2008 Solis - Lactoferrina

LACTOFERRINA

Autores:

CARLOS ANDRÉS SOLÍS CARVAJAL.

PAULA ANDREA QUIROZ

UNIVERSIDAD DEL VALLE

CALI – COLOMBIA

2008

SOLIS, C.A. - QUIROZ, P.A. LACTOFERRINA

ReCiTeIA - v.8 n.2 2

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Carlos Andrés Solís Carvajal.

Paula Andrea Quiroz

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Cali – Valle – Colombia

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Lactoferrina

Carlos Andrés Solís Carvajal – Paula Andrea Quiroz

Universidad del Valle – Colombia

CONTENIDO

Resumen.......................................................................................................................................... 4 1 Introducción ........................................................................................................................... 4 2 Antecedentes .......................................................................................................................... 5

2.1 Lactoferrina (Proteína lagrimal) ...................................................................................................... 5 3 Revisión histórica. .................................................................................................................. 7 4 Fundamentos teóricos ............................................................................................................. 8

4.1 Lactoferrina ..................................................................................................................................... 8 4.2 Funciones biológicas: ...................................................................................................................... 8 4.3 Función antimicrobiana ................................................................................................................... 9 4.4 Acción microbiana .......................................................................................................................... 9

4.4.1 Sideroforos ........................................................................................................................... 10 4.4.2 Otro sistema ......................................................................................................................... 11

4.5 Función antiviral ........................................................................................................................... 12 4.6 Función antifúngica ....................................................................................................................... 13

5 Aplicaciones ......................................................................................................................... 14 5.1 Estimulante del sistema inmunológico .......................................................................................... 14 5.2 Estimula el crecimiento y la proliferación de la mucosa intestinal. .............................................. 14 5.3 Propiedades farmacodinamicas ..................................................................................................... 15 5.4 Aplicaciones clínicas potenciales de la lactoferrina ...................................................................... 15

6 Producción y uso de lf y sus derivados ................................................................................ 17 6.1 Los efectos protectores de anfitrión de lf y lactoferricina ............................................................. 18 6.2 Usos ............................................................................................................................................... 19

7 Procesos tecnológicos: Obtención de lactoferrina................................................................ 20 7.1 Método 1 ....................................................................................................................................... 20

7.1.1 Resultados y discusiones (filtración de gel en sephacril s – 300) ........................................ 21 7.2 Metodo2: Método de aislamiento de lactoferrina y otras proteínas lácteas ................................... 22 7.3 Método 3 ....................................................................................................................................... 22 7.4 Método 4 ....................................................................................................................................... 23 7.5 Método 5: ultrafiltracion ............................................................................................................... 23 7.6 Método 6: nanofiltracion ............................................................................................................... 23 7.7 Método 7: diafiltracion .................................................................................................................. 25 7.8 Cursograma analítico ..................................................................................................................... 27

8 Conclusiones ........................................................................................................................ 28 9 Bibliografía: ......................................................................................................................... 29 10 Anexos ................................................................................................................................. 29

10.1 Glosario .................................................................................................................................... 29 10.2 Grupos de investigación ........................................................................................................... 30



Lactoferrina

RESUMEN

La lactoferrina (Lf) es una glicoproteína multifuncional que presenta la capacidad de unir

hierro y pertenece a la familia de las transferrinas. Una de las funciones primordiales de la

Lf es el transporte de metales. También actúa como proteína de defensa no específica. La

Lf se encuentra en diversas secreciones mucosas como la leche, las lágrimas, la saliva y es

abundante en el calostro. También es un componente abundante de los neutrófilos y puede

ser liberada al plasma sanguíneo por la acción de éstos. Las Lf humana y bovina,

despliegan un amplio espectro antimicrobiano, actuando contra bacterias Gram positivas y

Gram negativas y contra algunos virus y hongos. Inicialmente se pensó que esta actividad

antimicrobiana se debía únicamente a su capacidad de secuestrar hierro. En la actualidad, se

sabe que existen diversos mecanismos que contribuyen a la capacidad de esta glicoproteína,

para defender a los mamíferos de las infecciones microbianas. Esta revisión presenta un

panorama del conocimiento actual acerca de dichos mecanismos y de las aplicaciones

clínicas potenciales de la Lf, contra infecciones microbianas.

La Lf después de ser extraída y purificada, puede destinarse a la fabricación de

nutraceuticos y también a la producción de leches maternizadas ya que la leche humana

contiene de 8-10 veces más Lf que la leche vacuna, es decir que al ser una proteína de alto

valor, su adecuado aprovechamiento da origen a productos útiles de gran valor agregado.

Actualmente, la Lf ha sido objeto de numerosas investigaciones dentro de las cuales se ha

descubierto su facilidad para interactuar sinérgicamente con los fármacos aplicado en el

tratamiento de enfermedades tales como: la hepatitis C, el VIH, enfermedades

gastrointestinales, etc.

Palabras claves: Glicosaminoglicanos / Inmunoglobulinas / Interleucina / Nutraceutico /

Prostaglandina / Suero

1 INTRODUCCIÓN

La lactoferrina, es una proteína no hemica, que es extraída de el lactosuero de leche de

bovinos principalmente; esta proteína se viene estudiando a partir del año de 1985; en

donde se demostró en estudios hechos en ratas que la lf suministrada oralmente, disminuía

el efecto cancerigeno en ratas enfermas que fueron sometidas a dicho tratamiento.

Desde su descubrimiento y caracterización, la lactoferrina (Lf) ha sido sujeta a numerosos

estudios sobre su estructura, biosíntesis, distribución tisular, metabolismo y propiedades

biológicas. La Lf es una proteína no hémica de unión a hierro perteneciente a la familia de

las transferrinas, producida por diversas especies de mamíferos. A diferencia de otros

miembros de la familia de las transferinas como la transferina sérica, cuyo papel biológico



más relevante es el transporte de hierro, la función primaria atribuida a la Lf es colaborar en

mecanismos innatos de protección del hospedero. El papel de la Lf como componente

esencial de la respuesta innata de defensa se ve reflejado por su amplia distribución en

secreciones diseminadas en las superficies mucosas que recubren glándulas exocrinas y

diversos conductos como el tracto respiratorio, intestinal y genitourinario. Dichas

secreciones forman parte de la primera línea de defensa del hospedero que enfrenta el

contacto directo con agentes patógenos que colonizan o invaden las superficies mucosas.

Numerosas evidencias experimentales generadas en su mayor parte en ensayos in vitro

demuestran que la Lf es una molécula multifuncional capaz de exhibir actividad

antimicrobiana sobre un amplio espectro de agentes patógenos entre los que se incluyen:

bacterias, levaduras, hongos, protozoarios y virus. Estudios in vivo, muestran que la Lf

puede actuar como modulador de la inflamación y de la respuesta inmunitaria. Mediante

esta actividad inmunomoduladora, la Lf refuerza la efectividad de su acción

antimicrobiana.

Observando las capacidades fisiológicas de la Lf en la defensa del huésped sumado a las

necesidades farmacéuticas y nutricionales que existen en la actualidad, la Lf es una proteína

con potencial uso en ambos campos por lo que es considerada un nutracéutico y desde hace

varias décadas hasta la fecha, los investigadores han buscado la manera mas conveniente de

obtenerla, de tal forma que ha la fecha la podemos obtener como Lf nativa, aislada

principalmente de leche y calostro de varios mamíferos y Lf recombinante para la cual a

través de los años se han empleado varios modelos de expresión dentro de los que se

encuentran sistemas bacterianos, fúngicos y virales, además se ha logrado la expresión de

esta proteína en organismos superiores como son plantas y mamíferos.

2 ANTECEDENTES

La lf, viene cobrando importancia en las investigaciones tendientes a mejorar los productos

de uso masivo tales como: alimentos, champú para el cabello, cremas para manos entre

otros.

2.1 LACTOFERRINA (PROTEÍNA LAGRIMAL)

La lactoferrina es una proteína que alcanza en lágrima normal valores medios de 1,75 g/l,

constituyendo otro 25% de las proteínas lacrimales normales. Es producida principalmente

por los ácidos de la glándula lagrimal: la lactoferrina se puede determinar por

electroforesis, pero el método más usado en clínica racriológica es el deinmunodifusión

radial, aunque resulte más lento. La primera tipificación de la prueba de

inmunodifusión se hizo por Janssen et al 1982. Los inmunoplatos más usados son los de

Culemborg, Eagle Visión y MacKeen (LactoplateTM JDC, Culemborg, Países Bajos. Eagle

Vision, Memphis, EEUU). Se coloca con pinza un disco de papel de 4 mm de diámetro en

el fórnix inferior, sin anestésico (aunque el valor de lactoferrina es aproximadamente el

mismo con y sin anestesia tópica: 1,58 – 1,55 mg/g.), durante 3-5 minutos. Se retira y se

coloca sobre el Lactoplate de gel de agarosa con anticuerpos anti-lactoferrina lacrimal

humana para inmunodifusión radial, donde se mantiene durante 3 días a temperatura



doméstica. Al fin de ellos se mide el diámetro de precipitación antígeno-anticuerpo, que se

lleva a una tabla de conversión que determina los g/l de lactoferrina en lágrima. La

concentración de lactoferrina es proporcional al cuadrado del diámetro del anillo de

precipitación. En personas con ojo secos es aproximadamente la mitad que en personas

sanas.

Para Murube y Cortés (1989) los valores normales oscilan alrededor de 1,75 g/l; por debajo

de 1,5 g/l son valores deficitarios que probablemente se corresponden con un ojo seco; por

debajo de 1 g/l hay una evidente descenso patológico; y por debajo de 0,5g/l suelen

corresponderse con un ojo seco grave. Otros autores consideran que son indicativos de ojo

seco los valores inferiores a 1 g/l (van Bijsterveld 1983, Nelson, 1994).

Cortina et al 1996 encontraron que en pacientes de KCS los valores de lactoferrina estaban

bajo 0,9 g/l 90 en el 66% de los pacientes, y sobre ellos en el 44%. Consideran por tanto la

prueba como de escasa sensibilidad. Sin embargo, consideran que los bajos niveles de

lactoferrina en lágrima se asocian estrechamente con las KCS de origen autoinmune.

Un estudio reciente encontró que al agregar la lactoferrina y la lisozima a las soluciones de

rehidratación oral (sales rehidratantes) reducen significativamente la duración de la diarrea

y también reducen la recurrencia de la misma: por lo tanto, resultan siendo una buena

alternativa al uso de las actuales sales de rehidratación oral que no tienen un claro impacto

en reducir la severidad de la diarrea (Nelly Zabaleta Pimentel, investigadora principal del

Instituto de Investigación Nutricional (IIN)).

Entre sus funciones además de su capacidad de unirse fuertemente al hierro y liberarlo

(Kawakami y col. 1988), existen otras no relacionadas con dicha función. Es un potente

activador de las células “natural killer” (Mantel y col. 1994) y juega un rol en la defensa

antitumoral (Horwitz y col.1984) y regula las granulopoiesis y la citotoxicidad anticuerpo-

dependiente (Mantel y col. 1984), la producción de citoquinas (gahr y col. 1991, gentille y

Broxmeyer 1983) y el crecimiento de algunas células in Vitro (De Sousa y col. 1988). Sin

embargo, tiene efectos controversiales en esta proliferación celular ya que se ha visto que

así facilita la proliferación de las líneas celulares de ratones BALB/c 3T3 (Azuma y col.

1989) y de monos Caco-2; no tiene efecto sobre la proliferación linfocitaria (Hurley y col.

1994, Damiens y col. 1998).

Recientemente se ha encontrado que la lactoferrina presente en las heces, ayuda a detectar

enfermedades tales como: la Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII), el síndrome de

colon irritable (SCI), el síndrome de fatiga crónica, y la migraña principalmente. Las cuales

son enfermedades muy comunes hoy en día y gracias a la presencia de lactoferrina; los

científicos de Quest diacnostIc, han creado un método llamado tecnología INSURE, el cual

permite la identificación temprana de cáncer colorectal (www.questdiagnostic.com).

Nacional Beef que es una de las industrias del vacuno más importantes de EEUU ha

implementado una nueva tecnología para proteger a los consumidores contra las bacterias

patógenas que pueden estar presentes en la carne, como son E.coli O157:H7, Salmonella y



Listeria. Esta tecnología, que se ha denominado Activin utiliza la lactoferrina, que es una

proteína que protege a los bebes contra las bacterias, mientras su sistema inmunológico se

desarrolla. La lactoferrina está de forma natural presente en el vacuno.

Una vez que se descubrió como activar la molécula de lactoferrina, los científicos fueron

capaces de imitar las propiedades de luchar contra las bacterias en la superficie de la carne

de vacuno.

Christchurch (Nueva Zelanda), 26 nov (EFE).- Un equipo de investigadores neozelandeses

ha descubierto que la lactoferrina", una proteína de la leche de vaca, posee una serie de

propiedades para regenerar los huesos que podrían ser de fundamental ayuda para combatir

la osteoporosis. Según informan en esta ciudad los medios locales, el equipo de

investigaciones de la Universidad de Auckland, 660 kilómetros al norte de Wellington, ha

comprobado que la lactoferrina" ayuda a desarrollar la densidad ósea y frena la disposición

de los huesos a quebrarse. (http://www.saludcolombia.com/actual/salud76/noveda76.htm)

Investigadores de la Universidad de California publicaron en la revista Nature la obtención

de un arroz genéticamente modificado por métodos de ingeniería genética que codifica una

proteína de la leche humana. Los nutricionistas coinciden en señalar que la lactancia

materna es mejor que la lactancia artificial, a pesar de las mejoras logradas en las llamadas

leches de vaca maternizadas para bebés. Uno de los posibles métodos para hacer que las

leches para bebés sean lo más parecidas posible a las humanas, es la producción de

proteínas exactamente iguales, como sucede en este caso. La proteína en cuestión es

precisamente una de las más importantes en la nutrición del bebé, la lactoferrina, una

enzima responsable de la asimilación del hierro, que previene además de posibles

infecciones. La esterilización de la leche infantil procedente de vacas, inactiva la

lactoferrina vacuna. Sin embargo, la que se obtiene del arroz OGM es estable.

Estudios realizados en animales sugieren asimismo que la lactoferrina puede ayudar a

prevenir o reducir los canceres de colon, vejiga, lengua, esófago y pulmón así como la

formación de metástasis del pulmón. Los mecanismos subyacentes están bajo estudio pero

parecen estar relacionados con la capacidad de la lactoferrina para mejorar el

funcionamiento del sistema inmune.

HILPER ET. AL. Reporto que las inmunoglobulinas de la leche de vaca pueden ser

adicionadas a fórmulas para niños con el fin de concederle propiedades inmunológicas y

comportarse como leche humana

3 REVISIÓN HISTÓRICA.

El estudio de la lactoferrina y de su efecto protector al hospedero inició a principios de

1980, cuando a partir de experimentaciones hechas en ratas infectadas con cáncer, hepatitis

y otras enfermedades; Se encontró que después de administrar oralmente lactoferrina a

estos animales estos a su vez iban presentando una disminución importante en los daños



celulares y en los efectos colaterales a los cuales se veían sometidos gracias a su

enfermedad.

Fue así como a principios de 1986 cuando se empezó a adicionar lactoferrina en una gran

variedad de productos, incluyendo fórmulas para infantes. Varias funciones biológicas de la

lactoferrina (LF), han sido reportadas durante las dos décadas anteriores. La actividad anti

bacterial de la lactoferrina fue reportada inicialmente y otras propiedades, incluyendo la

regulación en la respuesta del sistema inmune y las funciones celulares fueron detectadas

subsecuentemente.

4 FUNDAMENTOS TEÓRICOS

4.1 LACTOFERRINA

Se la conoce como la proteína roja de la leche. Es una glicoproteína con capacidad de

unirse a dos átomos de hierro férrico (Fe3+

). Es estable a un pH ácido. La lactoferrina se

encuentra en diversos fluidos corporales: lágrimas (1500-2000 mcg/ml), fluido seminal

(500-1000 mcg/ml), moco cervical (500-1000 mcg/ml), secreciones nasales (100 mcg/ml),

saliva (5-10 mcg/ml), orina (1 mcg/ml), sangre normal (0,02-1 mcg/ml), sangre con

inflamación (40-200 mcg/ml) y neutrófilos (2-15 mcg/106 cálulas).

La lactoferrina es uno de los componentes más importantes de las proteínas de la leche

materna, constituyendo alrededor del 10-15% de las mismas. El calostro contiene 2-3 g por

litro y en la leche madura desciende al 1-1,5% (Lonnerdal et al, 1976). La lactoferrina es

una glicoproteína de peso molecular alrededor de 80.000 que es capaz de unirse a dos

átomos de hierro férrico, conjuntamente con los aniones bicarbonato o carbonato. Debido a

esta capacidad de ligante de hierro, se le ha atribuido funciones de mantenimiento del status

de hierro en el periodo neonatal y propiedades inhibitorias del crecimiento bacteriano como

se describe más adelante. Esta proteína posee la capacidad de resistir a la proteolisis,

especialmente en su forma saturada de hierro, por tanto, puede resistir en el intestino del

lactante la acción de las enzimas pancreáticas y pepsina.

La lactoferrina bovina en su estado natural esta solo parcialmente saturada con hierro (15-

20%) la LF con solo una saturación del 5% de hierro (deplecionada) se la denomina

apolactoferrina mientras que cuando está saturada se la refiere como hololactoferrina. En la

leche materna se la encuentra fundamentalmente como apolactoferrina.

4.2 FUNCIONES BIOLÓGICAS:

Mejor que un suplemento de hierro ya que reequilibra su metabolismo. Debido a que

favorece la fijación del hierro presente en la alimentación y aumenta su absorción; su

afinidad por el hierro es 260> a la transferrina sérica y protege las reservas de hierro



4.3 FUNCIÓN ANTIMICROBIANA

El mecanismo por el cual la lactoferrina ejerce su actividad antimicrobiana in vivo es

complejo y todavía poco entendido. Hay dos mecanismos básicos que están involucrados

en el mecanismo de defensa:

• Capacidad de unión al hierro.

• Reacción con otras moléculas del entorno y las superficies

Puede participar en la regulación de la respuesta inmune en diferentes niveles. En los

individuos sanos actúa como primera barrera en la defensa de la infección. Además de un

efecto antiadherente, puede tener efecto bactericida que depende de su unión a la superficie

bacteriana y se han descrito también agentes antimicóticos. Hay una relación directa entre

la lactoferrina y el lipopolisacarido de las bacterias gramnegativas y los ácidos lipoteicoicos

de las grampositivas. Es importante su efecto anti-agregativo que influiría en la inhibición

de la formación del biofilm, particularmente el desarrollado por Pseudomonas aeruginosa y

Streptococcus mutans.

Es capaz de inhibir la invasión intracelular de patógenos como E.coli, Listeria

monocytogenes, Shigela flexneri. Puede amplificar las señales de apoptosis en las células

infectadas facilitando de esta manera la eliminación de los patógenos permitiendo que estos

queden expuestos a los mecanismos de defensa o eliminación natural.

Sus diferentes actividades se justifican por diferentes propiedades fisicoquímicas: su

naturaleza cationica responsable de la unión a la superficie aniónica de la célula, a la

heparina o al ADN, y su actividad serino-proteasica.

4.4 ACCIÓN MICROBIANA

Bacterias que poseen sideroforos u otros sistemas para la captación del hierro

La limitación de la disponibilidad del hierro es indudablemente un mecanismo de defensa

importante especialmente impidiendo o bloqueando a aquellos microorganismos que lo

requieren para su desarrollo.

Cuando uno considera un ambiente con la presencia de bacterias con sideroforos y la

lactoferrina conjuntamente, podría asumirse que esta última contribuirá a la proliferación

bacteriana y no a su inhibición ya hay bacterias que producen los sideroforos mencionados,

cuya afinidad por el hierro está en el mismo rango o similar en perjuicio del que ostentan la

lactoferrina o la transferrina. En estos casos las bacterias lo sustraen en perjuicio del

huésped, limitando su estrategia defensiva.

Sabemos que la lactoferrina funciona como un análogo para los receptores microbianos

bloqueando la unión de los mismos a las mucosas que es el paso inicial de la mayoría de las

infecciones.



Observemos dicho mecanismo mediante la figura 1.

Figura 1. Lactoferrina.

Para comprender mejor el modo de acción de la lactoferrina como agente protector;

debemos conocer como las bacterias se fortalecen para evitar ser destruidas por la

lactoferrina y por las defensas del organismo.

Entre los factores de virulencia bacterianos se incluye la capacidad de los microorganismos

de incorporar hierro que pueden adquirir mediante:

1. sideroforos.

2. otro sistema

4.4.1 Sideroforos

Los sideroforos son moléculas bacterianas transportadoras de hierro. Hay varias clases y

alguna de ellas son más eficaces que otras para dicha función. Los sideroforos pueden ser:

Catecolatos.

Hidroxamatos.

Hidroxicarboxilatos.

Se distinguen por la estructura de la funcionalidad del Fe+++

. Mientras que algunas bacterias

producen solo una clase de sideroforo. Hay otras que secretan múltiples tipos, haciendola

más eficiente ya que le permiten colonizar diferentes ambientes. Por ejemplo, Escherichia

coli produce dos tipos: enterobactina y aerobactina. La aerobactina puede ser más efectiva

que la enterobactina en la competencia por el hierro con las proteínas del huésped, porque

la enterobactina se une a la albúmina y le permite a la bacteria obtener el hierro necesario,

siendo considerada entonces como un factor de virulencia bacteriano.

Tanto la enterobactina como la aerobactina serían los sideroforos primarios de las

enterobacterias, como E. Coli, Shigella spp, Salmonella spp, Klebsiella spp y Yersinia spp.



Recientemente la enterobactina ha sido también aislada de especies grampositivas como

Streptomyces spp. Los sideroforos fúngicos son generalmente hidroxamatos. Este tema es

importante pues los sideroforos compiten por el hierro con las moléculas del huésped que

también tiene la capacidad de unirse al mismo.

En la figura 2 vemos como el Fe+++

ingresa con los sideroforos a las bacterias

grampositivas y negativas.

Figura 2. Ingreso del Fe

3+.

Los sideroforos – Fe en las bacterias gram negativas son reconocidos por receptores

específicos de la membrana externa (ME) a quienes se unen y luego son transportados a

través de la ME mediante unión a la proteína periplasmica-ABC dependiente de permeasas.

En las grampositivas el complejo sideroforo-Fe es reconocido por proteínas específicas

ancladas en la membrana interna y luego transportadas por el complejo ABC-dependiente

de permeasas.

4.4.2 Otro sistema

Las bacterias pueden adquirir hierro del heme. Este es transportado al citoplasma y extraído

por una oxigenasa que rompe el anillo tetrapirrolico. El transporte se efectúa de diferentes

maneras. En las gramnegativas ha sido sustancialmente elucidado y se reconocen dos tipos:

a-uno implica receptores de membrana y transporte por parte del sistema ABC-dependiente

de permeasas específico para el heme; b- el otro componente de la secreción de proteínas

bacterianas especializadas con capacidad de secuestrar heme de diversas fuentes y unirlo a

receptores específicos de la ME. Debido a su semejanza con sideroforos se lo denomina

hemoforo.

En la figura 3 se observa una comparación esquemática entre el hemoforo y el sideroforo:



Figura 3. Comparación esquemática entre el hemoforo y el sideroforo.

4.5 FUNCIÓN ANTIVIRAL

La actividad antiviral de la Lf se ha observado contra virus del Herpes Simplex 1 y 2,

adenovirus, virus del VIH, virus de la hepatitis C,citomegalovirus, virus de la polio,

hantavirus, rotavirus (en líneas de cultivo),93 virus respiratorio sincicial, calicivirus felino,

y virus de inmunodeficiencia felina, entre otros. La mayoría de estos estudios sugieren que

la Lf inhibe la entrada del virus a la célula hospedera más que actuar sobre su replicación

(Fig. 4).

Figura 4. Modelo del mecanismo de acción de la lactoferrina contra los virus.

La lactoferrina (Lf) ejerce su acción por competencia sobre los virus, impidiendo su

internalización en la célula eucariota. 1) La Lf se une a proteínas de la cápsula viral. 2) La

Lf se une al heparán sulfato. 3) La Lf también puede unirse a los receptores específicos de



algunos virus. 4). Si el virus logra entrar a la célula, la Lf activa mecanismos que

contribuyen a amplificar a la respuesta inmune. Modificado de Waarts et al.110

La primera estrategia de la Lf para lograrlo es la de unirse a la partícula viral, impidiendo

que se adhiera a la célula. Este es el caso del virus de la hepatitis C, en el que la Lf se une a

proteínas E1 y E2 de su envoltura. Los experimentos demuestran que en este caso, se

requiere de la molécula entera de Lf, en su conformación nativa, para que el efecto

ocurra.116 Este mismo mecanismo también se presenta contra el rotavirus.93 Existen otros

virus en los que la actividad de la Lf se atribuye en parte a su unión con algunas proteínas

de la envoltura viral y en parte al bloqueo de receptores celulares. Tal es el caso de los virus

del herpes, el adenovirus y el virus del VIH. Un segundo mecanismo consiste en bloquear

moléculas de la superficie celular, que el virus reconoce como receptores o coreceptores.

Una de las hipótesis más aceptadas es que la Lf bloquea los receptores virales del tipo

glicosaminoglicanos, especialmente al heparán sulfato (HS).

Otros estudios muestran que la Lf es capaz de modular al sistema inmune de los mamíferos

presentando una actividad antiviral y antibacteriana indirecta. La Lf mantiene una estrecha

interacción con neutrófilos, linfocitos, macrófagos y sus productos, los cuales juegan un

papel de protección importante durante las primeras etapas de la infección.

4.6 FUNCIÓN ANTIFÚNGICA

Su mecanismo de acción se debe a que: secuestra el Fe por lo que impide su utilización por

las bacterias e inhibe su multiplicación; produce una alteración de la membrana de las

bacterias, por quitar sus lipopolisacáridos, lo que produce una pérdida de su integridad y su

muerte; y porque estimula la fagocitosis por macrófagos y monocitos

La Lf también ejerce una acción protectora contra hongos y levaduras. Los primeros

estudios al respecto se realizaron con el género Candida spp. por Kirkpatrick quienes, junto

con otros investigadores, atribuyeron el efecto antifúngico de la Lf, a su capacidad de

secuestrar Fe.

Es por ello que en la actualidad, existe el interés por combinar la acción de la Lf, con el

fluconazol, el ketoconazol y el clomitrazol, con el fin de encontrar un efecto sinergístico y

de reducir las dosis de medicamento. Se ha observado que el mejor efecto se obtiene al

combinar Lf (1 mg/ml) y concentraciones mínimas efectivas de fluconazol; en estas

condiciones se observa la completa inhibición de diversas especies de Candida.

Otros autores indican que la acción de la Lf administrada por vía oral se debe a su efecto

inmunomodulador, ya que, existe evidencia de que la Lf aumenta la actividad fagocítica de

los neutrófilos sanguíneos, la actividad de las células NK, el número de células

progenitoras de neutrófilos en la sangre y la producción de gamma interferón.



5 APLICACIONES

5.1 ESTIMULANTE DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO

Produce una estimulación a nivel general ya que aumenta: el crecimiento de las bífido

bacterias, el crecimiento de las células asesinas naturales (natural Killer Cells) y la

actividad de los neutrofilos, lo que le permite ser una parte esencial del programa de

mantenimiento inmunitario

En el plasma es liberada por los neutrófilos en caso de: infección, inflamación, tumores y

sobrecarga de hierro. Si los neutrófilos no la poseen, pierden su capacidad bactericida y

aumenta la susceptibilidad a las infecciones.

Además, coopera con otros factores de defensa inespecífica presentes en secreciones

exócrinas: lisozima, IgG, IgA, péptidos antimicrobianos.

Produce una estimulación local: estimula la inmunidad de las células de la mucosa

intestinal y promueve su citotoxicidad lo que inhiben las infecciones y el desarrollo

tumoral.

Protege frente a las infecciones gastrointestinales, tanto en los niños como en los adultos, y

frente a las infecciones en general (gripe, infecciones renales, infecciones de vías

respiratorias bajas, etc.).

5.2 ESTIMULA EL CRECIMIENTO Y LA PROLIFERACIÓN DE LA MUCOSA INTESTINAL.

Potente antioxidante: previene la formación de radicales libres liberados por los fagocitos y

participa en el control de los daños celulares asociados con el envejecimiento.

Acción antiinflamatoria por: bloqueo de las citoquinas inflamatorias: IL-1ß, IL6, por que

reduce la liberación de interleucinas, del factor de necrosis tumoral (TNF) y la liberación de

prostaglandina E, por activar los linfocitos T8 y modular la actividad del complemento.

Esto le hace ser muy útil en casos de dermatosis y estomatitis.

Preventiva de diversos tipos de cánceres (colon, vejiga, esófago y pulmón). Existen

estudios en los que se observó que suprimió la formación de lesiones precancerosas en

tumores de colon inducidos en ratas y en otros se vio que aumentaba la actividad de las

células “natural Killer” en tumores de bazo.

Potencia el efecto de diversos medicamentos como antimicrobianos (b-Lactámicos y grupos

azol), antifúngicos y potencia el efecto del retroviral AZT, lo que es muy importante, ya

que puede ser una alternativa para disminuir la transmisión del SIDA de madre-hijo.



Ayuda a desarrollar la densidad ósea (osteoporosis) y frena la disposición de los huesos a

las fracturas.

5.3 PROPIEDADES FARMACODINAMICAS

Hierro proteinsuccinilato es un compuesto orgánico en el cual el hierro está unido a las

proteínas succiniladas de la lecha (caseína) formando un complejo ferro-proteico que

contiene 5% + 0,2% de hierro trivalente.

Debido a sus características propiedades de solubilidad, estrictamente relacionadas con la

variación de pH, el hierro proteinsuccinilato ofrece la ventaja, sobre otras sales de hierro,

de precipitar a pH ácido gástrico, manteniendo el hierro protegido en el núcleo proteico y

disminuyendo las molestias gástricas que originan la ingesta de sales de hierro.

La liberación del hierro contenido en Lactoferrina Solución oral tiene lugar en el duodeno y

sobre todo en el yeyuno, debido al aumento de pH que redisuelve al preparado y a la acción

de los enzimas pancreáticos que digieren la matriz proteica. El hierro queda así disponible

para su absorción sistémica e incorporación a los lugares de depósito.

Figura 5. Lactoferrina comercial.

5.4 APLICACIONES CLÍNICAS POTENCIALES DE LA LACTOFERRINA

La potencialidad de la Lf en aplicaciones biológicas, farmacológicas y nutracéuticas, ha

atraído la atención delos científicos, debido a su amplia gama de efectos biológicos,

incluyendo su uso como inmunomodulador y anticancerígeno.46, 99,101 Diversos estudios

muestran que no existe diferencia entre la actividad antibacteriana de la lactoferrina

humana (Lfh) y la lactoferrina bovina (Lfb). Es por ello que la principal fuente comercial

de Lf es la leche bovina. En la actualidad, la Lf es aislada y purificada a escala industrial a

partir del suero de queso y de leche desnatada; la purificación se realiza mediante el uso de

resinas de intercambio iónico, posteriormente la fracción Lf se concentra, ultrafiltra,

pasteuriza y liofiliza obteniéndose un producto con 95% de pureza.99 Alternativamente se



realizan estudios para la producción a gran escala de lactoferrina humana recombinante

producida en vaca. Existen muy pocos trabajos en los que la Lf se utiliza de manera

intraperitoneal o intravenosa. Entre ellos destaca el de Zagulski et al.118 quienes aplicaron

inyecciones de Lf a ratones, 24 h antes de inducirles una infección con E. coli

enteropatógena.

La Lf previno la mortalidad de los roedores hasta 30 días después de que se manifestó la

infección. En humanos, la manera natural de administrar lactoferrina, es la vía oral. En

infantes neonatos, Reiter, 79 estimó que la alimentación con leche materna, permite la

ingestión de 3 g de lactoferrina por día, durante la primera semana de vida. Esta Lf actúa

como primera línea de defensa en las mucosas intestinales; también promueve el

crecimiento de bifidobacterias y lactobacilos. Estas bacterias cuentan con diversas

estrategias para combatir a los enteropatógenos, entre ellas, la producción de ácido, de

bacteriocinas, y la competencia por los sitios de adhesión en la mucosa y en el epitelio

gastrointestinal. Además, gran parte de la lactoferrina se absorbe intacta en el intestinode

los neonatos, permitiendo su distribución por el torrente sanguíneo, hacia sitios de infección

lejanos del tracto gastrointestinal. Lo anterior abre un campo de posibilidades para las

aplicaciones clínicas y profilácticas de la Lf en fórmulas para lactantes. En adultos

humanos y animales, parte de la lactoferrina administrada oralmente se degrada en péptidos

bioactivos, debido a la acción de la pepsina. Adicionalmente, la absorción intestinal de la

Lf que permanece intacta es muy pequeña. De allí que se piense que en estos casos, el

mecanismo de protección de la Lf sea el de activar al sistema inmune. La lactoferrina es

capaz de influir en la respuesta inmune sistémica de diferentes maneras. Una de ellas es la

regulación de la actividad de los macrófagos y de la proliferación de linfocitos, mediante

mecanismos aún no elucidados. Sin embargo, su acción más importante se relaciona con los

neutrófilos polimorfonucleares; estas células, además de actuar como fagocitos, son

capaces de descargar gránulos de lactoferrina en el plasma sanguíneo, poniéndolas en

contacto con los microorganismos invasores.

En el sistema inmune de las mucosas se han reportado diversos efectos inmunomoduladores

en modelos animales y en humanos, suplementados con Lf por vía oral se observaron un

incremento en los niveles de IgA e IgG en el fluido intestinal de ratones, así como la

proliferación de placas de Peyer y esplenocitos. La administración de hidrolizados de

lactoferrina, provoca un aumento de células NK y de linfocitos T del tipo CD4+ y CD8+,

en la sangre y en el intestino delgado de ratones. La molécula intacta, induce la secreción

de IL-18, IL-10 y gamma interferón. Los estudios en humanos muestran que la

administración de Lf, induce el aumento de células Th0 y Th1 en sangre. El conjunto de

estas observaciones, da soporte a la idea de que la Lf y sus péptidos, son capaces de

modular al sistema inmune de la mucosa intestinal, protegiéndolo contra las infecciones.99

Se piensa que la Lf reconoce receptores localizados en las células del epitelio intestinal y en

las células del tejido linfoide asociado al intestino (GALT, por sus siglas en inglés Gut

Associated Lymphoid Tissue). Esta interacción provoca un aumento en la producción de

citocinas y quimiocinas o estimula directamente a los linfocitos del GALT. Los principales

estudios en humanos relacionados con la actividad antimicrobiana de la Lf, están dirigidos

hacia el efecto de esta glicoproteína, sobre la bacteria Helicobacter pylori y el virus de la



hepatitis C. En 150 pacientes positivos para H. pylori, se observó un 100% de erradicación

de la bacteria en pacientes que recibieron el tratamiento convencional más Lf y un 73% en

los que únicamente recibieron el tratamiento convencional con antibióticos.31 En un

estudio piloto con 11 pacientes con hepatitis C crónica, se observó la disminución

significativa de la alanina transaminasa sérica y de los conteos de carga de ARN viral, en

aquellos pacientes que mostraron un conteo viral inicial baja (≤100 kcopias/ml de ARN).

Las dosis utilizadas fueron de 1.8 a 3.6 g de Lf por día, durante un periodo de 8 semanas.

No se observaron efectos adversos en los pacientes. En la actualidad se realizan estudios en

10 hospitales de Japón, para probar la efectividad de la Lf en pacientes con hepatitis B y C.

Los primeros resultados confirman la efectividad de la Lf en pacientes con títulos virales

bajos. Una de las aplicaciones potenciales de la lactoferrina que requiere de estudios in

vivo, tanto en modelos animales como en humanos, es la de explotar el sinergismo que

muestra in vitro, con algunos medicamentos. Este es el caso de antifúngicos como el

fluorazol, del AZT utilizado en pacientes con HIV, o de diversos antibióticos. Otro aspecto

muy importante en clínica, es el uso de moléculas bioactivas, como acarreadores de

medicamentos antivirales. La ventaja consiste en que dichas moléculas se dirigirían

únicamente hacia las células afectadas por el virus.

Ello permitiría utilizar dosis de medicamento más bajas, disminuyendo sus efectos tóxicos

y colaterales. Los principales estudios hasta el momento, se basan en el ensamble de

medicamentos a proteínas modificadas químicamente. La idea es que las proteínas

conserven su actividad antimicrobiana y que puedan dirigirse específicamente hacia las

células o tejidos infectados acarreando al mismo tiempo un medicamento que también

combata al patógeno causante de la infección. El interés por el uso de lactoferrina en este

sentido es grande, debido a su amplio espectro contra virus, hongos y bacterias.

6 PRODUCCIÓN Y USO DE LF Y SUS DERIVADOS

Actualmente, LF es aislada y purificada a una escala industrial (aproximadamente 20-30

toneladas cada año por todo el mundo) del suero de queso y la leche desnatada.

La concentración de LF en el suero del queso es aproximadamente 100 Mg. " l-1. El crudo

obtenido de LF es desalado y concentrado usando la ultrafiltración y membranas de

diafiltración, después de lo cual es sujetado a la pasterización. Purificada la LF, el polvo

con una pureza del 95 % o más, finalmente es obtenida por la sequedad de helada. En un

proceso alternativo, la microfiltración y la sequedad de rocío son realizadas en vez de la

pasterización y la sequedad de helada, respectivamente. En años recientes, la pasterización

ha venido siendo considerada como una alternativa muy importante para inactivar no sólo

la bacteria, sino también virus como el pie y el virus de enfermedad de boca. Mientras se

ha venido haciendo esfuerzos para desarrollar un método práctico para la pasteurización de

LF, encontramos que la LF es estable contra el tratamiento térmico en condiciones ácidas

(Abe et al. 1991), mientras el tratamiento térmico a un pH neutro causa desnaturalización

de la proteína. Se considera que la calefacción a un pH de 4 y a una temperatura entre 90-

100°C durante 5-10 minutos así como el método UHT son métodos convenientes y



prácticos para la pasterización de LF. Este proceso de pasterización fue patentado, y ha sido

aplicado a la fabricación de una amplia variedad de productos comerciales que contienen

LF. Un pepsina hidrolizada de LF es producida por el tratamiento con pepsinas en

condiciones ácidas (Saito et al. 1991). Después de que la hidrólisis ha sido completada, la

pepsina es inactivada por el tratamiento térmico. Entonces la mezcla de reacción es filtrada

y concentrada por la ósmosis inversa. Finalmente, el hidrolizado de LF es obtenido por la

pasterización y la sequedad de helada para el empleo en fórmulas infantiles. Además, la

lactoferricina puede ser purificada de esta LF hidrolizada por la cromatografía hidrófoba de

dos pasos (Bellamy et al. 1992). El péptido es diluido con un parachoques ácido, la

solución diluida es concentrada por la ósmosis inversa, y finalmente, la lactoferricina es

producida por la sequedad de helada como un polvo con la pureza de más del 95 %. Este

proceso de producción para la lactoferricina también ha sido patentado. La toxicidad de LF

purificado, como se juzgaba, era sumamente baja en pruebas de seguridad. De los

resultados de dosis sola, pruebas de toxicidad orales de 4 semanas, y de 13 semanas, la

dosis de LF que no causó ningunos efectos adversos fue encontrada para ser 2000 mg " el

kilogramo 1 " el día 1 para las ratas de ambos sexos (Yamauchi et al. 2000a). Además, LF

no expuso ningún potencial mutagénico en una prueba de mutación inversa bacterial

(Yamauchi et al. 2000b). Basado en los resultados de estas pruebas de seguridad y los

resultados de estudios clínicos, purificados LF, como se considera, es un aditivo alimenticio

sumamente salvo(seguro). Con el reconocimiento aumentado de los efectos biológicos de

LF, como descrito debajo, los usos de LF han sido ampliados. LF- es complementada en la

fórmula infantil, la leche de continuación, la leche desnatada, el yogur, el chicle, y

suplementos alimenticios. Además de productos de alimentación, LF también es usado en

cosméticos de cuidado de la piel, en dietas especiales terapéuticas para el alivio de

inflamación en perros y gatos, y en la comida de acuicultura.

6.1 LOS EFECTOS PROTECTORES DE ANFITRIÓN DE LF Y LACTOFERRICINA

Considerando la amplia variedad de los efectos biológicos de LF, farmacéutico - y usos

relacionados con el alimento, incluyendo el empleo como un immunopotenciador, ha

atraído la atención considerable. Estudios recientes han examinado los efectos protectores

de anfitrión de administración oral de LF en varios modelos de animal y en la gente. En

experimentos de ratón, supresión del crecimiento excesivo intestinal y el desplazamiento

bacterial de enterobacteria así como un efecto protector contra la infección causada por

Staphylococcus methicillin-resistente aureus (MRSA) y Candida albicans ha sido relatada

(Teraguchi et al. 1994, 1995; Bhimani et al. 1999; Abe et al. 2000). LF también ha sido

mostrado para mejorar enfermedades inflamatorias como dermatophytosis causado por el

hongo Trichophyton mentagrophytes en conejillos de Indias y stomatitis insuperable en

gatos (Sato et al. 1996; Wakabayashi et al. 2000), mientras esto confiere la resistencia

contra infecciones como la enfermedad de punto blanca en el pescado (Kakuta y 1995

Kurokura). Entre los efectos protectores de anfitrión de LF, informes recientes sobre la

prevención de cáncer han estado atrayendo la atención. En un modelo de rata de cáncer de

colon inducido por la inyección subcutánea de un cancerígeno, la administración oral de LF

suprimió la formación de lesiones precancerosas en el intestino grueso y también

considerablemente redujeron(obligaron) la incidencia de carcinoma (Sekine et al. 1997a).



La administración oral de LF también aumentó la actividad de célula natural asesina (NK)

en el bazo (Sekine et al. 1997b). Un efecto de prevención sobre el cáncer también ha sido

demostrado en varios modelos de animal, como el esófago, y el pulmón en ratas (Ushida et

al. 1999; Masuda et al. 2000) o metástasis pulmonar en ratones con tumores

subcutáneamente implantados (Iigo et al. 1999). Además, se ha relatado que la

administración oral de lactoferricin muestra un efecto protector contra la infección causada

por MRSA o el parásito Toxoplasma gondii en ratones (Nakasone et al. 1994; Isamida et al.

1998).

6.2 USOS

Anti cándida: la lactoferrina cuando es combinada con agentes antifungicos como por

ejemplo clotrimazol, ketoconazol, fluoconazol; inhiben sinergicamente el crecimiento

de Cándida albicans. Siendo las cepas resistentes, más sensibles a este efecto sinérgico.

Aditivo en fórmulas lácteas para niños para prevenir infecciones y como estimuladora

de la concentración de lactobacilos.

Prevención de caries dentales, periodontopatologias, infecciones amigdalinas.

Uso tópico: ha sido sugerido para casos de herpes virus tipo 1 y tipo 2 Varicela Zoster.

Recombinante de lactoferrina: para bloquear la formación de “biofilm” (película

biológica) y seria promisorio su uso en pacientes con fibrosis quistica.

Lactoferrina en el diagnóstico de infecciones: la lactoferrina sirve como marcadora de

la presencia de leucocitos en muestras clínicas.

Posibles usos en patologías no infecciosas: osteoporosis, materiales implantables.

Identificación del síndrome del colon irritable (SCI): la presencia de lactoferrina en las

heces indica un proceso inflamatorio y ha demostrado gran sensibilidad y especificidad

en la detección de la Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) Y, por lo tanto, es un

marcador útil en el diagnóstico diferencial entre SCI y EII. La lactoferrina es negativa

en SCI.

Fosfopeptido de caseína: este subproducto de la manufactura del lactosuero está siendo

utilizada para producir materiales que ayudan a prevenir la caries dental.

Incremento de la actividad de las bifidobacterias.

La lactoferrina adicionada en alimentos, especialmente en alimentos para niños

previene la gastroenteritis causada por infección de enteropathogenica Escherichia coli.

La resistencia de los niños a la infección son atribuidos a factores en la leche humana

que son escasos en la leche bovina. Estos factores, en su mayoría: son proteínas, la más

importante es la Ig, la lactoferrina y la lisozima.



7 PROCESOS TECNOLÓGICOS: OBTENCIÓN DE LACTOFERRINA

Figura 6. Fraccionamiento del lactosuero.

El proceso para la obtención de las proteínas del suero, es muy complejo y requiere

especialmente de la aplicación de técnicas modernas de extracción y filtración como lo son

la ultrafiltracion, la diafiltracion, filtración por membranas y técnicas de concentración. A

continuación describiremos cuatro métodos para la obtención de la lactoferrina, a partir del

suero del queso.

7.1 MÉTODO 1

Figura 7. Fraccionamiento del lactosuero.



Utilizando la técnica de la filtración de gel en SEPHACRIL S-300, y un FRACTOGEL

TSK HW-55, se pueden aislar inmunoglobulinas del suero del calostro. Utilizando la

técnica de la SDS-PAGE y las técnicas de inmunoforesis se puede determinar la pureza de

los trozos fraccionados en SEPHACRIL S – 300, estos resultados se valoran mediante un

análisis inmunoquímico en el cual se obtienen en proporción las cantidades de ácido, dulce

de suero y calostro, luego la lactoferrina se puede aislar del suero dulce mediante la técnica

de HEPARIN –ATATCHED SEPAROSE. Luego la lactoferrina absorbida en la columna

de la técnica anterior es lavada con 0.5M NaCl, pH 7.4. finalmente la pureza de la proteína

del aislado se puede confirmar por SDS – PAGE y por inmunoelectroforesis.

7.1.1 Resultados y discusiones (filtración de gel en sephacril s – 300)

La filtración de gel es el método o alternativa para la preparación de proteínas aisladas. El

Calostro bovino contiene proteínas aisladas así como proteínas con un rango ancho de

pesos moleculares de alfa -lacto albúmina (MW ca. 14.500) a IgM (Mwca.1*106).La

filtración de gel de alto peso molecular en proteínas requiere de una gel altamente porosa y

un gel rígido para proveer buena estabilidad y cortos tiempos de separación. La producción

de inmunoglobulinas aisladas puede ser como del 90%. La figura 8a y la figura 8b

muestran la separación de calostro bovino sin tratar y suero tratado con sulfato de amonio,

respectivamente. Esto índico que en ambos perfiles se limpió con un solvente y se

obtuvieron dos de los más importantes picos; El primero apareció en el volumen vació de la

columna, la cual indica que el peso molecular fue en la vecindad de un millón y el segundo

pico indica un bajo peso molecular de las proteínas.

Figura 8. separación de calostro bovino sin tratar y suero tratado con sulfato de amonio.

La fracción 3 sin tratar de ambos sueros de calostro bovino y el sulfato de amonio con el

que se trato el suero contuvo el 99% de IgG cuando estas fueron analizadas por

inmunodifusion radial.



7.2 METODO2: MÉTODO DE AISLAMIENTO DE LACTOFERRINA Y OTRAS PROTEÍNAS

LÁCTEAS

El objeto de la invención es un método de aislamiento de la lactoferrina basado en la

absorción específica mediante un ligando insolubilizado en placas de cartón de celulosa

filtrante. El aislamiento de lactoferrina se hace a partir de lactosuero procedente de

quesería. Este se hace pasar en flujo continuo por un dispositivo en el que se encuentran las

placas de celulosa modificadas con Azul Reactivo2, que retienen fundamentalmente la

lactoferrina. Una vez lavada la celulosa para eliminar las proteínas no retenidas, se eluyen

las retenidas con una solución salina. Finalmente, la lactoferrina obtenida se dializa para

eliminar parte de la sal y se liofiliza, tras lo cual puede ser utilizada para su adición a

productos para uso animal o humano.

7.3 MÉTODO 3

Desde hace cinco años, nuestro grupo de trabajo estudia la purificación de lactoferrina y

lactoperoxidasa por métodos que se diferencian de los utilizados corrientemente. La

estrategia de trabajo consiste en "atrapar" una proteína adsorbiéndola a un soporte o matriz

cromatográfica que, a su vez, lleva unida una molécula -o ligando- que tiene afinidad por

dicha proteína. La cantidad de material que va a quedar retenido en la matriz depende de

dos factores: su concentración en la solución original y sus características de interacción

con el ligando presente en la matriz cromatográfica. Esta interacción está caracterizada por

lo que se llama la constante de disociación de la proteína con el ligando inmovilizado en la

matriz. Para que la captura de la proteína sea eficiente, su concentración debe ser por lo

menos 10 veces mayor que el valor de la constante de disociación. En la cromatografía de

intercambio iónico -como su nombre lo indica- las proteínas quedan retenidas por una

interacción electrostática entre el ligando, que posee carga eléctrica neta, positiva o

negativa, y la proteína cuya carga es de signo contrario. En la cromatografía de afinidad, en

cambio, las proteínas son atrapadas por ligandos inmovilizados merced a una multiplicidad

de interacciones, de manera tal que la interacción es mucho más intensa y por lo tanto la

constante de disociación menor que en el caso del intercambio iónico. Es decir que si se

quiere retener una proteína que está en baja concentración, como es el caso del suero del

queso, la cromatografía de afinidad resulta la opción más apropiada. Este procedimiento

permite partir del suero original, por lo que así evita la complicación de obtener primero un

WPC. Cuando se habla de cromatografía de afinidad, normalmente se piensa en utilizar

como ligando un anticuerpo, pero este tipo de cromatografía, llamada bioespecífica, resulta

muy cara; está reservada para proteínas de alto valor comercial. Sin embargo, existe otro

tipo de cromatografía de afinidad que utiliza ligandos sintéticos: es la cromatografía de

afinidad pseudobioespecífica. Ligandos típicos de este tipo de cromatografía son los

metales inmovilizados (véase "Jugos de fruta sin metanol", en Ciencia Hoy 33: 25-32,

1996) y los colorantes triazínicos, que son aquellos que usa la industria textil para teñir las

telas. Los colorantes triazínicos son baratos y resistentes a la degradación química y

biológica; recordemos que una matriz cromatográfica que se use industrialmente debe tener

una larga vida útil. Como hay muchísimos colorantes triazínicos, y puesto que cada uno de



ellos mostrará una constante de asociación distinta con una determinada proteína, debimos

elegir cuál resultaba más adecuado a nuestros fines. Resultó ser el Rojo HE-3B. Luego de

inmovilizarlo sobre un soporte cromatográfico, conseguimos establecer condiciones

experimentales en las que este ligando podía retener el 95% de la lactoferrina presente en el

suero del queso y prácticamente nada del resto de las proteínas. Luego, agregando

simplemente una determinada concentración de sal, que debilita la unión de la proteína al

ligando, se separa la lactoferrina del soporte. Creemos que esta metodología -desarrollada

en la Universidad de Buenos Aires- puede resultar de interés para valorizar el suero del

queso, un subproducto industrial que, como dijimos al principio, todavía se utiliza como

alimento para los cerdos.

7.4 MÉTODO 4

El método consiste en un proceso de extracción y purificación de proteínas a partir de la

leche vacuna mediante el uso de colorantes triazínicos como ligandos específicos,

inmovilizados sobre un soporte", explican los investigadores en la memoria descriptiva de

la patente.

Las ventajas del método pueden resumirse en que, por un lado, se trata de un

proceso particularmente económico y eficiente, dado que no necesita de una etapa de

concentración por ultrafiltración y diafiltración previos, y por otro, que el costo del ligando

y su proceso de inmovilización también resulta muy económico.

Esto se debe a que los colorantes triazínicos son producidos en grandes cantidades para la

industria textil y ya tienen incorporados en su estructura los grupos reactivos para su

inmovilización sobre soportes cromatográficos, que en este caso son membranas de fibra

hueca. Las matrices cromatográficas así obtenidas tienen una productividad 10 veces mayor

que las convencionales. Fuente: Amalia Dellamea, prensa FFyB UBA

7.5 MÉTODO 5: ULTRAFILTRACION

La ultrafiltración consiste en un proceso de filtración a través de una membrana que por su

pequeño tamaño de poro, no permite el pasaje de proteínas en solución y, por lo tanto, las

concentra. La diafiltración es un modo operativo de la ultrafiltración que permite eliminar

las sales de una solución de proteína.

7.6 MÉTODO 6: NANOFILTRACION

Nanofiltración es un proceso de filtración por membranas operadas bajo presión en la que

solutos de bajo peso molecular (1000 daltons) son retenidos, pero las sales pasan, total o

parcialmente, a través de la membrana con el filtrado. Esto provee un rango de selectividad

entre las membranas de Ultrafiltración y Osmosis Inversa, permitiendo simultáneamente

concentración y desalado de solutos orgánicos. La membrana NF retiene solutos que la UF



pasaría, y deja pasar sales que la OI retendría. En algunas aplicaciones, su selectividad

entre moléculas de tamaños similares es la clave del éxito del proceso de separación con

membrana.

Permitiendo un paso, prácticamente libre, de iones monovalentes, la membrana de

nanofiltración reduce el incremento del gradiente de presión osmótica, a la que contribuyen

las sales monovalentes. Como resultado, una mayor cantidad de producto (permeado) es

posible.

Las membranas de Nanofiltración pueden ser membranas tubulares o espirales, hechas

especialmente para la recuperación de cáusticos y ácidos.

Figura 9. Equipo y Esquema del proceso de Ultrafiltacion y Nanofiltracion.



7.7 MÉTODO 7: DIAFILTRACION

Este proceso se refiere a la adición de agua a la corriente de rechazo a fin de continuar con

la eliminación de las especies que permean a través de la membrana conjuntamente con el

agua.

La DF puede ser discontinua (DD) o continua (CD).

En la DD los solutos permeables son eliminados de la corriente de alimentación/rechazo

por reducción del volumen, seguido de redilución con agua y reultrafiltración en etapas

repetitivas.

En la CD se adiciona agua, con pH y temperatura adecuado, al tanque de alimentación con

un caudal igual al del flujo de permeado, manteniendo constante el volumen durante todo el

proceso (V0 = VR). Los solutos que permean son removidos a la misma velocidad que el

flujo de permeado.

Los datos en un proceso CD son expresados en función al volumen permeado o diluido VD

Volumen diluido

Volumen de líquido permeado VP

VD

Volumen de alimentación inicial V0

Ec (1)

Con lo cual la concentración de soluto en el rechazo después de VD volúmenes de DF

continua es VD 1 R

0CR C e

Ec (2)

El flujo J en una CD normalmente es mayor que el flujo promedio en una DD, pero esta

ventaja muchas veces no compensa el mayor procesado requerido y la posible necesidad de

una etapa adicional de concentración del rechazo final que se encuentra diluido.

Los procesos DF se basan en la eliminación convectiva de microsolutos permeables.

La velocidad JS a la cual los microsolutos son removidos a través de la membrana depende

de su concentración CS y del flujo de agua JW.

JS CS JW Ec (3)

Si R= 0, resulta

CS R CS P Ec (4)

La concentración del microsoluto es la misma en la corriente de rechazo y en la corriente de

permeado.



El flujo JW es controlado por la presión transmembrana o consideraciones de transferencia

de masa. Para aumentar JS, el módulo de membrana puede se operado en el modo de

DIALSIS ULTRAFILTRACION.

Para ello una corriente de agua se hace circular por el canal del permeado con un flujo

mucho mayor al flujo de permeado y con una presión mucho más baja que la presión de

alimentación al módulo. De esta forma, debido al efecto de dilución, la concentración de

microsolutos en el flujo de permeado es más baja que en el flujo de alimentación/rechazo.

Esto establece un gradiente de concentración entre ambos flujo (rechazo y permeado)

incrementándose así el flujo JS de los microsolutos que permean.

JS CS JW DS CS R CS P Ec (5)

DS= Coeficiente de difusión del soluto permeable

La aplicación de este proceso resulta en menores tiempos de operación de una DF.

Este tipo de proceso se utiliza en aplicaciones como desalinización de gelatinas, producción

de vino y cerveza de bajo contenido de alcohol (usando membranas de O.I. y

Nanofiltración), concentración de jugos (usando membranas de O.I. y una solución con un

agente osmótico)

Recepción de suero del queso o leche desnatada

(humana o bovina)

Uso de resinas de intercambio iónico

Concentración de la leche

Ultrafiltración

Pasteurización

Liofilización

Obtención de lactoferrina

Figura 10. Diagrama de flujo de obtención de lactoferrina.



7.8 CURSOGRAMA ANALÍTICO

1

2

3

Figura 11. Diagrama de flujo de obtención de lactoferrina.

1) Recepción del suero del queso o leche desnatada.

2) Uso de resinas de intercambio iónico.

3) Obtención de la lactoferrina.

etapa /actividad

RECEPCION

USO DE RESINAS DE INTERCAMBIO IONICO

CONCENTRACION

ULTRAFILTRACION

PASTEURIZACION

LIOFILIZACION

OBTENCIÓN DE LACTOFERRINA



DIAGRAMA DE TUBERÍAS P&I

Figura 12. P&I.

8 CONCLUSIONES

Con el progresivo desarrollo de las ciencias y en especial el desarrollo de los métodos

industriales que nos permiten cada vez más comprender mejor el mundo y a su vez con

este conocimieniento poder mejorar la vida de todos los seres vivos. Ejemplo de ello es el

descubrimiento de la lactoferrina como proteína moduladora del sistema inmune: proteína

que se encuentra en las secreciones y se puede aislar de la leche humana y de la leche

bovina.

Es muy importante el hecho de que esta proteína pueda ser adicionada en alimentos para

niños, con lo cual no solo se lograría fortalecer la salud de nuestros niños sino también que

disminuiría en gran proporción el porcentaje de niños que mueren a causa de enfermedades.

Es para resaltar también la acción de la lactoferina sobre virus y bacterias, su importancia

en la detección de enfermedades intestinales y su acción sinérgica con los fármacos en la

destrucción de enfermedades, entre otras.

Es por eso que concluimos que se debe seguir investigando acerca de la lactoferrina, de

todas sus ventajas acerca de la protección de la salud y sus posibles aplicaciones, ya que



esto permitirá disminuir en gran numero el numero de muertes por enfermedad en el mundo

entero, por otro lado nos sentimos afortunados por haber tenido la dicha de investigar

acerca de esta importantísima proteína ya que nos permite tener una visión acerca de la

importancia de la manipulación inteligente de esta proteína en la protección de la salud y

por tanto de la vida.

9 BIBLIOGRAFÍA:

(1) (Nelly Zabaleta Pimentel, investigadora principal del Instituto de Investigación

Nutricional (IIN)).

(2) (Lonnerdal, B. 1985. Biochemistry and physiological function of human milk

proteins, Am. J. Clin. Nutr. 42: 1299.

(3) (Kawakami y col. 1988), and M. W. Chase, ed. 1971. Methods in immunology and

immunochemistry. Vol. 3. Academic Press, Inc., New York, NY.

(4) (Mantel y col. 1994)

(5) ( Horwitz y col.1984)

(6) (Mantel y col. 1984)

(7) (gahr y col. 1991, gentille y Broxmeyer 1983)

(8) (De Sousa y col. 1988).

(9) (Azuma y col. 1989)

(10) (Hurley y col. 1994, Damiens y col. 1998).

(11) (WWW. Queso diagnostic.com.mx

(12) Zagulski et al.118

(13) (http://www.saludcolombia.com/actual/salud76/noveda76.htm)

10 ANEXOS

10.1 GLOSARIO

CALOSTRO: El calostro es un líquido segregado por las glándulas mamarias durante el

embarazo y los primeros días del parto, compuesto por sustancias inmunológicas,

leucocitos, agua, proteínas, grasas y carbohidratos en un líquido seroso y amarillo

ELECTROFORESIS: La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza

una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su

tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

FUNGISTATICO: agente que inhibe el crecimiento de los hongos.

GLICOSAMINOGLICANOS: Los glicosaminoglicanos son largas cadenas de

polisacáridos no ramificadas formadas por la repetición sucesiva de la unidad de

disacáridos formada por: ácido urónico y hexosamina acetilada, la cual puede estar

sulfatada.



INMUNOMODULADOR: Sustancia que actúa regulando el sistema inmune mediante

el aumento o la disminución de la capacidad de producir anticuerpos.

INMUNOGLOBULINAS: Las Inmunoglobulinas son proteínas anticuerpo altamente

específicas que son producidas en respuesta a antígenos específicos. Los anticuerpos o

inmunoglobulinas son producidos por los linfocitos B en su forma unida a la

membrana. Este anticuerpo unido a la membrana constituye el receptor de antígenos de

la célula B. Los linfocitos B secretan anticuerpos sólo tras su diferenciación, inducida

por la interacción del antígeno con el anticuerpo de membrana de este tipo celular. Esta

interacción constituye la fase de reconocimiento de la inmunidad.

INTERLEUCINA: Son proteínas solubles de bajo peso molecular que ejecutan

múltiples funciones vinculadas al crecimiento celular, inmunidad, diferenciación tisular,

inflamación, etc.

NUTRACEUTICO: La palabra nutracéutico se deriva de las palabras nutrición y

farmacéutico y se refiere a todos aquellos alimentos que se proclaman como poseedores

de un efecto beneficioso sobre la salud humana. Estos alimentos a menudo se

denominan también como alimentos funcionales. También el término puede aplicarse a

compuestos químicos individuales presentes en comidas comunes como algunos

fitoquímicos. Ejemplos de alimentos a los que se les atribuyen propiedades

nutracéuticas son el vino tinto, el brócoli, la soja, la fruta, la leche de cabra, etc.

PROSTAGLANDINA: son un conjunto de sustancias que pertenecen a los ácidos

grasos de 20 carbonos (eicosanoides), que contienen un anillo ciclopentano y

constituyen una familia de mediadores celulares, con efectos diversos y, a menudo,

contrapuestos.

SUERO: El suero de leche es un líquido obtenido en el proceso de fabricación del

queso y de la caseína, después de la separación de la cuajada o fase micelar. Sus

características corresponden a un líquido fluido, de color verdoso amarillento, turbio, de

sabor fresco, débilmente dulce, de carácter ácido, con un contenido de nutrientes o

extracto seco del 5.5% al 7% provenientes de la leche.

10.2 GRUPOS DE INVESTIGACIÓN

Universidad Autónoma Metropolitana

Unidad Xochimilco, México, DF.

Department of Dairy & Animal Science. Penn State University. 302 Henning Bldg.

University Park, PA 16802 (USA)



Centro de investigación y desarrollo en Alimentación y Desarrollo A.C. Carretera a la

Victoria Km. 0.6 Hermosillo, Sonora. Coordinación de Ciencia de los Alimentos. Tel/fax

662 280 00 58. e-mail [email protected]

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2008 Solis - Lactoferrina