugo a la bureta gota a gota hasta que la
coloración azul desapareció y tomó un color rojo ladrillo. Se repitió la titulación
agregando 1 ml menos de la muestra gastada en la titulación anterior, verificando que
no se gastara en la titulación más de 1ml de jugo antes de que cambiara el color del
indicador. Se determinó el % de reductores con la tabla Nº 9 “Sustancias Reductoras
en jugo por el método rápido de Lane y Eynon” con el volumen gastado de titulación.
(Procedimiento muestreo y análisis de jugos pspcca 16, Manuelita S.A., 2003).
39
5.8.3.5 Determinación de dextranos: Método de Roberts (Precipitación con
alcohol y Lectura en Espectrofotómetro a 720nm)
Se tomaron 15 ml de la muestra en un balón aforado de 100ml; se tomaron 20 ml de
la dilución anterior y 20 ml de solución patrón (agua destilada). Se agregaron 0.5g de
supercell y 4ml de ácido tricloroacético; se puso a filtrar la muestra en filtro No.1
eliminando las primeras gotas de filtrado. Se tomaron 10 ml de la muestra filtrada
mezclada con 10 ml de alcohol al 95%. Se dejó en reposo durante 20 min., luego de
los cuales se realizó la lectura en espectrofotómetro a 720nm, llevado a cero
previamente con la solución patrón preparada con agua destilada. Finalmente se
aplicó la siguiente fòrmula:
1179.77 x Abs x 6.67 = Dextranas (ppm) Fórmula (3)
(Procedimiento muestreo y análisis de jugos pspcca 25, Manuelita S.A., 2003).
5.8.4 Evaluación de los bactericidas
De acuerdo a los resultados obtenidos en los recuentos de microorganismos en los
puntos de muestreo, se hizo un ensayo en el laboratorio para determinar la eficiencia
de diferentes bactericidas sobre las poblaciones microbiológicas presentes en las
muestras de jugo de la primera extracción, por presentar éstas una alta carga
microbiológica procedente de la materia prima que ingresa a la fábrica. Para este
experimento se tomaron 1000 ml de muestra puntual del jugo; se aplicaron los
agentes biocida en 3 concentraciones: la recomendada por el proveedor, una menor y
una mayor, y se establecieron tiempos de contacto de 5, 10 y 15 min., teniendo en
cuenta el tiempo máximo que puede durar el recorrido del jugo en el proceso de
extracción antes de entrar al proceso de clarificación a temperaturas elevadas,
establecido mediante la rutina de muestreo empleada en el estudio (Tabla 2) (Cerutti
et al., 2000). Las muestras se mantuvieron en agitación durante todo el ensayo
40
buscando simular las condiciones de aplicación en el molino.
Tabla 2: Bactericidas evaluados, sus concentraciones y los tiempos de contacto
Agentes biocida Volumen de jugo
evaluado (ml)
Concentración
(ppm)
Tiempos de
Contacto (min.)*
Busan 881 ® 100 5, 10, 20 5, 10, 15
Lipesa 106C® 100 5, 10, 20 5, 10, 15
Nalco 5581® 100 10, 20, 30 5, 10, 15
Testigo sin biocida 100 Jugo puro 5, 10, 15
* Tiempo después del cual se realizaron las siembras.
Después de cumplido el tiempo de contacto, cada muestra se diluyó con agua
peptonada estéril al 0.1% hasta 10-6 y se sembraron 0.1ml de cada una de las dos
últimas diluciones en agar nutritivo para mesófilos, 0.1ml en agar MRS para bacterias
ácido lácticas productoras de exopolisacárido, 0.1ml en agar YGC para hongos y
levaduras y 0.1ml en agar glucosa-peptona de caseína para termófilos. Cada siembra
se realizó por duplicado.
Finalmente, se compararon los recuentos obtenidos en los diferentes tratamientos y se
evaluó el tiempo de acción y la concentración de cada compuesto de acuerdo al
porcentaje de inhibición obtenido (Cerutti et al., 2000).
5.9 Recolección de la Información
Se recolectó la información de acuerdo a las lecturas de las muestras analizadas que
se registraron en el formato que se presenta en el anexo 1.
41
5.10 Análisis de la Información
El estudio se clasifica como un estudio observacional dentro de las condiciones
normales de funcionamiento del ingenio Manuelita S.A.
Los datos de sólidos solubles (ºBrix) del DAC se utilizaron como referencia para
establecer un factor de dilución en los siguientes puntos y aplicar este factor en la
corrección en las poblaciones de microorganismos mediante una relación entre cada
punto de muestreo y la muestra directa de caña:
ºBrix Dac/ºBrix 1era Ext
ºBrix Dac/ºBrix 2º molino
ºBrix Dac/ºBrix 4º molino
ºBrix Dac/ºBrix Colador
ºBrix Dac/ºBrix diluido
Los datos de se sometieron a un análisis de varianza utilizando dos modelos lineales
con el programa estadístico SAS, teniendo en cuenta el 10% de significancia.
Para determinar el efecto de las características de la caña sobre las poblaciones
microbiológicas y los parámetros físico-químicos del jugo de DAC, se aplicó el
siguiente modelo lineal:
Yi : µ + Var + Tcaña + edad + % ME + TP + Error Fórmula (4)
Para la evaluación de los jugos en la fábrica, el modelo lineal aplicado fue:
Yi : µ + pto de muestreo + Error Fórmula (5)
Donde:
Yi: Variable a evaluar
42
Var: Variedad de caña
Tcaña: Tipo de caña
%ME: % de materia extraña
TP: Tiempo de permanencia de la caña en el campo.
Pto de muestreo: Punto de muestreo
Error: factores no considerados o no previsibles.
Adicionalmente, se hizo análisis de correlación para detectar posibles relaciones entre
las diferentes variables en cada uno de los puntos de muestreo.
43
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Población de microorganismos
Los microorganismos mesófilos, es decir, aquellos cuya temperatura óptima está
entre los 25°C y 40°C, representaron el grupo microbiano más abundante en el
proceso, seguido de la población de bacterias ácido-lácticas productoras de
exopolisacáridos, las levaduras, los mohos y por último la población de bacterias
termófilas (ver anexo 2).
6.2 Análisis físico-químico
La determinación de las características físico-químicas de los jugos permitió
establecer un factor de corrección para las poblaciones microbiológicas con respecto
a los ºbrix de la muestra de DAC. Los factores aplicados para los recuentos en cada
punto de muestreo fueron: 1.03 para el jugo de la 1era extracción, 2.3 para el jugo
del 2º molino, 5.2 para el jugo del 4º molino, 1.5 para el jugo del colador y 1.5 para el
jugo diluido.
La pureza se determinó aplicando la fórmula (2) a las lecturas de % de sacarosa y
°brix, y los dextranos aplicando la fórmula (3) a la absorbancia de la muestra
determinada mediante el espectrofotómetro (método de Roberts). Se comparó el
comportamiento de parámetros como las caídas de pureza, el incremento de los
azúcares reductores, el incremento en la concentración de dextranos y la disminución
en el % de sacarosa, con relación a las poblaciones corregidas (ver anexo 2).
44
6.2.1 Temperatura y pH
La tabla 3 muestra la temperatura y valores de pH evaluados en cada punto de
muestreo.
La temperatura encontrada en las muestras de DAC, 1era Ext., 2º molino, jugo del
colador y jugo diluido son ideales para el desarrollo de microorganismos sacarolíticos
y no sacarolíticos; el jugo del 4º molino es menos susceptible a esta flora al presentar
una temperatura más elevada como consecuencia del agua de maceración aplicada al
sexto molino. No obstante, si se encuentran bacterias esporuladas, éstas pueden
permanecer latentes hasta el momento en que encuentren las condiciones para su
desarrollo; en este caso, al no existir un choque térmico fuerte, se da lugar a la
germinación de las esporas y, en consecuencia, la aparición de células vegetativas que
encuentran en el jugo del colador y diluido temperaturas adecuadas para
desarrollarse, aumentando la población microbiana si el tiempo de retención es alto.
Tabla 3. Promedios de temperatura y pH en cada punto de muestro
Punto de Muestreo Temp. (Cº) pH
DAC 25 + /-1.43 5.4 + /- 0.2
1era Ext. 25 + /-1.55 5.4 + / - 0.2
2° molino 42 + /- 4.14 5.7 + /- 0.3
4° molino 54 + /- 6.62 5.6 + /- 0.3
Colador 35 + /- 2.88 5.4 + /-0.2
Diluido 34 + /- 4.71 5.4 + /- 0.2
En el rango mesofílico encuentran su temperatura óptima de crecimiento muchas de
las bacterias con capacidad de producir exopolisacáridos a partir de la sacarosa, entre
ellas Leuconostoc sp. y otras bacterias ácido-lácticas como Lactobacillus sp. y
Lactococcus sp. Hernández y colaboradores (1979) determinaron la temperatura
óptima de desarrollo de Leuconostoc mesenteroides en jugos de caña entre 27º y
45
37ºC; normalmente estos microorganismos son eliminados en etapas posteriores del
proceso cuando se alcanzan altas temperaturas, pero sus subproductos metabólicos
permanecen en los jugos causando problemas posteriores. (Antier, 1996; Cerutti de
Guglielmone, 1999; Cuddihy et al, 2001; Hoing, 1969).
En cuanto al pH, para cada especie microbiana existe un valor máximo y uno mínimo
pero, en general, las bacterias encuentran un valor óptimo alrededor de 5.0 a 6.5;
para las bacterias ácido lácticas, el pH ideal está entre 5.0 y 5.5, valores fácilmente
encontrados en el jugo de la caña como lo muestra la tabla 3, donde se observa la
poca variación de los valores entre los diferentes puntos.
Según los valores de temperatura y pH encontrados en el estudio, la mayor parte del
proceso de extracción favorece el metabolismo de la sacarosa por parte de los
microorganismos pues, normalmente, los jugos no alcanzan temperaturas ni valores
de pH capaces de inhibir la actividad microbiológica y el movimiento constante del
jugo en las caídas del molino a tanques y canales permiten la aireación del mismo, lo
que favorece la proliferación de los microorganismos. Resultados similares son
reportados por Sais et al., 1979, Hollaus, 1978 y Romani et al., 1991.
6.3 Variables de respuesta
6.3.1 Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones
microbiológicas y los parámetros físico-químicos en la muestra de DAC.
La diferencia entre los valores encontrados en los jugos tomados de los puntos de
muestreo elegidos, indica que existe una gran variedad de factores que inciden sobre
los mismos. A algunas de las variables analizadas se les aplicó una transformación
46
logarítmica para el análisis de varianza debido al alto coeficiente de variación inicial;
se aplicó el modelo lineal planteado en la fórmula (4).
Como lo señala Antier (1996) y Cerutti de Guglielmone y colaboradores (2000), la
variabilidad de los datos se debe a los numerosos factores que inciden en la calidad de
la caña que entra a la fábrica. Por esta razón, para evaluar la influencia de las
características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas y los parámetros
físico-químicos del jugo, se realizó un análisis de varianza entre los datos obtenidos
en la muestra de DAC y los datos de trazabilidad de la caña a partir de la cual se tomó
la muestra. La tabla 4 muestra las significancias obtenidas.
6.3.1.1 Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones
microbiológicas en la muestra de DAC.
Cuando se tomaron muestras de cosecha manual, el tipo de caña (verde o quemada)
influyó significativamente sobre la población de mesófilos; se observó el mismo
efecto sobre la población de BALPE cuando la cosecha había sido mecánica e,
independientemente de la cosecha, el tipo de caña influyó significativamente sobre la
población de levaduras.
El test de Tukey que muestra la tabla 5, donde se comparan los valores medios de las
poblaciones en cada tipo de cosecha (cosecha manual o mecánica) con tipo de caña
(verde o quemada), muestra poblaciones mayores de mesófilos, BALPE y levaduras
cuando la caña fué cosechada en verde, puesto que este tipo de caña llega a la
molienda con todo el cuerpo foliar y las partículas de suelo; esta característica la
convierte en la fuente más directa de contaminación con microorganismos, pues la
flora epífita de la caña entra a formar parte de la flora en el proceso de extracción
(figura 5) como lo reportan Van der Poel et al., (1998), Hernández (1978) y Cerutti
de Guglielmone (1999).
47
Así mismo, el tiempo de permanencia de la caña en campo (TP) cuando la cosecha es
manual, mostró influencia significativa sobre las poblaciones de mesófilos, BALPE y
levaduras (tabla 4), pues cuando se corta la caña se generan tejidos expuestos
fácilmente accesibles para los microorganismos presentes en todas las superficies
con las que ésta entra en contacto, desde que es recogida del suelo hasta que llega a
la fábrica. Estos microorganismos encuentran las condiciones óptimas para
desarrollarse en las chorras en que se organiza la caña antes del alce, pues la
temperatura del medio, las condiciones de humedad y la concentración de O2
favorecen su proliferación. Resultados similares reportaron Mora (1995) y Duarte y
colaboradores (1982) quienes encontraron una marcada incidencia del tiempo de
permanencia sobre las poblaciones microbiológicas.
Por el contrario, el tiempo de permanencia (TP) no mostró incidencia sobre las
poblaciones en caña cosechada mecánicamente (tabla 4) ya que, en este tipo de
cosecha, la caña permanece menos tiempo en el campo disminuyendo la influencia de
este factor. La figura 6 muestra las tendencias de la relación entre el tiempo de
permanencia y las poblaciones de microorganismos; se observó incremento de las
poblaciones después de 30 horas, y un incremento importante después de 70 horas de
tiempo de permanencia de la caña en el campo.
48
Tabla 4: Influencia de las características de la caña sobre las poblaciones microbiológicas y los parámetros físico-químicos en la muestra de DAC. Análisis estadístico (SAS) (10% de significancia). n= 40
Factores
Mesófilos
BALPE
Levaduras
Mohos
Bacterias termófilas aerobias
Tipo de Cosecha
Man
Mec
Man
Mec
Man
Mec
Man
Mec
Man
Mec
Variedad NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS Tipo de Caña S NS NS S S S NS NS NS NS
Edad NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS TP S NS S NS S NS NS NS NS NS
%ME S NS S NS S NS NS NS NS NS
Factores ºBrix %Sacarosa %Pureza Dextranos (ppm)
%Azúcares reductores
Tipo de Cosecha
Man
Mec
Man
Mec
Man
Mec
Man
Mec
Man
Mec
Variedad NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS Tipo de Caña NS NS NS NS NS NS S NS NS NS
Edad NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS TP NS NS NS NS NS NS S NS NS NS
%ME NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS TP: tiempo de permanencia; %ME: % de materia extraña; Man: cosecha manual; Mec: cosecha mecánica; S: significativo; NS: no significativo; BALPE: bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos.
49
Tabla 5: Test de Tukey. Comparación de los valores medios de poblaciones microbiológicas y características físico-químicas de la muestra de DAC, por tipo de caña y tipo de cosecha, y sus diferencias. n = 40.
oblaciones microbiológicas Log UFC/ml
Cosecha manual Cosecha Mecánica Grupos
microbianos Verde Quemada Verde Quemada
Mesófilos 7.79ª 7.48ª 7.39 7.19
BALPE 5.28 4.92 5.45ª 4.99ª
Levaduras 5.90ª 5.15ª 5.54ª 5.18ª
Mohos 3.83 3.30 3.58 3.30
Bact. termófilas aerobias 2.30 1.62 2.20 2.24
Cosecha manual Cosecha
Mecánica Características
físico-químicas Verde Quemada Verde Quemada
ºBrix 21.10 20.07 19.88 19.83
%Sacarosa 19.11 18.11 18.04 17.86
Pureza 90.57 90.07 90.71 90.02
Dextranos (ppm) 51.00ª 72.76ª 75.69 86.62
% Azúcares reductores 0.54 0.61 0.40 0.58
ª : Valores con diferencias significativas BALPE: Bacteria ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos.
50
a)
b)
Figura 5. Diferencias entre las poblaciones microbiológicas de acuerdo al tipo de caña:
a) Cosecha manual; b) Cosecha mecánica.
Cosecha manual
0123456789
Mesóf ilos Levaduras
Tipo de caña
Log
UFC
/ml
Caña larga verde Caña larga quemada
Cosecha mecánica
4,74,84,9
55,15,25,35,45,55,6
BALPE Levaduras
Tipo de caña
Log
UFC
/ml
Caña picada verde Caña picada quem ada
51
Figura 6. Tendencias de las poblaciones microbiológicas de acuerdo al incremento de los tiempos de permanencia de la caña en campo en caña larga (cosecha manual).
En el estudio se encontró que el porcentaje de materia extraña es otro factor que
incide significativamente en las poblaciones de mesófilos, cuando la cosecha ha sido
manual, pues todos los residuos del corte como son, cogollos, hojas secas y verdes y
terrones de suelo, aportan microorganismos al jugo, constituyendo una fuente
importante de contaminación, tal como lo reportaron McMaster en 1980 y Clarke en
1996. Este factor también influyó sobre las poblaciones de BALPE y levaduras,
aunque la tendencia no se observa claramente, pues no se presentaron incrementos
importantes en la medida que el % de materia extraña aumentó (figura 7). El menor
porcentaje de materia extraña correspondió a caña que había sido quemada, y esta
característica pudo disminuir la población de mesófilos que son altamente sensibles a
las altas temperaturas, dando paso a la proliferación de BALPE y levaduras, razón por
la cual el comportamiento observado es coherente en la relación de éste factor con
dichas poblaciones.
4 4,5
5 5,5
6 6,5
7 7,5
8 8,5
9
10-30 30-50 50-70 70-90 90-110 tiempos de permanencia (h)
Mesófilos BALPE Levaduras
Log UFC/ml
52
La figura 7 muestra las tendencias de las poblaciones de mesófilos, BALPE y
levaduras en relación al % de materia extraña en la caña larga que ingresa a la
fábrica; en el estudio se encontró que, a partir del 2%, las poblaciones tienden a
incrementarse.
Figura 7. Influencia del % de materia extraña sobre las poblaciones de microorganismos en caña larga (cosecha manual).
La población de mohos evaluada en el estudio no mostró una relación estadística
significativa con las características evaluadas en la caña; sin embargo, se presentaron
poblaciones mayores cuando la cosecha se realizó en verde (tabla 5), pues la alta
temperatura que se alcanza en la quema de los tallos pudo disminuir las poblaciones
que porta la caña y el suelo que la rodea, teniendo en cuenta que los hongos son el
grupo de microorganismos más sensible a la temperatura.
Asi mismo, la población de bacterias termófilas y los parámetros físico-químicos
como los valores de sólidos solubles (ºbrix), % de sacarosa, pureza y % de azúcares
reductores, no se vieron afectados por las características de la caña evaluadas en el
estudio.
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
0-1 1-2 2-3 3-4
% de Materia extraña
Log UFC/ml
Mesófilos BALPE Levaduras
53
Factores como la edad y la variedad de la caña no mostraron influencia sobre la
microflora presente en el jugo.
6.3.1.2 Influencia de las características de la caña sobre los parámetros físico-
químicos en la muestra de DAC.
La concentración de dextranos en el jugo de DAC mostró relación con el tiempo de
permanencia cuando se realizó corte manual de la caña, y concentraciones mayores
cuando la caña fue quemada para la cosecha (significancia con el tipo de caña, tabla
4). Estudios realizados en Australia, indican que especies de Leuconostoc sp.
colonizan rápidamente después del corte de la caña, penetran hasta 7.5cm en 10 min.
desde el punto de corte hasta el interior y producen dextrano en el tiempo que
transcurre entre la quema de la caña y su cosecha (Purchase, 2001; Morel du Boil,
2000; McMaster et al., 1980); en consecuencia, es posible que en este lapso se
sinteticen polisacáridos bacterianos (figura 8).
Holland (1990) y Landon et al. (2002) encontraron la mayor concentración de
dextranos en la caña quemada, como se observó en el presente estudio, pues el calor
elimina de la superficie la capa de cera protectora, causa hendiduras en la corteza y
daña el tejido de almacenamiento debajo de esta donde se encuentran las saponinas
responsables de la defensa contra agentes fitopatógenos; en consecuencia, los tejidos
quedan más expuestos y por tanto, más susceptibles a degradación microbiológica
especialmente por bacterias presentes en el suelo y la materia extraña capaces de
producir exopolisacáridos a partir de la sacarosa, como las pertenecientes al género
Leuconostoc sp., y Bacillus sp.
En el corte mecánico, aunque no se presentaron diferencias significativas, la
concentración de dextranos fue mayor en comparación con el corte manual, pues al
dividir los tallos en trozos de 10 a 30 cm. se genera un incremento en el área
54
disponible para la proliferación bacteriana y por ende para la degradación de la
sacarosa (tabla 5).
a)
b)
Figura 8. En caña cosechada manualmente: a) Influencia del tipo de caña sobre la concentración de dextranos b) Influencia del tiempo de permanencia sobre la concentración de dextranos.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Caña larga verde Caña larga quemada
Tipo de caña
Dex
tran
os (p
pm)
Promedio Dextranos
54 56 58 60 62 64 66 68
10-30 30-50 50-70 70-90 90-110Tiempo de permanencia (h)
Dextranas
Dextranos (ppm)
55
Para los demás parámetros físico-químicos del jugo no se encontró significancia con
las características de la caña (tablas 4 y 5); esto pudo deberse a que la heterogeneidad
en la procedencia de la caña y la variabilidad de factores como el % de materia
extraña y el tiempo de permanencia, generaron otras condiciones, como el incremento
de la población de BALPE y de la concentración de dextranos, por ejemplo,
afectando los resultados de estas mediciones.
6.3.2 Poblaciones microbiológicas y su correlación con las características físico-
químicas en los puntos de muestreo
Se realizó una cuantificación de la población de mesófilos, BALPE, levaduras,
mohos y bacterias termófilas, correlacionando las poblaciones con las características
físico-químicas de los jugos, y diferenciando mediante tinción de Gram las colonias
más frecuentemente encontradas. Se consideraron correlaciones significativas
aquellas con valores menores a 0.1 (10% de significancia), diferenciando los valores
positivos como correlación directa, en que ambas variables aumentan o disminuyen al
mismo tiempo, y los valores negativos como correlación inversa.
6.3.2.1 Cuantificación de las poblaciones de mesófilos, BALPE, levaduras, mohos
y bacterias termófilas aerobias.
La población microbiológica más alta encontrada en el estudio en los diferentes
puntos de muestreo correspondió a microorganismos mesófilos (figura 9), que
ingresan a la fábrica con una población cercana a 107 UFC/ml, determinada en la
muestra de DAC; en este punto no se observó correlación de esta población con los
parámetros físico-químicos evaluados (tabla 6).
El análisis estadístico mostró incremento de la población en la 1era extracción, punto
en el cual se presentó la mayor densidad de microorganismos mesófilos; sin embargo,
no se encontró correlación significativa entre esta población y los ° brix, % de
56
sacarosa, pureza, % de azucares reductores y concentración de dextranos de la
muestra de jugo en este punto (tabla 6).
Figura 9: Promedio de poblaciones microbiológicas por punto de muestreo. n = 40
Estos incrementos de la contaminación microbiana están relacionados con los
cúmulos de bagacillo que se observan en varios puntos del molino, especialmente en
la 1era Ext., lo cual también fue reportado por Duarte y colaboradores en 1982.
En la muestra del segundo molino la población fue menor y se presentó correlación
significativa directa entre los mesòfilos y los °brix, y entre esta población y el % de
sacarosa, lo cual es un comportamiento lógico, pues al haber más sacarosa los
microorganismos tiene su fuente de carbono y el incremento de la población y los
subproductos del metabolismo resultan en un aumento de los °brix.
El jugo del 4º molino mostró la población más baja de los puntos evaluados, debido a
la alta temperatura que alcanza el jugo en este punto y al bajo contenido de sacarosa
del mismo.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Dac 1era Ext 2do m olino 4to m olino Colador Diluido
Log
UFC
/ml
Mesófilos BALPE Levaduras Mohos Termófilas Aerobias
57
Tabla 6. Correlaciones entre las poblaciones microbiológicas y las características físico-químicas de los jugos en cada punto de muestreo.
MESÓFILOS Características físico-químicas DAC 1era Ext 2° molino 4° molino Colador Diluido °Brix NS NS NS S (+) NS NS % Sacarosa NS NS NS S (+) NS NS Pureza NS NS NS NS NS NS %Azúcares reductores NS NS S (+) NS NS NS Dextranos (ppm) NS NS NS NS S ( - ) NS BALPE Características físico-químicas DAC 1era Ext 2° molino 4° molino Colador Diluido °Brix S ( - ) NS NS NS NS NS % Sacarosa S ( - ) NS NS NS NS NS Pureza S ( - ) NS NS NS NS NS %Azúcares reductores NS NS NS NS NS NS Dextranos (ppm) NS NS NS NS NS S (+)
LEVADURAS Características físico-químicas DAC 1era Ext 2° molino 4° molino Colador Diluido °Brix NS NS NS S (+) NS NS % Sacarosa NS NS NS S (+) NS NS Pureza NS NS NS NS NS NS %Azúcares reductores S ( - ) NS NS NS NS NS Dextranos (ppm) NS NS NS NS NS NS
MOHOS Características físico-químicas DAC 1era Ext 2° molino 4° molino Colador Diluido °Brix NS NS NS NS NS NS % Sacarosa NS NS NS NS NS NS Pureza NS NS NS NS NS NS %Azúcares reductores NS NS NS NS NS NS Dextranos (ppm) NS S (+) NS NS NS NS
BACTERIAS
TERMÓFILAS Características físico-químicas DAC 1era Ext 2° molino 4° molino Colador Diluido °Brix NS S ( - ) NS NS NS S ( - ) % Sacarosa NS NS NS NS NS S ( - ) Pureza NS NS NS NS NS S ( - ) %Azúcares reductores NS NS NS NS NS S ( - ) Dextranos (ppm) NS NS S ( - ) NS NS S ( - )
NS : Correlación no significativa S (+) : Correlación significativa directa S ( - ) : Correlación significativa inversa
58
Finalmente el jugo del tanque del colador presentó un evidente aumento de la
población, mientras el análisis estadístico (figura 9) mostró un leve aumento de los
recuentos en el jugo diluido, pues en este punto el jugo termina su recorrido por el
tándem y lleva toda la carga microbiológica aportada por la caña y las superficies con
las que entra en contacto durante el proceso de extracción, a partir de las cuales los
microorganismos son continuamente incorporados al jugo. Resultados similares
reportaron Mora (1995) y Nodarse (1989). En el jugo del colador se presentó
correlación inversa entre la población y la concentración de dextranos, pero en el
jugo diluido no se observó ninguna correlación significativa con los parámetros
físico-químicos (tabla 6).
Con una población menor se encontraron bacterias acido-lácticas productoras de
exopolisacáridos (105 UFC/ml) (BALPE, figura 9). Los recuentos fueron menores a
los reportados en otros estudios en fábricas de Estados Unidos y Argentina por Clarke
en 1996 y por Cerutti y sus colaboradores en 1999 respectivamente.
La evaluación estadística de los datos mostró un aumento significativo de la
población de BALPE de la muestra de DAC a la 1era extracción, así como también
aumentó la concentración de dextranos y azúcares reductores (figura 10), aunque
estadísticamente no hubo correlación significativa entre las poblaciones de BALPE y
estas características físico-químicas del jugo (tabla 6); sin embargo, los °brix, el %
de sacarosa y la pureza del jugo en la muestra de DAC, mostraron una relación
inversa con la población, lo cual es acorde con los resultados esperados, teniendo en
cuenta que las BALPE son el grupo más implicado en las pérdidas de sacarosa en los
molino de caña y que soluciones azucaradas con ºbrix bajos y con las características
de temperatura y pH presentes en las muestras (tabla 6), Leuconostoc sp. encuentra
las condiciones ideales para el consumo de sacarosa y síntesis de polisacáridos (
MacMaster et al., 1980).
59
En términos generales, la población de BALPE mostró, en el estudio, una tendencia a
aumentar en el transcurso del proceso de extracción, exceptuando el 4to molino
donde los recuentos fueron significativamente menores por presentar una mayor
temperatura (figura 9).
En el recorrido del jugo del tanque del colador al de jugo diluido, se observó un
incremento de la población de BALPE lo cual puede atribuirse a las superficies con
que entra en contacto, pues los tanques que pocas veces están completamente vacíos,
filtros, tuberías y bombas son puntos importantes de contaminación en donde se
forman biopelículas que son el resultado de la unión de material polimérico
extracelular, células microbianas y detritus inorgánicos variados formando cúmulos
de suciedad, ya que son lugares en que las limpiezas exhaustivas son poco frecuentes
(figura 9). Estas observaciones coinciden con las reportadas por Clarke en 1996 y
Cerutti en 1999. En este último punto se estableció una correlación significativa
directa entre la población de BALPE y la concentración de dextranos en el jugo (tabla
6).
Figura 10: Promedio del % de azúcares reductores y de la concentración de dextranos (ppm) por punto de muestreo. n = 40.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Dac 1era Ext 2do molino4to molino Colador Diluido
Punto de m uestreo
Dex
tran
os (p
pm)
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
% d
e az
úcar
es re
duct
ores
Dextranas % Reductor
60
Las levaduras y los mohos mostraron patrones de distribución muy similares entre sí
en los diferentes puntos del tándem (figura 9); la población de levaduras encontrada
en los jugos es menor a la reportada en otros estudios (Sais et al., 1979; Cerutti et al.,
1999; Antier, 1996). En la muestra de DAC se observó una correlación inversa entre
dicha población y el % de azúcares reductores en el jugo, lo cual puede deberse al
consumo de estos azucares por parte de este grupo microbiano; así mismo, se
presentó correlación directa entre la población de levaduras, los °brix y el % de
sacarosa en el jugo del 4° molino.
En los puntos de muestreo restantes, las correlaciones con los parámetros físico-
químicos de los jugos no mostraron significancia estadística (tabla 6).
En cuanto a la población de hongos, se encontraron recuentos menores que para
levaduras que generalmente provienen del suelo y del ambiente. En la 1era
Extracción se presentó nuevamente la población más alta de hongos (mohos y
levaduras), que se mantuvo hasta el jugo del colador y finalmente, el jugo diluido. En
el 2º molino y, aún más, en el 4º molino las poblaciones fueron mucho menores lo
cual puede explicarse porque esta microflora aportada principalmente por la caña, se
concentra en el 1er contacto con el molino y disminuye progresivamente en los
molinos posteriores (figura 9). Adicionalmente, al igual que las poblaciones ya
evaluadas, la temperatura tiene un efecto importante sobre estos microorganismos.
En el jugo de 1era extracción se presentó una correlación directa entre las poblaciones
de mohos y la concentración de dextranos, pues la acumulación de bagacillo y las
biopelículas que se forman en este punto pueden incrementar la presencia de estos
microorganismos; en general no se presentaron correlaciones significativas con
características de los jugos, pues los hongos pueden permanecen en su estado
formante durante el recorrido por el molino (tabla 6).
61
Las bacterias termófilas aerobias presentaron poblaciones menores que las
encontradas en los otros grupos microbiológicos evaluados, del orden de 102 UFC/ml
(Ver anexo 2) y la menor población se encontró en la caña que ingresa a molienda,
evaluada mediante la muestra de DAC (figura 9); la población se incrementó en
molinos posteriores y fue mayor en el 4to molino donde la temperatura se encontró
alrededor de los 54ºC, favorable para el desarrollo de este grupo microbiológico;
resultados similares reportó Antier en un estudio realizado en Bois-Rouge en 1996.
En la muestra de 1era extracción se observó una relación inversa significativa entre la
población de bacterias termófilas y los °brix del jugo, y en el 2° molino con la
concentración de dextranos; en la muestra de jugo diluido, la relación inversa se
estableció con todos los parámetros evaluados, pero son relaciones que se deben a
que las condiciones en este punto de muestreo no son óptimas para el desarrollo de
este grupo microbiológico y por ende, los recuentos son mucho menores a los
encontrados en molinos posteriores; esto explica las correlaciones inversas
encontradas. Los estudios que reportan la presencia de este grupo microbiano en
obtención de jugo de caña de azúcar provienen en su mayoría de fábricas
sudafricanas, en las cuales el proceso de extracción se lleva a cabo por difusión a
altas temperaturas y reportan especies de Bacillus sp., especialmente B.
stearothermophilus y B. coagulans, como consumidores importantes de sacarosa, la
glucosa y la fructosa y productores de acido láctico (Ravnö, 2001). Cuando la
extracción se realiza a bajas temperaturas, estas bacterias sobreviven al proceso y
causan pérdidas en etapas posteriores donde encuentran temperaturas óptimas para su
desarrollo.
6.3.2.2 Dextranos, % de azúcares reductores, ºBrix, POL, %Sacarosa y Pureza
Los valores de dextranos detectados en el jugo fueron menores a los reportados en
otros estudios realizados por Solomon y colaboradores en un ingenio Hindú en 2005
y por Cerutti y colaboradores en Tucumán, Argentina en 1999, a pesar de que en este
último se utilizó el mismo método de cuantificación (figura 10). Esto sugiere que los
62
compuestos asociados a la actividad microbiológica difieren significativamente entre
fábricas de azúcar dependiendo de su ubicación geográfica, épocas de cosecha,
estaciones y condiciones de operación; además de los géneros bacterianos
involucrados, las poblaciones presentes y a los sistemas de desinfección aplicados en
las fábricas de azúcar.
La relación encontrada de % de azúcares reductores en cada punto de muestreo
(figura 10) muestra un incremento progresivo en la medida en que avanza el jugo por
el tándem. Los molinos posteriores presentaron valores menores a los encontrados en
la muestra de DAC y 1era Ext., como sucede con los valores de dextranos; esto indica
que estas características del jugo no siempre son acordes con el comportamiento y
actividad metabólica de los microorganismos y puede llevar a falsas interpretaciones.
Los análisis de POL, ºbrix, %sacarosa y pureza mostraron comportamientos similares
a los observados en las poblaciones de los diferentes puntos del molino, pero en la
gran mayoría de los casos no se observó correlación estadística entre las poblaciones
y éstos parámetros físico-químicos (figura 11).
Las figuras 10 y 11 muestran el comportamiento de los parámetros físico/químicos
evaluados en cada muestra de jugo.
63
Figura 11: Promedio de parámetros físico-químicos por punto de muestreo. n = 40.
6.3.3 Clasificación de los microorganismos
6.3.3.1 Mesófilos
Se aislaron 40 colonias con características fenotípicas diferentes (Anexo 3).
Como se observa en la figura 12, predominaron bacilos Gram negativos (figura 13A),
que pueden corresponder a géneros y especies de Enterobacterias relacionados con la
microflora epifita de la caña y del suelo que la rodea, como Escherichia coli,
Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Rahnella sp., Xanthomonas sp.
entre otros.
0
5
10
15
20
25
DAC 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Puntos de m uestreo
° brix
- %
de
saca
rosa
76
78
80
82
84
86
88
90
92
Pure
za
Brix Sacarosa Pureza
64
También se encontraron en menor proporción bacilos Gram positivos (13B) entre los
que se podrían mencionar especies como Bacillus subtilis, B. liqueniformis, B.cereus,
B. megaterium, B. pumilus y especies de Corynebacterium sp.
Figura 12: Clasificación por tinción de Gram de la población de mesófilos en cada
punto de muestreo.
Con menor frecuencia se encontraron cocos Gram negativos (13C) y cocos Gram
positivos (13D) entre los que podrían encontrarse bacterias como Staphylococcus
fragilis y Micrococcus luteus, entre otros. Muy pocas veces se detectaron
cocobacilos (fig 12).
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
DAC 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Bacilos Gram neg Bacilos Gram post Cocos Gram negCocos Gram post Cocobacilos Gram neg Cocobacilos Gram post
65
13A. Bacilos Gram negativos
13B. Bacilos Gram positivos
13C. Cocos Gram negativos 13D. Cocos Gram positivos
Figura 13. Morfología y coloración de las colonias de mesófilos
Fuente: Autor
66
En la 1era extracción se encontraron bacilos tanto Gram positivos como Gram
negativos; en una menor proporción se presentaron los cocos Gram negativos,
seguidos de los cocos Gram positivos (figuras 12 y 13). En la muestra del segundo
molino la población fue menor, pero la distribución de la población se mantuvo muy
similar en cuanto a los tipos de microorganismos encontrados, a pesar de ser jugos
independientes.
Al evaluar el jugo en el 4º molino, en donde se presentó la mayor temperatura de los
puntos muestreados debido al agua de maceración aplicada a alta temperatura,
predominaron los bacilos Gram positivos lo cual pudo deberse a su capacidad de
formar esporas; con menor frecuencia se presentaron bacilos Gram negativos y cocos,
en comparación con los otros puntos de muestreo, lo cual coincide con la poca
termoresistencia de estos microorganismos.
Las características poblacionales del jugo en el colador y jugo diluido fueron muy
similares, pues en ambos predominaron los bacilos Gram positivos, seguidos por los
Gram negativos, los cocos Gram negativos y los cocos Gram positivos (figura 12).
6.3.3.2 Bacterias acido-lácticas productoras de exopolisacáridos (BALPE)
En el estudio se aislaron 4 tipos de colonias de morfología diferente que fueron
identificadas como cocobacilos Gram positivos y bacilos Gram positivos delgados y
en cadenas, probablemente pertenecientes al género Leuconostoc sp. y Lactobacillus
sp. (Anexo 3) géneros reportados por Lonvaud-funel (1999) y McMaster et al.
(1990).
Según la clasificación de las colonias de BALPE, la distribución se mantuvo en todos
los puntos, pues la población de bacilos Gram positivos fue predominante (figura
14); sin embargo, en las colonias con mayor producción de goma se encontraron
cocobacilos Gram positivos con un olor ácido, fuerte y desagradable, lo que
evidencia la gran capacidad de síntesis de exopolisacáridos y la generación de otros
67
subproductos como acido acético, acido láctico, glucosa, fructosa, manitol y CO2 de
estos microorganismos, que se adaptan fácilmente a las condiciones temperatura, pH
y nivel de oxígeno con que opera el tándem. (figuras 15 y 16) (Hernández, 1978;
Cerutti et al., 2000).
Figura 14. Clasificación de la población de BALPE en cada punto de muestreo
Figura 15: colonias de BALPE en agar MRS hipersacarosa
Fuente: Autor
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
DAC 1era Ext 2do Mol 4to Mol Colador Diluido
Cocobacilos gram post Bacilos gram post
68
Figura 16: Colonias de BALPE en agar MRS hipersacarosa
Fuente: Autor
6.3.3.3 Levaduras y mohos
Se aislaron 25 colonias de levaduras diferentes entre cremosas, opacas, blancas,
beige y rosadas, de tamaños y formas variadas (Anexo 5).
La figura 17 muestra el aspecto de las colonias de hongos y levaduras observadas en
agar YGC que en algunas ocasiones desprendían olor a alcohol y producción de gas.
Estos microorganismos, al igual que Leuconostoc sp. y Bacillus sp., tienen la
capacidad de producir polisacáridos como glucógeno y manano (Hernández et al.,
1977; Sais et al., 1979; Landon et al., 2002).
69
Figura 17: Colonias de levaduras y mohos en Agar YGC
Fuente: Autor
En cuanto a la población de hongos, se aislaron 27 colonias de apariencias, texturas y
colores diferentes algunas de las cuales se observan en la figura 18, que
probablemente pertenecen a los géneros Aspergillus sp., Penicillium sp.,
Trichoderma sp., Rhizopus sp., Mucor sp. y Monilia sp. , reportados por Duarte y
colaboradores (1982), y Herrera (1989), y como los más comúnmente asociados a la
caña de azúcar.
La figura 19 muestra algunas estructuras de las colonias aisladas.
70
Figura 18: Colonias de mohos al estereoscopio 20X. Agar YGC
Fuente: Autor
71
Figura 19: Visión microscópica de mohos 100X. Coloración azul de lactofenol
Fuente: Autor
6.3.3.4 Bacterias termófilas aerobias
En la cuantificación de la población de bacterias termófilas aerobias se encontraron
20 colonias fenotípicamente diferentes, pero solo se obtuvieron cultivos puros de
algunas de ellas (Anexo 3). Hollaus (1978) reportó que cepas de Bacillus
stearothermophilus muestran comportamientos bioquímicos diferentes,
especialmente en su capacidad de degradar carbohidratos, lo que puede explicar la
heterogeneidad y el comportamiento variable de esta población en los jugos
evaluados.
72
Predominaron notablemente los bacilos Gram positivos, algunos de la cuales tienen
capacidad de formar esporas; si el tiempo de retención del jugo se prolonga en sitios
como el tanque de jugo diluido, estos microorganismos podrían desarrollarse y
generar pérdidas importantes de sacarosa (figura 20) (Antier, 1996).
Figura 20. Clasificación de la población de bacterias termófilas aerobias en cada punto de muestreo
6.4 Evaluación de desinfectantes
Para cada uno de los agentes biocida evaluados se realizaron 2 pruebas y aquellas en
las que no se obtuvieron resultados contundentes, se hizo una prueba adicional
confirmatoria Los datos presentados pertenecen al promedio de los ensayos
realizados.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
DAC 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Bacilos Gram positivos Bacilos Gram negativos
73
Las poblaciones y los parámetros físico-químicos fueron evaluados en una muestra
control que corresponde a una parte de la muestra analizada inmediatamente después
de haber sido tomada; los valores obtenidos en las muestras con desinfectante se
compararon con los valores del control y se aplicó la fórmula (1) para la
determinación del % de inhibición.
6.4.1 Busan 881®
Para el Busan 881® se probaron 5, 10 y 20 ppm en tiempos de contacto de 5, 10 y 15
minutos. Al pH determinado en la muestra de jugo a evaluar fue de 5.4, adecuado
para mantener la efectividad del Busan 881 que actúa mejor a pH inferior a 5,5 según
al información suministrada por la casa comercial; sin embargo, la efectividad del
producto se incrementa a temperaturas mayores a 65ºC y este factor es muy distante
de la temperatura encontrada en el jugo de 1era extracción.
La evaluación del efecto del Busan 881® sobre la población de mesófilos mostró %
de inhibición muy bajos que no representaron efectividad en la disminución de las
poblaciones. Las otras poblaciones evaluadas no mostraron inhibición lo que no
corresponde a la efectividad esperada; incluso la población de bacterias termófilas
varió en los tiempos de contacto evaluados lo que indica que sobre este grupo
microbiológico tampoco ejerció ningún efecto (Tabla 7).
74
Tabla 7. Evaluación de Busan 881®. Promedios de los porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. n=3
Mesófilos BALPE Levaduras Mohos Bacterias termófilas
Concentraciones % Inhib % Inhib % Inhib % Inhib % Inhib
5ppm-5min 3,0 0 0 4,2 0
5ppm-10min 1,6 0 1,9 0 0
5ppm-15min 2,8 2,1 1,0 0 0
10ppm-5min 3,1 0 0 0 0
10ppm-10min 7,6 2,3 0 0 0
10ppm-15min 9,3 4,0 4,6 0 10,3
20ppm-5min 0 3,3 1,3 11,8 0
20ppm-10min 1,3 0,7 1,7 0 20,0
20ppm-15min 9,6 3,4 0,7 0,9 0
Así mismo, los parámetros físico-químicos mostraron mínimas variaciones, lo que
sustenta la posibilidad de que el biocida no actuó sobre las poblaciones
microbiológicas (tabla 8).
Tabla 8. Evaluación de Busan 881®. Promedio de los parámetros fisco-químicos. n = 3
Parámetros ºBrix % sacarosa Pureza % Azúcares reductores
Dextranos (ppm)
Control 18,1 16,5 91,1 0,4 102,3 5ppm-15min 18,0 16,4 91,0 0,4 107,7
10ppm-15min 18,1 16,5 91,1 0,4 105,0 20ppm-15min 18,1 16,5 91,0 0,4 105,0
Onna y sus colaboradores reportaron también, en 1989, que se habían realizado
pruebas con este bactericida en fábricas de azúcar en Hawai sin generar los resultados
esperados, por lo que iniciaron estudios con otros productos. Por el contrario,
75
Appling y colaboradores (1959) realizaron ensayos en un ingenio del Perú y
obtuvieron muy buenos resultados, aplicando en jugos cuyo valor de ºbrix era de
16.88; el jugo evaluado en el presente estudio presentó un valor de ºbrix de 18,11, lo
cual puede ser un factor interferente con la actividad del biocida. Sin embargo, es
necesario realizar estudios que permitan relacionar la efectividad del biocida con los
°brix.
De acuerdo a esto, y con el fin de encontrar una concentración adecuada de aplicación
del bactericida del tándem, se realizó una última prueba tomando nuevamente
muestra de la 1era extracción y aplicando concentraciones máximas permitidas del
producto de acuerdo a las toneladas de caña molidas hasta la fecha en el tándem del
ingenio. Se evaluaron 50ppm y 100ppm del Busan 881® pero los resultados no
fueron satisfactorios, pues los porcentajes de inhibición no fueron coherentes con los
tiempos de contacto y ponen en duda la efectividad del bactericida; se observó una
leve disminución en la concentración de dextranos en comparación con los patrones
evaluados, mayor cuando se aplica a 100ppm, así como un pequeño aumento de los
valores de pureza en los jugos, pero incluso algunas poblaciones microbiológicas
como la de bacterias termófilas, mostraron aumentos considerables (anexo 6). Estos
resultados pueden estar relacionados con la gran variedad de microorganismos
encontrada en el jugo de 1era extracción, pues se generan interacciones complejas
entre las poblaciones, y las biopelículas constituidas por polímeros extracelulares,
permiten a los microorganismos protegerse de los factores adversos del medio en que
se encuentran (Saye, 1993).
6.4.2 Lipesa 106C® (Glutaraldehído)
Para la evaluación de la efectividad del glutaraldehido se realizaron pruebas a 5, 10 y
20 ppm durante 5, 10 y 15 minutos de contacto con la muestra de jugo de 1era
extracción.
76
Los pruebas realizadas con este agente biocida no mostraron resultados satisfactorios
a las concentraciones evaluadas, pues las poblaciones no se inhibieron al aplicarlo
(tabla 9); este comportamiento es totalmente contrario a lo que se espera cuando una
muestra de jugo se pone en contacto con un agente bactericida o bacteriostático.
En cuanto a los parámetros físico-químicos, factores como los ºbrix, % sacarosa y
pureza no variaron en los diferentes tiempos de contacto y la concentración de
dextranos pudo estar un poco controlada a 10 y 20 ppm; sin embargo, éstos factores
no son acordes con los resultados microbiológicos (tabla10). Otálora (2001) reporta
que el glutaraldehído no es totalmente efectivo ante bacterias presentes en
biopelículas, pues ésta característica las protege y evita que el biocida entre en
contacto con sus constituyentes celulares, y dadas las concentraciones de dextranos
en el jugo, este factor pudo interferir en la efectividad del biocida.
Tabla 9. Evaluación de Lipesa 106C®. Promedios de los porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. n=3
Mesófilos BALPE Levaduras Mohos Bacterias termófilasConcentraciones % Inhib % Inhib % Inhib % Inhib % Inhib
5ppm-5min 0 0 0 0 0 5ppm-10min 1,4 0 0 0 0 5ppm-15min 6,0 0 0 0 0
10ppm-5min 2,8 0 0 0 0
10ppm-10min 4,2 0 0 0 0 10ppm-15min 4,3 0 0 0 0
20ppm-5min 0 0,5 0 5,9 0
20ppm-10min 0 0 0 0 0 20ppm-15min 0 0 0 0 0
77
Tabla 10. Evaluación de Lipesa 106C®. Promedio de los parámetros físico-químicos. n = 3
Parámetros ºBrix % sacarosa Pureza %Azúcares reductores
Dextranos (ppm)
Control 18, 16,0 88,7 0,4 108,0 5ppm-15min 17,9 16,0 88,7 0,4 110,0
10ppm-15min 18, 16,0 88,7 0,4 95,0 20ppm-15min 18,0 16,0 88,7 0,4 92,0
En un estudio realizado por Saye en 1993 sobre la actividad del glutaraldehido sobre
jugos de caña se determinó que la dosis efectiva era aquella capaz de disminuir por
lo menos en una unidad logarítmica la población de microorganismos presentes en la
muestra; en consecuencia, la densidad de población presente es el parámetro que
determina la dosis. De acuerdo a esto, las dosis evaluadas no son efectivas, razón por
la cual se realizó un ensayo adicional empleando concentraciones mayores teniendo
en cuenta las UFC/ml encontradas en el jugo.
Se evaluaron 100 y 200ppm sobre la muestra de la 1era extracción a los mismos
tiempos de contacto evaluados en el primer ensayo, pero nuevamente se obtuvieron
resultados poco concluyentes, pues a 100ppm hay inhibición de las poblaciones, y a
200ppm los % de inhibición después de 15 minutos, no eliminaron o inactivaron parte
importante de la población, pues los mesófilos presentaron 2.04% de inhibición, las
BALPE 8.21%, las levaduras 6.75%. los mohos 1.35% y bacterias termófilas de
3.92% . Las características físico-químicas de esta última prueba tampoco
permitieron sacar conclusiones acerca de la efectividad del glutaraldehido (Anexo 5).
La evaluación In Vitro del glutaraldehido realizada por Nalco (1992) sobre
poblaciones de Leuconostoc mesenteroides muestra resultados satisfactorios en
cultivos puros de esta bacteria aislada de fábricas de azúcar de caña; sin embargo,
cuando se aplica sobre jugos de caña con toda su carga microbiológica, como los
78
evaluados en el presente estudio, se presentan resultados anormales debido a las
complejas interacciones que se dan entre las poblaciones, como lo reporto Saye en
1993.
6.4.3 Nalco 5581® (Ditiocarbamato)
Se probaron concentraciones de 10, 20 y 30ppm de acuerdo a las recomendaciones
del proveedor, durante los tiempos de contacto anteriormente aplicados a los agentes
biocida evaluados. Las tablas 11 y 12 muestran los resultados obtenidos.
Tabla 11. Evaluación de Nalco 5581®. Promedios de los porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto. n=3
Mesófilos BALPE Levaduras Mohos Bacterias termófilasConcentraciones % Inhib % Inhib % Inhib % Inhib % Inhib
10ppm-5min 0 5,8 0 7,5 0
10ppm-10min 0 4,2 0 18,9 10,4 10ppm-15min 1,0 6,3 0 6,8 9,7
20ppm-5min 0,9 5,3 0 2,9 2,1
20ppm-10min 3,7 4,7 0 3,6 2,2 20ppm-15min 3,2 5,3 0 8,0 0
30ppm-5min 3,6 5,1 0 0 10,2
30ppm-10min 0 4,0 0 2,6 5,7 30ppm-15min 3,3 6,0 0 4,2 5,9
79
Tabla 12. Evaluación de Nalco 5581®. Promedio de los parámetros físico-químicos. n = 3
Parámetros ºBrix % sacarosa Pureza %Azúcares reductores
Dextranos (ppm)
Control 18,7 16,9 90,7 0,4 110,3 10ppm-15min 18,6 16,9 90,7 0,5 107,7 20ppm-15min 18,6 16,9 90,8 0,4 115,7 30ppm-15min 18,6 16,9 90,8 0,4 118,0
Al igual que los resultados encontrados para los biocida anteriores, el ditiocarbamato
no presentó la actividad bactericida esperada. La población de mesófilos mostró un
porcentaje muy bajo de inhibición a 10ppm (1.03%) y a concentraciones mayores los
porcentajes no fueron coherentes con los tiempos de contacto; sobre las poblaciones
de BALPE y mohos la actividad fue un poco más efectiva, aunque no fueron
concluyentes los resultados teniendo en cuenta que en la medida en que aumentaron
los tiempos de contacto los porcentajes de inhibición no aumentaron ni tampoco lo
hicieron a mayores concentraciones (tabla 11); ante las levaduras no hubo ninguna
actividad y para bacterias termófilas los porcentajes fueron muy variables en el
intervalo de tiempo evaluado; así mismo, los resultados físico-químicos tampoco
mostraron resultados concluyentes sobre la efectividad del ditiocarbamato. El % de
azúcares reductores solamente se mantuvieron a 30ppm, mientras la concentración de
dextranas aumentó en los 3 tiempos evaluados (tabla 12).
Contrario a lo que reporta Acosta (1986), la concentración de dextranos se
incrementó en las muestras que estuvieron en contacto con el bactericida, y los
azúcares reductores tuvieron un leve aumento (Acosta, 1986). Resultados similares
fueron reportados en otros ensayos realizados en fábricas azucareras en los que se
concluye que estos compuestos no controlan efectivamente la producción de
dextranos ni la producción de ácido láctico (Day et al., 1995) (Holland, 1990).
Otros estudios realizados en ingenios en la India reportan una recuperación
importante de azúcar al aplicar ditiocarbamato a 10ppm sobre caña preparada
80
basándose en la determinación de pureza y reductores en jugos antes y después del
tratamiento (Solomon, 2005); sin embargo, no fue posible determinar dicha actividad
en el presente estudio.
A pesar de los resultados obtenidos, para el ditiocarbamato no se probaron
concentraciones mayores en los jugos, pues en la última prueba realizada el 3 de dic
de 2005 se encontró crecimiento de microorganismo mesófilos en el medio sembrado
únicamente con el biocida, razón por la cual se descartó posibilidad de usar este
agente como biocida en los jugos del molino.
6.4.4 Hipoclorito de Calcio
Ante los resultados obtenidos con los agentes biocida evaluados sobre los jugos, se
realizó un ensayo adicional sobre muestras de jugo del mismo punto con un agente
clorado, Hipoclorito de calcio, reportado en la bibliografía como un sanitizante
accesible y fácil de manipular (Mora et al., 1995) (Cerutti de Guglielmone et al.,
2000).
Se evaluaron concentraciones de 0.5% y 1% partiendo de un hipoclorito de calcio al
65%, preparado al 10% en agua destilada estéril; la concentración de cloro activa
corresponde al 4,7% (Anexo 6). Los tiempos de contacto fueron los mismos
establecidos para los biocida anteriores (5, 10 y 15min). Con una dosis de hipoclorito
de calcio de 0,5% se elimina el 30.97% de la población de microorganismos
mesófilos después de 15 minutos de contacto, el 72.71% de la población de BALPE,
el 79.72% de la población de levaduras y el 17.81% de la población de mohos (Tabla
13).
81
Tabla 13. Evaluación de hipoclorito de calcio. Porcentajes de inhibición de las poblaciones microbiológicas a diferentes concentraciones y tiempos de contacto.
Mesófilos BALPE Levaduras Mohos Bacterias termófilas
Concentraciones % Inhib % Inhib % Inhib % Inhib % Inhib
0.5% - 5min 7,7 11,4 11,1 9,6 0
0.5% - 10min 26,4 68,6 59,4 12,2 4,6
0.5% - 15min 31,0 72,7 79,7 17,8 1,8
1% - 5min 27,9 25,3 39,2 17,8 1,0
1% - 10min 31,1 56,7 59,4 22,9 3,8
1% ppm - 15min 32,0 76,8 79,7 45,2 0
A concentraciones del 1% los porcentajes de inhibición tuvieron un leve incremento
en las poblaciones, siendo más notorio el aumento en la inhibición de los mohos.
Como lo reporta Mora (1997) y Cerutti y colaboradores (1999), el hipoclorito de
calcio puede ser empleado satisfactoriamente como agente de desinfección pues
disminuye las poblaciones de manera más efectiva que otros biocidas que implican
mayores inversiones; en el estudio incluso presentó un % de inhibición importante
ante las levaduras que suelen presentar resistencia a los productos de cloro (Cerutti de
Guglielmone et al., 1999). Sin embargo, por la poca solubilidad que presenta el
aumento de iones CA++ y el incremento del pH, Duarte (1982) no lo recomienda, y
plantea la evaluación de otros compuestos clorados que pueden arrojar resultados
similares. Será objeto de estudios posteriores si estas características del hipoclorito
de calcio tienen repercusiones negativas en el proceso de producción.
El efecto de hipoclorito de calcio sobre la población de BALPE debería contribuir a
la disminución en la concentración de dextranos pero, contrario a lo esperado, dicha
concentración aumento aún cuando se aplicó el biocida (tabla14).
82
Tabla 14. Evaluación del hipoclorito de calcio: Parámetros físico-químicos
Parámetros pH ºBrix % sacarosa Pureza %Azúcares reductores
Dextranos (ppm)
Control 5,4 17,6 15,4 87,6 0,7 157
0.5% 15 min. 6,4 17,2 14,9 86,6 0,6 165 1% 15 min. 7,1 16,8 14,3 85,0 0,6 173
Así mismo, algunas características del jugo no mostraron concordancia con la
actividad ejercida sobre las poblaciones microbiológicas, pues factores como la
sacarosa y la pureza disminuyeron en la medida en que aumentó la concentración del
hipoclorito; solamente el comportamiento del % de azúcares reductores y los ºbrix
fueron coherentes con los resultados de las poblaciones microbiológicas. Es
importante resaltar el notable aumento del pH en el jugo, lo cual puede tener
consecuencias en etapas posteriores del proceso de producción de azúcar al aplicarlo
en los jugos del tándem (tabla 14). Estas relaciones poco acordes entre el
comportamiento de las poblaciones en los jugos y los parámetros físico-químicos
ponen en duda el significado que pueden tener estos con las condiciones higiénicas de
un tándem (Hernández, 1978).
Finalmente, se estableció que los agentes biocida ensayados en el laboratorio no
muestran resultados satisfactorios, a excepción del Hipoclorito de calcio, que se
convierte en una interesante alternativa para el control microbiológico en los jugos de
caña.
83
7. CONCLUSIONES
• Las poblaciones de microorganismos que entraron a la fábrica, en los tallos de la
caña de azúcar, especialmente mesófilos, BALPE y levaduras, y la concentración
de dextranos en el jugo, dependieron del tipo de caña, el tipo de cosecha, el
tiempo de permanencia y el % de materia extraña.
• La población más alta de microorganismos encontrada en la muestra directa de
caña (DAC) correspondió a bacterias mesófilas (107 UFC/ml), seguida de la
población de bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos (BALPE)
(105), levaduras (105), mohos (103) y termófilas (102).
• El punto de contaminación más crítico determinado en el estudio fue la 1era
extracción, donde hubo un incremento significativo de las poblaciones en la
muestra del jugo.
• Las poblaciones presentes en el jugo de primera extracción permanecieron
relativamente constantes en los siguientes puntos de muestreo, excepción del 4º
molino, en que descienden por la temperatura.
• Se encontró predominio bacilos Gram negativos y Gram positivos; en menores
proporciones se encontraron poblaciones de cocos Gram negativos, cocos Gram
positivos y cocobacilos.
• En población de BALPE predominaron los bacilos largos y delgados Gram
positivos, morfología característica de Lactobacillus y en menor proporción los
coco-bacilos Gram positivos.
84
• Las bacterias termófilas aerobias presentes en el molino, especialmente en el 4º
molino, fueron en su mayoría bacilos Gram. positivos, muy variables y
heterogéneas en los diferentes puntos de muestreo.
• Los parámetros físico-químicos determinados, tanto en la evaluación de los jugos
como en las pruebas de efectividad de los biocidas, no fueron buenos indicadores
de las poblaciones microbiológicas presentes en los jugos de caña.
• Los biocidas Busan 881® (5, 10, 20, 50 y 100ppm), Lipesa 106C® (5, 10, 20, 100
y 200 ppm) y Nalco 551® (10, 20, y 30 ppm) no mostraron efectividad en el
control de las poblaciones microbiológicas del jugo de 1era extracción.
• El hipoclorito de calcio al 65% a una concentración de 0.5%, fue el biocida más
efectivo de los evaluados, con disminuciones importantes de las poblaciones de
BALPE y levaduras, hasta del 72% de inhibición.
85
8. RECOMENDACIONES
• Incluir la determinación de Bacterias ácido-lácticas productoras de
exopolisacáridos en medio MRS hipersacarosa en los análisis de rutina que se
realiza a los jugos de la fábrica.
• Continuar con estudios sobre la microflora del tándem que permitan
identificar los géneros y especies más frecuentemente encontrados en los
jugos y determinar la incidencia de cada uno de ellos sobre el deterioro e
inversión de la sacarosa en la etapa de molienda. Así mismo, incluir análisis
del jugo en etapas posteriores del proceso.
• Continuar con las políticas de higiene en el área de molinos y estandarizar las
rutinas de limpieza mediante documentos escritos que aseguren la eficacia de
la misma, evitando puntos de acumulación de bagazo y que favorecen la
proliferación de microorganismos contaminantes.
• Establecer rutinas de limpieza y desinfección en las superficies con que está en
contacto la caña desde que es descargada al conductor en el patio, hasta que
llega a la 1era extracción, para evitar la inoculación continua de
microorganismos al jugo por parte de estas superficies.
• Aplicar Hipoclorito de calcio al 65% en el jugo de 1era extracción en una
concentración de 0.5% para el control de las poblaciones microbiológicas, no
sin antes considerar las implicaciones del incremento de pH en el jugo para
etapas posteriores del proceso.
86
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Acosta Dueñas S., Rodríguez Cruz O., Duarte Pérez E. 1986. La evaluación
del dialquiditiocarbamato (antiformin) como desinfectante en la industria de
azúcar de caña. Cuba Azúcar p.17-22.
Anónimo. Buckman Laboratories, Inc. 1993 Information Release. Evaluating
the benefits of Busan 881 as a Sanitation aid for Cane Sugar Mills. Memphis,
Tennessee, USA.
Antier P. 1996. Microbiological Control in a Cane sugar Mill: implications on
Sugar Quality and on losses. Proceeding of the South African Sugar Technologist
Association. V 7 p. 185 – 188.
Appling J.W., Ugarte M. 1959. Bactericida especial acusa importantes
economías. Sugar y Azúcar . Memphis, Tennessee, Buckman Laboratories, s.f. 8
p.
Broadfoot, R. 2001. Aspects of sucrose losses: impact on profitability,
competitiveness and the environment. En: Congress of the International Society
of Sugar Cane Technologists, 24, Brisbane, Australia. Proceedings. Mackay,
ASSCT, 2001. v.1, p.339-340.
Cárdenas G., Diez O., Cerutti de Guglielmone, G. I. 1999. Análisis y
evaluación de las pérdidas de sacarosa en un ingenio azucarero durante las
operaciones previas a la decantación. Revista Industrial y Agrícola de Tucumán.
Tomo 76 (1-2). p 87-93.
87
Cárdenas G., Diez O. 1997. Dextranos: La incidencia en el proceso de
fabricación de azúcar (2ª parte). EEAOC Avance Agroindustrial, Julio. p. 25-28.
Centro de Investigación de la caña de azúcar de Colombia, CENICAÑA.
2005 [En línea] < http://www.cenicana.org/programas/fabrica/index.php> [Consulta:
Noviembre de 2005]
Cerutti de Guglielmone G.I., Diez O.A., Cárdenas G.J., Oliver G. 2000.
Determinación de contenidos microbianos y cuantificación de dextranos en la
Industria Azucarera Tucumana. Revista Industrial y Agrícola de Tucumán. V77
#2, p. 19 – 27.
Cerutti de Guglielmone G.I., Cárdenas G.J., Diez O.A., Oliver G. 1999.
Método rápido para detección de contaminación microbiana en fábricas
azucareras. Avance Agroindustrial (Argentina) V.19 no.77, p.4-6.
Cerutti de Guglielmone G.I., Cárdenas G.J., Diez O.A., Soria R. 1999.
Hipoclorito de calcio: agente de desinfección para ingenios azucareros. Avance
Agroindustrial (Argentina) V.19 no.76, p.13-16.
Cerutti de Guglielmone G.I., Diez O.A., Cárdenas G.J. 2000. Control
microbiológico en la industria azucarera: Empleo de agentes de sanitización puros
y en mezclas. Revista Industrial y Agrícola de Tucumán V.77 no.2, p.19-27.
Cerutti de Guglielmone G.I, Diez, O; Cárdenas, G.J., Oliver, G. 2000.
Sucrose utilization and Dextran production by Leuconostoc mesenteroides
isolated from the Sugar Industry. The sugar journal V 62 No 10, p. 36-41.
Tucumán, Argentina.
88
Clarke M. 1996. Dextran in sugar factories: causes and control. Sugar
Processing Research Institute, Inc. Presentation at the Congress of the Association
of Sugar Technologist, Acapulco, México. p. 1-30.
Cuddihy J., Rauh J., Mendez F., Berhard C. 1996. Dextranase in sugar
production: Factory Experience. Midland Research Laboratories, Inc.
Cuddihy J., Porro M., Rauh J. 2001. The presence of total polysaccharides in
sugar Production and methods for reducing their negative effects. Journal of the
American Society of Sugar Cane Technologists V.21, p.73-91.
Day D., Cuddihy J. 1995. Biocide usage at Louisiana Factories. Midland
Research Laboratories, Inc. L.A, USA.
De Vuyst L., Degeest B. 1999. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria.
FEMS Microbiology Reviews 23. p. 153-177.
Dols M., Remaud-Simeon M., Willemot R., Vignon M., Monsan P. 1998.
Characterization of different dextransucrase activities excreted in glucose,
fructose, or sucrose medium by Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299.
Applied and Enviromental Microbiology, April. p 1298-1302.
Duarte E., Guillermo A., Polanco N., López M. 1982. Análisis microbiológico
de productos azucareros. Editorial científico-técnica. Ciudad de la Habana. 28 p.
Duarte E., Guillermo A., Polanco N., Lopez M. 1982. Análisis Microbiológico
de productos azucareros. Revista Científico-Técnica, La Habana, 29p.
Eggleston, G. 2001. Sucrose losses in juice and during clarification:
Experiences in the United States. En: Congress of the International Society of
89
Sugar Cane Technologists, 24, Brisbane, Australia. Proceedings. Mackay,
ASSCT, 2001. v.1, p.358-359.
Engelke J. 2002. Sugarcane: Measuring Comercial Quality. Farmnote:
Department of Agriculture.V 25 No 23.
Hernández M.T., Dauval C., Pérez M.E. 1978. Acción de L. mesenteroides y
otros microorganismos sobre los componentes del jugo de caña. Centro Azúcar
(Cuba) V5 no 1. Ene-Abr p 69-87.
Hernández Nodarse M.T. 1979. Microbiological control in the milling station.
International Sugar Journal V.81 no.969, p.266-270. Sep; no.970, p.291-293.
Hernández Nodarse M.T., Pérez M.E., Dauval C., Herrera N., Portal
Pedrosa A. 1977. Acción de las levaduras sobre los componentes de jugo de
caña. Centro Azúcar (Cuba) V.4 no.3, p.2-23.
Holland G., Buckley M. E., Frampton S. 1990. Experiences in the use of
biocides for microbiological control in the raw factory. Sugar Technology.
British Sugar plc Technical conference 85 p.
Hollaus F. 1978. The microbiology of beet sugar manufacturing: Practical
consideratios on operational checks and measures against microorganisms. La
sucrerie Belge. V 97. p 3-11.
Honig P. 1969. Principios de Tecnología Azucarera. Tomo I: Propiedades de
los Azúcares y no Azúcares. Pags. 21 - 41. Tomo III: Parte 3: Microbiología
Azucarera. p. 315 - 454. Compañía Editorial Continental S.A. México, España y
Argentina.
90
Ingenio Manuelita S.A., 2005. [En linea]. <http://www.manuelita.com/html/sitio/>.
[Consulta: Noviembre de 2005].
Laboratory Manual for South African Sugar Factories. Including the official
methods. 1985. South African Sugar Technologists Association. 3rd edition.
Natal. p 25-31.
Landon W., Trost, Steele F., 2002. Review article: Control of microbiological
losses prior to cane delivery, and during sugar processing. International Sugar
Journal. V 104 no 1239. p 118-123.
Lonvaund-Funel A. 1999. Leuconostoc [En linea] Faculty of enology,
University Victor Segalen, Bordeaux, France
<http://www.foodscience.cornell.edu/fs406/LEUCONOSTOC.doc>. [Consulta:
Febrero de 2005].
Mc Master L., Ravnö A.B. 1990. The occurrence of lactic acid and associated
micro-organisms in cane sugar processing. Processing Sao Paulo Impress V3, p
2679-2693.
Mora Henao Z.A. 1995. Estudio de las microfloras contaminantes durante la
etapa de molienda de caña en relación con el proceso de elaboración de azúcar.
Cali, Universidad del Valle. Departamento de Biología. 114 p.
Morel Du Boil P.G. 2001. Losses associated with post-harvest and pre-delivery
conditions. En: Congress of the International Society of Sugar Cane
Technologists, 24, Brisbane, Australia, 17-21 September, 2001. Proceedings.
Mackay, ASSCT V.1, p.382-383.
91
Anónimo. 1992. Case Study: Microbiological control maintained in the sugar
beet extraction process using glutaraldehyde. Nalco Chemical Company.
Nodarse M.T., Pérez M. E., Sánchez R., Sánchez R. 1979. Desarrollo de L.
Mesenteroides a distintos valores de temperatura y pH. Centro Azúcar. p 25-43.
Onna K. M., Hashimoto W.K. 1989. Economics of using a biocida at a milling
tandem. International sugar journal. V 91, Nº1092, p 232-234.
Otálora A. 2001. Análisis microbiológico de las biopelículas implicadas en el
biodeterioro de los monumentos de piedra en Villa de Leyva, Boyacá y
evaluación de sustancias biocidas para su control. Microbiólogo Industrial.
Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Santafé de Bogotá. 122p.
Pulido M.L., Ferrer V. 1977. Programa coordinado de tratamiento químico
para centrales. Congreso de Asociación de Técnicos azucareros, San Juan de
Puerto Rico. Buckman Laboratorios.
Purchase B.S., 2001. Losses caused by micro-organisms. En: Congress of the
International Society of Sugar Cane Technologists, 24, Brisbane, Australia, 17-21
September. Proceedings. Mackay, ASSCT, 2001. V.1, p.379.
Ravnö A.B. 2001. Microbial degradation in sugar cane diffusers. Congress of the
International Society of Sugar Cane Technologists, 24, Brisbane, Australia.
Proceedings. Mackay, ASSCT, V.1, p.384-385.
Rincón, S., Cortes, D. 1996. Evaluacion y control de agentes microbiológicos
contaminantes presentes dentro del sistema de producción de alcohol.
Bacteriología. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. Santa fe
de Bogotá.
92
Romani J.C., Graneros M.A. 1991. El problema de la falta de asepsia en el
tándem de molienda y su implicancia económica. TECNOZUCAR (Argentina)
V.1 no.003, p.11-19.
Sais Herrera T. 1977. Estudios de la flora microbiana en jugos de caña de varias
unidades industriales y a escala semi-industrial. Centro Azúcar (Cuba) V.4 no.2,
p.3-19.
Sais Herrera T., López de la Cruz M. 1979. Influencia del pH y la temperatura
sobre la composición microbiana del jugo de caña. Centro Azúcar (Cuba) V 6
no.1, p.15-43.
Sais Herrera T., Ulloa Díaz S. 1979. Estudio de la composición en levaduras y
microorganismos formadores de gomas en el jugo de caña. Centro Azúcar (Cuba)
V.6 no.1, p.45-51.
Saye D.J. 1993. Glutaraldehyde application for the control of microbial growth
in sugar beet diffusion processes. Nalco chemical company. American Society
of SugarBeet Technologists Biennial meeting. March 2-6.
Solomon S., Shrivastava A. 2005. Minimising post-harvest biological losses of
sucrose by application of organo-sulfur based biocida during milling of cane.
Proceedings ISSCT, V 25, págs 26-30.
Tallgren A.H., Airaksinen U., Weissenberg R., Ojano H., Kuusisto J., Leisola
M. 1999. Exopolisacharide-producing Bacteria from sugar Beets. Applied and
Environmental Microbiology. p. 862 - 864. V 65 #2.
93
Trost L. W., Steel F. M. 2002. Review Article: Control of Microbiological
losses prior to cane delivery and during sugar processing. International Sugar
Journal V. 104 No 1239 p.118, 120-123. USA.
Vander poel P.W., Schiweck H., Schwartz T. 1998. Sugar technology: Beet
and Cane Sugar Manufacture. p. 993 – 1007.
Zhennai Yang. 2000. Antimicrobial Compounds and Extracellular
polysaccharides produced by Lactic acid Bacteria: Structures and Proprieties.
Department of Food Technology. University of Helsinki, Helsinki.
94
ANEXOS
Anexo 1: Formato de Evaluación Fecha Hora de Muestreo Evaluación #
Datos de Trazabilidad de la Caña Mayordomía Tipo de Caña Suerte Tipo de Cosecha Variedad Permanencia en Campo(h) Edad % Materia Extraña
Parámetros fisico-Químicos Hora de inicio: Hora de finalización:
Muestra
pH
ºBrix
Pol
% Sacarosa
Pureza
Dextranas
(ppm)*
% Azúcares
Reductores** Dac
1era Ext 2º Molino 4º Molino Colador J Diluido * Método de Roberts ** Método de Eynon y Lane
95
Parámetros microbiológicos ( UFC/ml) Hora de inicio: Hora de finalización:
Muestra Mesófilos BPE* Levaduras Mohos Termófilas** Dac
1era Ext 2ºmolino 4º Molino Colador
Jugo Diluido (*)Bacterias productoras de Exopolisacárido (**) Termófilas formadoras de esporas Otras Observaciones Anexo 2: Promedio de las poblaciones microbiológicas y los parámetros fisico-químicos en cada punto de muestreo
Muestra Mesófilosª BALPEª Levadurasª Mohosª Termófilas Aerobiasª
Dac 7,41 5,26 5,19 3,42 1,971era Ext 7,71 6,19 5,77 4,15 2,942do molino 7,42 6,30 5,11 3,68 3,054to molino 6,46 3,65 2,81 2,97 3,48Colador 7,62 6,40 5,52 4,00 3,20Diluido 7,69 6,57 5,64 3,94 3,08
ª : Log UFC/ml
Muestra °Brix Pol % Pureza %Sacarosa %Azúcares reductores
Dextranos (ppm)
Dac 20,01 75,18 90,29 18,09 0,53 75,40 1era Ext 19,49 72,39 89,55 17,46 0,58 160,45
2do molino 8,47 28,66 85,24 7,23 0,29 114,53
96
4to molino 3,82 12,05 80,60 3,09 0,22 86,18 Colador 13,45 47,81 87,50 11,80 0,46 122,38 Diluido 13,64 48,53 87,42 11,97 0,47 120,10 Anexo 3: Descripción de colonias aisladas Mesófilos (Agar nutritivo, 37ºC)
Características Macroscópicas
Coloración de Gram
M1 Colonias redondas de color amarillo claro, de centro húmedo y borde regular, rodeadas de un halo transparente
Bacilos Gram positivos
M2 Colonias irregulares que se expanden en el medio en forma de flor, color crema y apariencia cremosa/húmeda.
Bacilos Gram positivos
M3 Colonias puntiformes bien definidas, incoloras y muy pequeñas. Cocos Gram negativos
M4 Colonias húmedas, color crema, redondas pero con borde irregular. Bacilos Gram positivos
M5 Colonias totalmente irregulares, color crema, opacas, grandes, húmedas.
Bacilos Gram negativos en cadena
M6 Colonia irregular, blanca, se extiende en el medio con apariencia cerosa. Bacilos Gram negativos
M7 Colonia blanca, opaca, grande, concéntrica, con borde irregular. Bacilos Gram positivos
M8 Colonia blanca, húmeda, regular y grande. Cocos Gram negativos
M9 Colonia color amarillo pálido, irregular, con apariencia húmeda; despiden olor desagradable. Bacilos Gram negativos
M10 Colonias transparentes húmedas, amarillosas a trasluz, pequeñas e irregulares. Bacilos Gram negativos
M11 Colonias irregulares, transparentes, húmedas, amarillas, en forma de sol. Bacilos Gram negativos
M12 Colonia amarilla, redonda pero de borde irregular, húmeda. Bacilos Gram positivos
M13 Colonia pequeña, Amarillo transparente, de apariencia húmeda y borde irregular.
Bacilos Gram positivos en pares
M14 Colonia blanca, cremosa, irregular, grande. Coco-bacilos Gram negativos
M15 Colonia que crece como hilos enredados en el medio, blanca. Bacilos Gram positivos
M16 Colonia redonda, color crema, concéntrica, de apariencia húmeda, regular. Bacilos Gram positivos
97
M17 Colonia blanca irregular, redonda, similar a una flor. Cocos Gram negativos
M18 Colonias grandes, redondas, con halo opaco alrededor y centro húmedo (como ampollas). Bacilos Gram positivos
M19 Colonia amarilla/azul a trasluz, concéntrica, redonda, de borde regular. Micrococos Gram negativos
M20 Colonia color amarillo transparente, redonda. Bacilos Gram negativos
M21 Colonia amarilla, de color más intenso en el centro, que se hace menos visible en los bordes, bien definidas.
Cocos Gram positivos
M22 Colonia color amarillo, transparente, no definida. Coco-bacilos Gram positivos M23 Colonia crema, de borde irregular, mediana. Bacilos Gram positivos M24 Colonia color Amarillo intenso. Bacilos Gram negativos
M25 Colonia transparente, no definida, amarrilla a trasluz. Bacilos Gram positivos
M26 Colonia crema, con centro opaco y bordeada, mediana. Bacilos Gram positivos
M27 Colonia cremosa similar a una levadura, de color blanco y forma de flor. Cocos Gram positivos
M28 Colonia Amarillo transparente, no definida, de apariencia húmeda. Micrococos Gram negativos
M29 Colonia cremosa, blanca, irregular. Micrococos Gram positivos
M30 Colonia amarilla, de apariencia arenosa, seca, de borde alto y bien definido. Bacilos Gram negativos
M31 Colonia seca, que crece como regada por canales , blanca transparente .
Bacilos Gram positivos esporulados
M32 Colonia irregular, húmeda en el borde y seca en el centro, blanca, opaca. Bacilos Gram positivos
M33 Colonia que crece como “dedos” delgados, color crema. Bacilos Gram positivos
M34 Colonia redonda, regular, con muchos puntos en el centro y apariencia arenosa alrededor. Bacilos Gram negativos
M35 Colonia redonda, rosada, húmeda. Bacilos Gram positivos
M36 Colonia transparente, azul a trasluz, completamente irregular, de apariencia húmeda. Cocos Gram positivos
M37 Colonia transparente, azul a trasluz, que crece en forma de “dedos” delgados. Bacilos Gram negativos
M38 Colonia color amarillo, opaca, grande, con muchos puntos en el centro. Bacilos Gram negativos
M39 Colonia compacta, dura, que genera un halo café alrededor, pequeña, blanca, redonda. Filamentos Gram negativos
M40 Colonia blanca de apariencia gomosa, transparente y húmeda. Bacilos Gram positivos
98
Bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos (agar MRS hipersacarosa, 37ºC).
Características Macroscópicas
Coloración de Gram
B1 Colonia gomosa, transparente, grande, que despide olor desagradable.
Coco-bacilos Gram positivos
B2 Colonia muy pequeña, trasnparente, puntiforme. Bacilos largos, delgados, Gram positivos.
B3 Colonia transparente, alta, de consistencia dura, similar a un terrón de azúcar.
Bacilos medianos, algunos curvos, Gram positivos.
B4 Colonia pequeña, redonda, opaca. Bacilos largos, delgados, Gram positivos
Levaduras (agar YGC, 30ºC)
Características Macroscópicas
L1 Colonia blanca, cremosa, redonda, bien definida.
L2 Colonia grande, de borde irregular, blanca de apariencia seca, opaca, con un punto central.
L3 Similar a la anterior, pero color crema. L4 Colonia blanca con ondulaciones en la superficie, alta.
L5 Colonia puntiforme, pequeña, color crema de apariencia cremosa y con extensiones en el borde.
L6 Colonia irregular, seca, blanca y de apariencia cremosa. L7 Colonia color crema, irregular, alta, concéntrica, bien definida. L8 Colonia blanca, similar a una flor, de apariencia húmeda, de olor agradable. L9 Colonia color crema, grande, con protuberancia central, bien definida. L10 Colonia redonda, blanca, con extensiones en el borde. L11 Colonia cremosa, regular, color guayaba.
L12 Colonia grande, cremosa, de superficie rugosa y protuberancia central, con borde opaco alrededor.
L13 Colonia pequeña, color crema, con protuberancia central, bien definida. L14 Colonias pequeñas, color blanco/crema, con una hendidura en el centro. L15 Colonia blanca, seca, con un borde opaco alrededor. L16 Colonia seca, como un terrón de azúcar, alta y blanca. L17 Colonia color curaba, bien definida, de apariencia cremosa. L18 Colonia opaca, sin forma definida, blanca, como cuarteada en la superficie. L19 Colonia blanca completamente rugosa en la superficie, alta. L20 Colonia rugosa, como plegada, blanca, no definida.
99
L21 Colonia color rosado pálido, bien definida. L22 Colonia color crema, opaca, con forma de estrella. Mohos (agar YGC, 30ºC)
Características Macroscópicas
H1 Colonia blanca en la superficie, de revés amarillo-naranja. El centro de vuelve violeta cuando envejece.
H2 Colonia blanca-amarillo, revés crema, de apariencia arenosa . Toma un color verde oliva cuando envejece.
H3 Colonia blanca, con pintas negras en el centro, de revés oscuro en el centro y claro en los extremos. Toma un color azul tenue cuando envejece.
H4 Colonia verde en el centro y blanca en los bordes, de apariencia arenosa, de revés amarillo fuerte. Cuando envejece la colonia se torna verde oscura y es totalmente arenosa.
H5 Colonia color naranja-rosado, que da olor, de revés del mismo color. H6 Colonia color blanco-amarillo claro, de apariencia algodonosa.
H7 Colonia color café-verde oliva, arenosa, más oscura en el centro, de revés amarillo. Despide olor a tierra.
H8 Moho blanco, bien definido, de revés amarillo intenso y apariencia algodonosa.
H9 Moho blanco con verde, de crecimiento difuso, de apariencia algodonosa y revés amarillo.
H10 Moho blanco, tupido, de apariencia correosa, sin colonia definida. Se vuelve verde cuando envejece.
H11 Moho color amarillo tenue , de revés amarillo intenso. Se vuelve verde militar cuando envejece.
H12 Moho de centro azul-verdoso, con un copito blanco alrededor. H13 Moho violeta con blanco, de apariencia algodonosa y crecimiento difuso.
H14 Moho de crecimiento no definido, color crema con verde, de apariencia aterciopelada.
H15 Moho verde-amarillo , de apariencia arenosa H16 Moho de color negro, de apariencia atípica, sólido, alto.
H17 Moho amarillo claro intenso, de revés del mismo color, apariencia aterciopelada.
H18 Moho negro, tipico. H19 Moho de colonia café, crecimiento similar a una raíz.
H20 Colonia color blanco con curaba, sin centro definido, de apariencia correosa y olor agradable.
H21 Moho verde claro-blanco en el centro, tupido, rodeado de una zona amarilla, de crecimiento radial definido.
H22 Moho de color blanco; cuando envejece el centro se torna anaranjado, con
100
borde blanco, de apariencia aterciopelado.
H23 Moho color azul-gris, con borde blanco, que deforma el medio de cultivo en el centro.
H24 Moho con muchos colores pasteles en su colonia, tupido, de apariencia algodonosa.
H25 Moho rosado, de revés del mismo color, combinado con blanco, de apariencia peluda.
H26 Moho similar a un girasol, inicialmente amarillo con pelitos oscuros en el centro.
H27 Moho blanco alto, bien tupido. Anexo 4: Ensayo adicional de la efectividad de los agentes biocida a concentraciones máximas permitidas. Busan 881®
Mesófilos BPE Levaduras Mohos Termófilas Concentraciones %Inhib %Inhib %Inhib %inhib %Inhib
50ppm-5min 17,0 7,8 4,2 2,9 0 50ppm-10min 10,4 4,2 11,8 19,7 0 50ppm-15min 6,1 17,4 6,5 11,8 0
100ppm-5min 8,2 10,8 5,7 17,8 0 100ppm-10min 12,2 4,6 7,6 19,1 0 100ppm-15min 9,3 4,2 12,4 20,5 0
ºBrix %Sacarosa %Pureza%Azúcares Reductores
Dextranos (ppm)
Control 19,9 18,5 93,0 0,5 63 50ppm-15min 19,8 18,4 92,9 0,5 79 100ppm-15min 19,8 18,4 92,7 0,4 63 Control 15min 19,8 18,4 93,0 0,4 94
101
Lipesa 106C® (Glutaraldehido)
Mesófilos BPE Levaduras Mohos Termófilas Concentraciones %Inhb %Inhb %Inhb %Inhb %Inhb
100ppm-5min 0 0 0 0 2,0 100ppm-10min 0 0 5,5 6,0 1,5 100ppm-15min 0 7,2 1,7 11,3 0
200ppm-5min 0,3 6,9 3,8 2,3 9,6 200ppm-10min 0 6,4 1,0 6,0 7,9 200ppm-15min 2,0 8,2 6,8 1,4 4,0
ºBrix %Sacarosa %Pureza%Azúcares reductores
Dextranos (ppm)
Control 1 18,7 17,0 90,8 0,5 63 100ppm-15min 18,6 16,9 91,1 0,5 79 200ppm-15min 18,6 16,9 91,1 0,4 63
Anexo 5. Medios de cultivo Agar nutritivo (Merck ®) Composición g/L Peptona de caseína 5.0 Extracto de levadura 2.5 D (+) glucosa 1.0 Agar, Agar 14.0 Agar Extracto de levadura-glucosa-cloranfenicol (YGC) (Merck®) Composición g/L Extracto de levadura 5.0 D (+) glucosa 20.0 Cloranfenicol 0.1 Agar-agar 14.9
102
Agar Man Rogosa Sharpe hipersacarosa (MRS) (Merck ®) Composición g/L Peptona de caseína 10.0 Extracto de carne 8.0 Extracto de levadura 4.0 D (+) Glucosa 20.0 Acetato de sodio 5.0 Citrato de triamonio 2.0 Sulfato de magnesio 0.04 Fosfato de dipotasio 2.0 Polisorbato 80 1.0 Agar-agar 15.0 Adicionar 20% de sacarosa antes de esterilizar. Agar glucosa-peptona de caseína Composición g/L Peptona de caseína 10.0 D (+) glucosa 5.0 Púrpura de bromocresol 0.04 Agar-agar 12.0 Anexo 6. Concentración de hipoclorito de calcio Hipoclorito de calcio al 65% (ClO)2Ca + H2O = 2Cl OH + Ca 149 g 52g 2 x 52 = 104 / 144 = 0.722 x 0.65 = 0.47 Es decir, 47% de Cl utilizable en forma de ácido hipocloroso.
DETERMINACION DE LAS POBLACIONES DETERMINACION DE LAS POBLACIONES MICROBIOLMICROBIOLÓÓGICAS EN EL PROCESO DE GICAS EN EL PROCESO DE
EXTRACCIEXTRACCIÓÓN DE JUGO DE CAN DE JUGO DE CAÑÑA DE AZA DE AZÚÚCAR EN EL CAR EN EL INGENIO MANUELITA S.AINGENIO MANUELITA S.A
Laura Serrano GalvisMicrobiología Industrial
Pontificia Universidad JaverianaFacultad de ciencias
Marzo 6, 2006
INDUSTRIA AZUCARERAINDUSTRIA AZUCARERAINDUSTRIA AZUCARERA
** 13 13 IngeniosIngenios: : mmááss de 200.000ha de 200.000ha cultivadascultivadas..
PPéérdidasrdidas indeterminadasindeterminadas::
** 13% inversi13% inversióón qun quíímicamica
** 25% efecto enzim25% efecto enzimáático tico
** 62% inversi62% inversióón microbioln microbiolóógicagica
Sacarosa en caSacarosa en caññaa
EfluentesEfluentes++
BagazoBagazo
CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICACONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA* Contaminación en campo: Tipo de caña, tipo de cosecha
Cosecha manual Cosecha Cosecha manual Cosecha mecmecáánicnic
Fuente: Gerencia de Fuente: Gerencia de cosecha MANSAMANSA
CaCañña Quemada Caa Quemada Cañña a Verde
CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICACONTAMINACICONTAMINACIÓÓN MICROBIOLN MICROBIOLÓÓGICAGICA
* Condiciones de la caña:
Tiempo de permanencia
Fuente: Gerencia de cosecha MANSA
% de Materia extraña
* Condiciones de la caña:
TransporteFuente: Autor
CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICACONTAMINACICONTAMINACIÓÓN MICROBIOLN MICROBIOLÓÓGICAGICA
CICLO DE EXTRACCIÓNCICLO DE EXTRACCIÓN
Entrada de la caña a la molienda
Molinos Fuente: Autor
* Contaminación en fábrica
MICROORGANISMOSMICROORGANISMOSMICROORGANISMOS* Bacterias
3 grupos principales: productoras de exopolisacáridos, aerobios esporo-formadores, y aerobios no esporo-formadores.
Especies identificadas: Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. megaterium, B. pumilus, B. sterereotermophilus, Leuconostoc mesenteroides, L. dextranicum, Escherichia coli, Enterobacteraerogenes, Citrobacter freundii, Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Corynebacterium sp., Micrococcusluteus, Staphylococcus fragilis y Clostridium sp.
* Levaduras: Saccharomyces cereviseae, S. rouxii, S. pombe, Candida tropicalis, C. mycoderma, C. Intermedia, Kloeckera apiculata, Pichiamembranofaciens, P. farinosa, Kluyvoromyces fragilisy Hansenula anomala.
* Mohos: Penicillium citrovorus, P. funiculosum, Aspergillus variatum, A. niger, Trichoderma viride y Monilia sitophila.
(Duarte et al., 1982; Tallgren et al., 1998)
MICROORGANISMOSMICROORGANISMOSMICROORGANISMOS
CONSECUENCIASCONSECUENCIASCONSECUENCIAS
* Productos del metabolismo microbiano : masa celular, azúcares reductores, manitol, ácidos orgánicos, etanol, nitritos, H2 y CO2
* Efecto melazogénico
* Polisacáridos en los subproductos del proceso
POLISACÁRIDOS BACTERIANOSPOLISACÁRIDOS BACTERIANOS
* Dextranos:
Dextransacarasa
* Levanos:
Levansacarasa
CONTROL MICROBIOLÓGICOCONTROL MICROBIOLCONTROL MICROBIOLÓÓGICOGICO
* Disminución de TP
** Limpiezas
*Agentes biocida:
* Busan 881®
* Lipesa 106C ®
* Nalco 5581®
*
Flautas de vapor
OBJETIVOSOBJETIVOS
General
Determinar las poblaciones microbiológicas presentes en el proceso de extracción de jugos de caña de azúcar mediantemuestreos puntuales en el recorrido del mismo por los molinos, determinando los puntos críticos y correlacionando la información con la evaluación físico-química de los jugos, paraestablecer criterios reales que permitan tomar medidas paracontrolar las pérdidas microbiológicas de sacarosa en un ingenioazucarero.
Específicos
* CuantificarCuantificar la la cargacarga microbiolmicrobiolóógicagica con con queque ingresaingresa la la cacaññaa del del campo al campo al molinomolino mediantemediante la la evaluacievaluacióónn de de muestramuestra directadirecta de de dedeCaCaññaa (DAC).(DAC).
** DeterminarDeterminar la la variacivariacióónn de de laslas poblacionespoblaciones de de microorganismosmicroorganismosdurantedurante el el recorridorecorrido de de loslos jugosjugos a en a en diversosdiversos puntospuntos del del molinomolinomediantemediante muestreosmuestreos puntualespuntuales de de loslos mismosmismos..
** RealizarRealizar aislamientosaislamientos de de loslos microorganismosmicroorganismos parapara obtenerobtenercultivoscultivos purospuros, , describirdescribir la la morfologmorfologííaa de de laslas coloniascolonias y la y la clasificaciclasificacióónn mediantemediante tincitincióónn de Gram.de Gram.
OBJETIVOSOBJETIVOS
Específicos
* Determinar parámetros físico-químicos de los jugos evaluadospara establecer correlaciones con los resultados microbiológicos.
* Focalizar los puntos críticos de acuerdo a las cargasmicrobiológicas encontradas, para sugerir procedimientos de limpieza y desinfección más minuciosos en estos sitios que permitancontrolar dichas cargas.
* Realizar pruebas en el laboratorio con agentes biocida quepermitan evaluar su eficiencia en el control de las cargas de microorganismos con mayor incidencia en el proceso.
OBJETIVOSOBJETIVOS
METODOLOGIAMETODOLOGIA
Ingenio Manuelita
Información recolectada
Toma de MuestrasAnálisis Microbiológico Análisis físico químico
Correlación de resultadosAnálisis estadístico
Evaluación de Biocidas
LUGAR DE TRABAJO
INGENIO MANUELITA:
* Municipio de Palmira (Valle del Cauca)
* TANDEM 2
* Molienda: 6000 Ton/dia
INFORMACIÓN RECOLECTADA
** 40 muestreos, teniendo en cuenta representatividad:40 muestreos, teniendo en cuenta representatividad:Hora de muestreo, procedencia de la caHora de muestreo, procedencia de la cañña, edad del a, edad del cultivo, variedad, tipo de cacultivo, variedad, tipo de cañña, tipo de cosecha (TP), % de a, tipo de cosecha (TP), % de materia extramateria extrañña (a (%ME%ME).).
** Variables
Poblaciones microbiológicas: Agar nutritivo: mesófilosAgar MRS Hipersacarosa, BALPE; Agar YGC, levaduras y mohos; Agar glucosa-peptona de caseína, bacterias Termófilas aerobias.
Análisis físico-químico: pH; Temperatura; % de Pureza, ºBrix y % de sacarosa (POL); Azúcares Reductores, Método de Eynon y Lane; Dextranas, Método de Roberts.
TOMA DE MUESTRAS
ANALISIS ESTADISTICO
* Significancia : 10%
*Efecto de las características de la caña en muestra de DAC:
Yi : µ + Var + Tcaña + edad + % ME + TP + Error
*Evaluación de los jugos en la fábrica:
Yi : µ + pto de muestreo + Error
BIOCIDAS
* Pruebas bactericidas
5, 10, 15Jugo puro100Testigo
5, 10, 1510, 20, 30100Nalco 5581®
5, 10, 155, 10, 20100Lipesa 106C®
5, 10, 155, 10, 20100Busan 881 ®
Tiempos deContacto (min.)
Concentraciones(ppm)
Volumen evaluado (ml)
Agentes biocidas
* % DE INHIBICION UFC/ml inicial – UFC/ml final x 100UFC/ml final
((CeruttiCerutti, 2000, 2000)
RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS
34+/-4.71
35+/-2.88
54+/-6.62
42+/-4.14
25 +/-1.55
25 +/-1.43
Temp °C
5.4+/-0.2Diluido
5.4+/-0.2Colador
5.6+/-0.34° molino
5.7+/-0.32° molino
5.4+/-0.21era Ext
5.4+/-0.2DAC
pHMuestra
*Temperaturas y pH ideales para el desarrollo de microorganismos sacarolíticos y no sacarolíticos.
* 4°molino: se induce la germinación de esporas bacterianas.
* Temperatura ideal para el desarrollo de BALPE
INFLUENCIA DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LA CAÑAINFLUENCIA DE LAS CARACTERINFLUENCIA DE LAS CARACTERÍÍSTICAS DE LA CASTICAS DE LA CAÑÑAA
* Poblaciones microbiológicas
TP: tiempo de permanencia; %ME: % de materia extraña; Man: cosecha manual; Mec: cosecha mecánica; S: significativo; NS: no significativo;
BALPE: bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos.
NSNSNSNSNSSNSSNSS%ME
NSNSNSNSNSSNSSNSSTP
NSNSNSNSNSNSNSNSNSNSEdad
NSNSNSNSSSSNSNSSTipo de Caña
NSNSNSNSNSNSNSNSNSNSVariedad
MecManMecManMecManMecManMecManTipo de Cosecha
TermófilasaerobiasMohosLevadurasBALPEMesófilosFactores
** TestTest de de TukeyTukey
2.242.201.622.30Termófilasaerobias
3.303.583.303.83Mohos
5.18ª5.54ª5.15ª5.90ªLevaduras
4.99ª5.45ª4.925.28 BALPE
7.197.397.48ª7.79ªMesófilos
QuemadaVerdeQuemadaVerde
Cosecha MecánicaCosecha manualGrupos microbianos
Poblaciones microbiológicas Log UFC/ml
ª : Diferencia significativa
INFLUENCIA DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LA CAÑAINFLUENCIA DE LAS CARACTERINFLUENCIA DE LAS CARACTERÍÍSTICAS DE LA CASTICAS DE LA CAÑÑAA
*Parámetros físico-químicos
TP: tiempo de permanencia; %ME: % de materia extraña; Man: cosecha manual; Mec: cosecha mecánica; S: significativo; NS: no significativo; BALPE: bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos.
NSNSNSNSNSNSNSNSNSNS%ME
NSNSNSSNSNSNSNSNSNSTP
NSNSNSNSNSNSNSNSNSNSEdad
NSNSNSSNSNSNSNSNSNSTipo de Caña
NSNSNSNSNSNSNSNSNSNSVariedad
MecManMecManMecManMecManMecManTipo de Cosecha
%Azúcaresreductores
Dextranos(ppm)%Pureza%SacarosaºBrixFactores
INFLUENCIA DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LA CAÑAINFLUENCIA DE LAS CARACTERINFLUENCIA DE LAS CARACTERÍÍSTICAS DE LA CASTICAS DE LA CAÑÑAA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Caña larga verde Caña larga quemada
Tipo de caña
Dex
tran
os (p
pm)
Promedio Dextranos
54
56
58
60
62
64
66
68
.10-30 30-50 50-70 70-90 90-110
Tiempo de permanencia (horas)
Dext
rano
s (p
pm)
* La concentración de dextranos en DAC : relación significativa con el tiempo de permanencia y el tipo de caña (cosecha manual)
INFLUENCIA DE LAS CARACTERÍSTICAS DE LA CAÑAINFLUENCIA DE LAS CARACTERINFLUENCIA DE LAS CARACTERÍÍSTICAS DE LA CASTICAS DE LA CAÑÑAA
Poblaciones microbiológicas y su correlación con las características físico-químicas por punto de muestreoPoblaciones microbiolPoblaciones microbiolóógicas y su correlacigicas y su correlacióón con las n con las caractercaracteríísticas fsticas fíísicosico--ququíímicas por punto de muestreomicas por punto de muestreo
* Cuantificación microbiológica: bacterias mesófilas, BALPE, levaduras, mohos y termófilas.
10 310 410 610 710 8Diluido
10 310 410 610 610 8Colador
10 410 310 310 410 64º molino
10 310 410 510 610 72º molino
10 310 410 610 610 81era Ext
10 210 310 510 510 7Dac
TermófilasAerobiasMohosLevadurasBALPEMesófilosMuestra
MESÒFILOSMESÒFILOSMESÒFILOS
5,80
6,00
6,20
6,40
6,60
6,80
7,00
7,20
7,40
7,60
7,80
8,00
Dac 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Log
UFC
/ml
Mesófilos
NSS ( - )NSNSNSNSDextranos (ppm)
NSNSNSS (+)NSNS%Azúcares reductores
NSNSNSNSNSNSPureza
NSNSS (+)NSNSNS% Sacarosa
NSNSS (+)NSNSNS°Brix
DiluidoColador4° molino2° molino 1era ExtDACCaracterísticas físico-químicas
BALPEBALPEBALPE
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Dac 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Log
UFC
/ml
BALPE
S (+)NSNSNSNSNSDextranos (ppm)
NSNSNSNSNSNS%Azúcares reductores
NSNSNSNSNSS ( - )Pureza
NSNSNSNSNSS ( - )% Sacarosa
NSNSNSNSNSS ( - )°Brix
DiluidoColador4° molino2° molino 1era ExtDACCaracterísticas físico-químicas
LEVADURASLEVADURAS
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
Dac 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Log
UFC
/ml
Levaduras
NSNSNSNSNSNSDextranos (ppm)
NSNSNSNSNSS ( - )%Azúcares reductores
NSNSNSNSNSNSPureza
NSNSS (+)NSNSNS% Sacarosa
NSNSS (+)NSNSNS°Brix
DiluidoColador4° molino2° molino 1era ExtDACCaracterísticas físico-químicas
HONGOS FILAMENTOSOSHONGOS FILAMENTOSOSHONGOS FILAMENTOSOS
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
Dac 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Log
UFC
/ml
Mohos
NSNSNSNSS (+)NSDextranos (ppm)
NSNSNSNSNSNS%Azúcares reductores
NSNSNSNSNSNSPureza
NSNSNSNSNSNS% Sacarosa
NSNSNSNSNSNS°Brix
DiluidoColador4° molino2° molino 1era ExtDACCaracterísticas físico-químicas
BACTERIAS TERMÒFILASBACTERIAS TERMÒFILASBACTERIAS TERMÒFILAS
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
Dac 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Log
UFC
/ml
Termófilas Aerobias
S ( - )NSNSS ( - )NSNSDextranos (ppm)
S ( - )NSNSNSNSNS%Azúcares reductores
S ( - )NSNSNSNSNSPureza
S ( - )NSNSNSNSNS% Sacarosa
S ( - )NSNSNSS ( - )NS°Brix
DiluidoColador4° molino2° molino 1era ExtDACCaracterísticas físico-químicas
CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOSCLASIFICACICLASIFICACIÓÓN DE LOS MICROORGANISMOSN DE LOS MICROORGANISMOS
* Población de mesófilos
0,00%
5,00%
10,00%
15,00%
20,00%
25,00%
30,00%
35,00%
40,00%
45,00%
50,00%
DAC 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Bacilos Gram neg Bacilos Gram post Cocos Gram neg
Cocos Gram post Cocobacilos Gram neg Cocobacilos Gram post
CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOSCLASIFICACICLASIFICACIÓÓN DE LOS MICROORGANISMOSN DE LOS MICROORGANISMOS* Coloración de Gram de colonias de mesófilos
Bacilos Gram positivos
Bacilos Gram negativos
Fuente: Cenicaña
POBLACIÓN DE BALPEPOBLACIPOBLACIÓÓN DE BALPEN DE BALPE
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
DAC 1era Ext 2do Mol 4to Mol Colador Diluido
Cocobacilos gram post Bacilos gram post
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
DAC 1era Ext 2do Mol 4to Mol Colador Diluido
Cocobacilos gram post Bacilos gram post
COLONIAS DE BALPECOLONIAS DE BALPECOLONIAS DE BALPE
Fuente: autor
POBLACIÓN DE TERMÓFILASPOBLACIPOBLACIÓÓN DE TERMN DE TERMÓÓFILASFILAS
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
90,00%
DAC 1era Ext 2do molino 4to molino Colador Diluido
Bacilos Gram positivos Bacilos Gram negativos
POBLACIÓN DE LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOS
POBLACIPOBLACIÓÓN DE LEVADURAS Y N DE LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOSHONGOS FILAMENTOSOS
Fuente: autor
Fuente: autor
POBLACIÓN DE LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOS
POBLACIPOBLACIÓÓN DE LEVADURAS Y N DE LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOSHONGOS FILAMENTOSOS
a. Aspergillus sp. b. Penicillium sp.
c. Mucor sp. d. Monilia sp.
POBLACIÓN DE LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOS
POBLACIPOBLACIÓÓN DE LEVADURAS Y N DE LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOSHONGOS FILAMENTOSOS
EVALUACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DE BACTERICIDASEVALUACIEVALUACIÓÓN DE LA EFECTIVIDAD DE BACTERICIDASN DE LA EFECTIVIDAD DE BACTERICIDAS
** Busan 881®: Poblaciones microbiológicas
0.00%0,89%0,66%3,40%9,63%20ppm-15min
20,00%0.00%1,74%0,68%1,34%20ppm-10min
0.00%11,81%1,30%3,27%0.00%20ppm-5min
10,32%0.00%4,57%4,01%9,32%10ppm-15min
0.00%0.00%0.00%2,30%7,59%10ppm-10min
0.00%0.00%0.00%0.00%3,14%10ppm-5min
0.00%0.00%1,03%2,11%2,81%5ppm-15min
0.00%0.00%1,94%0.00%1,60%5ppm-10min
0.00%4,15%0.00%0.00%2,97%5ppm-5min
% Inhib% Inhib% Inhib% Inhib% InhibConcentraciones
TermófilasMohosLevadurasBALPEMesófilos
BUSAN 881 ®: PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOSBUSAN 881 BUSAN 881 ®®: PAR: PARÁÁMETROS FMETROS FÍÍSICOSICO--QUQUÍÍMICOSMICOS
105,000,4591,0416,5118,1320ppm-15min
105,000,4491,0716,518,1210ppm-15min
107,670,4591,0516,4418,055ppm-15min
102,330,4491,1116,518,11Control
Dextranos(ppm)
% Azúcaresreductores
Pureza% sacarosaºBrixParámetros
BUSAN 881 ®: ENSAYO ADICIONALBUSAN 881 BUSAN 881 ®®: ENSAYO ADICIONAL: ENSAYO ADICIONAL
0.00%20,46%12,44%4,25%9,32%100ppm-15min
0.00%19,06%7,57%4,60%12,23%100ppm-10min
0.00%17,81%5,73%10,79%8,22%100ppm-5min
0.00%11,85%6,46%17,40%6,13%50ppm-15min
0.00%19,74%11,79%4,25%10,39%50ppm-10min
0.00%2,90%4,24%7,82%17,02%50ppm-5min
%Inhib%inhib%Inhib%Inhib%InhibConcentraciones
TermófilasMohosLevadurasBPEMesófilos
940,4592,9418,4319,83Control 15min
630,4392,6818,3719,82100ppm-15min
790,4792,8818,3819,7950ppm-15min
630,4692,9518,4619,86Control
Dextranos(ppm)
%AzúcaresReductoresPureza %SacarosaºBrix
LIPESA 106C ® (GLUTARALDEHIDO):POBLACIONES MICROBIOLÓGICAS.
LIPESA 106C LIPESA 106C ®® (GLUTARALDEHIDO):(GLUTARALDEHIDO):POBLACIONES MICROBIOLPOBLACIONES MICROBIOLÓÓGICAS.GICAS.
0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%20ppm-15min
0.00%0,00%0.00%0.00%0.00%20ppm-10min
0.00%5,87%0.00%0,48%0.00%20ppm-5min
0.00%0.00%0.00%0.00%4,34%10ppm-15min
0.00%0.00%0.00%0.00%4,19%10ppm-10min
0.00%0.00%0.00%0.00%2,81%10ppm-5min
0.00%0.00%0.00%0.00%6,01%5ppm-15min
0.00%0.00%0.00%0.00%1,38%5ppm-10min
0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%5ppm-5min
% Inhib% Inhib% Inhib% Inhib% InhibConcentraciones
TermófilasMohosLevadurasBALPEMesófilos
LIPESA 106C ® (GLUTARALDEHIDO):PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS.
LIPESA 106C LIPESA 106C ®® (GLUTARALDEHIDO):(GLUTARALDEHIDO):PARPARÁÁMETROS FMETROS FÍÍSICOSICO--QUQUÍÍMICOS.MICOS.
920,4488,7415,9517,9620ppm-15min
950,4488,7315,9617,9710ppm-15min
1100,4588,6915,9217,935ppm-15min
1080,4488,6715,9617,98Control
Dextranos(ppm)
%AzúcaresreductoresPureza% sacarosaºBrixPARÁMETROS
LIPESA 106C ®: ENSAYO ADICIONALLIPESA 106C LIPESA 106C ®®: ENSAYO ADICIONAL: ENSAYO ADICIONAL
3,92%1,35%6,75%8,21%2,04%200ppm-15min
7,82%5,95%1,01%6,37%0.00%200ppm-10min
9,59%2,34%3,82%6,88%0,27%200ppm-5min
0.00%11,28%1,74%7,25%0.00%100ppm-15min
1,48%5,95%5,48%0.00%0.00%100ppm-10min
2,01%0.00%0.00%0.00%0.00%100ppm-5min
%Inhb%Inhb%Inhb%Inhb%InhbConcentraciones
TermófilasMohosLevadurasBPEMesófilos
630,4391,0816,9418,6200ppm-15min
790,4791,1216,9418,59100ppm-15min
630,4690,8516,9818,69Control 1
Dextranos(ppm)
%AzúcaresreductoresPureza %SacarosaºBrix
NALCO 5581 (DITIOCARBAMATO):POBLACIONES MICROBIOLÓGICAS
NALCO 5581 (DITIOCARBAMATO):NALCO 5581 (DITIOCARBAMATO):POBLACIONES MICROBIOLPOBLACIONES MICROBIOLÓÓGICASGICAS
5,86%4,19%0.00%6,03%3,33%30ppm-15min
5,73%2,57%0.00%3,95%0.00%30ppm-10min
10,17%0.00%0.00%5,11%3,62%30ppm-5min
0.00%7,99%0.00%5,35%3,21%20ppm-15min
2,23%3,55%0.00%4,66%3,72%20ppm-10min
2,12%2,94%0.00%5,28%0,92%20ppm-5min
9,68%6,85%0.00%6,34%1,03%10ppm-15min
10,40%18,90%0.00%4,18%0.00%10ppm-10min
0.00%7,52%0.00%5,79%0.00%10ppm-5min
% Inhib% Inhib% Inhib% Inhib% InhibConcentraciones
TermófilasMohosLevadurasBALPEMesófilos
NALCO 5581 ® (DITIOCARBAMATO):PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS
NALCO 5581 NALCO 5581 ®® (DITIOCARBAMATO):(DITIOCARBAMATO):PARPARÁÁMETROS FMETROS FÍÍSICOSICO--QUQUÍÍMICOSMICOS
118,000,4490,816,8718,5930ppm-15min
115,670,4590,8216,9118,6220ppm-15min
107,670,4690,6616,8718,6210ppm-15min
110,330,4490,7416,9418,68Control
Dextranos(ppm)
%AzúcaresreductoresPureza
%sacarosaºBrixParámetros
HIPOCLORITO DE CALCIOHIPOCLORITO DE CALCIOHIPOCLORITO DE CALCIO
0.00%45,21%79,72%76,82%32,04%1% ppm - 15min
3,78%22,93%59,43%56,67%31,11%1% - 10min
0,95%17,81%39,15%25,28%27,91%1% - 5min
1,81%17,81%79,72%72,71%30,97%0.5% - 15min
4,59%12,22%59,43%68,61%26,39%0.5% - 10min
0.00%9,56%11,06%11,40%7,67%0.5% - 5min
% Inhib% Inhib% Inhib% Inhib% InhibConcentraciones
TermófilasMohosLevadurasBALPEMesófilos
Concentraciones: 0.5% y 1% de hipoclorito al 65%Poblaciones microbiológicas
HIPOCLORITO DE CALCIOPARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS.
HIPOCLORITO DE CALCIOHIPOCLORITO DE CALCIOPARPARÁÁMETROS FMETROS FÍÍSICOSICO--QUQUÍÍMICOS.MICOS.
1730,6385,0414,3216,847,11% 15 min.
1650,6586,614,8717,176,40.5% 15 min.
1570,7187,6415,3917,565,4Control
Dextranos(ppm)
%AzúcaresreductoresPureza
%sacarosaºBrixpHParámetros
CONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONES
** Las poblaciones de microorganismos que entran a la fábrica, en los tallos de la caña de azúcar,especialmente mesófilos, BALPE y levaduras, y la concentración de dextranos en el jugo, dependen del tipo de caña, el tipo de cosecha, el tiempo de permanencia y el % de materia extraña.
** La población más alta de microorganismos encontrada en DAC corresponde a bacterias mesófilas (107 UFC/ml), seguida de la población de bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos (BALPE) (105), levaduras (105), mohos (103) y termófilas (102).
CONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONES
* Punto de contaminación más crítico: 1era extracción, donde hay un incremento significativo de las poblaciones en la muestra deljugo.
* Poblaciones en el jugo de primera extracción permanecen relativamente constantes en los siguientes puntos de muestreo.
* Se encontró predominio bacilos Gram negativos y Grampositivos; en menores proporciones se encuentran cocos Gramnegativos, cocos Gram positivos y cocobacilos.
* En BALPE predominan los bacilos largos y delgados Grampositivos y en menor proporción los coco-bacilos Gram positivos.
* Las bacterias termófilas aerobias presentes en el molino (especialmente en el 4º molino) son, en su mayoría, bacilos Gram. positivos y son muy variables y heterogéneas en los diferentes puntos de muestreo.
* Los parámetros físico-químicos determinados no son buenos indicadores de las poblaciones microbiológicas.
CONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONES
* Los biocidas Busan 881® (5, 10, 20, 50 y 100ppm), Lipesa106C® (5, 10, 20, 100 y 200 ppm) y Nalco 551® (10, 20, y 30 ppm) no mostraron efectividad en el control de las poblaciones microbiológicas del jugo de 1era extracción.
* El hipoclorito de calcio al 65% a una concentración de 0.5%, es el biocida más efectivo de los evaluados, con disminuciones importantes de las poblaciones de BALPE y levaduras, hasta del 72% de inhibición.
CONCLUSIONESCONCLUSIONESCONCLUSIONES
RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES
** Determinación de Bacterias ácido-lácticas productoras de exopolisacáridos en medio MRS hipersacarosa.
* Continuar con estudios sobre la microflora del tándem que permitan identificar los géneros y especies en los jugos y determinar la incidencia de cada uno de ellos sobre el deterioroe inversión de la sacarosa en la etapa de molienda. Así mismo, incluir análisis del jugo en etapas posteriores del proceso.
* Continuar con las políticas de higiene en el área de molinos y estandarizar las rutinas de limpieza.
** Establecer rutinas de limpieza y desinfección en las superficies con que está en contacto la caña desde que es descargada al conductor en el patio, hasta que llega a la 1era extracción, para evitar la inoculación continua de microorganismos al jugo por parte de estas superficies.
* Aplicar Hipoclorito de calcio al 65% en el jugo de 1era extracción en una concentración de 0.5% para el control de las poblaciones microbiológicas, no sin antes considerar las implicaciones del incremento de pH en el jugo para etapas posteriores del proceso.
RECOMENDACIONESRECOMENDACIONES
AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS
* IngenioManuelita
* Ing. Jaime Cardona
* Personal del laboratorio central
*Centro de investigación de la caña de azúcar de Colombia: CENICAÑA.
* María Luisa Guzmán
* Alberto Palma.
*Pontificia Universidad Javeriana
