2 Metodos Moleculares Em Farmacogenetica

DA BIOLOGIA MOLECULAR MEDICINA: MTODOSCOMUMENTE UTILIZADOS EM FARMACOGENTICA

FROM MOLECULAR BIOLOGY TO MEDICINE: METHODS COMMONLY USED IN PHARMACOGENETICS

Mario Hiroyuki Hirata1, Vladimir Tavares2, Rosario Dominguez Crespo Hirata1

1Docentes. 2Doutor do Programa de Ps-Graduao em Farmcia Analises Clinicas. Departamento de Anlises Clnicas e Toxicol-gicas. Faculdade de Cincias Farmacuticas USP.Correspondncia: Prof. Dr. Mario H. Hirata. Av. Prof. Lineu Prestes, 580 B. 17,CEP 05508-900 So Paulo - SP. Tel.: (11) 3091-3634 - FAX: (11) 3813-2197 - E-mail: [email protected]

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC. Da biologia molecular medicina: mtodos comumente utilizados emfarmacogentica. Medicina (Ribeiro Preto) 2006; 39 (4): 522-34.

RESUMO: Nesta reviso, foram discutidos os procedimentos para obteno, manuseio earmazenamento de amostras biolgicas teis em testes moleculares. Mtodos para triagem edeteco direta de mutaes e polimorfismos genticos foram apresentados. Os princpios,estratgias, aplicaes e limitaes de variaes da reao em cadeia pela polimerase (PCR),tais como eletroforese em gel com gradiente de desnaturao (DGGE), polimorfismo de confor-mao de fita simples (SSCP), polimorfismo de tamanhos de fragmentos de restrio (RFLP),amplificao alelo oligonucleotdeo-especfica (PCR-ASO), PCR em tempo real PCR, arranjosde DNA e outras tcnicas moleculares, foram comentados.

Descritores: Farmacogentica. Reao em Cadeia da Polimerase. Polimorfismo Conforma-cional de Simples Fita. Polimorfismo de Fragmento de Restrio. DNA- Arranjos. Eletroforeseem Gradiente em Gel Desnaturante.

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Medicina, Ribeiro Preto, Simpsio: FARMACOGENTICA39 (4): 522-34, out./dez. 2006 Captulo II

ABREVIATURAS

PCR, reao em cadeia pela polimeraseSouthern blot, tcnica de transferncia de DNA

RFLP, polimorfismo de tamanhos de frag-mentos de restrio

SDS, duodecil sulfato de sdioDEPC, dietilpirocarbonatoDGGE, eletroforese em gel com gradiente de

desnaturaoSSCP, polimorfismo de conformao de fita

simplesHDA, anlise de heteroduplexCCM, mtodo da clivagem qumicaPTT, teste da protena truncada

PCR-ASO, amplificao alelo oligonucleotdeo-especfica

1- INTRODUO

A procura pela teraputica individualizada ecom o menor risco de efeitos indesejveis ou colate-rais sempre foi uma meta dos mdicos, farmacologis-tas, farmacuticos. Para isso tm sido pesquisadasnovas formas e formulaes farmacuticas procuran-do aumentar a eficcia e reduzir a toxicidade dos me-dicamentos. No entanto, at recentemente, os estu-dos dirigidos com abordagem gentica de pacientesforam pouco explorados. A descrio da seqnciacompleta do genoma humano trouxe perspectivas deaplicaes potenciais das informaes do genoma,transcriptoma e proteoma para o estudo de novos al-vos teraputicos e da possibilidade, em um futuro bre-ve, de uso da medicao individualizada.

A abordagem de mtodos utilizados no estudo

523

Mtodos moleculares em farmacogentica

da farmacogentica ser realizada de forma sucinta eclara para facilitar a compreenso e estimular o leitor aampliar seu conhecimento procurando textos mais es-pecficos e aprofundados em cada tema apresentado.Os assuntos esto divididos em tpicos que abrangemprocedimentos de obteno de amostras, mtodos ex-trao de cidos nuclicos e mtodos de triagem demutaes e de estudo de polimorfismos genticos.

2- PROCEDIMENTOS DE OBTENO DEAMOSTRAS

Os procedimentos de obteno de amostras bi-olgicas so parte da fase pr-analtica dos estudosfarmacogenticos. Nessa fase, so obtidas informa-es sobre indivduo que est participando do estudoque incluem o tipo de material biolgico a ser coletado,horrio de coleta, procedimento de coleta do material,forma de transporte e armazenamento da amostra, almde dados pessoais como sexo, idade, etnia, dieta, usode medicamentos e outras caractersticas necessriaspara anlise dos resultados. Estas informaes dire-cionaro a maneira que deve ser obtida e conservada,para que ao proceder a anlise no se tenha dvida doresultado que possa ser gerado nos processo analtico.

Na fase pr-analtica, primordial que se verifi-quem os tipos testes a serem realizados e o cido nu-clico a ser isolado para utilizar os procedimentos maisadequados de conservao e armazenamento paramanter a integridade da amostra biolgica1. impor-tante ter em mente que os cuidados no processamentode amostras para obteno de DNA so distintos dosutilizados para a extrao de RNA. Para o isolamentode DNA, as amostras biolgicas podem ser refrigera-das em temperaturas que variam entre 4 a 10C. Poroutro lado, para a anlise de RNA as amostras devemser imediatamente conservadas em temperatura ultra-baixa (-70 a -80 oC), exceto se a extrao do RNA forrealizada imediatamente. Recomenda-se tambm aadio de um conservante de RNA na amostra a serarmazenada, geralmente fornecido comercialmente.

Uma outra observao importante nesta etapa a escolha do material descartvel a ser utilizado paraa conservao da amostra, se for conservada em ni-trognio lquido, ou em congelador de ultra-baixa tem-peratura, os tubos a serem utilizados devem ser resis-tentes nessa temperatura e ter tampa de rosca comanel de vedao, de boa procedncia, e isentos deRNAse e DNAses.

As amostras de tecidos a serem utilizadas paraestudos histolgicos ou in situ devem ser congela-

das no criostato do micrtomo e imediatamente pro-cessadas e transferidas para tubos termo-resistentes,mantidos em gelo seco, se possvel com conservantepara RNA. A seguir, os tubos devem ser armazena-dos a -80 oC. Caso a amostra tiver que ser emblocadaem parafina para estudos anatomo-patolgicos, o ma-terial biolgico deve ser mergulhado em formol (deboa procedncia) tamponado com tampo fosfato empH=7,0 a 7,4, recm preparado. Ressalta-se a impor-tncia da averiguao da pureza do formol, pois quan-do se encontra armazenado de forma inadequada, podeconter excesso de cido frmico que degrada os ci-dos nuclcos. Ao se utilizar a soluo de formol, deve-se vaporizar nitrognio dentro do frasco e fechar her-meticamente para aumentar a estabilidade do formol.

As amostras de clulas em cultura podem serarmazenadas para anlise futura, em tubos termo-re-sistente, com uma prvia lavagem das clulas em tam-po fosfato pH 7,4 e, posteriormente em tampo Tris-EDTA, pH 8,0.

Amostras de rgos como fgado, rins, cora-o, entre outros que retm volume de sangue relati-vamente grande devem ser rapidamente limpos porperfuso com salina tamponada gelada e o excessode salina e membranas aderidas devem ser rapida-mente retiradas. As amostras devem ser congeladasimediatamente em nitrognio liquido e armazenadasem congelador -70 oC.

Amostras de sangue perifrico podem ser co-lhidas com o anticoagulante EDTA ou citrato. Paraextrao de DNA a amostra pode ser conservadaapenas em temperatura de 4 oC a 10 oC. Amostras decogulo tambm podem ser utilizadas para extraode DNA, mas devem ser armazenadas a -20 oC antesdo processamento.

3- MTODOS DE EXTRAO DE CIDOSNUCLEICOS

Os estudos genticos requerem cidos nuclicosntegros e isento de contaminantes e interferentes quepossam prejudicar os testes moleculares. Mtodoscomo a reao em cadeia pela polimerase (PCR), atcnica de transferncia de DNA (Southern blot) eoutros utilizados no estudo de polimorfismo de tama-nhos de fragmentos de restrio (RFLP) podem so-frer interferncias significativas se a obteno do DNAestiver comprometida.

Os mtodos de isolamento e purificao doscidos nuclicos consistem de trs etapas: (1) lise dasclulas e solubilizao do DNA ou RNA; (2) mtodo

524

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC

enzimtico ou qumico para remover as protenascontaminantes e outras macromolculas; e (3) preci-pitao alcolica para isolamento do DNA2. Os pro-tocolos bsicos geralmente so aplicveis a uma am-pla variedade de materiais.

3.1- Extrao de DNA genmico de leuccitosA extrao de DNA dos leuccitos humanos

tornou-se uma realidade nos laboratrios que estudamdoenas genticas. Os mtodos atualmente dispon-veis possibilitam recuperar o DNA de alto peso mole-cular, sendo simples, rpidos e econmicos com ren-dimentos adequados para uso rotineiro.

O protocolo mais adequado rotina laboratorialpara avaliao de polimorfismos e mutaes genti-cas compreende a lise celular com detergentes, remo-o das protenas por precipitao com cloreto de s-dio concentrado (salting-out) e isolamento do DNAgenmico por precipitao etanlica3. A utilizao dedetergentes, como Triton X-100 e duodecil sulfato desdio (SDS), evita o uso de solventes orgnicos peri-gosos e o alto custo e demorada digesto da protenaseK. O rendimento e a integridade do DNA extrado soexcelentes quando comparados com os de outros m-todos de extrao. O DNA apropriado para as tc-nicas moleculares como a PCR e RFLP. Atualmenteso utilizados produtos comerciais disponveis no mer-cado que minimizam erros de procedimentos resultan-tes de reagentes produzidos no laboratrio.

3.2- Extrao de DNA genmico de tecidos eclulas

O mtodo bsico compreende a ruptura do te-cido com um homogeinizador, a lise celular com o de-tergente inico SDS, extrao fenlica das protenas(atualmente se substitui por cromatografia de afinida-de) e precipitao etanlica do DNA. Este mtodo til para preparao de DNA genmico de muitasamostras de tecido ou de linhagens celulares, com ummnimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA ge-nmico produzido adequado para amplificao pelaPCR ou para a digesto com enzimas de restrio eanlise de transferncia de DNA. Uma quantidadesubstancial de RNA acompanha o DNA genmico, oque dificulta a quantificao por espectroscopia no UV.Para eliminar o RNA residual, a preparao deve sertratada com RNase isenta de DNAse que est pre-sente na maioria dos reagentes comerciais.

Outro mtodo compreende a solubilizao dostecidos ou clulas com SDS que inativa as DNAsesendgenas. A protenase K usada para digerir as

protenas celulares, seguidas de digesto com RNasepara remover a maioria do RNA celular. O isolamen-to do DNA segue basicamente o princpio anterior.Este mtodo adequado para extrair DNA genmicopara anlise de DNA por Southern blot ou constru-o de bibliotecas genmicas. Porm no adequadopara extrair DNA de tecidos, pois no h etapa deruptura do tecido conjuntivo.3.3- Extrao de RNA de clulas ou de amostras

biolgicasA maioria dos mtodos de extrao de RNA

semelhante aos utilizados na obteno de DNA, excetoque 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineira-mente para precipitao do RNA. essencial que todagua usada diretamente ou nos tampes seja tratada comdietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases.

O mtodo mais adequado para preparar RNAde boa qualidade envolve a solubilizao simultneado tecido ou clulas e inativao de RNases endge-nas na presena de isotiocianato de guanidina, comsubsequente isolamento do RNA por centrifugao emgradiente de cloreto de csio. Dois outros mtodosque no requerem ultracentrifugao podem ser utili-zados: (1) lise com detergente no-inico para pro-porcionar um mtodo rpido para preparao de amos-tras de RNA citoplasmtico e (2) lise celular comisotiocianato de guanidina, remoo das protenas pelaextrao fenlica em pH cido, seguida de precipita-o do RNA2. O segundo mtodo freqentementeutilizado para isolamento de genoma dos vrus RNA apartir de amostras biolgicas.

A anlise e quantificao de RNA total parti-cularmente importante para os estudos com RNAm. recomendvel que se obtenha RNA com alto ndicede pureza, ou seja razo OD260/OD280 igual ou maiorque 1,9 e sem contaminao por DNA2. Os mtodosde extrao de RNA que utilizam colunas de afinida-de para RNA e tratamento da amostra com DNaseisenta de atividade RNase fornecem RNA total comalto grau de pureza. O RNAm pode ser purificado apartir de preparaes de RNA total por cromatogra-fia com oligo-dT celulose.

4- MTODOS DE TRIAGEM DE MUTAESVrios mtodos para a triagem de mutaes de

ponto, pequenas delees ou inseres foram descritos.Para a escolha de um destes mtodos, algumas conside-raes devem ser observadas, tais como: o tipo de ci-do nuclico a ser utilizado, o tipo de material biolgico

525


(sangue perifrico, medula ssea, tecidos, secreesou excrees), o conhecimento ou no da mutao a serpesquisada, a confiabilidade do mtodo a ser utilizadoe que mtodo mais rpido e economicamente vivel.

Um dos mtodos moleculares mais utilizados natriagem de mutaes a PCR, reao que possibilitaproduzir milhares de cpias de segmentos de cidosnuclicos in vitro utilizando uma enzima DNA polime-rase termoestvel4. A Taq DNA polimerase apresen-tando ndice de erro de incorporao que varia de 10-4 a10-5 por nucleotdeo, sendo amplamente afetada pelascondies da reao (concentrao do cloreto de mag-nsio, dNTPs, pH e temperatura). Dependendo domtodo a ser utilizado, os erros da DNA polimerasepodem reduzir a especificidade da PCR, particular-mente nos casos em que a freqncia de alelos raros baixa5. Embora a probabilidade seja baixa, os errospodem ser interpretados como mutaes quando asanlises so realizadas com pequeno nmero inicial demolculas de DNA molde (< 100 molculas)5.

importante ressaltar que os resultados dosmtodos de triagem de mutaes devem ser confir-mados por seqenciamento de DNA, pois um mto-do definitivo para a deteco de mutaes6.

4.1- Eletroforese em gel com gradiente de des-naturao (DGGE)

A triagem de mutaes por DGGE (DenaturingGradient Gel Electrophoresis) um mtodo no quala dupla fita de DNA submetida eletroforese emgel de poliacrilamida em que utiliza um gradiente deagente desnaturante (uria ou formamida) ou de tem-peratura7. Nestas condies, ocorre a separao dasmolculas de DNA de acordo com sua temperaturade desnaturao ou melting temperature (T

m), em

segmentos denominados domnios. A dissociao dasfitas de DNA em tais domnios resulta em diminuioda mobilidade eletrofortica (Figura 1). A diferenade 1 par de bases entre as fitas de DNA (homoduplex)pode alterar a temperatura de desnaturao em 1 Cou mais. A falta de complementaridade de bases en-tre as fitas de DNA (heteroduplex) leva a significan-te desestabilizao desses domnios, resultando emdiferenas na T

m entre homo e heteroduplex acima

de 6 C. Por esta razo, heteroduplex formadas en-tre fragmentos de alelos comuns e mutantes so ge-ralmente utilizados para a triagem de mutaes deponto (Figura 2).

Selvagem MutadoFragmentos

amplificados pela PCR

Selvagem+

Mutante

Molculas heteroduplex

Selvagem Mutante HeteroduplexT

C

G

A

T

A

G

CGel com gradiente de desnaturao

Eletroforese

Selvagem MutadoFragmentos

amplificados pela PCR

Selvagem+

Mutante

Molculas heteroduplex

Selvagem Mutante HeteroduplexT

C

T

C

G

A

T

A

T

A

G

C

G

CGel com gradiente de desnaturao

Eletroforese

Figura 1. Esquema da triagem de mutaes por eletroforese em gel com gradiente de desnaturao (DGGE).

526


Para deteco no DGGE, os produtos da PCRso marcados com substncias radioativas7. Atualmen-te, esse sistema foi substitudo por colorao dos pro-dutos com brometo de etdeo ou nitrato de prata.

No mtodo DGGE, podem ser feitas modifica-es para aumentar o nmero de domnios a seremanalisados. Uma estratgia o acoplamento seqn-cias ricas em GC em um dos oligonucleotdeos na PCR(GC clamp), conseqentemente, mais mutaes sodetectadas por DGGE para diferentes finalidades8,9.

O tamanho do produto da PCR submetido aoDGGE de aproximadamente 1000 pares de bases(pb). Com o aumento do nmero de domnios, a mobi-lidade diminui, por isto, a frao de mutaes detecta-das diminui com o aumento do tamanho do fragmen-to. O limite de deteco do DGGE parece no serinfluenciado pela baixa freqncia de alelos mutantesna presena de alta frequencia de alelos comuns.

4.2- Polimorfismo de conformao de fita sim-ples (SSCP)

O SSCP (Single-Strand Conformation Poly-morphism) um mtodo de triagem de mutaes quepermite detectar alteraes na mobilidade eletrofor-tica de fitas simples de cidos nuclcos em condiesno-desnaturantes10 (Figura 3). As fitas simples de ci-

1 2 31 2 3

Figura 2. Autorradiograma de produtos da PCR separados porDGGE para a triagem de mutaes.

1- Selvagem, 2- Heteroduplex, 3- Mutante

dos nuclicos formam estruturas secundrias em so-luo que dependem da composio/seqncia de ba-ses e do tamanho da fita simples. Mudana em umabase na seqncia do cido nuclico amplificado pelaPCR pode ser detectada por SSCP. Os perfis de SSCP

CCC

GGG

CCC

GGG

CCC

GGG

TTT

AAA

CCC

GGG

TTT

AAA

SelvagemSelvagemSelvagem MutanteMutanteMutante

CCC

PCRPCR

AAA

TTT

EletroforeseEletroforese

SS MM

CCC

GGG

GGG

CCC

GGGCCC

GGG

CCC

GGGCCC

GGG

CCC

GGGCCC

GGG

TTT

AAATTT

AAA

CCC

GGGCCC

GGG

TTT

AAATTT

AAA

SelvagemSelvagemSelvagem MutanteMutanteMutante

CCCCCC

PCRPCR

AAAAAA

TTTTTT

EletroforeseEletroforese

SS MMSS MM

CCC

GGGCCC

GGG

GGGGGG

Figura 3. Esquema de triagem de mutaes por polimorfismo de conformao de fita simples (SSCP).

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podem ser detectados por autorradiografia marcan-do-se os produtos da PCR com substncias radiativas.Atualmente so utilizados os sistemas de deteco porcolorao dos gis de eletroforese com nitrato de pra-ta (Figura 4).

O SSCP foi inicialmente descrito para analisarDNA, entretanto, a anlise do RNA tambm poss-vel11. Estruturas secundrias distintas so formadascom maior freqncia pelo RNA do que por molcu-las de DNA e fragmentos maiores podem ser analisa-dos. As mutaes detectadas por SSCP devem serconfirmadas por sequenciamento de DNA6. Alm dis-so, em vrias aplicaes, sistemas eletroforticos comgis de tamanhos menores so utilizados em substitui-o aos sistemas eletroforticos padronizados paraseqenciamento de DNA12.

A sensibilidade de deteco de mutaes porSSCP maior quando os tamanhos dos produtos daPCR so de 150 a 200 pb13. O nmero de mutaesdetectveis diminui quando fragmentos maiores soanalisados. A triagem de mutaes de produtos maio-res sem prejudicar significativamente a sensibilidadedo mtodo pode ser alcanada utilizando-se RNA-SSCP11.

A eletroforese realizada em gel de poliacrila-mida no-desnaturante. Dependendo da concentraoda poliacrilamida, do tamanho do fragmento e da pre-sena de glicerol no gel, o tempo de separao variade 2 a 6 horas. A resoluo maior em sistemas degis especiais comercialmente disponveis14. A anli-se de um fragmento sob diferentes condies podeaumentar o ndice de deteco de mutaes, sendoque as condies ideais devem ser determinadas em-piricamente. O limite de deteco depende do tama-nho do produto da PCR (< 200 pb) e da execuo daeletroforese em pelo menos duas temperaturas ou doistampes de eletrodos no sistema eletrofortico. Nes-sas condies 80 a 90% de mutaes so detectveispor SSCP15.

4.3- Anlise de heteroduplex (HDA)A HDA (Heteroduplex Analysis) se funda-

menta na separao de fitas hbridas de DNA por sis-tema eletrofortico no-desnaturante16. As fitas du-plas de DNA (produtos da PCR) de amostras commutao so desnaturadas por aquecimento e, a se-guir, so hibridizadas com amostras sem mutao, for-mando-se hibridos homoduplex e heteroduplex. Asmolculas hbridas so separadas por eletroforese emgel poliacrilamida no-desnaturante, sendo que as mo-lculas homoduplex e heteroduplex apresentam di-

ferentes migraes eletroforticas (Figura 5). A de-teco desses produtos pode ser realizada por colora-o com brometo de etdeo ou nitrato de prata.

A resoluo de HDA pode ser aumentada uti-lizando-se gis especiais (MDE gel) que esto dis-ponveis comercialmente17. Melhor definio das ban-das pode ser obtida pela separao das mesmas napresena de uria (15%). O tamanho do produto dePCR detectado por HDA varia entre 200 a 600 pb,entretanto, a deteco de mutaes para produtos comtamanho acima de 900 pb tem sido realizada15.

O limite de deteco de mutaes por HDAdependente principalmente da posio e do tipo de baseque no apresenta complementaridade. Foram des-critas diferentes mutaes atravs da aplicao destametodologia, com o poder de deteco variando emtorno de 80%16. O limite de deteco depende da in-tensidade do sinal e da separao das heteroduplexe homoduplex.

O tempo de eletroforese em gel de poliacrila-mida no-desnaturante pode variar entre 14 a 30 ho-ras, dependendo do tamanho do produto da PCR. Otempo pode ser reduzido utilizando-se eletroforese emcapilar18.

4.4- Mtodo da clivagem qumica (CCM)O mtodo CCM (Chemical Cleavage Method)

se fundamenta na clivagem de seqncias especfi-cas de DNA heteroduplex por agentes qumicos. Osprodutos da PCR em heteroduplex formados entreamostras com e sem mutao apresentam desparea-mento no ponto da mutao que vulnervel a modi-

1 2 3 41 2 3 4

Figura 4. Perfis de SSCP de produtos da PCR separados poreletroforese em gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata.

1- MUTANTE2- MUTANTE

3- NORMAL4- NORMAL

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ficaes qumicas (por exemplo, hidroxilamina modi-fica citosina no pareada). Os hbridos DNA:DNAformados so clivados pela piperidina em stios demodificao qumica (Figura 6). Os pontos de muta-o geram fragmentos de clivagem so analisados poreletroforese19,20.

Originalmente o mtodo foi descrito para anali-se de DNA:DNA (heteroduplex), porm, pode tam-bm ser aplicado para a analise de DNA:RNA(heteroduplex)20. A CCM permite analisar produtoscom tamanho superior a 2 kb. Utilizando-se substn-cias fluorescentes, uma clula mutante pode ser de-tectada em dez clulas normais19. O sistema de de-teco inicialmente proposto era por marcao dosfragmentos com 32P ou 35S. Quando pequenas quanti-dades de alelos mutantes so analisadas na presenade grandes quantidades de alelos comuns, a sensibili-dade pode ser aumentada pela separao e detecode fragmentos marcados com substncias fluorescen-tes e detectados num aparelho para seqenciamentoautomtico21.

A vantagem do mtodo CCM que todos ospontos de mutao so detectados quando as fitas

sense e antisense so analisadas. As desvantagensso a utilizao de substncias txicas para fazer aclivagem e a limitao do potencial de automao.

4.5- Teste da protena truncada (PTT)O seqenciamento do genoma humano desper-

tou grande interesse na rea da protemica. Sistemasde expresso livre das clulas podem ser utilizadoscomo ligao entre genmica e protemica pela con-verso de seqncias de cidos nuclicos em prote-nas. A aplicao destes sistemas de expresso in vi-tro para a deteco de mutaes referida como PTT(Protein Truncation Test)22. Este mtodo til paraa deteco de mutaes que alteram a fase de leitura(reading frame) da protena expressa e que gera umproduto protico menor.

O mtodo PTT envolve a transcrio reversa(RT) onde o RNA utilizado para produzir cDNA(DNA complementar). A seguir, utilizando-se da PCRcom um oligonucleotdeo sense que inclui sinal apro-priado para transcrio e traduo, produzido umproduto que codifica uma protena funcional. Acoplan-do os produtos da PCR com um sistema transcrio e

Selvagem (wild-type)

G C T A

Mutante

+

G A T C

G C T A

Heteroduplex

Homoduplex

Desnaturao

Hibridizao

SS MM

Eletroforese

Selvagem (wild-type)

G CG C T AT A

Mutante

+

G AG A T CT C

G CG C T AT A

Heteroduplex

Homoduplex

Desnaturao

Hibridizao

SS MMSS MM

Eletroforese

Figura 5. Esquema de triagem de mutaes por anlise de heteroduplex (HET).

529


traduo in vitro, que inclui RNA polimerase, amino-cidos marcados por radiativos, ribossomos e tRNAs,so produzidos peptdeos marcados a partir dos pro-dutos da PCR moldes (Figura 7). Os peptdeos mar-cados so separados por sistema de eletroforese emgel de poliacrilamida com desnaturante (SDS). A de-teco de uma banda, na eletroforese, com menor pesomolecular que a protena natural indica a presena deum polipeptdio truncado que corresponde a uma mu-tao de fase de leitura que introduziu um cdon deparada na seqncia de DNA. A mutao poder serconfirmada por sequenciamento de DNA.

O mtodo pode iniciar com a transcrio reversado RNAm e o cDNA resultante amplificado pelaPCR. Rearranjos grosseiros e mutaes que afetamo processamento do RNA tambm podem ser detec-tados pela anlise dos produtos da RT-PCR23. O ta-manho do produto de PCR pode variar entre 4 e 5 kbcom bom desempenho nas reaes subseqentes detranscrio e traduo23.

O mtodo PTT particularmente adequado paragenes nos quais a maioria das mutaes (> 80%) re-sulta em protenas truncadas23. At o momento, no

se conhece qual a relao entre alelos mutantes enormais que pode ser analisada.

Neste sistema podero aparecer bandas adici-onais, provavelmente devido a isoformas que podemcomplicar a interpretao dos resultados. Portanto,diferenas na mobilidade eletrofortica de protenastruncadas e no truncadas podem ser analisadas visu-almente. Desde que PTT envolve certo nmero depassos (RT-PCR, transcrio e traduo in vitro eeletroforese), um controle positivo interno deve serincludo.

5- MTODOS DE ESTUDOS DE POLIMOR-FISMOS GENTICOS

A deteco direta de mutaes e polimorfis-mos genticos de nucleotdeo nico (SNPs) realiza-da por mtodos que permitem a identificao da se-qncia de DNA alterada. Esses mtodos so tam-bm utilizados para confirmao de mutaes detec-tadas por mtodos de triagem. Algumas das estrat-gias mais utilizadas nos estudos de polimorfismos ge-nticos so descritas neste tpico.

CCC

GGGAAA

TTT

Selvagem (Wild-type) Mutado

AAA

GGG

M

SHeteroduplex 1

M

SHeteroduplex 2

(marcada)

+

Eletroforese

CCTT

*

*

*

*

Somente os fragmentos marcados so detectados

CCC

GGGAAA

TTT

Selvagem (Wild-type) Mutado

AAA

GGG

M

SHeteroduplex 1

M

SHeteroduplex 2

(marcada)

+

Eletroforese

CCTT

*

*

*

*

Somente os fragmentos marcados so detectados

Figura 6. Esquema de triagem de mutaes por Clivagem Qumica.

530


5.1- Polimorfismo de tamanhos de fragmentos derestrio (RFLP)

O RFLP (Restriction Fragment LenghtPolymorphysm) um mtodo que utiliza enzimas derestrio para deteco de mutaes e polimorfismosgenticos24. As enzimas de restrio reconhecem sti-os especficos na seqncia do DNA que clivadasomente quando o stio est presente, gerando frag-mentos de vrios tamanhos que so separados e ana-lisados por eletroforese.

Os tamanhos de fragmentos gerados so muitovariveis. Originalmente este mtodo foi utilizado noSouthern Blot para deteco de grandes fragmentosde DNA. Nesta aplicao, o DNA genmico frag-mentado utilizando-se enzimas de restrio e os frag-mentos so separados por eletroforese em gel de aga-rose de alta resoluo. Posteriormente os fragmentosde DNA so transferidos a uma membrana de nylon ehibridizados com sondas marcadas que contem seqn-cias complementares ao loco gnico a ser estudado.Os fragmentos hibridizados so identificados porautorradiografia ou outro sistema de deteco.

Com o advento da PCR e do conhecimento edisponibilidade das seqncias de DNA em bancos ge-nmicos, o mtodo passou a ser utilizado no formato dePCR-RFLP (Figura 8) que permite analisar fragmentosde tamanhos menores25. Quando as mutaes ou poli-morfismos no esto presentes em stios de restrio,podem ser criados stios artificiais utilizando-se oligonu-cleotdeos modificados na PCR. Esta estratgia de-nominada mutagenese sitio-dirigida mediada pela PCR26.

Os fragmentos gerados no RFLP podem serdetectados por eletroforese e transferncia de DNAcomo o Southern blot. No caso da PCR-RFLP, osfragmentos so separados por eletroforese em gel deagarose ou acrilamida e detectados diretamente pelacolorao com brometo de etdeo ou outro corantefluorescente como o SYBR Gold ou ainda por colo-rao com nitrato de prata. O limite de deteco daPCR-RFLP de uma clula mutante pode ser detec-tada entre cinqenta a cem clulas normais27.

A especificidade do mtodo de 100% quandoa enzima de restrio apropriada utilizada. Para ocontrole de qualidade, amostras de DNA contendoalelos mutantes e comuns devem ser includos na an-

RNA Transcrio reversa

cDNA

PCR

MOLDE transcrio/traduo

Transcrio/traduo in vitro

Produtos proticos

Separao das proteinas SDS-PAGE

Selvagem

Mutado

Autorradiografia

RNA Transcrio reversa

cDNA

PCR

MOLDE transcrio/traduo

Transcrio/traduo in vitro

Produtos proticos

Separao das proteinas SDS-PAGE

Selvagem

Mutado

Autorradiografia

Figura 7. Esquema de triagem de mutaes por Teste da Protena Truncada (PTT).

531


lise. O mtodo tambm deve ser ajustado para condi-es que no permitam que resultados falsos positi-vos sejam obtidos quando quantidade varivel e dife-rentes propores de DNA mutante e selvagem este-jam sendo analisadas. Resultados questionveis de-vero ser confirmados por repetio dos testes e se-qenciamento de DNA.

5.2- Amplificao Alelo Oligonucleotideo-Espe-cfica (PCR-ASO)

A PCR-ASO (Allele Specific OligonucleotideAmplification) um mtodo de deteco direta demutaes, tambm conhecido como ARMS(Amplification Refractory Mutation System). Nes-te sistema, utilizado um par de oligonucleotdeos comseqncia especfica na extremidade 3 para cada alelopresente no lcus gnico28,29. As reaes so realiza-das separadamente para cada par de oligonucleot-deos (iniciadores da PCR) e apenas os iniciadores quecontem a seqncia 100% complementar ao alelomutante ou comum possibilitam gerar o produto dePCR especfico. A deteco dos produtos da PCR realizada por eletroforese em gel de agarose. Hetero-zigotos e homozigotos podem ser discriminados emum nico ensaio da PCR quando diferentes alelos soamplificados utilizando-se marcados com diferentesfluorocromos como o caso da PCR em tempo real30.

A especificidade da reao influenciada porvariaes nas concentraes dos reagentes (magn-sio, oligonucleotdeos, desoxirribonucleotdeos, DNAe DNA polimerase), temperatura e tempo de hibridi-

zao e nmero de ciclos31. A adio de formamidapode reduzir a gerao de produtos inespecficos. Condi-es de baixa estringncia na PCR propiciam a hibri-dizao e extenso dos iniciadores nas seqncias deambos os alelos que levam a gerao de resultadosincorretos. A especificidade crtica quando a fre-qncia do alelo mutante baixa ou desconhecida.

A possibilidade de resultados falso-positivo oufalso-negativo a principal limitao do mtodo. Fal-

1 2 3 4 5

104158199303

1 2 3 4 5

104158199303

Figura 8. Perfis de RFLP obtidos por eletroforese em gel deagarose a 2% corado com brometo de etdeo de produtos de PCRdigeridos com a enzima NIa III. Produto de PCR (coluna 2).Gentipos: CC (coluna 3); CT (coluna 4) e TT (coluna 5). Marcadorde pares de bases de DNA de 50 bp (coluna 1).

Alelo A

Alelo B

Amplificao

Oligonucleotdeo comum

Ponto de mutao

Oligonucleotdeo especfico para o alelo A

1 2 1 2 1 2M MN N

1 Oligonucleotdeo especfico para o alelo M

2 Oligonucleotdeo especfico para o alelo N

Grupo sanguneo MN

Alelo A

Alelo B

Amplificao

Oligonucleotdeo comum

Ponto de mutao

Oligonucleotdeo especfico para o alelo A

1 2 1 2 1 2M MN N

1 Oligonucleotdeo especfico para o alelo M

2 Oligonucleotdeo especfico para o alelo N

Grupo sanguneo MN

Figura 9. Esquema de deteco de mutaes pela PCR Alelo Oligonucleotideo-Especfico (PCR-ASO).

532


so-positivo pode resultar de contaminao ou de ex-tenso incorreta pela DNA polimerase. Para a exclu-so de resultados falsos, as condies de reao de-vem ser otimizadas e a concentrao do DNA de in-teresse deve ser definida e precisamente controlada.A utilizao de controles deve ser realizada para ex-cluir resultados indesejados. A utilizao de controleinterno na PCR-ASO importante para excluir resul-tados falsos negativos principalmente para a identifi-cao de heterozigotos.

5.2- PCR em tempo realNa PCR em tempo real (Real-time PCR) so

utilizadas pequenas sondas de DNA marcadas nas ex-tremidades 5 e 3com compostos fluorescentes de-nominados reporter (marcador) e quencher(bloqueador), respectivamente32,33. As sondas soconstrudas de maneira a hibridizar perfeitamente comum alelo especifico em um determinado lcus, porm,de forma incompleta com outro alelo.

No sistema TAqMan, o fluorforo bloquea-dor est prximo do marcador, bloqueando a emissodo sinal fluorescente32. Na fase de extenso da PCR,a atividade exonuclase 5 e 3 da DNA polimerase responsvel pela digesto da sonda, o marcador li-berado distanciando-se do bloqueador e a fluorescn-cia emitida (Figura 10). As seqncias de iniciado-res e sondas, assim como as condies de PCR de-vem ser muito bem estabelecidas para evitar parea-mentos incorretos durante as etapas de hibridizao eextenso na PCR em tempo real.

5.3- Arranjos de DNA

Os arranjos de DNA (DNA Arrays) foram con-cebidos para ampliar e agilizar as anlises genmicas.O microarray a forma miniaturizada de arranjosem que os fragmentos de genes esto fixos em umalmina de vidro34. Tambm conhecido como bioshipou ship biolgico35.

As anlises das atividades gnicas e a identifi-cao de mutaes e polimorfismos so realizadas deforma sistematizada usando o princpio da hibridiza-o de DNA. As seqncias de genes que contemmutaes conhecidas so fixadas na matriz de vidro(sondas de captura). Produtos da PCR so geradosutilizando-se iniciadores especficos marcados comfluorforos. A seguir os produtos da PCR so hibridi-zados com as sondas capturadas na matriz de vidro eos arranjos de sinais fluorescentes so medidos utili-zando-se um sistema ultra-rpido de deteco de fluo-rescncia e a intensidade de cada ponto determina-da. A localizao do ponto associado com a sua inten-sidade determina a seqncia e a quantidade de ma-terial presente na amostra. Estes dados so processa-dos por programas sofisticados de computadores quepossibilitaro a analise refinada dos resultados.

A possibilidade de se colocar milhares de se-qncias em uma nica lmina de arranjo possibilita aobteno de informaes do genoma inteiro em umnico ensaio, identificando milhes mutaes e poli-morfismos simultaneamente35. Comercialmente j es-to disponveis, em bioships, conjuntos de polimorfis-

F Q

3 55

3 5

F Q

Alelo A Alelo A

Alelo B

3 55

Alelo B

3 5

F

Q F

Q

5

5

F Q

3 55

3 5

F Q

Alelo A Alelo A

Alelo B

3 55

Alelo B

3 5

F

Q F

Q

5

5

Figura 10. Esquema de deteco de mutaes pela PCR em tempo real.

533


mos e ou mutaes para fins de estudos farmacoge-nticos do sistema citocromo P450 para cada grupode frmacos potencialmente importantes, assim comopara diagnstico de alteraes genticas de utilidadeteraputica na clinica mdica36.

6- CONSIDERAES FINAISNesta reviso foram abordados mtodos mole-

culares que podem ser utilizados nos estudos farma-cogenticos. Foram apresentados os mtodos utiliza-dos na obteno de cidos nuclicos e na detecomutaes e polimorfismos genticos, indicando suasespecificaes, aplicaes e limitaes.

Alguns desses mtodos podem ser aplicadospara estudos de alteraes genticas em larga escala.A anlise do enorme conjunto de resultados geradospor esses mtodos dependente da Bioinformtica

que tornou-se uma cincia imprescindvel no desen-volvimento da tecnologia molecular com a integraodas cincias da sade, biolgicas e da computao.A simulao in silico uma ferramenta potencial-mente importante na formulao de reaes e deinteraes medicamento-protena, protena-DNA, me-dicamento-DNA e outras possibilidades que estoenvolvidas na eficcia e na segurana teraputica dosmedicamentos.

Com os avanos crescentes da tecnologia mo-lecular e bioinformtica tem sido possvel aplicar osconhecimentos gerados pelos estudos farmacogen-micos, transcriptmicos e protemicos na investiga-o de novos alvos teraputicos. Esses conhecimen-tos permitiro, em futuro prximo, aplicao da tera-pia individualizada que melhoraro significativamentea ateno mdica e farmacutica e, conseqentemen-te, a qualidade de vida das pessoas.

Hirata MH, Tavares V, Hirata RDC. From Molecular Biology to Medicine: methods commonly used inpharmacogenetics. Medicina (Ribeiro Preto) 2006; 39 (4): 522-34.

ABSTRACT: In this review, we discussed the procedures for obtaining, handling and storageof biological samples useful in molecular tests. Methods for screening and direct detection ofmutations and gene polymorphisms were presented. Principles, strategies, applications andlimitations of polymerase chain reaction (PCR) variations, such as denaturing gradient gelelectrophoresis (DGGE), single strain conformational polymorphism (SSCP), restriction fragmentlength polymorphism (RFLP), allele oligonuleotide-specific amplification (PCR-ASO), Real timePCR, DNA arrays and other molecular techniques, were commented.

Keywords: Pharmacogenetics. Polymerase Chain Reaction. Polymorphism, Single-StrandedConformational. Polymorphism, Restriction Fragment Length. DNA Arrays. Denaturing GradientGel Electrophoresis.

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