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5/15/2018 1893 Klemperer 2012 Huhn Antitoxin Ei - slidepdf.com
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174 WISSENSCHAFT · SPECIAL: ANTIKÖRPERDESIGN
BIOspektrum | 02.12 | 18. Jahrgang
LARS NIEDERSTADT1, RÜDIGER SCHADE2
1ROBERT-KOCH-INSTITUT BERLIN2INSTITUT FÜR PHARMAKOLOGIE, CHARITÉ-UNIVERSITÄTSMEDIZIN BERLIN
The IgY-technology includes all aspects of the production of specific anti-
bodies (Ab) in laying hens as for example animal keeping, immunisation
as well as IgY-extraction procedures. IgY-Ab can be used for all immunolo-gical techniques similar to the use of IgG-antibodies and, despite of the
aspect of animal welfare, offers several advantages. For example, from
one laying hen ca. 20 g total IgY can be obtained within one year. So,
IgY-Ab are suited for therapeutic/prophylactic purposes which needs
relatively large quantities of Ab.
DOI: 10.1007/s12268-012-0162-3© Springer-Verlag 2012
IgY – historischer Abriss
ó Inspiriert durch die Arbeit von Paul Ehr-lich „Ueber Immunität durch Vererbung undSäugung“ im Jahr 1892 [1] untersuchte FelixKlemperer im selben Jahr, ob sich bei Hüh-nern Immunität gegen Tetanusbazillen errei-chen lässt und ob sich diese Immunität auchim Ei wiederfindet (Abb. 1). Er fand heraus,dass tatsächlich die Immunität auf das Ei der-artig immunisierter Hühner übertragen wird,und zwar ausschließlich auf das Eidotter,nicht aber auf das Eiweiß [2]. Damit warbewiesen, dass durch Immunisierung erzeug-te Antitoxine aus dem Blut der immunisier-
ten Hühner in das Eidotter gelangen. Mehrals ein halbes Jahrhundert fanden die Ergeb-
nisse von Klemperer kaum Beachtung. In derzweiten Hälfte des letzten Jahrhundertsänderte sich die Situation, zurückzuführenauf das Erstarken des Tierschutzgedankens.Initiiert wurde diese Bewegung insbesonde-re durch das Buch von Russell und Burch(1959), The Principles of Human Experimental
Technique [3]. In den folgenden 20 Jahrenfanden die Studien von Klemperer mehr undmehr Beachtung, da sich spezifische Immun-globulin-Y-Antikörper (IgY-Ak) unblutig ausdem Eidotter immunisierter Hennen isolie-ren ließen. Seit den 1980er-Jahren fand dieAnwendung von IgY-Ak breitere Akzeptanz,
zumal Sekundärreagenzien, wie z. B. Anti-IgY-Ak, nun auch kommerziell verfügbar
waren. Seit 1996 ist der Begriff „IgY-Techno-logie“ (1995 eingeführt durch Dr. Claus Staak,[4]) ein international anerkannter Terminus
technicus.
Struktur des IgY-Antikörpers im
Vergleich mit IgG
Obwohl das IgY funktionell eher dem IgG ent-spricht, ähnelt es seiner Struktur nach mehrdem IgE bzw. IgA und ist mit diesen näherverwandt als mit IgG. IgY besteht aus zweischweren und zwei leichten Ketten, wobei dieschwere Kette eine variable und vier kon-stanten Domänen und die leichte Kette einevariable und eine konstante Domäne besitzt(Abb. 2). Das Molekulargewicht von IgYbeträgt 168.000 Dalton (leichte Kette: rund19.000 Dalton; schwere Kette: rund 65.000Dalton). Damit ist IgY deutlich schwerer alsIgG (rund 160.000 Dalton). Wie beim IgG istder Fc-Teil Träger verschiedener biologischerFunktionen. Der isoelektrische Punkt (IP) derIgY-Ak liegt zwischen 5,7 und 7,6, derjenigeder IgG-Ak zwischen 6,1 und 8,5. Damit istdas IgY-Molekül hydrophober als IgG [5]. EineBesonderheit im Unterschied zum IgG ist diestark reduzierte sogenannte hinge region
(Gelenkregion), die normalerweise für einegewisse Flexibilität des Fab-Teils sorgt. Eswird angenommen, dass dies zu Antikörpernmit unterschiedlicher Spezifität führen kann,wenn Kaninchen und Hühner mit demselben
Antigen immunisiert werden. Für den rezep-torabhängigen IgY-Transport vom Blut in dasEidotter ist ein Aminosäuremotiv wichtig, dasaus Histidin–Glutaminsäure–Alanin–Leucin(HEAL) besteht und sich zwischen der zwei-ten und dritten konstanten Domäne befindet(Positionen 429–432) [6].
Unterschiede zwischen IgY- und
IgG-Antikörpern
In Tabelle 1 sind einige unterschiedliche Cha-rakteristika von IgY- und IgG-Ak aufgeführt.
Abgesehen davon lassen sich aufgrund derphylogenetischen Distanz zwischen der Klas-se der Aves und der Mammalia im Huhn spe-zifische Antikörper gegen in der Phylogene-se der Säuger hochkonservierte Proteine
IgY-Technologie
Was sind und was können polyklonaleaviäre Antikörper?
¯ Abb. 1: Originalprotokoll des
richtungweisenden „Tetanus-
versuches“ von Felix Klemperer
im Jahre 1893 [2]. Man beachte
den minimalen Tiereinsatz.
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BIOspektrum | 02.12 | 18. Jahrgang
erzeugen. Immunisierungen von Kaninchenmit derartigen Antigenen bleiben in derRegel erfolglos, weil das Immunsystem desKaninchens das Antigen nicht als fremd
erkennt.
Haltung und Immunisierung von
Hühnern („klassische“ versus
gene gun-Immunisierung)
Die Haltung von Hühnern ist unproblema-tisch. Eine artgerechte Haltung ist in spe-ziell für diese Zwecke entwickelten Käfigenmöglich, von den für Tierversuchsgeneh-migungen zuständigen Landesbehördenwird inzwischen aber eine Bodenhaltungbevorzugt. Dies ist möglich in Boxen, die mit
Legenestern und Sitzstangen ausgerüstetsind. Es ist sinnvoll, jeweils ein braunes undein weißes Huhn zusammen in einer Boxzu halten, um die Eier zweifelsfrei zuord-nen zu können.
Die Immunisierung der Hühner erfolgtintramuskulär in den Musculus pectoralis,
jeweils rechts und links. Ein Injektionsvo-lumen von insgesamt einem Milliliter soll-te nicht überschritten werden (siehe Über-sichten in [7]). Da im Huhn Gedächtnis-zellen nicht vor drei Wochen nach Grund-immunisierung nachzuweisen sind, erfol-gen Boost-Immunisierungen nach ca. vierWochen. In der Regel wird die Antigenlö-sung 1:1 mit einem Adjuvans gemischt zurHerstellung einer stabilen Emulsion.Obwohl kontrovers diskutiert (Gewebeun-verträglichkeit), gilt das Freund’sche Adju-vans ( Freund’s complete/ incomplete adju-
vans, FCA/FIA) nach wie vor als der Gold-Standard, da es zuverlässige Ergebnissegewährleistet. Abhängig vom Antigen (Ag)ist eine Menge von 100 Mikrogramm aus-reichend zur Erreichung eines guten Ak-
Titers, z. B. bei Proteinen. Bei Peptidenkann es sinnvoll sein, die Ag-Konzentra-tion auf 200 bis 300 Mikrogramm zu erhö-hen, hervorragende Ak-Titer können auchmit einer Ag-Menge zwischen zehn und 20Mikrogramm erreicht werden, allerdingserst nach mehrfacher Immunisierung [8].
Eine Alternative zur „klassischen“ Immu-nisierung ist die gene gun-Immunisierung(Abb. 3). Bei dieser Form der ballistischenImmunisierung wird das Antigen mittelsPlasmidvektoren in die Versuchstiere ein-
gebracht. Durch die Beschichtung von kol-loidalen Goldpartikeln (Durchmesser: einMikrometer) mit rekombinanten Nuklein-säuren wird ein physiologisch unbedenkli-ches Trägermaterial erzeugt, welches mittels
Gasimpuls in die oberen Schichten der Epi-dermis appliziert werden kann. Beim Durch-dringen der behandelten Hautschichten ver-bleibt Antigen-codierendes Erbgut in den
durchschlagenen Zellen, wodurch eineTransfektion der Zellen mit den verwende-ten Expressionsvektoren erreicht werdenkann.
Die durch die Expression der Immuni-sierungsvektoren gebildeten Antigenegelangen in der Folge, je nach Beschaffen-heit des Antigens, über sekretorische Stoff-wechselwege oder durch Apoptose der Zel-le in den extrazellulären Raum, wodurcheine effektive Immunreaktion möglich wird[9]. In Abhängigkeit der Körpergröße und
Spezies des Versuchstieres sind schon gerin-ge DNA-Mengen für die Anwendung zurImmunisierung ausreichend (Dosis: vierMikrogramm pro Huhn; zwei Mikrogrammpro Maus).
IgY-Extraktion
IgY kann aus dem Eidotter mit unterschied-lich aufwendigen Methoden (hinsichtlichZeit, Kosten) extrahiert werden [7]. Wir ver-wenden ein Präzipitationsverfahren nachPolson [10] auf der Basis von Polyethylen-glykol 6.000. Dieses Verfahren benötigt einenur geringe Laborkapazität sowie einengeringen Einsatz von Chemikalien. Eingenaues Protokoll sowie ein entsprechendesVideo findet sich bei Pauly et al. [11]. Mitdiesem Protokoll kann eine geübte Labor-kraft IgY aus 86 Eiern pro Woche separatisolieren, wobei die IgY-Ausbeute ca. 80 Pro-zent und die Reinheit zwischen 70 und80 Prozent liegt. Bei dieser Methode beträgtder Gesamt-IgY-Gehalt ca. 60 Milligrammpro Ei. Bei jüngeren Tieren ist dieser Wertetwas geringer, bei älteren Hennen höher
und kann bis 100 Milligramm pro Dottererreichen. Im Dotter ist nur IgY vorhanden.Die IgY-Konzentration im Serum verglichenmit der im Eidotter wird kontrovers disku-tiert: Es wird einerseits beschrieben, dassdie IgY-Konzentration im Serum höher istals im Dotter, andererseits, dass das Gegen-teil der Fall ist, oder auch, dass sich beideKonzentrationen nicht unterscheiden. Dieeinfache Erklärung für diese Diskrepanzscheint ein signifikanter IgY-Biorhythmuszu sein [8]. Da das Serum-IgY mit einer Ver-
zögerung von etwa drei bis fünf Tagen imDotter erscheint, unterscheiden sich auchdie aktuellen Rhythmen und damit die IgY-Konzentration zwischen Serum-IgY und Dot-ter-IgY.
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Anwendung aviärer Antikörper –
aktuelle und zukünftige Bereiche
IgY-Ak werden in vielen analytischen und dia-gnostischen Plattformen eingesetzt. Es gibtinzwischen weltweit kommerzielle Anbieter,die sich auf die Produktion von IgY-Ak spe-zialisiert haben. Insofern muss heute die Wer-
tigkeit der IgY-Ak nicht mehr besonders her-vorgehoben werden. Abgesehen von der
Bedeutung der IgY-Ak als diagnostisch/ana-lytisches Werkzeug, soll ein Aspekt der IgY-Technologie betont werden: Man kann voneiner Legehenne enorme Mengen vonGesamt-IgY erhalten. Ein Huhn legt relativ
kontinuierlich fünf bis sieben Eier pro Wochebis etwa zur 72. Lebenswoche. Danach sinktdie Legeleistung. Nach unseren Erfahrungenist die reduzierte Legeleistung durch den Ak-
Titer der Eier aus dieser Periode mit Ak-Titernvon teilweise 1:1.000.000 mehr als kompen-siert [8]. In dieser Studie konnten innerhalbvon zwei Jahren IgY-Mengen pro Huhn zwi-schen 33 und 38 Gramm erreicht werden. Daseröffnet Perspektiven für eine prophylakti-sche, therapeutische Anwendung von IgY-Ak.Es gibt eine Vielzahl von Studien, die derar-tige Anwendungen sowohl in der Human- alsauch in der Veterinärmedizin beschreiben.So z. B. als Karies-Prophylaxe durch Spülendes Mundraumes mit IgY-Ak gegen Strepto-
coccus mutans oder mit IgY-Ak gegen Pseu- domonas aeruginosa zur Verhinderung einerSekundärinfektion bei Mukoviszidose-Patien-ten (Übersicht in [12]). Ein wesentlicherBereich der Anwendung spezifischer IgY-Akkönnte zukünftig in der Behandlung vonDurchfallerkrankungen bei neugeborenenFerkeln und Kälbern liegen, indem artifiziel-ler Nahrung spezifische Antikörper z. B.gegen Rotaviren und E. coli beigemischt wer-den. Entsprechende Studien sind in Deutsch-land schon in den 1980er-Jahren durchgeführtworden. Angesichts zunehmender Resisten-zen gegen verschiedene Antibiotika könnteder Einsatz von spezifischen IgY-Ak an Bedeu-tung gewinnen.
Danksagung
Einige der hier vorgestellten Ergebnisse sindim Rahmen eines vom BMBF geförderten Pro-
jekts entstanden (Biologische Gefahrenlagen:Risikobewertung, ultraschnelle Detektion undIdentifizierung von bioterroristisch relevantenAgenzien, BiGRUDI). ó
Literatur[1] Ehrlich P (1892) Ueber Immunität durch Vererbung undSäugung. Zeitschrift für Hygiene und Infektionskrankheiten12:183–203[2] Klemperer F (1893) Ueber natürliche Immunität und ihreVerwerthung für die Immunisierungstherapie. Arch ExpPathol Pharmakol 31:356–382[3] Russel WMS, Burch RL (1959) The Principles of HumaneExperimental Technique. Methuen, London[4] Schade R, Hlinak A (1996) Egg yolk antibodies, state of the art and future prospects. ALTEX 13 (Suppl): 5–9[5] Davalos-Pantoja L, Ortega-Vinuesa JL, Bastos-Gonzalez Det al. (2000) A comparative study between the adsorption of IgY and IgG on latex particles. J Biomater Sci Polym Ed11:657–673[6] Morrison SL, Mohammed SM, Wims LA et al. (2001)
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˚ Abb. 3: A, Gene gun-Immunisierung einer Legehenne. Das Huhn wird auf dem Rücken fixiert,
und die beladenen Goldkugeln werden in den Musculus pectoralis „geschossen“. B, schematische
Darstellung des Prinzips der Plasmid-Immunisierung (Schema nach [13]). C, Immunfluoreszensfär-
bung transfizierter Zellen mit Immunseren nach Gene Gun-Immunisierung (1. Bild: Negativkontrol-
le, folgende Bilder: Positivkontrollen). AG: Antigen; MHC: Haupthistokompatibilitätskomplex.
Weitere Erklärungen im Text.
A B
C
¯ Abb. 2: Vergleich der Struktur
von IgG und IgY. VL, variable
Domäne der leichten Kette; VH,
variable Domäne der schweren
Kette; CL, konstante Domäne der
leichten Kette; CH, konstante
Domäne der schweren Kette; Fab,
Antigen-bindender Teil; Fc, frag-
ment cristalline ; HR, hinge region.Die schwarzen Punkte bedeuten
Kohlehydratketten.
AK-Gewinnung invasiv nicht-invasiv
AK-Ausbeute 200 mg/40 ml Blut 50–100 mg/Ei
5–7 Eier/Woche
AK-Ausbeute/Monat 200 mg ca. 1.000–2.800 mg
Interferenz mit Säuger-IgG (Rheumafaktoren) ja nein
Interferenz mit HAMA (human anti mouse antibody ) ja nein
Interferenz mit Säuger-Komplementfaktoren ja nein
Protein-A/G-Bindung ja nein
Tab. 1: Vergleich einiger Charakteristika von IgG- und IgY-Antikörpern (AK).
IgG (Kaninchen) IgY (Huhn)
176 WISSENSCHAFT · SPECIAL: ANTIKÖRPERDESIGN
BIOspektrum | 02.12 | 18. Jahrgang
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177HERSTELLERNACHWEIS SPECIAL: ANTIKÖRPERDESIGN
BIOspektrum | 02.12 | 18. Jahrgang
AUTOREN
Lars Niederstadt Jahrgang 1980. 2008 Biologie-Di-
plom an der FU Berlin. 2008–2012
Promotion am Robert-Koch-Institut
(RKI), Berlin. Seit 2008 Mitarbeiter
am RKI, Fachgebiet „Virale Infektio-
nen“.
Rüdiger Schade Jahrgang 1945. 1974 Promotion zum Dr. rer. nat. (Tierphysiologie), HU Berlin.
1976–2011 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Pharmakologie und
Toxikologie der HU Berlin. 1982 Facultas docendi für Immunologie. 1983 Habili-
tation zum Dr. sc. nat. (Immunologie). 1986 Anerkennung als Fachbiologe in der
Medizin (Immunologie). 2002 Ernennung zum außerplanmäßigen Professor.
[8] Pauly D, Dorner M, Zhang X et al. (2009) Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibo-dy titer development in chickens immunized with ricin andbotulinum toxins over a two-year period. Poult Sci 88:281–290[9] Witkowski PT, Bourquain DR, Hohn O et al. (2009) Genegun-supported DNA immunisation of chicken for straightfor-
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[11] Pauly D, Chacana PA, Calzado EG et al. (2011) IgY technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolkby polyethylene glycol (PEG) precipitation. JoVE 51,DOI: 10.3791/3084[12] Schade R, Zhang X-Y, Terzolo HR (2007) Use of IgY anti-bodies in human and veterinary medicine. In: Huopalahti R,
López-Fandin–o R, Anton M, Schade R (Hrsg) Bioactive EggCompounds. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. 213–222[13] Bolhassani A, Yazdi SR (2009) DNA immunization as anefficient strategy for vaccination. Avicenna J Med Biotechnol1:71–88
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Rüdiger Schade
Charité – Universitätsmedizin Berlin
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