1

A VÍZBEFULLADÁST IGAZOLÓ IGAZSÁGÜGYI

LABORATÓRIUMI MÓDSZEREK FEJLESZTÉSE

Doktori (PhD) - értekezés

Rácz Evelin

Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Vezető: dr. Kovács L. Gábor, egyetemi tanár, akadémikus

Készült a “Molekuláris patológiai és laboratóriumi vizsgálatok jelentősége az orvosi

diagnosztikában és terápiában” c. program keretében

Programvezető: dr. Miseta Attila, egyetemi tanár

Témavezető: dr. Sipos Katalin, egyetemi docens

Pécsi Tudományegyetem

Általános Orvostudományi Kar

Igazságügyi Orvostani Intézet

Pécs, 2016.

2

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK 5

1. BEVEZETÉS 6

1.1 A vízbefulladás okainak statisztikai vizsgálata és annak nehézségei 6

1.2 A vízbefulladás, mint diagnózis felállításának problémái 8

1.3 A vízbefulladás igazolását célzó laboratóriumi módszerek 9

1.4 Az algák és a vízbefulladás kapcsolata 10

1.4.1 Diatómák 10

1.4.2 A vízbefulladás tényének bizonyítása: Diatóma teszt 12

1.4.3 Cianobaktériumok 16

2. CÉLKITŰZÉSEK 18

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 19

I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT MÓDSZERTANA 19

3.1 A vízbefulladások számának felmérése 19

3.2 Toxikológiai analízis 19

3.3 Statisztikai analízis 20

II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI

TECHNIKA MÓDSZERTANA 21

3.4 Mintakezelés 21

3.5 A vízbefulladás bizonyítására alkalmazott módszer, a diatóma teszt 21

3.5.1 Diatóma teszt I.: Savas emésztés 22

3.5.2 Diatóma teszt II.: Enzimatikus emésztés 22

3.5.3 Diatómák vizsgálata fordított plankton mikroszkóppal 22

3.6 Pikocianobaktériumok és pikoeukarióta algák azonosítása és elkülönítése vízmintában fluoreszcens

mikroszkóppal 23

3.7 DNS izolálás és PCR 24

3

3.7.1 Fitoplankton DNS izolálás vízből, algatenyészetből és poszt mortem szövetből 24

3.7.2 Diatóma DNS izolálás vízből, algatenyészetből és poszt mortem szövetből 25

3.7.3 PCR 25

3.7.4 PCR kontrollok 28

4. EREDMÉNYEK 29

I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEI 29

4.1 A vízbefulladások számának felmérése Magyarország dél-dunántúli régiójában 29

4.1.1 Rizikófaktor: Életkor 30

4.1.2 Rizikófaktor: Véralkoholszint 32

4.1.3 Rizikófaktor: Kábítószer- és gyógyszerfogyasztás 35

4.1.4 Rizikófaktor: Évszakok 35

4.1.5 Rizikófaktor: Vízbefulladások helyszínei 36

4.1.6 Rizikófaktor: A vízbe kerülés oka 37

II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI

TECHNIKA EREDMÉNYEI 39

4.2 A vízbefulladás tényének alátámasztására alkalmazott mikroszkópos módszer, a diatóma teszt 39

4.2.1 Vízminták vizsgálata fény- és fluoreszcens mikroszkóppal 39

4.2.2 Poszt mortem szövetminták mikroszkópos vizsgálata 43

4.3 A vízbefulladás tényének alátámasztására alkalmazott molekuláris biológiai módszer 45

5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA 48

I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEINEK MEGVITATÁSA 48

II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI

TECHNIKA EREDMÉNYEINEK MEGVITATÁSA 51

6. ÖSSZEFOGLALÁS 55

7. IRODALOMJEGYZÉK 56

8. PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA 64

I. A disszertáció alapjául szolgáló közlemények 64

II. Egyéb közlemények 64

4

III. Konferenciaszereplések 65

9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 68

FÜGGELÉK 69

5

RÖVIDÍTÉSEK

BAC Blood alcohol concentration (véralkohol koncentráció)

CBR a dolgozatban alkalmazott, cianobaktériumokra specifikus

primerek egyike

DIA a dolgozatban alkalmazott, diatóma csoportokra specifikus

primerek egyike

dNTP dezoxi-nukleozid-trifoszfátok

EDTA etilén-diamin-tetraecetsav

F forward (primer)

HPLC-DAD High-Performance Liquid Chromatography with Diode-

Array Detection (diódasoros detektorral ellátott

nagyhatékonyságú folyadékkromatográf)

HS-GC-FID Headspace gas chromatograph with flame-ionization

detection (gőztér mintaadagolóval ellátott gázkromatográf

lángionizációs detektorral)

ICD-10/BNO-10 International Classification of Diseases (Betegségek

nemzetközi osztályozására szolgáló kódrendszer)

ISZKI Igazságügyi Szakértői és Kutató Intézetek

KSH Központi Statisztikai Hivatal

O/N „overnight”, azaz egy éjszakán át

PCR Polymerase Chain Reaction (polimeráz láncreakció)

PLA a dolgozatban alkalmazott primerek egyike

R reverse (primer)

rbcL ribulose-1,5-biphosphate carboxylase oxygenase gén

rRNS riboszomális RNS

RUB a dolgozatban alkalmazott, zöldalgákra specifikus primerek

egyike

SDS nátrium-dodecil-szulfát

SiO2 szilícium-dioxid

Tm olvadási hőmérséklet

TRIS Trisz[hidroximetil]-aminometán

WHO World Health Organization

6

1. BEVEZETÉS

A vízbefulladás definíció szerint (World Health Organization, 2005) részleges vagy

teljes folyadékba merülés miatti légzéskárosodás eredményeképpen kialakuló halálok

[1][2]. A WHO 2014-es adatai szerint évente világszerte 372 000 ember hal meg

vízbefulladás miatt (ld. 1. ábra). Ez a 7%-át teszi ki az összes erőszakos halálesetnek, ezzel

pedig a harmadik nem természetes módon bekövetkező erőszakos halálok a világon [1].

1. ábra

Vízbefulladási ráta a világon 100.000 főre nézve. Forrás: http://www.who.int/

1.1 A vízbefulladás okainak statisztikai vizsgálata és annak nehézségei

A vízbefulladás nem csak a természetes vizekben gazdag országok állandó,

lokálisan megjelenő problémája: a váratlanul fellépő ökológiai (esőzések, árvizek,

villámárvizek, cunami stb.) és emberi okokra (közlekedési baleset) visszavezethető

katasztrófák nagyszámú halálos áldozatot követelnek világszerte. A vízbefulladásos

halálesetek pontos számát nem csak az ilyen, sok halálesettel járó tömegszerencsétlenségek

miatt nehéz nyomon követni; a vízbefúlások gyakran az alacsony és közepes jövedelemmel

rendelkező országokban következnek be, ahol a víz az emberek mindennapi életének

szoros részét képezi (közlekedés, munka, mezőgazdaság). Ezekben az országokban mind

a statisztikai célú adatgyűjtés, mind a prevenciós programok bevezetése problémákba

7

ütközik [2][3]. Ezen kívül fontos megemlíteni, hogy kevés adatot ismerünk a nem

balesetszerűen bekövetkező vízbefulladások számáról (pl. öngyilkosság, emberölés).

Ennek egyik oka, hogy az International Classification of Diseases (ICD-10,

Magyarországon BNO-10) kódok között a vízbefulladásnak csak az a verziója adható meg

halálokként, amikor a vízbefulladás volt a tényleges halálok, és az nem valamilyen külső

következmény hatása (pl. közlekedési baleset, öngyilkosság) [1][2].

Más európai országokhoz hasonlóan, kevés tanulmány ismert, amely a hazai

vízbefulladásos esetek hátterével, okaival, a lehetséges megelőzési stratégiákkal

foglalkozik [1][4].

A Központi Statisztikai Hivatal (KSH) statisztikai adatbázisából

(http://www.ksh.hu/) való lekérdezés alapján a vízbefulladások száma Magyarországon

csökkenő tendenciát mutat: 1995-ben (n=259) több, mint kétszer annyian fulladtak vízbe,

mint ahányan 2014-ben (n=126) (ld. 2. ábra és 1. táblázat) [5]. A vízijármű-balesetek

száma Magyarországon elenyésző, ezek nagyrészt a Balaton és a Duna környékén

bekövetkező transzport-, illetve sportbalesetek következményei [5][6].

2. ábra

Vízbefulladások számának megoszlása Magyarországon 1995-2014 között.

0

50

100

150

200

250

300

350

Vízbefulladással kapcsolatos halálesetek számának évenkénti megoszlása Magyarországon (1995-2014)

Adatok forrása: Központi Statisztikai Hivatal

8

Időszak Vizijárműbalesetek

(V90-V94)

Balesetszerű

vízbefulladás vagy

elmerülés (W65-W74)

1995. év 3 259

1996. év 5 249

1997. év 5 216

1998. év 2 301

1999. év 3 259

2000. év 3 231

2001. év - 186

2002. év 1 214

2003. év - 206

2004. év - 180

2005. év 6 192

2006. év 4 213

2007. év 9 191

2008. év 6 159

2009. év 11 177

2010. év 1 203

2011. év 3 156

2012. év 4 131

2013. év 5 123

2014. év 2 126

1. táblázat

Vízbefulladások számának megoszlása 1995-2014 között. Adatok forrása: www.ksh.hu

1.2 A vízbefulladás, mint diagnózis felállításának problémái

A vízbefulladás a fulladásos halálnak egy olyan formája, amikor a légutakba és

légzőnyílásokba került folyadék elzárja a levegő útját [1][7][8]. A vízbefulladásnak nem

kritériuma, hogy az egész test vízbe merüljön, a halál olyan módon is bekövetkezhet,

amikor csak az arc (csak az orr és a szájnyílás) merül folyadékba [9][10].

A vízből előkerült holttestek vizsgálatakor az igazságügyi orvostan gyakorlatában

számos kérdés vetődik fel [11][12]. A legfontosabb annak eldöntése, hogy élő állapotban

vízbe kerülésről, tehát vízbefulladásról van-e szó, vagy a holttest utólag került a vízbe, és

a halál közvetlen oka a vízbefulladástól eltérő volt-e (vízbe merülést megelőzően

9

bekövetkezett halál más, pl. természetes okból vagy bűncselekmény leplezése)

[7][9][10][11].

Megnehezíti a holttest vizsgálatát és a halál okának megállapítását az is, hogy

esetenként az előrehaladott bomlás miatt a vízben talált holttesten lévő sérülések időbeli

elkülönítése nem könnyű vagy egyáltalán nem is lehetséges: keletkezhettek élőben,

közvetlenül a halál bekövetkezte előtt (pl. vízbeugráskor kemény tárgyakhoz ütődés során

szerzett sérülés), vagy a holttest vízben való sodródásakor (pl. vízben úszó tárgyakhoz, vízi

járművekhez ütődés, a mederben lévő kavicsok, sziklák okozta sérülések, vízi élőlények és

járművek okozta sérülések) és a holttest partra juttatása során is (pl.: csáklyázás)

[7][8][9][10].

Mivel a vízbefulladás diagnózisának felállítása kizárólag a bonclelet alapján sok

esetben nehéz, ezért a boncleleten kívül más technikával is meg kell erősíteni a

vízbefulladás tényét [7][9][13]. Az utóbbi évszázadban számos új módszer megalkotásával

próbálkoztak, ezek némelyike specifikus az adott vízközeg típusára [14][15], ezért a

legtöbbjük a gyakorlatban nem terjedt el [16]. A diatóma teszt a legrégebbi, és általánosan

a mindennapi gyakorlatban alkalmazott módszer a bonclelet megerősítésére, ám ahogyan

később látni fogjuk, számos korláttal rendelkezik [17][18][19].

1.3 A vízbefulladás igazolását célzó laboratóriumi módszerek

Már a 20. század elején bizonyították állatkísérletekkel, hogy édesvízbe fulladáskor

a diffúzióval és ozmózissal a szervezetbe nagy mennyiségben bejutó víz hemodilúciót,

sósvízbe fulladáskor a vér koncentrálódását (hemokoncentráció) és elektrolit változást

okoz a szervezetben [20][21]. A fentiekben nevesített folyamatokat kísérő elektrolit-

változásokra vonatkozó, mindennapos gyakorlatban alkalmazható metodika nincs. Ennek

oka, hogy a halál után olyan fizikai-kémiai és biológiai változások (rothadás, autolízis)

mennek végbe a szervezetben, amelyek torzíthatják az elektrolit-vizsgálatot, ezáltal

csökkentik annak standardizálhatóságát [8]. Azparren és munkatársai számos tanulmányt

jelentettek meg sósvízbe fulladás esetén a jobb és bal szívfél között regisztrálható

stroncium (Sr) koncentráció különbség gyakorlati alkalmazhatóságáról, amelyről

megállapították, hogy minden esetben nagyobb, mint 75 μg/l [14][15][22][23][24][25][26].

Ezzel a méréssel megerősíthető a vízbefulladás ténye, ezért kiegészítő módszerként jól

alkalmazható a pozitív bonclelet mellett, ám édesvízbe fulladás esetén nem alkalmazható.

10

1.4 Az algák és a vízbefulladás kapcsolata

Az algák az élővilág heterogén, polifiletikus, ubikvista csoportját alkotják. A

legrégebben leírt cianobaktériumok korát 3,3-3,5 milliárd évre becsülik [27], míg az eddig

leírt legkorábbi fonalas alga fosszília kora 1,6 milliárd év [28], így joggal nevezhetjük őket

a Föld ősi szervezeteinek. Nemcsak az őskorban, hanem a jelenben is nagy hatással vannak

világunkra: fotoszintetikus aktivitásuk révén a légköri oxigén és a szerves szén

termelésében játszanak kiemelkedő szerepet [29][30].

Általánosan kijelenthető, hogy minden természetes, és a legtöbb mesterséges

vízben előfordulnak algák – legyen szó csapvízről, talajvízről, sós- és édesvízről, álló- és

folyóvízről. Léteznek olyan fajok, melyek az álló-, míg mások a folyóvizeket preferálják

inkább, illetve néhány algafaj ritka jelzője, ún. indikátorszervezete a speciális környezeti

körülményeknek.

Már a 20. század végén felismerték, hogy ezek a vízben élő egy- és többsejtű

szervezetek méretükből és élőhely-specifitásukból adódóan alkalmasak lehetnek a

vízbefulladás igazságügyi orvostani igazolására [31]. A vízbefulladás bizonyítása során

fontos az algák poszt mortem szervekben való jelenlétének igazolása, ezért célszerű inkább

tágabb algacsoportok kimutatását megcélozni ahelyett, hogy egyes fajokra koncentrálnánk

(akár mikroszkópos, akár molekuláris biológiai módszerrel). A diatómák ellenálló

szilícium vázuk miatt megfelelő indikátorszervezetek erre a célra [32][33]. Vannak olyan

esetek azonban, amikor a vízközeg kevés diatómát tartalmaz, vagy nem tartalmaz diatómát,

ekkor célszerű más baktérium- és algacsoportok (cianobaktériumok, zöldalgák stb.)

kimutatására fókuszálni.

1.4.1 Diatómák

1703-ban Lemna írta le az első diatóma fajokat, melyeket egy békaszőlő gyökerén

figyelt meg [30].

A diatómák (másnéven kovamoszatok) unicelluláris, eukarióta mikroorganizmusok

[30]. A kovamoszatok (Bacillariophyceae) a sárgásmoszatok (Heterokontophyta)

törzsének egy osztálya, a fajok számát 30 és 100.000 közé teszik [34]. Ubikvista csoport,

azaz édes- és tengervízben is élnek, ám nem csak vízben, hanem a levegőben, növényeken

és a talajban is előfordulnak (diatómaföld) [29][30][35][36]. Színtesteket tartalmaznak és

fotoszintetizálnak, mégis, egyes fajaik a tengerek mélyén folytatnak heterotróf életmódot

[30]. Egyaránt ismertek lebegő életmódot folytató, valamint az aljzathoz, növényekhez

11

tapadó fajaik is, ez utóbbiak leginkább a folyókban fordulnak elő. Az aljzaton élő diatómák

robusztusabb, nagyobb mérettartományba eső fajok, ezek az ún. bentikus diatómák.

3. ábra

A Különböző diatómafajok Balatonból származó Lugol-oldatos vízmintában. Az ábrán látható

Cymbella fajok 15-40 µm mérettartományba esnek, míg a B ábrán látható Cyclotella fajok általában

5-40 µm közötti méretűek.

Képek készítésének helye: Balatoni Limnológiai Intézet; Olympus DP71, 1000x

B

A

12

Általánosan elmondható, hogy a folyókban a bilaterális szimmetriájú diatómák a

jellemzőek, ezzel szemben a körsugaras szimmetriájú diatómák a tavakban nagyobb

számban vannak jelen. Néhány diatóma mikroszkópos képe látható az 3.A és B ábrán.

A diatómák azonosítását és elkülönítését (nem csak más algafajoktól, hanem

egymástól is) a jól differenciát, szilícium-dioxidot tartalmazó sejtfaluk teszi lehetővé. Ez a

sejtfal több részből áll: állandó alkotója két, bonyolultan formált, egymásba illő héj,

amelyet valvának nevezünk. Ehhez a héjhoz kapcsolódhatnak kisebb-nagyobb függelékek,

struktúrák (melyek száma elérheti akár az 50-et is) [29][30][37]. A valvák meghatározzák

és szabályozzák a diatómák méretét: néhány μm-től kb. 3-500 μm-ig terjed a diatómák

mérettartománya [38], habár leírtak 600 μm átmérőjű valvákat is (kultúrában) [30].

1.4.2 A vízbefulladás tényének bizonyítása: Diatóma teszt

A vízbefulladás igazolására már a 20. század eleje óta alkalmazott módszer a

diatóma teszt. Revenstorf volt az első kutató, aki a vízbefulladás bizonyítására diatómák

kimutatását alkalmazta, 1904-ben publikálta ezzel kapcsolatos tanulmányát (ebben

megemlíti, hogy a diatómák jelenlétét vízbefulladás során a tüdőben Hofmann 1896-ban

már megfigyelte) [8][31].

A diatóma teszt azon alapul, hogy vízbefulladáskor a fuldokló tüdejébe jutó,

diatómákat és más baktériumokat, algákat tartalmazó víz a vérkeringésbe kerülve

elszállítódik a szervekhez (ld. 4. ábra). Mivel a fuldoklás általában percekig tartó folyamat

(sósvízben hosszabb ideig tart, mint édesvízben), az algáknak elég idejük van a vérárammal

eljutni a szervekig, és ezáltal kimutathatók az agyban, vesében, májban, lépben és/vagy

csontvelőben is [7][8][13][33][36][38][39][40][41][42][43].

Ha az adott személy nem élő állapotában kerül a vízbe (nem fuldoklik), úgy

keringés hiányában a fentnevezett, vízben élő szervezetek a nagyvérköri keringésbe

kapcsolt szervekhez nem jutnak el. Ebben az esetben negatív diatóma teszt eredmény

várható. Fentieket kiegészítve, a diatómák (és más algák) jelenléte a tüdőben nem bizonyító

erejű a vízbefulladás szempontjából, hiszen ezek az élőlények passzívan is bekerülhetnek

a tüdőbe, azonban a vérkeringés hiányában a célszervekig eljutni nem tudnak (kivéve

abban az esetben, ha a testüregek valamilyen ok miatt megnyílnak, pl. a holttest bomlása

vagy sérülés miatt, ilyenkor a vízi organizmusok jelenléte nem bizonyítja a vízbefulladást)

[8][13][39][43][44]. A tudomány jelenlegi állása szerint ép kültakaró esetén sem a

diatómák, sem a méretben baktériumokhoz hasonló cianobaktériumok és más pikoalgák

13

nem jutnak el passzívan a célszervekhez (pl. agy, lép, máj, vese, csontvelő), amennyiben

az vízben ázik [44].

4. ábra

A diatóma teszt szerepe a vízbefulladás orvosszakértői igazolására.

A diatóma teszt során a savas vagy enzimatikus módszerrel elemésztik a szövet

minél nagyobb részét, ezáltal csak a kovamoszatok szilícium-dioxid (SiO2) vázai maradnak

vissza, melyek fénymikroszkóppal detektálhatók és akár fajszintű azonosításra is

alkalmasak [11][29][30][38][39][45][46][47]. Amennyiben ismert az adott földrajzi hely –

egyéb környezeti tényezőket is figyelembe vett – kovamoszat populációja, nem csak a

vízközeg, hanem a vízbefulladás pontos helyszíne is meghatározható, illetve megadhatjuk,

hogy a feltalálási hely és a vízbefulladás helye milyen viszonyban van egymással

[8][13][19][32][40][45][48].

élő állapotban vízbe kerülés

az algák (a vízzel együtt) bejutnak a tüdőbe

az algák az alveoláris membránon át a véráramba kerülnek

a vérkeringés segítségével eljutnak a szervekig

a szervek savas/enzimatikus emésztése utáni mikroszkópos vizsgálat (diatóma teszt)

holttest kerül a vízbe

a szövetekben nem figyelhetők meg

diatóma vázak (kivéve: tüdő és

emésztőrendszer)

a szövetekben diatóma vázak

detektálhatóak

14

Amennyiben a vizsgálat pozitív eredménnyel jár, azaz a vízben és meghatározott

poszt mortem szövetekben is kovavázakat lehet látni, az elhunyt nagy valószínűséggel

vízbefulladt. Minél több diatómát tartalmazott a holttest feltalálásának helyszínét képező

víz, illetve minél hosszabb ideig húzódott el a fuldoklás, annál nagyobb a valószínűsége az

algák bekerülésének a szervezetbe [7][8]. Az 5.A és B ábrán tüdőszövetben látható diatóma

vázakat mutatunk be proteinase K enzimmel történt emésztés után.

5. A ábra

Cymatopleura sp. váza vízbefulladt

személy tüdőmintájában. A képen

látható faj – amely feltehetően

Cymatopleura elliptica –

mérettartománya 50-220 µm. Natív

fénymikroszkópos metszet.

Készítés helye: PTE ÁOK, Igazságügyi

Orvostani Intézet

B ábra

Diatóma vázak (↑) vízbefulladás

miatt elhunyt személy tüdőszövet

mintájában. Az ábrán látható

Pinnularia sp. mérettartománya: 20-

120 µm. Natív fénymikroszkópos

metszet.

Készítés helye: PTE ÁOK, Igazságügyi

Orvostani Intézet

A

B

15

A diatómákat és más algafajokat nem csak mikroszkópos, hanem PCR alapú

módszerekkel is ki lehet mutatni, ezekről később esik szó. A diagnosztikus lehetőségeket

a 6. ábrán mutatjuk be.

6. ábra

Vízben talált holttest esetén alkalmazandó diagnosztikus döntési lehetőségek laboratóriumi

vizsgálathoz. Amennyiben a diatóma teszt negatív, érdemes megfontolni a PCR alapú vizsgálat

lehetőségét.

A diatóma teszt alkalmazhatóságáról és értékelhetőségéről az igazságügyi orvostani

gyakorlatban a kutatóknak eltérő a véleménye. Egyes szakértők már a ’60-es évek végén

megkérdőjelezték a teszt hatékonyságát és alkalmazhatóságát a vízbefulladás tényének

megerősítésére [43][49][50]. Irodalmi adatok alapján valóban előfordulhatnak olyan

kivételes esetek, amikor a diatóma teszt álnegatív vagy álpozitív eredményt adhat

[12][38][49][50][51][52][53][54][55].

diatóma teszt PCR

pozitív negatív

vízbefulladás

vagy

álpozitivitás?

más halálok,

vagy

álnegativitás?

negatív pozitív

vízbefulladás

más algafajok keresése a vízmintában

új primer tervezése, majd új PCR

16

Álnegatív esetek előfordulhatnak, ha (1) a vízbefulladás közege kevés diatómát

tartalmazott, (2) a fuldoklás rövid ideig tartott, és a diatómáknak nem volt ideje a keringés

segítségével elszállítódni a szervekig, (3) a szövetekben lévő kevés diatóma váz az

emésztés következtében elveszett [8][55].

Az irodalomban számos eshetőséget leírtak az álpozitivitás lehetőségére is. Mivel

kovamoszatok előfordulnak a levegőben és a talajban is, utólag nehéz kizárni, hogy a

diatómák jelenléte a szövetekben nem inhaláció eredménye-e [12][38][56][57]. Langer és

munkatársai 1971-ben felvetették, hogy dohányzás közben a dohánylevelek felületén élő

kovamoszatok belégzése is lehetséges [58]. Peabody 1977-ben publikált tanulmányában

leírja, hogy nem csak a gyufák fejében láthatóak diatóma vázak (amelyek az égés után is

épek maradnak), hanem egyes festékek és lakkok is tartalmazzák őket, ez pedig felveti a

kontamináció lehetőségét [38]. Otto 1961-ben 28 szilikózisos beteg tüdejét vizsgálta meg,

és 23 esetben írta le diatómák jelenlétét a mintákban [18], ezekben a kutatásokban azonban

nem vizsgálták a vér vagy a további szervek esetleges pozitivitását. A szilícium tartalmú

kozmetikumok és táplálékkiegészítők kovaföldet tartalmaznak porított formában, amely

bejutva a szervezetbe szintén torzíthatja vizsgálataink eredményességét [38].

1.4.3 Cianobaktériumok

A cianobaktériumok a diatómáktól eltérően prokarióták. Kékeszöld algákként is

hivatkoznak rájuk, ám egyes megfontolások szerint csak az eukarióta algák nevezhetőek

algának, ezért a cianobaktérium elnevezést pontosabbnak tartják [29]. A diatómákhoz

hasonlóan fotoszintetizáló életmódot folytatnak, és nem csak a vízben, hanem a nedves

talajban is előfordulnak. Ismertek unicelluláris és fonalas megjelenésű fajaik is [29].

Az unicelluláris cianobaktérium fajokról elmondható, hogy azok a diatómák

mérettartományának alsó határán helyezkednek el. A legkisebb unicelluláris

cianobaktériumok átmérője 0,2-1 µm közötti (pl. Prochlorococcusok), ezeket méretük

miatt pikocianobaktériumoknak nevezzük. A széleskörűen elterjedt Synechococcus

nemzetség tagjai a legkisebb pikocianobaktériumok, méretük kisebb, mint egy emberi

vörösvértest: coccoid sejtjeik átlagosan 1 µm átmérőjűek [29][59][60].

Nem csak édes- és sósvízi fajaikat ismerjük, a magyarországi álló-és folyóvizekben

nagy számban fordulnak elő minden évszakban, illetve a talajból kimosódva

megjelenhetnek az esővízben is (pl. árokban nagy esőzések után ideiglenesen felgyűlt víz),

17

ezért megfelelő indikátorszervezetek lehetnek a vízbefulladás laboratóriumi igazolásához

[29][34].

Mivel a cianobaktériumok nem rendelkeznek a diatómák SiO2 vázához hasonló, a

baktériumoktól való elkülönítésüket segítő, illetve a faji szintű meghatározást lehetővé tévő

mikroszkopikus jegyekkel, kimutatásukra más módszerek terjedtek el az algológusok

körében. A 7. ábrán néhány pikocianobaktérium látható, amelyeket

autofluoreszcenciájuknak köszönhetően könnyen azonosíthatunk friss vízmintában

kékesibolya gerjesztőfénnyel. Ezek a pikocianobaktérium fajok csupán fénymikroszkóppal

vizsgálva nem különíthetőek el a vizekben megtalálható más baktériumcsoportoktól. Jelen

dolgozat tárgyát ebből a csoportból a Synechococcus nemzetség képezi, amely kis mérete

és évszaktól független, széleskörű magyarországi elterjedése miatt a molekuláris szintű

vizsgálatok kidolgozásához kiváló szervezetnek bizonyult.

7. ábra

Cianobaktériumok (↑) azonosítása balatoni vízmintában fluoreszcens mikroszkóppal. A képen

látható fajok átmérője a néhány mikrométeres tartományba esik.

Képek készítésének helye: Balatoni Limnológiai Intézet; Olympus BX51, 1000x nagyítás

18

2. CÉLKITŰZÉSEK

A vízbefulladás tényének igazolására jelenleg is alkalmazott módszer a diatóma

teszt, amelyet már a 19. században is alkalmaztak a törvényszéki orvosi gyakorlatban [31],

a PCR (polimeráz láncreakció) 20. század végi felfedezésével azonban új távlatok nyíltak

meg az igazságügyi orvostani módszerek kiterjesztésében. Kutatásom céljai a következők

voltak:

1. a dél-dunántúli régióban történt vízbefulladások körülményeinek és

helyszíneinek felmérése, a rizikófaktorok vizsgálata;

2. a dél-dunántúli régió vizeiben élő legjellemzőbb algacsoportok meghatározása,

és az ezeknek az algacsoportoknak megfelelő PCR primerek alkalmazása a

vízbefulladás bizonyítására;

3. a korábbi, törvényszéki gyakorlatban alkalmazott mikroszkópos módszer

(diatóma teszt) érzékenységének és specifikusságának növelése, és a módszer

diatómáktól eltérő algafajokra és cianobaktériumokra való kiterjesztése; valamint

4. egy olyan, a mindennapi igazságügyi orvostani gyakorlatba egyszerűen

átültethető, DNS alapú módszer kifejlesztése, amely széleskörűen alkalmazható

természetes és mesterséges vizekben történő vízbefulladás esetén a vízbefulladás

megerősítésére.

19

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT MÓDSZERTANA

3.1 A vízbefulladások számának felmérése

2008. január 1. és 2012. december 31. között, a dél-dunántúli régió (Baranya-,

Tolna- és Somogy-megye) természetes és mesterséges vizeiben elhunyt személyek

retrospektív vizsgálata történt. Összesen 114 esetet vizsgáltam meg az alábbi osztályozási

szempontok figyelembevételével: nem, életkor, alkohol- és drogfogyasztás, vízbefulladás

helyszíne (a vízközeg típusa), illetve más körülmények, amelyek hozzájárulhattak a vízbe

kerüléshez (a vízbe kerülés oka).

A vizsgálat az összes olyan vízbefúlásos esetet tartalmazta, amikor az elhunyt

boncolása intézetünkben, vagy az Igazságügyi Szakértői és Kutató Intézet szekszárdi és

kaposvári kirendeltségén keresztül, azaz, Baranya-, Somogy- vagy Tolna-megyében

történt. A vízbefulladás, mint halálok, előzményi és nyomozati adatok, a boncolási

jegyzőkönyv, és a boncolást kiegészítő mikroszkópos vizsgálatok (szövettan, diatóma

teszt) alapján lett megadva. A boncolás során a természetes halálokokat kizárták. A

leggyakoribb boncleletek a következők voltak: a savós hártyák pontszerű vérzései; puffadt,

száraz tüdők; Paltauf foltok; testszerte híg, folyékony, szederjes vér; jobb szívfél tágulat és

belső szervek pangásos bővérűsége [6][7][8]. A szövettani vizsgálatok a makroszkópos

megfigyeléseket mindenben megerősítették (pl.: emphysema aquosum).

3.2 Toxikológiai analízis

A toxikológiai analízishez szükséges vérmintát a boncolások során a csípő

visszerekből nyertük minden esetben.

A véralkohol vizsgálatot gőztér mintaadagolóval ellátott gázkromatográffal

(Agilent Technologies 7890A), a detektálást lángionizációs detektorral (HS-GC-FID)

végeztük el. Kábítószer meghatározásra diódasoros detektorral ellátott nagyteljesítményű

folyadékkromatográfot (HPLC-DAD), illetve tömegspektrométerrel (Waters Mass

Detector 3100) kapcsolt szuperkritikus fluid kromatográfot (Waters UPC2) alkalmaztunk

[61][62].

20

3.3 Statisztikai analízis

A statisztikai analízist a GraphPad Prism programmal végeztük el (Windows) és a

leíró módszereken kívül a Pearson-féle Chi-négyzet próbával elemeztük az adatokat. A

0,05 alatti p értéket tekintettük statisztikailag szignifikáns eltérésnek.

21

II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS

MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKA MÓDSZERTANA

3.4 Mintakezelés

A vízmintákból (minimum) 10-50 ml közötti mennyiséget dolgoztam fel esetenként

a beérkezett mintamennyiségtől és a vízminta típusától függően. A kísérletek során

felhasznált vízminták az ország számos részéről, illetve külföldről is származtak. A

feldolgozott vízbefúlásos esetekhez a hatóság által biztosított vízmintákat alkalmaztam.

Negatív kontrollként a boncolás helyszínéről (krematórium, boncterem) a saját steril, 50

ml-es centrifugacsöveinkben biztosított vizet alkalmaztam.

A kísérletek során a protokollok kidolgozására alkalmazott algatenyészetek a

Magyar Tudományos Akadémia Balatoni Limnológiai Kutatóintézete által biztosított

algatörzsek voltak: (1) bentikus algák a Balatonból, (2) Synechococcus sp. alga a

cianobaktérium alapú PCR vizsgálat kidolgozásához, (3) Choricystis sp. zöld pikoalga a

zöldalgákra specifikus primerek alkalmazásakor, (4) Nitzschia sp. a diatóma alapú

vizsgálatokhoz (bővebben ld. 3.7.4 PCR kontrollok fejezet).

A boncolás során nyert szervminták magyarországi igazságügyi orvostani és

szakértői intézetekből származtak, esetenként (minimum) 1-15 g tömegű mintát dolgoztam

fel ezekből. A boncolás közbeni mintavétel során az esetleges technikai szennyeződéseket

az orvosszakmai ajánlásnak megfelelően (pl. csapvízzel való érintkezés) minden lehetséges

módon próbáltuk elkerülni: a kültakaró megnyitása után új, steril eszközzel lettek a szervek

eltávolítva, valamint egyszer használatos, steril gyűjtőedényeket alkalmaztunk a minták

tárolására. A vízbefulladások során alkalmazandó steril mintavételi eljárás lépéseit

Hürlimann publikálta [63].

3.5 A vízbefulladás bizonyítására alkalmazott módszer, a diatóma teszt

A diatóma teszt célja kovavázak fénymikroszkóppal történő kimutatása a

vízbefulladás helyszínét képező víz- és poszt mortem szövetmintában. A kovavázak

jelenléte a mintában utalhat a vízbefulladásos halálokra.

A tesztek elvégzésekor a megfelelő pozitív és negatív kontrollok mellett a

hatóságok által biztosított, a holttest feltalálásának helyéről származó vízből (min. 10 ml)

és a szervmintákból (1-15 g) indultunk ki, majd az emésztési eljárás után az algák

22

vizsgálata a vízmintában és a szövetmintában mikroszkóppal történt. A minta

vizsgálatához a megfelelő mikroszkópos technikát a szerint választottam ki, hogy milyen

algacsoportokat szeretnék vizsgálni, kimutatni, illetve, hogy az adott minta feltehetően

algában gazdag, vagy szegényes környezet-e.

3.5.1 Diatóma teszt I.: Savas emésztés

A diatóma tesztnek számos változata terjedt el aszerint, hogy milyen vegyszerekkel

emésztik a szövetet. Intézetünkben a mindennapi gyakorlatban a diatóma teszt elvégzése

kombinált savas emésztéssel történik (H2SO4, HNO3 és H2O2 felhasználásával) [32].

A vizsgálat során a poszt mortem szövetet (leggyakrabban csontvelő) egy éjszakán

át H2SO4-oldatban emésztik. A kénsavas emésztést követően kis részletekben HNO3-at

adagolnak az elegyhez halvány sárga szín eléréséig, majd H2O2–oldatot csepegtetnek

hozzá, amíg az oldal áttetszővé nem válik. A felülúszó eltávolítása után a kovavázakat

fénymikroszkóppal analizálják.

3.5.2 Diatóma teszt II.: Enzimatikus emésztés

Az enzimatikus emésztés formalin fixált és natív, fixálatlan mintán is elvégezhető.

Ehhez az 1-15 g szövetmintát először steril algamentes vízzel mostuk. Annyi proteinase K

enzim lízis puffert adtunk a mintához, hogy az bőven ellepje (kb. 5 ml), valamint 250 μl

proteinase K enzimet (Thermo Scientific, >600 U/ml (~20 mg/ml)). Az így kapott oldatot

56°C-on inkubáltuk O/N, óvatosan rázatva a mintát, segítve, hogy az enzim hozzáférjen a

szövethez minden irányból. Másnap megismételtük a mosó lépést, majd ismét proteinase

K enzimet adtunk az elegyhez (20-200 μl, a minta zavarosságától függően). Szükség szerint

ismét O/N rázattuk. Ha a minta áttetszővé vált, lecentrifugáltuk, ezután a pellet

mikroszkópban vizsgálható [45][46].

3.5.3 Diatómák vizsgálata fordított plankton mikroszkóppal

A néhány gramm (1-15 g) szövetet 1-2 mm-es darabokra vágtuk és erőteljesen

összeráztuk néhány másodpercig steril, 15 ml-es centrifugacsőben. Centrifugálás után

(4500 rpm, 15 perc) határozott mozdulattal leöntöttük a felülúszót és desztillált vízben

vettük fel a pelletet. A pelletből 3 ml-t kivettünk és 20 μl Lugol-oldatot adtunk hozzá.

Ülepítő tartályba mértük az elegyet, levegőmentesen lezártuk, majd O/N ülepítettük (ld.

23

8.A ábra), ezután fordított plankton mikroszkópban vizsgáltuk a jellegzetes vázzal

rendelkező diatómákat és a zöldalgákat (ld. 8.B ábra).

8. ábra

A Különböző térfogatú ülepítőtartályok, Lugol-oldatos víz- és poszt mortem szövetmintával. B A

vizsgálatok során használt Zeiss fordított plankton mikroszkóp (a Balatoni Limnológiai Intézet

tulajdona).

3.6 Pikocianobaktériumok és pikoeukarióta algák azonosítása és elkülönítése

vízmintában fluoreszcens mikroszkóppal

A friss, homogenizált vízmintákat 0,2 µm pórusméretű, fehér polikarbonát

membránszűrőre (Millipore) szűrtük, majd a szűrőt glicerinbe ágyaztuk. A preparátumot

Olympus BX51 epifluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk (1000x nagyítás) (ld. 9. ábra).

Először a különböző pigment típusú pikoalgákat azonosítottuk kékesibolya (U-

MWBV2) és zöld (U-MWG2) gerjesztőfény segítségével. A felvételeket a látható fényt

érzékelő digitális mikroszkóp kamerával (Olympus DP71) készítettük MacIsaac és

Stockner (1993) leírása szerint [64][65][66]. A kékesibolya fénnyel való megvilágítás

hatására a pikocianobaktériumok és pikoeukarióta zöldalgák válnak láthatóvá. A zöld fény

a cianobaktériumok és az eukarióták elkülönítésére szolgál, ugyanis a

pikocianobaktériumok fluoreszcenciája (fikobiliprotein-tartalmuk miatt) zöld fénnyel

világítva erősebb lesz, míg az eukariótáké kevésbé erőteljes (a klorofill a és b vörös és kék

fénnyel gerjesztődik jól, ám zölddel nem gerjesztődik).

A B

24

9. ábra

A vizsgálatok során Olympus BX51 epifluoreszcens mikroszkópot használtunk a Balatoni

Limnológiai Intézetben. A mikroszkópos preparátumok és a fotók egy részét a Balatoni

Limnológiai Kutatóintézetben készítettük.

3.7 DNS izolálás és PCR

3.7.1 Fitoplankton DNS izolálás vízből, algatenyészetből és poszt mortem szövetből

A több lépésben ülepített, majd kb. 10 ml végtérfogatú vízminta centrifugálása után

a pellethez 10% Chelex 100 oldatot adtam [67].

Az 1-15 g tömegű humán poszt mortem szervminták esetében a kb. 2 mm3

darabokra felvágott szöveteket steril, mikroalga-mentes víz hozzáadásával, Potter-

Elvehjem homogenizátor segítségével homogenizáltam. Ezután lecentrifugáltam a

szövetszuszpenziót, és a pellethez adtam a 10% Chelex 100 oldatot.

Az algák sejtfalát mechanikai módszerrel tártam fel gyors felolvasztás-lefagyasztás

lépéseket (-80°C és 56°C) ismételve négy cikluson át. Az utolsó felolvasztáskor a mintát

25

20 percig inkubáltam 56°C-on, majd 8 percre forrásban lévő vízbe helyeztem.

Centrifugálás után a felülúszó tartalmazta a DNS-t.

3.7.2 Diatóma DNS izolálás vízből, algatenyészetből és poszt mortem szövetből

A több lépésben ülepített, majd kb. 10 ml végtérfogatú vízmintát 60 percen át

vízfürdőben melegítettem. A Potter-Elvehjem homogenizátor segítségével homogenizált,

1-15 g-os szövetdarabokat mikroalga-mentes vízzel egészítettem ki ugyanilyen térfogatra.

Az üledékhez 300 μl, ún. diatóma lízis puffert adtam, amelynek az összetétele a

következő: 10 mM Tris-HCl, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav dinátrium só (disodium-

EDTA), 200 mM NaCl, 0,2 % nátrium-dodecil szulfát (SDS). A mintában lévő algák

sejtfalának feltárása mechanikai módon történt: négy cikluson át gyors fagyasztás-

felolvasztás (-80°C és 56°C) lépéseket alkalmaztam. Az utolsó felolvasztási lépés után

proteinase K enzimet (20 mg/ml) adtam a mintához és néhány órán át 56°C-on, gyengéden

rázatva inkubáltam az elegyet. Amikor nagyrészt vagy teljesen áttetszővé vált az üledék

(vízminták esetében ez átlagosan 1-3 órán belül, szervminták esetén egész éjszakán át tartó

rázatás után következett be), a mintákat centrifugáltam és a DNS-t tartalmazó felülúszót

alkalmaztam templátként a PCR során.

3.7.3 PCR

A vízből és a szövetekből a különböző izolálási folyamatok végén nyert DNS-t

DNS tisztító kit alkalmazásával az esetleges szennyezésektől megtisztítottam (GeneJET

Genomic DNA Purification Kit, Thermo Scientific), szükség esetén tisztító és koncentráló

kitet alkalmaztam (DNA Clean & Concentrator™-5, Zymo Research), majd az így kapott

elegyet használtam templátként a PCR során, 20 μl végtérfogatban.

A megfelelő Taq polimeráz enzim megtalálása a kísérletek során sarkalatos pont

volt, ugyanis számos enzimmel kísérleteztem, amíg megtaláltam azt, amely a vizsgálatok

során a legnagyobb valószínűséggel amplifikálta fel a keresett DNS szakaszt. Végül a

Thermo Scientific™ által gyártott DNA DreamTaq™ Polymerase enzim bizonyult a

legmegfelelőbbnek. A gyártó ajánlása szerint ez az enzim nagy szenzitivitása miatt erősen

szennyezett mintában is fel tudja amplifikálni a kívánt DNS szakaszt. Az enzim számára a

gyártó saját, optimalizált DreamTaq™ puffere biztosítja az optimális

reakciókörülményeket. Esetünkben külön előny volt, hogy az enzim robosztus PCR

terméket eredményez abban az esetben is, ha a körülmények nem tökéletesen

26

optimalizáltak, hiszen a kísérletek során a specifikusság kiszélesítésének érdekében egyes

esetekben reakciónként a szokásos egy helyett két reverse primert is alkalmaztam (ld. 2.

táblázat, cianobaktériumokra specifikus CBR primerek).

A reakcióelegy összetétele:

DNS-t tartalmazó oldat 1 μl

oligonukleotidok (500 nM) 2 μl

dNTP mix (10 mM) 1 μl

Taq polimeráz enzim (5 U/µl) 0,2 μl

10x puffer (+ MgCl2) 2 μl

nukleáz mentes víz 13,8 μl

ÖSSZESEN: 20 μl

Az kísérletek során alkalmazott oligonukleotid szekvenciákat és adataikat a 2.

táblázat mutatja [68][69][70][71][72][73]. A CBR kódokkal ellátott primerek

cianobaktériumokra, a DIA kódokkal ellátott primerek diatómákra, míg a PLA és RUB

jelzésű oligonukleotidok az előbb felsorolt organizmusoktól eltérő plankton szervezetekre

specifikusak (pl. zöldalgák).

27

2. táblázat

A kísérletek során alkalmazott oligonukleotidok és specifitásuk. F= forward (előre); R= reverse (vissza) oligonukleotid

Oligonukleotid Szekvencia 5’→3’ Tm Specifitás

Algacsoport Gén

CBR F

CBR R1

CBR R2

CGGACGGGTGAGTAACGCGTGA

GACTACTGGGGTATCTAATCCCATT

GACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT

66,9°C

59,2°C

59,2°C

Cyanobacteria 16S rRNS

CBR2 F

CBR2 R

ATGAGCAAGAAGTACGACGC

GGTCTCCTGCTCGGACAG

58,3°C

59,1°C Cyanobacteria / Synechococcus sp. rbcL

CBR3 F

CBR3 R

GGTCCACTGTGTGGTCCGAGG GTTCTCGTCGTCCTTGGTGAAGTC

64,7°C

63,4°C Cyanobacteria / Synechococcus sp. rbcL

DIA F

DIA R

GACTCAACACGGGAAAACTTACC

CACCAACTAAGAACGGCCATGC

59,8°C

62,3°C Heterokontophyta 18S rRNS

DIA2 F

DIA2 R

AGATTGCCCAGGCCTCTCG

CCATCGTAGTCTTAACCATAAAC

61,7°C

54,9°C Heterokontophyta / Bacillariophyceae 18S rRNS

PLA F

PLA R

ATGTGGCGCCAAGGAATGTTTGT

ACCCAATGCCAAATAGCAGC

60,0°C

59,1°C Eukaryota/Euglena sp.

chloroplast

genom

RUB F

RUB R

CCACAAACTGAAACTAAAGCA

CATGTGCCATACGTGAATACC

54,9°C

57,1°C Chlorophyta rbcL

28

3.7.4 PCR kontrollok

Vizsgálatom során kiemelten fontos volt a megfelelő kontrollok kiválasztása. Az

eljárás érzékenységéből adódóan a DNS templát mentes kontroll alkalmazása

elengedhetetlen a PCR alapú módszerek esetében.

A vízbefúlás bizonyításának céljából kísérleteink során az alábbi kontrollok

alkalmazását találtam szükségesnek:

1. DNS templát mentes kontroll („no template” kontroll) a PCR-elegy összeállítása

során esetlegesen bekövetkező kontamináció kizárására: ebben az esetben az 1 μl

DNS templát helyett a minta a DNS templátnak megfelelő térfogatú algamentes

desztillált vizet tartalmazott;

2. csapvízminta-kontroll a boncolás helyszínéről, amelyet a boncolás során a tetem

lemosására alkalmaztak (boncterem, krematórium);

3. poszt mortem szövet nem vízbefulladás miatt elhunyt tetemekből (8 esetben,

amikor a halál oka önakasztás volt);

4. pozitív algatörzs kontrollok: Synechococcus sp., Chorycistis sp., Nitzschia sp.

tisztatenyészete, illetve balatoni bentikus algafajok (az algatenyészetek forrása:

Magyar Tudományos Akadémia Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, Tihany).

29

4. EREDMÉNYEK

I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEI

A WHO évenként vizsgálja a vízbefúlásos halálesetekkel összefüggésbe hozható

rizikófaktorokat [1]. Az általuk kiemelt és jelentősnek tartott rizikófaktorok érvényességét

vizsgáltam meg Magyarország dél-dunántúli régiójában azon célból, hogy meghatározzam

a leginkább veszélyeztetett csoportokat és a leggyakoribb vízbefúlási helyszíneket, illetve

a vízbe kerüléshez vezető okokat.

4.1 A vízbefulladások számának felmérése Magyarország dél-dunántúli régiójában

Összesen 114 vízbefulladás miatt elhunyt személy retrospektív vizsgálata történt a

2008-2012-ben elhunytak körében. A Pearson-féle Chi-négyzet próba elvégzése nem adott

szignifikáns különbséget az egyes években ismertté vált vízbefulladások számát illetően

(p=0,1259), tehát az a vizsgált időszak alatt állandónak tekinthető (kivéve 2008-ban,

amikor feleannyi vízbefulladás miatt elhunyt személyt boncoltak az általam vizsgált

intézetekben, ennek oka nem ismert; ld. 10. ábra).

10. ábra

A vízbefulladások számának évenkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (2008-2012).

30

A 114 esetből négy elhunyt személyazonosságát nem tudták megállapítani, azonban

a boncolás alapján be lehetett sorolni őket a legtöbb vizsgált csoportba (pl. nem, életkor).

Azonban két egyén esetén a halál időpontját nem volt lehetséges évre pontosan megadni,

ők „ismeretlenként” vannak feltüntetve a 10. ábrán (részletesen ld. Függelék F/1.

táblázata).

4.1.1 Rizikófaktor: Életkor

A 2008 és 2012 között vízbefulladás miatt elhunytak életkorának nemenkénti

megoszlását vizsgáltam azon célból, hogy megismerjem, mely korcsoport a leginkább

veszélyeztetett a vízbefulladás tekintetében ebben a régióban. Az eredményeket a 11. A, B

és C ábra, valamint a Függelék F/2. táblázata mutatja be.

Úgy találtam, hogy a legmagasabb rizikófaktorú csoport az életkort tekintve az 51

és 60 év közöttiek korcsoportja (31 a vizsgált 114 esetből; 27,19%), sőt, mind a férfiakat,

mind a nőket tekintve az 51 és 70 év közöttiek fulladtak vízbe leggyakrabban (ld. 11.C

ábra). Ez a korcsoport az összes vízbefulladásos haláleset közel felét (44,73%) tette ki a

vizsgált ötéves periódusban.

AWHO szerint az 14 év alatti gyermekek között a legmagasabb a vízbefulladási

ráta Afrikában, Ázsiában és Amerikában, ám Magyarország vizsgált környékén meglepően

alacsony volt az ebbe a korcsoportba tartozó elhunytak száma [1][2][74]. A vizsgálatban

szereplő elhunytak közül a legfiatalabb egy 5 éves fiú volt, akit egyik szülője látott

elsüllyedni a Balatonban. A legidősebb áldozat egy 88 éves nő volt, akit a saját telkén

található kútban találtak meg.

A WHO jelentése szerint Kanadában és Új-Zélandon a felnőtt férfiak a

vízbefulladás szempontjából a legveszélyeztetettebbek [1][75][76]. Vizsgálatom alapján

Magyarországon az 50 év feletti férfiak nagyobb gyakorisággal fulladnak vízbe, mint az

50 év alatti középkorúak és az ennél fiatalabbak. Nem találtam adatot arról, hogy más

országokban a dél-dunántúli vízbefulladásos esetekhez hasonlóan magas lett volna az

idősebbek körében a vízbefulladások száma.

31

A

B

32

11. ábra

A vízbefulladásos esetek nemenkénti és korcsoportonkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (2008-

2012). A Férfiak; B Nők; C mindkét nem megoszlása.

4.1.2 Rizikófaktor: Véralkoholszint

Kevés tanulmány vizsgálja az alkoholfogyasztás és a vízbefulladás kapcsolatát, ám

a WHO szerint szoros összefüggés lehet közöttük [77]. Azért, hogy megvizsgáljam az

alkoholfogyasztás és a vízbefulladás kapcsolatát, a 2008-2012 közti időszakban

bekövetkezett halálesetek áldozatainak véralkoholszintjét és a korcsoportok közti

megoszlását hasonlítottam össze.

68 (n=81 fő (83,95%)) férfi és 29 nő (n=33 (87,89%)) véralkoholszintje volt

mérhető (összesen 97 a 114 vizsgált esetből), közülük 58 férfi (a mérhető véralkoholszinttel

rendelkező férfiak 85,29%-a) és 15 nő (a mérhető véralkoholszinttel rendelkező nők

51,72%-a) fogyasztott alkoholt. Összesen az esetek közel kétharmadában (n=73; 64,04%)

volt a véralkoholszint 0,21‰ felett. 17 esetben nem lehetett megmérni a véralkoholszintet

az előrehaladott bomlás vagy a vér hiánya miatt.

A mérhető véralkoholszintek értékeinek nemek közti megoszlását a 12. ábrán

ábrázoltam. Az ábrán jól látszik, hogy azokban az esetekben, ahol a véralkoholszintet

C

33

mérni lehetett, háromszor annyi elhunyt véralkoholszintje lett pozitív, mint amennyié

negatív. A 0,21‰ alatti véralkoholszintet tekintettem negatívnak (n=24; 21,05%), ez alatt

az érték alatt az alkoholfogyasztás nem bizonyítható (az alkoholos befolyásoltság

megállapítása során figyelembe vett határértékek leírása a Függelék F/3. táblázatában

láthatók).

12. ábra

A véralkoholszint és a nemek közti összefüggés. A mérhető véralkoholszintek száma n=97 volt. A

negatív (n=24, 0-0,20‰ közötti BAC értéket tekintettem negatívnak) és a pozitív (n=73)

véralkoholszintű elhunytak száma szignifikáns eltérést mutatott (p<0,05). Az áttekinthetőség miatt

az ábrán az 1,50‰ BAC alatti és feletti értékeket különítettem el, amely az enyhe és a közepes fokú

alkoholos befolyásoltság határértéke.

A férfiak véralkoholszintje átlagosan magasabb volt, mint az alkoholt fogyasztó

nőké. Nyolc férfi elhunyt véralkoholszintje az igen súlyos fokú alkoholos befolyásoltság

tartományába esett, azaz közel toxikus mennyiségben volt jelen az alkohol a

149

6

10

2830

negatív pozitív, BAC < 1,50 pozitív, BAC ≥ 1,50

ese

tek

szám

a

véralkoholszint

férfiak

nők

- 34 -

3. táblázat

Vízbefulladás miatt elhunyt személyek véralkoholszint-értékeinek megoszlása korcsoportok szerint (Dél-Dunántúl, 2008-2012).

1 A nem meghatározható véralkoholszint oka: előrehaladott bomlás vagy nem elegendő folyékony vér.

2 0-0,20% közötti BAC érték negatívnak tekinthető.

Nők Férfiak Min

dk

ettő

összesen

BAC

Életkor

nem

meghatá

rozható1

0-

0,202

0,21-

0,50

0,51-

0,80

0,81-

1,50

1,51-

2,50

2,51-

3,50 3,50< Össz.

nem

meghatá

rozható1

0-

0,202

0,21-

0,50

0,51-

0,80

0,81-

1,50

1,51-

2,50

2,51-

3,50 3,50< Össz.

0-10 - - - - - - - - 0 - 1 - - - - - - 1 1

11-20 - 1 - - - - - - 1 1 4 4 2 - 1 - - 12 13

21-30 - - - - - - - - 0 - 1 3 2 1 - - - 7 7

31-40 2 - 1 - - - - - 3 1 1 2 - 1 1 3 1 10 13

41-50 1 2 - - - - 1 - 4 - - - - - 2 2 4 8 12

51-60 1 3 2 1 1 2 - - 10 5 2 2 1 1 1 6 3 21 31

61-70 - 4 1 - - 2 - - 7 3 - 3 1 1 3 2 - 13 20

71-80 - 2 2 - - 1 - - 5 1 - 3 1 - 1 - - 6 11

81-90 - 2 1 - - - - - 3 - 1 - - - - - - 1 4

ismeretlen - - - - - - - - 0 2 - - - - - - - 2 2

Összesen 4 14 7 1 1 5 1 0 33 13 10 17 7 4 9 13 8 81 114

35

szervezetükben (3,51‰ feletti véralkoholszint). A halál oka ezekben az esetekben is

vízbefulladás volt. Férfiak esetében minden életkorban egyenlő mértékben volt jellemző

az alkoholfogyasztás, a nők kevesebb alkohol fogyasztottak, és az is inkább az idősebb

korosztályra volt jellemző (ld. 3. táblázat). Az elhunytak pozitív (n=73) és a negatív (n=24)

véralkoholszint eredményeinek száma között szignifikáns különbség mutatkozott (ld. 12.

ábra).

4.1.3 Rizikófaktor: Kábítószer- és gyógyszerfogyasztás

Az alkoholfogyasztás mellett a kábítószer- és gyógyszerfogyasztás is

befolyásolhatja az áldozatok veszély-felismerési és önmentési képességét, ezért

megvizsgáltam, hogy a dél-dunántúli régióban elhunytak esetében van-e kapcsolat a

kábítószer- és gyógyszerfogyasztás és a vízbefulladás között, valamint, hogy milyen

gyógyszereket fogyasztottak az elhunytak.

74 esetben találtam adatot a kábítószer- és gyógyszerfogyasztásról. 11 esetben

(14,86%) azonosítottak valamilyen gyógyszerhatóanyagot a vérben, 5 esetben nőknél, míg

6 esetben férfiaknál. A leggyakrabban benzodiazepin csoportba tartozó szerek jelenlétét

írták le a vérben (5 eset), ezt követte a citalopram (2 eset), további egy-egy esetben

carbamazepine, noraminophenazon, ibuprofen és venlafaxine került leírásra. Ezeket a

gyógyszerhatóanyagokat 54 és 75 év közötti elhunytak véréből mutatták ki. Ezzel szemben

amfetaminszármazékot három esetben írtak le (17, 20 és 52 évesek, mindannyian férfiak).

Más országok statisztikai adataival összehasonlítva a gyógyszeres illetve kábítószeres

befolyásoltság vízbefulladáskor kifejezetten ritka hazánkban [78][79].

4.1.4 Rizikófaktor: Évszakok

A vízbefulladásos halálesetek bekövetkeztének időszakát vizsgálva a várt

eredményt kaptam.

A Dél-Dunántúlon történ vízbefulladások nagy része a melegebb hónapokban,

márciustól augusztus végéig történt (74,56%). A vízbefulladások közele fele (49,12%)

nyáron történt (p<0,0001). A téli időszakban bekövetkezett vízbefulladások nagy része

öngyilkosság miatt következett be, míg a többi évszakban inkább a véletlenszerű balesetek

száma volt a jellemző. A vízbefulladások szezonális mintázata más országokéhoz (pl. USA,

Banglades, Irán) hasonlóan alakult (ld. 13. ábra és Függelék F/4. táblázat) [76][77][80].

36

13. ábra

A vízbefulladásos esetek évszakonkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (2008-2012).

4.1.5 Rizikófaktor: Vízbefulladások helyszínei

A vízbefulladások helyszíneit országonként leginkább a földrajzi és éghajlati

viszonyok határozzák meg. Vizsgálatom célja volt, hogy felmérjem, mely helyszíneken

történik vízbefulladás a környékünkön.

A 14. ábrán látható, hogy a legtöbb vízbefulladás természetes vizekben (folyókban,

tavakban) történt Magyarország dél-dunántúli régiójában. A holttestek legnagyobb

számban a Dunában (n=30; 26,32%), illetve a Balatonban (n=22; 19,30%) kerültek

feltalálásra. A beltéri vízbefulladások ritkák voltak, mindössze négy esetben írtak le

hasonlót. 13 esetben találták meg az elhunytat az ingatlanja közvetlen környezetében

(telekhez tartozó borospince, kút, árok, kerti tó). A kútba ugrás, mint öngyilkosság

elkövetésének módja, gyakori Magyarországon az idősebbek körében, ezen a környéken

nyolc esetben jegyezték fel a vizsgált ötéves periódusban (bővebben ld. Függelék F/5.

táblázat).

Négy ismeretlen személyazonosságú holttestet jegyeztek fel ebben az időszakban a

három megyében, akiket tudomásom szerint jelen dolgozat megírásakor sem azonosítottak.

25,44%

49,12%

11,40%

10,53%

3,51%

tavasz nyár ősz tél ismeretlen

37

Mivel a Duna tíz országon folyik keresztül, az is lehetséges, hogy ezek az elhunytak a

határon túlról származnak. Ez a tény az áldozatok azonosítását még inkább megnehezíti

[39].

14. ábra

A dél-dunántúli vízbefulladások helyszínei (2008-2012).

4.1.6 Rizikófaktor: A vízbe kerülés oka

Országonként (földrajzi és társadalmi összetétel-különbség miatt) igen eltérő

okokra vezethető vissza az elhunytak vízbe kerülése. Célom volt, hogy ezt a lehetséges

rizikófaktort megvizsgáljam a dél-dunántúli régióban bekövetkezett vízbefulladások

körében.

A szemtanúk hasznos adatokat szolgáltathatnak a vízbefúlásos esetek hátteréről a

rendőrség számára, ezzel megkönnyítve a nyomozás előrehaladását [3][39], azonban

inkább kevés esetben volt jellemző, hogy az eseménynek szemtanúja lett volna valaki. 29

esetben semmilyen adat nem volt ismert a vízbefulladások hátteréről, a boncolás során

azonban kizárták az erőszakos elkövetési módot, így a kérdéses halálesetek baleset vagy

öngyilkosság miatt következhettek be [39].

A vízbe kerülés oka legnagyobb részben baleset volt (59,65%), ezekben

közrejátszhatott a magas véralkoholszint vagy krónikus betegség (cukorbetegség, magas

34,21%

36,84%

5,26%

2,63%

7,02%

7,02%

7,02%

tó folyó patak árok otthon kút egyéb

38

vérnyomás betegség stb.). Minden, vízi sporttevékenység végzése közben elhunyt áldozat

férfi volt, és alkoholt fogyasztott.

Két esetben (1,75%) írtak le emberölés miatt bekövetkezett vízbefulladást: az egyik

áldozat egy fiatal férfi, a másik egy idős nő volt. Mindkét áldozatot bántalmazták, majd

vízbe dobták, a haláluk oka végül vízbefulladás volt.

15 esetben (13,16%) jegyeztek fel öngyilkosságra utaló nyomokat a vizsgált 114

esetből. Az öngyilkossági szándék bizonyítása szemtanúk vagy búcsúlevél hiányában

nehéz, de egyes nyomok utalhatnak az elkövetési módra: jellegzetes külsérelmi nyomok,

elrendezett személyes tárgyak a vízbeesés közelében. Az öngyilkosságok az idősebb

korosztályra voltak jellemzőek (61 és 90 év közöttiek) és ezen elhunytak nem fogyasztottak

alkoholt, vagy csak kis mennyiségben, tehát nem voltak alkoholos befolyásoltság alatt [81].

A nők a férfiaknál gyakrabban választották a vízbefulladást, mint öngyilkossági elkövetési

módot (11 nő és 4 férfi). Az öngyilkosságot elkövető férfiak 50 és 75 év közöttiek voltak,

míg a nők 38 és 82 év közöttiek. Az öngyilkosságok elkövetési módja kútba ugrás vagy

hídról leugrás volt.

A vízbe kerülés okainak megoszlását a 15. ábrán tüntettem fel, a különböző

kategóriák bővebben a Függelék F/6. táblázatában láthatók.

15. ábra

A vízbe kerülés okainak megoszlása a vízbefulladás miatt elhunytak körében (2008-2012).

1,75%

59,65%

25,44%

öngyilkosság emberölés baleset ismeretlen

13,16%

39

II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS

MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKA EREDMÉNYEI

4.2 A vízbefulladás tényének alátámasztására alkalmazott mikroszkópos módszer,

a diatóma teszt

4.2.1 Vízminták vizsgálata fény- és fluoreszcens mikroszkóppal

A vízbefulladás tényének megállapítására jelenleg alkalmazott módszer, a

diatóma teszt hatékonyságának és érzékenységének növelését tűztem ki vizsgálataim

egyik céljául.

A vizsgálatok során kezdetben különböző magyarországi természetes és

mesterséges vizekből gyűjtöttem vízmintákat, majd ezek évszakonkénti változását

vizsgáltam meg. E vizsgálatok célja elsősorban az volt, hogy megismerjem a vizek

algaösszetételét, azért, hogy megtudjam, mely nemzetségek lehetnek legfőbb célpontjai

16. ábra

Vízminták gyűjtésének helyszínei a mikroszkópos és DNS alapú vizsgálatokhoz. Világoskékkel

a természetes és mesterséges vizek, míg sötétebb színnel a csapvízminták forrását jelöltem.

Vaktérkép forrása: http://d-maps.com/

40

a későbbi molekuláris vizsgálatoknak, illetve az algaösszetétel környezettől függő

változását szerettem volna feltérképezni.

2011 és 2015 között 69 magyarországi vízmintát gyűjtöttem (ld. 16. ábra),

amelyeket natívan fénymikroszkópos, illetve némelyeket Lugol-oldattal hígítva, fordított

plankton mikroszkópos vizsgálatnak vetettem alá. A fordított planktonmikroszkóppal

meghatározhatjuk, hogy térfogategységnyi vízmintában mennyi alga található, így kis

alga tartalmú vizek esetében célszerű ezzel a mikroszkóppal értékelni a diatóma tesztet.

A fordított planktonmikroszkóp alkalmazásával tehát növelhetjük annak a lehetőségét,

hogy a mintában diatómákat találunk.

A saját intézetünkben és a Balatoni Limnológiai Intézetben végzett kutatások

alapján a leggyakrabban megfigyelt diatóma nemzetségek az általam gyűjtött

magyarországi vizekben a következők voltak: Cyclotella sp., Cymbella sp., Diatoma sp.,

Navicula sp., Nitzschia sp. A diatómákon kívül a zöldalgák képviseltették magukat nagy

számban a fénymikroszkópos vizsgálatok során (Noctoc sp., Pediastrum sp.,

Scenedesmus sp., Volvox sp.), ezek közül gyakran láttam a Cladophora glomerulata

fonalas algára rátelepülő kovamoszatokat és cianobaktériumokat (ld. 17. ábra).

17. ábra

Fonalas zöldalgára rátelepült bentikus kovamoszatok natív vízmintában (fénymikroszkópos

metszet, 20x nagyítás). A bentikus algafajok jellemzője, hogy nagy mérettartományba esnek.

Kép készítésének helye: PTE ÁOK, Igazságügyi Orvostani Intézet

41

Általánosan kijelenthető, hogy a vízmintákban nagy számban voltak leírhatóak

baktériumok, amelyek közül leginkább a cianobaktériumokat érdemes kiemelni. A

pikocianobaktériumok fénymikroszkóp segítségével nem elkülöníthetők más

18. A és B ábra

A pikofitoplankton két

csoportját, a

pikocianobaktériumokat

és pikoeukariótákat

azonosítottuk autofluoresz-

cenciájuk alapján. A két ábrán

ugyanaz a vízminta látható, az

A ábrán a

pikocianobaktériumok és a

pikoeukarióták is látszanak

(kékesibolya gerjesztés), míg

a B ábrán a

pikocianobaktériumok

gerjesztődnek (zöld

gerjesztés).

Képek készítésének helye:

Balatoni Limnológiai Intézet;

Olympus BX51, 1000x nagyítás

B

A

42

pikoeukarióta kokkuszoktól, ezért azonosításukhoz fluoreszcens mikroszkópra van

szükség (ld. 18. A és B ábra). A hazai vizek egyik, évszaktól függetlenül gyakori

pikocianobaktérium faja a Synechococcus sp., ezért ezt a csoportot választottam alapul a

molekuláris vizsgálati protokoll kidolgozásához.

A pikocianobaktériumok zöld fénnyel megvilágítva válnak láthatóvá

autofluoreszcenciájuknak köszönhetően. Az eukarióták nem gerjeszthetők zöld fénnyel,

fluoreszcenciájuk csökken. A cianobaktériumok autofluoreszcenciáját csak friss, 24 órán

belül vizsgált minta esetében érzékeltük erőteljesnek, 2-3 nap után egyre kevesebb

cianobaktérium látható a mintában (amennyiben nincs volt lehetőségünk azonnal

megvizsgálni a vízmintát rövid időn belül, a megfelelő, sötétben és hűtve tárolt minta

vízmintától függően valamivel hosszabb ideig vizsgálható). Kékesibolya fénnyel

gerjesztve a mintát, mindkét csoport láthatóvá válik.

A vízminták vizsgálatakor a fajszintű meghatározás nem volt cél, sokkal inkább a

hazai vizek algaösszetételének megismerésére fókuszáltam, illetve a protokoll

érzékenységének meghatározására. Az osztályozhatóság miatt a vízmintákat az egy

látómezőre eső diatóma szám alapján egy skálán értékeltem: negatív (-) jelet kapott az a

vízminta, amelyben nem láttam algát, egy pozitív jellel (+) jelöltem azt, amely esetében

kevés, vagy nem minden látómezőre jutott alga (<3 db, teljes vagy töredék), a

látómezőnként 1-10 közé eső algaszámú vízmintákat két pozitív jellel láttam el (++), és

az e fölötti, algában gazdag mintákat három pozitív jellel jelöltem (+++). Tapasztalataim

alapján a vízminták több, mint 90%-át értékeltem ++ vagy +++ jellel, mintáink 10%-ában

nagyon kevés töredék algát láttunk, vagy egyáltalán nem láttunk benne algát.

Az általam vizsgált halastavak igen változatos algaösszetétellel rendelkeztek, és

általában az algasűrűség ezekben a víztípusokban volt a legmagasabb. Egy összetett, 9

tóból álló halastórendszert vizsgáltam meg abból a szempontból, hogy az egy területen,

egymáshoz igen közel eső tavak algasűrűségét és összetételét hasonlítottam össze. A 10

vizsgált vízmintát 2013. júliusában gyűjtöttük (32°C, Csokonyavisonta), egymással nem

összeköttetésben álló halastavakból. Megfigyeléseim alapján a tavak többségét

egymáshoz viszonyítva ugyanolyan mennyiségben fordultak elő zöldalgák és diatómák,

ám egyes esetekben ettől eltérő módon az egyik vagy a másik csoport dominált (ld. 4.

táblázat).

43

Halastó száma Algák száma Algák jellemzői

1. tó A oldal + főleg diatómák

1. tó B oldal + 1 db alga

2. tó ++ zöldalgák többségben

3. tó +++

4. tó ++ zöldalgák többségben

5. tó ++

6. tó +++

7. tó ++

8. tó +++ bentikus, nagyméretű diatómák túlsúlyban

9. tó ++

4. táblázat

Csokonyavisontai halastavak fénymikroszkópos vizsgálatának eredménye.

4.2.2 Poszt mortem szövetminták mikroszkópos vizsgálata

Tapasztalataim alapján a poszt mortem szövetminták vizsgálatának legnagyobb

nehézségét a háttér, azaz a humán szövettörmelék jelenléte okozza. Minél nagyobb

mértékben sikerül elroncsolni a poszt mortem szövetet, annál nagyobb az esély arra, hogy

a kovavázak is eltűnnek vagy eltörnek, ezzel megnehezítve a kovavázak felismerését.

Avatatlan szem számára a diatóma vázak a csonttörmeléken kívül (pl. csontvelő

vizsgálatakor) növényi szőrökkel is összetéveszthetőek.

A vizsgálatokhoz vízbefulladás során elhunyt személyekből származó poszt

mortem lép és csontvelő mintát használtam, valamint lehetőség szerint tüdőszövetet

(egyes esetekben vér, máj, vese és agy is felhasználásra került). Amennyiben tüdőminta

volt biztosított a vizsgálandó szövetminta mellett, ám vízminta nem, a tüdőminta is

megfelelő kontrollként szolgált a vizsgálatokhoz, hiszen ennek a szövetmintának a

pozitivitása várható el a legnagyobb valószínűséggel.

Megfigyeléseim alapján kijelenthető, hogy összehasonlítva a magyarországi

igazságügyi orvostani és igazságügyi szakértői intézetek gyakorlatában alkalmazott

kombinált savas emésztéssel, a proteinase K enzimmel emésztett poszt mortem

szövetmintákban a háttér kevésbé zavaró, kevesebb töredezett, ám több ép vázzal

rendelkező diatómát tudtam kimutatni. A két módszer előnyeit és hátrányait az 5. táblázat

mutatja. A 19. ábrán egy ilyen, proteinase K enzimmel való emésztés utáni, poszt mortem

lépről, illetve az abban megfigyelt diatóma vázról készült felvétel látható.

44

19. ábra

Proteinase K enzim alapú feltárás, diatóma váztöredék vízbefulladás miatt elhunyt személy poszt

mortem lépszövetében (natív minta, fénymikroszkópos metszet).

Kép készítésének helye: PTE ÁOK, Igazságügyi Orvostani Intézet

5. táblázat

A klasszikus, savas emésztéssel végzett diatóma teszt és az enzimatikus emésztéssel végzett

diatóma teszt előnyeinek és hátrányainak összehasonlítása.

Klasszikus diatóma teszt Proteinase K alapú diatóma teszt

Előnyök

Megfizethető Kisebb háttérzaj

Kevesebb anyag szükséges

hozzá

Egyszerűen szemmel

követhető az emésztés

hatékonysága

Kevesebb algatörmelék

Hátrányok

Nagy háttérzaj

Ártalmas anyagok

alkalmazása (savak)

Gyakorlat szükséges az

algák felismeréséhez

Az algavázak

összetöredezhetnek vagy

elveszhetnek (fals

negatív eredmény)

Gyakorlat szükséges az algák

felismeréséhez

Drágább

45

Megjegyzendő, hogy a vízbefulladás helyszínéről származó víz és/vagy a

tüdőminta pozitivitása nem jelenti azt, hogy a poszt mortem szövetmintán elvégzett

diatóma teszt is pozitív lesz. Amikor pl. a víz kevés diatómát tartalmaz vagy egyáltalán

nem is tartalmaz, illetve a fuldoklás rövid ideig tart (gyakorlatilag a halál reflexszerűen

következett be), a szövetminta nagy valószínűséggel negatív lesz, míg a vízminta pozitív

lehet.

4.3 A vízbefulladás tényének alátámasztására alkalmazott molekuláris biológiai

módszer

Vizsgálataim során 33 vízbefulladásos esetben izoláltam DNS-t a hatóság által

biztosított vízmintákból és poszt mortem szövetekből. Ezekben az esetekben a boncolás

során megállapított halálok vízbefulladás volt, és eredményeim a vízbefulladásos

bonclelettel és a vízbefulladás igazolásra alkalmazott diatóma teszt pozitivitásával

egyezően alátámasztották a vízbefulladás tényét (azaz mind a vízminta, mind valamely

poszt mortem szövetminta pozitív eredményt adott valamely algaspecifikus

oligonukleotiddal).

Nyolc esetben alkalmaztam a vízbefulladástól eltérő ok (önakasztás illetve

gyógyszermérgezés) miatt elhunyt holttestekből származó poszt mortem szövetmintákat

(lép és májszövet), amely esetekben negatív PCR eredményt kaptam a kísérletek során

alkalmazott primerpárokkal.

6. táblázat

Vízbefulladásos esetekből származó poszt mortem szövetek vizsgálatai eredményeinek

áttekintése.

* Pozitív az eredmény, ha valamely, vagy minden, a 2. táblázatban felsorolt primerrel DNS

pozitivitást láttam. Negatív az eredmény, ha minden primerrel negatív eredményt kaptam.

** n.b.= a hatóság nem biztosított mintát

PCR eredménye*

Diatóma teszt eredménye Víz Lép

1. eset pozitív pozitív negatív

2. eset

3. eset

4. eset

pozitív

pozitív

n.b.**

pozitív

pozitív

pozitív

negatív

negatív

negatív

46

Négy esetben pozitív PCR eredményt kaptam, így az általam leírt módszer

támogatta a vízbefulladás tényét (ezen esetek áttekintése a 6. táblázatban látható). Ennek

a négy esetnek az előző esetekhez képest az az érdekessége, hogy a diatóma teszt mind a

víz, mind a szervek mikroszkópos vizsgálatakor negatív eredményt adott, ám a

boncoláskor és toxikológiai vizsgálattal a vízbefulladáson kívül minden más kizárásra

került. Az említett esetekhez tartozó PCR eredményeink összefoglalása a 7. táblázatban

látható. Az 1. esethez tartozó gélfotót a 20. ábra szemlélteti.

1. eset 2. eset 3. eset 4. eset

életkor 54 év 2 év 53 év 35 év

víz típusa és mélysége talajvíz

(200 mm)

tüzivíztározó

(500 mm)

élményfürdő árok

(100 mm)

holttest megtalálása <1 nap <1 óra <1 óra <1 nap

gyógyszerszármazékok negatív negatív negatív negatív

alkoholfogyasztás 2,71 g/L

(vér)

3,61 g/L

(vizelet)

negatív 0,21 g/L

(vér)

3,77 g/L

(vér)

5,09 g/L

(vizelet)

diatóma teszt

eredménye

negatív negatív negatív negatív

7. táblázat

Négy, negatív diatóma teszttel járó vízbefulladásos eset áttekintése.

47

20. ábra

A 7. táblázatban ismertetett 1. esethez tartozó gélfotó (CBR F-R primerek).

L - Hyper Ladder II; 1 - templát mentes kontroll; 2 – 1. sz. negatív kontroll: bonctermi vízből

származó DNS; 3 – 2. sz. negatív kontroll: nem vízbefulladás miatt elhunyt áldozat lépéből izolált

DNS; 4 – a vízbefulladás helyszínét képező vízből ízolált DNS; 5 – a vízbefulladás miatt elhunyt

áldozat lépéből izolált DNS; 6 – pozitív kontroll: Synechococcus sp. algatörzsből izolált DNS

L 1 3 2 5 4 6

700 bp

48

5. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA

I. A STATISZTIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEINEK MEGVITATÁSA

Amikor a vízbefulladások vizsgálatának kérdésköre, mint kutatási téma felmerült,

első lépésként felmértem a magyarországi, és elsősorban a környékbeli vízbefulladások

éves számát és azok körülményeit (ok, helyszín, élvezeti szerek fogyasztása stb.). A

felmérés szükségességét több szempontból is elengedhetetlennek tartottam: ennek egyik

oka az volt, hogy a vízbefulladás, mint halálok, nem szerepel kiemelt helyen a

köztudatban, azaz, az igazságügyi orvostanban kívülállónak tekinthető laikusok nehezen

hiszik el, hogy a vízbefulladás valóban olyan problémakör, amellyel érdemes foglalkozni.

Szerettem volna ehhez számszerű adatokkal hozzájárulni. Különösen érdekes volt

megvizsgálni a régió vízbefulladásainak helyszíneit, hiszen a dél-dunántúli régió

(elsősorban Baranya-megye) a többi megyéhez viszonyítva természetes vizekben

szegény. A régió vizeinek felmérése más szempontból is fontos volt: a vizek felmérése

után adatainkkal felkerestem a tihanyi Balatoni Limnológiai Kutatóintézet

Hidrobotanikai Osztályát (Magyar Tudományos Akadémia, Ökológiai Kutatóközpont),

és az ott dolgozó algológusok segítségével meghatároztuk, hogy melyek a régióbeli vizek

leggyakoribb algacsoportjai, amelyeket érdemes a DNS alapú kutatás

célorganizmusainak választani. Azaz, melyek azok a vízben élő, egysejtű organizmusok,

amelyek méretükből és előfordulásukból adódóan megfelelően nagy eséllyel jutnak el a

fuldokló áldozat szerveihez és jelenlétük kimutatható.

114, 2008 és 2012 közötti vízbefulladásos haláleset statisztikai elemzését

végeztem el. Ezek a dél-dunántúli természetes és mesterséges vizekben bekövetkezett

vízbefulladások hasonlítanak a WHO által közölt nemzetközi adatokhoz, ám az adatok

elemzésekor számos figyelemreméltó különbséget is találtam.

A nemek megoszlása az általam vizsgált esetekben nagyon hasonló a nemzetközi

adatokhoz: az elhunytak kétharmada volt férfi [1][2][6][77][78][82].

A dél-dunántúli, vízbefulladás miatt elhunytak korának megoszlása eltért más

országok adataitól. A WHO szerint az életkor magas kockázati tényezőt jelent és

összefüggésbe hozható a (gyermek)felügyelettel [1]. A legmagasabb vízbefulladási ráta

világviszonylatban az 5 év alatti gyermekeket érinti, szorosan követi ezt a csoportot az 5-

14 év közöttiek korcsoportja. A WHO Csendes-óceán nyugati régiójában, ezekben a

49

korcsoportokban a vízbefulladás miatti elhalálozás gyakoribb, mint bármilyen más

halálok [1][2][75][74][77]. Magyarországon a vizsgált 5 éves periódusban mindössze egy

halálos esetet regisztráltak a vizsgált dél-dunántúli régióban a 10 év alattiak körében.

Talán ez visszavezethető a Magyarországon élő kiskorúakra irányuló kiemelt figyelemre,

összevetve a kevésbé fejlett vagy fejlődő országokkal. A legmagasabb vízbefulladási ráta

az életkorokat tekintve az 51-70 év közöttiekre volt jellemző [6].

Elemzésem alapján az alkoholfogyasztás nagymértékben hozzájárul a

vízbefulladáshoz. Az esetek 31,58%-ában (36 eset a 114-ből) az elhunytak

véralkoholszintje 1,51 ezrelék fölött volt. Ilyen magas véralkoholszint (1,50-2,50‰, azaz

150-250 mg%) közepes fokú alkoholos befolyásoltságnak minősül. Ez azt jelenti, hogy

az adott személy reflexei lassulnak, a reakcióidő megnő, a motoros aktivitás zavart

szenved és mindezek együtt az önmentő képesség csökkenéséhez vezetnek [83]. Számos

tanulmányból hiányzik a véralkoholszint és a vízbefulladás közötti összefüggések

vizsgálata (pl.: közlemények Iránból) [77][81][84]. Azokban a - leginkább európai -

tanulmányokban azonban, ahol az elhunytak véralkoholszintjét vizsgálták, egyértelmű

összefüggés mutatkozott az alkoholfogyasztás és a vízbefulladás ténye között [78]. A

nemzetközi irodalommal összevetve az eredményeket, az általam vizsgált esetekben a

mért véralkohol-koncentráció értékek átlagosan magasabbak voltak a vízbefulladt

áldozatok körében.

11 esetben (74 esetből), azaz a vizsgált esetek 14,86%-ában írták le valamilyen

gyógyszer vagy kábítószer jelenlétét a vérben. Ezzel szemben a nemzetközi adatok azt

mutatják, hogy az alkoholfogyasztás mellett a kábítószer fogyasztás szintén kiemelkedő

rizikófaktora a vízbefulladásnak [78].

A vízbefulladások számának szezonális megoszlása hasonló más, négy évszakkal

rendelkező országokéhoz: a vízbefulladások nagy része a melegebb, nyári hónapokban

történt: vizsgálatom során júliustól augusztusig észleltem egy kiugrást az esetek

számában (jellemző ok: sport- és más okok miatt bekövetkezett balesetek) [2][3][39][85].

Kissé szokatlan, hogy a téli időszakban az öngyilkosságok száma jelentős volt.

Magyarország dél-nyugati régiójában a vizsgált időszakban a legtöbb

vízbefulladás természetes vizekben történt: az esetek nagy részének helyszínei folyók és

tavak voltak. A vízbefulladások helyszíneit összehasonlítva a nemzetközi adatokkal, jól

látszik, hogy országunkban jóval kisebb a beltéri mesterséges vizekben (pl. élményfürdő)

és kerti tavakban vízbefulladás miatt elhunytak száma [2][78]. Más országokra jellemző,

hogy a kerti tavakban és uszodákban bekövetkező esetek száma magasabb a gyermekek

50

körében, azonban nálunk a gyermekkorúak között egyébként is alacsonyabb volt a

vízbefulladásos halálesetek száma [1][85][86][87][84].

Más országok statisztikáival összehasonlítva az adatainkat kitűnik, hogy nálunk

kevesen fulladtak vízbe sportolás közben. A Balaton déli részén bekövetkező

vízbefulladásos halálesetek az ISZKI kaposvári kirendeltségének hatókörébe tartoznak.

A Balaton kedvelt úti célja a vízi sportolási lehetőségek széles körét kihasználók számára,

mégis, a kis vízmélység az úszást kedvelők számára nem teszi népszerűvé a tavat. A

melegebb időszakban (tavasztól ősz végéig) a tavon kétfokozatú viharjelzés van

érvényben, illetve a Nemzeti Közlekedési Hatóság előírja mentőmellény alkalmazását a

vízi sporteszközök használatakor. Úgy gondolom, kiemelkedő jelentősége van mindkét

ténynek a sportaktivitás közben bekövetkező vízbefulladások kifejezetten alacsony

számában [88][89][90]. Magyarországon, főleg a falvakban az öngyilkosság

elkövetésének gyakori módja a kútba ugrás (az idősek körében) [81]. Ez az elkövetési

mód leginkább az idősebbekre volt jellemző és mindkét nem esetében gyakori volt [91].

Sok más országhoz hasonlóan Magyarországról is elmondható, hogy az életkorral az

öngyilkosságok száma is növekszik [78][81][91].

Mindent összegezve elemzésem alapján kijelenthetjük, hogy a fő

vízbefulladáshoz köthető kockázati tényezők a következők: (1) férfi nem (71,05%), (2)

51 és 70 év közötti életkor (44,73%) és (3) alkoholfogyasztás (64,04%) [1][2][78].

Vizsgálataim során nyilvánvalóvá vált, hogy a véletlenül bekövetkező balesetek

(és kisebb mértékben a vízbefulladás általi öngyilkosságok) szoros összefüggést

mutatnak az alkoholfogyasztással. Figyelembe kell venni tehát ezeket a kockázati

tényezőket a prevenciós megoldások kidolgozásakor. Reményeim szerint ezek az

eredmények felhívják a figyelmet az 51-70 éves korcsoportra, hiszen ebben a csoportban

volt a legmagasabb a vízbefulladások száma. Fontos, hogy kerüljük az alkoholfogyasztást

víz közelében végzett sportolási és szabadidő tevékenység idején, mert amellett, hogy az

alkohol növeli az önbizalmat, csökkenti a potenciális áldozatok veszély-felismerési és

önmentési képességét [39][84][85][86].

51

II. A VÍZBEFULLADÁS BIZONYÍTÁSÁRA ALKALMAZOTT MIKROSZKÓPOS ÉS

MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKA EREDMÉNYEINEK MEGVITATÁSA

A vízbefulladás tényének megállapítása jelenleg is nehéz: nincsenek specifikus

boncjelei, ugyanis azok a legtöbb fulladásos halálnál megfigyelhetők [8][11][12]. Mi

több, egyes boncleletek (pl. habgomba jelenléte) megjelennek a vízbefulladások egy

részében, máskor azonban az előrehaladott bomlás miatt hiányozhatnak is [8][92].

Habár a diatóma teszt a leginkább elterjedt módszer a boncolás során prediktált

diagnózis támogatására, számos hátránya ismert. A negatív diatóma teszt nem zárja ki a

vízbefulladás lehetőségét, és csupán a diatóma teszt negativitására támaszkodni

félrevezető lehet. (1) Ha a vízbefulladás helyszínét képező víz kevés diatómát tartalmaz,

vagy egyáltalán nem tartalmaz diatómát [93], az esély csökken a mikroszkópos

kimutatásra. Ennek egyik oka lehet, hogy a diatómák előfordulását a vizekben számos

környezeti faktor befolyásolja (víz típusa, hőmérséklete, fénymennyiség,

tápanyagtartalom, vízszennyezés, algavirágzás, más vízi élőlények stb.), megjelenésük és

a vizek fajösszetétele szezonálisan változó [92][93][94][95][96]. (2) Amennyiben a

fuldoklás rövid ideig tart, az algáknak nincs elég idejük arra, hogy eljussanak a tüdőtől a

szervekig (ez esetben a PCR alapú vizsgálattal sem várható pozitív eredmény). (3) A

szövetek savas roncsolása következtében a kovavázak is károsodnak, egy részük teljesen

elveszhet [8][92]. (4) A teszt során alkalmazott vegyszerek káros hatással vannak a

vizsgálatot végző személy szervezetére. (5) Ezen kívül az algák észrevétele a

csonttörmeléket is tartalmazó mikroszkópos csontvelő preparátumban gyakorlott

vizsgálót igényel. Habár már a ’60-as években megkérdőjelezték a mikroszkópos

módszer alkalmazhatóságát a vízbefulladás bizonyítására, manapság is egyre több kutatás

veti fel, hogy a diatóma teszt néhány esetben álnegatív vagy (6) álpozitív lehet

[8][12][16][49][50][52][56]. Mindezeket összevetve célszerűnek látszik más algafajok

(pikoeukarióták, pikocianobaktériumok) mikroszkópos kimutatását is megcélozni a

diatómák mellett (fluoreszcens mikroszkópia), vagy a savas emésztés helyett enzimatikus

(proteinase K) emésztést alkalmazni [32]. Előbbi esetben a detektálásnak azért lesz

nagyobb az esélye, mert a fénymikroszkóposan vizsgálható algacsoportok számát

terjesztjük ki, az enzimatikus emésztés alkalmazásával pedig kisebb az esély arra, hogy

az apró, finom kovavázak összetöredeznek vagy teljesen elvesznek (a bentikus

kovamoszat fajok nem csak nagyobb méretük miatt jutnak be kisebb valószínűséggel a

52

szervezetbe fuldoklás során, hanem az aljzathoz tapadó életmódjuk miatt is, vagyis akkor

nagyobb az esély a bekerülésükre, ha az áldozat felkavarja a víz medrét).

Vizsgálataim alapján úgy gondolom, hogy amennyiben a vízbefulladás

helyszínéről származó víz igen kevés algát tartalmaz, a poszt mortem szövetminta

esetében a preparátum vizsgálatát javasolt fordított plankton mikroszkóppal elvégezni.

Ezen mikroszkópos technikát alkalmazva az egy térfogategységre eső, azaz a mintában

található minden egyes alga megvizsgálható, ugyanis a Lugol-oldatban található jód az

algák pórusaiba beleülve az összes algát mintegy „lehúzza” a vizsgálandó felületre.

Jelen dolgozatban a pozitív diatóma tesztek megerősítése mellett négy olyan

esetben is sikerrel alkalmaztam a PCR módszert a vízbefulladás diagnózisának

támogatására, amikor a diatóma teszt negatív volt. Ezekben az esetekben a vízbefulladás

tényét a boncolás és a szövettan is megerősítette, a toxikológiai vizsgálat kizárta a

mérgezés lehetőségét, valamint a vízbe kerülés körülményeinek feltárását a szemtanúk

leírásai is alátámasztották. Ebben a négy esetben a következő boncleletek leírása történt:

száraz, puffadt, felfújt tüdők; Paltauf foltok; testszerte folyékony, sötét szederjes vér,

pangásos belső szervek és vérszegény lép. A szövettan során emphysema aquosum került

leírásra és minden más halálok kizárásra került.

Ahogy a diatóma teszt esetében, úgy az általam alkalmazott módszer esetében is

igaz, hogy a DNS alapú tesztek érzékenyek a kontaminációra. Ezért a PCR vizsgálat során

számos negatív kontroll alkalmazására van szükség. A poszt mortem szövetminták

fitoplanktonnal való szennyeződésnek két forrása lehetséges: a fitoplankton forrása lehet

maga a bőrfelszín (a holttest vízben állása miatt), másrészt a boncolás során alkalmazott

csapvíz. Ezen okok miatt különösen fontos a körültekintő mintavétel, fontos, hogy a

holttest lemosásakor ügyeljünk arra, hogy a szervek ne érintkezzenek a bőrfelszínnel, és

a lemosásra lehetőség szerint algamentes vizet alkalmazzunk.

A kísérletek során mind a laboratóriumi, mind a bonctermi vízből izoláltam DNS-

t, ezek a vizsgálatok negatív eredménnyel jártak. A kontamináció lehetősége aprólékos

mintaelőkészítés és steril eszközök használatával jelentősen csökkenthető, a negatív

kontrollok alkalmazása és a PCR eredmények együttes értelmezése elengedhetetlen [63].

Az általam leírt, PCR alapú módszer jó kiegészítője lehet a jelenleg alkalmazott

mikroszkópos módszernek. Számos algafajból történő DNS izolálásához rendelkezésre

állnak megbízható protokollok, amelyek - a diatóma teszttel szemben - nem igénylik az

egészségre káros vegyszerek alkalmazását. A DNS alapú módszer másik nagy előnye,

hogy a PCR technika érzékenységéből és specifikusságából adódóan, már kevés alga

53

jelenléte esetén is nagy eséllyel várható pozitív eredményt a mikroszkópos módszerrel

ellentétben. A diatóma teszt és a PCR alapú módszer előnyeit és hátrányait a 8.

táblázatban gyűjtöttem össze.

A négy, negatív diatóma teszt eredményt adó eset mutatja, hogy amennyiben a

vízbefulladás helyszínét képező víz kevés diatómát tartalmaz, vagy egyáltalán nem

tartalmaz diatómát [49][50][97], más fitoplankton fajok (cianobaktériumok, zöld

pikoalgák) kimutatását érdemes megcélozni. E fajok a diatómákhoz viszonyítva kisebb

méretűek, ezért rövidebb ideig tartó fuldoklás esetén is nagy valószínűséggel jutnak el a

véráramba és annak segítségével a szervekhez. Habár kevés adat ismert a baktériumok és

más algák passzív penetrációjáról, úgy tűnik, hogy a vízben ázó holttest ép kültakarója

esetén nem jutnak el a szervekhez [52]. Ennek igazolására Lucci és munkatársai 2008-

ban jelentettek meg egy tanulmányt a poszt mortem bakteriális invázió hiányáról [16].

Amennyiben tehát a vízbefulladás tényének megerősítésére alkalmazható

molekuláris biológiai módszert szeretnénk intézetünk mindennapi gyakorlatába

bevezetni, első lépésként javasolt algológusok segítségével a környékbeli vizek

algaösszetételének feltérképezése annak érdekében, hogy a megfelelő algacsoportok

kimutatását célozzuk meg. A PCR elvégzésekor célszerű minél több csoport kimutatását

megtervezni, ugyanis ezzel növelhető a pozitív eredmény esélye. Az általam vizsgált

esetekben több primer párral végeztem el a PCR-t, egyes esetekben a diatóma specifikus

primerekkel, máskor a zöldalgákra vagy a cianobaktériumokra specifikus primerekkel

kaptam negatív eredményt. Már valamely primerrel kapott pozitív eredmény is támogatja

a vízbefulladás diagnózisát, hiszen a pozitív eredmény, azaz a poszt mortem szövet DNS

pozitivitása azt a tényt valószínűsíti, hogy az áldozat vízbefulladás miatt hunyt el. Fontos,

hogy vizsgálatainkhoz olyan oligonukleotidokat válasszunk, amelyek a humán DNS

szekvencián nem ismernek fel szakaszokat, csak az általunk keresett algacsoportokra

specifikusak.

Jelen dolgozatban felsorolt eredményeim bizonyítják, hogy az általam leírt,

egyszerűen alkalmazható PCR alapú vizsgálat a mindennapi igazságügyi orvostani

gyakorlatba átültethető, mivel annak eredménye további bizonyítékot szolgáltathat a

vízbefulladásra a bonclelet mellett olyan esetekben, amikor a diatóma teszt eredménye

negatív.

54

8. táblázat

A diatóma teszt és a PCR alapú módszer előnyeinek és hátrányainak összehasonlítása.

Diatóma teszt PCR alapú teszt

Előnyök

Megfizethető

Kis anyag- és

eszközigény

Számos kontroll

alkalmazható

Bármilyen algacsoport

kimutatása lehetséges

pozitív eredmény lehetősége

növelhető

Nem szükséges hozzáértő

személyzet

Speciális esetekben is

alkalmazható (pl.

vízbefulladás konkrét

helyszínének meghatározása)

Egészséget nem károsító

anyagok szükségesek hozzá

Kis mintaigény

Már egy alga DNS-e is

felsokszorozható

Gyors eredmény (néhány

óra)

A vízminta és a poszt

mortem szövetek egy időben

vizsgálhatók

Hátrányok

Nagy háttérzaj

Ártalmas anyagok

alkalmazása (savak)

Gyakorlat szükséges az

algák felismeréséhez

Az algavázak

összetöredezhetnek

vagy elveszhetnek (fals

negatív eredmény)

Kevés alga esetén nagy

az esély a negatív

eredményre

Kontrollok

korlátozottan

alkalmazhatóak

Egyes esetekben fals

pozitív eredményt adhat

Hosszú időt vesz

igénybe (O/N emésztés)

Magasabb egyszeri költségek

(thermocycler beszerzése)

Kontamináció veszélye

(kontrollok alkalmazásával

kizárható)

55

6. ÖSSZEFOGLALÁS

Jelen dolgozatban összefoglaltam a Dél-Dunántúlon 2008 és 2012 között történt

vízbefulladások jellemzőit és meghatároztam a főbb rizikócsoportokat. Az

eredmények közül kiemelendő, hogy a közép-koraidős korcsoportba eső,

alkoholos befolyásoltság alatt álló férfiak a leginkább veszélyeztetett csoport a

vízbefulladás lehetőségének szempontjából.

Javaslatot tettem a klasszikus diatóma teszt módosításának lehetőségeire a

speciális körülmények (pl. kevés diatómát tartalmazó víz) esetén történő

vízbefulladások helyszínéről származó víz vizsgálatakor.

A klasszikus, mikroszkópos diatóma teszt megerősítése mellett bemutattam négy

olyan esetet, amikor a vízbefulladás diagnózisának bizonyítására az igazságügyi

orvostani gyakorlatban alkalmazott módszer, a diatóma teszt valamilyen okból

negatív eredménnyel járt, amely a bonclelettel összehasonlítva ellentmondásos

volt. Az általam alkalmazott DNS alapú módszerrel azonban egy vagy több

algaspecifikus PCR primerrel kapott pozitív eredménnyel támasztottam alá a

vízbefulladás tényét.

Javaslatot tettem egy olyan, a rutinba átültethető, DNS alapú módszer gyakorlati

alkalmazására, amely széleskörűen alkalmazható az édes- vagy sósvizekben

történő vízbefulladások esetében, a vízbefulladás helyszínét képező víz

algaösszetételének feltérképezése után.

56

7. IRODALOMJEGYZÉK

[1] WHO | Drowning Fact sheet N°347, (2014).

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs347/en/ (accessed January 22,

2014).

[2] World Health Organization, Global Report on drowning: preventing a leading

killer, (2014) 58.

[3] S.N. Forjuoh, Safety at play: let’s all help to prevent drowning., Int. J. Inj. Contr.

Saf. Promot. 18 (2011) 95–6. doi:10.1080/17457300.2011.575282.

[4] WHO, Water-related Diseases, (2001).

http://www.who.int/water_sanitation_health/diseases/drowning/en/#.Ut_OvBWru

4M.mendeley (accessed January 22, 2014).

[5] Központi Statisztikai Hivatal, (n.d.). http://www.ksh.hu/.

[6] E. Rácz, F. Könczöl, H. Mészáros, Z. Kozma, M. Mayer, Z. Porpáczy, V.S. Poór,

K. Sipos, Drowning-related fatalities during a 5-year period (2008–2012) in

South-West Hungary – A retrospective study, J. Forensic Leg. Med. 31 (2015) 7–

11. doi:10.1016/j.jflm.2015.01.001.

[7] P. Sótonyi, Az igazságügyi orvostan alapjai, Semmelweis Kiadó és Multimédia

Stúdió, 2011.

[8] P. Saukko, B. Knight, Knight’s Forensic Pathology, 3rd ed., CRC Press, 2004.

[9] L. Tamáska, Igazságügyi orvostan (Kézirat), Budapesti Orvostudományi

Egyetem, 1960.

[10] B. Kenyeres, A törvényszéki orvostan tankönyve I-II., Universitas, Budapest,

1925.

[11] M.H. Piette, E. De Letter, Drowning: still a difficult autopsy diagnosis., Forensic

Sci. Int. 163 (2006) 1–9. doi:10.1016/j.forsciint.2004.10.027.

[12] N. Foged, Diatoms and drowning -- once more., Forensic Sci. Int. 21 (1983) 153–

159.

[13] A. Gunn, Essential Forensic Biology, Wiley, 2006.

[14] J. Azparren, I. de la Rosa, M. Sancho, Biventricular measurement of blood

strontium in real cases of drowning., Forensic Sci. Int. 69 (1994) 139–48.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7813997 (accessed January 24, 2011).

[15] J.E. Azparren, A. Ortega, H. Bueno, M. Andreu, Blood strontium concentration

related to the length of the agonal period in seawater drowning cases, Forensic

Sci. Int. 108 (2000) 51–60.

57

[16] A. Lucci, C.P. Campobasso, A. Cirnelli, G. Lorenzini, A promising

microbiological test for the diagnosis of drowning., Forensic Sci. Int. 182 (2008)

20–6. doi:10.1016/j.forsciint.2008.09.004.

[17] T. Tomonaga, Identification of death by the disorganization method, Jpn. J. Leg.

Med. 8 (1954) 143–147.

[18] H. OTTO, On the demonstration of diatoms in human lung dust., Frankfurter

Zeitschrift Für Pathol. 71 (1961) 176–81.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13731658.

[19] M. Kobayashi, Y. Yamada, W.-D. Zhang, Y. Itakura, M. Nagao, T. Takatori,

Novel detection of plankton from lung tissue by enzymatic digestion method,

Forensic Sci. Int. 60 (1993) 81–90. doi:10.1016/0379-0738(93)90095-R.

[20] R. Jeanmonod, C. Staub, B. Mermillod, The reliability of cardiac haemodilution

as a diagnostic test of drowning., Forensic Sci. Int. 52 (1992) 171–80.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1601349.

[21] H.G. SWANN, N.R. SPAFFORD, Body salt and water changes during fresh and

sea water drowning., Tex. Rep. Biol. Med. 9 (1951) 356–82.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14835472.

[22] J. Azparren, Diagnosing death by drowning in fresh water using blood strontium

as an indicator, Forensic Sci. Int. 137 (2003) 55–59. doi:10.1016/S0379-

0738(03)00284-6.

[23] J.E. Azparren, G. Vallejo, E. Reyes, a Herranz, M. Sancho, Study of the

diagnostic value of strontium, chloride, haemoglobin and diatoms in immersion

cases., Forensic Sci. Int. 91 (1998) 123–32.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9549902.

[24] J.E. Azparren, C. Cubero, E. Perucha, P. Martínez, G. Vallejo, Comparison

between lung weight and blood strontium in bodies found in seawater., Forensic

Sci. Int. 168 (2007) 128–32. doi:10.1016/j.forsciint.2006.07.001.

[25] J.E. Azparren, E. Perucha, P. Martínez, R. Muñoz, G. Vallejo, Factors affecting

strontium absorption in drownings., Forensic Sci. Int. 168 (2007) 138–42.

doi:10.1016/j.forsciint.2006.07.003.

[26] M.D. Pérez-Cárceles, S. del Pozo, A. Sibón, J.A. Noguera, E. Osuna, M.A.

Vizcaya, A. Luna, Serum biochemical markers in drowning: diagnostic efficacy

of Strontium and other trace elements., Forensic Sci. Int. 214 (2012) 159–66.

doi:10.1016/j.forsciint.2011.07.047.

[27] J. Schopf, B. Packer, Early Archean (3.3-billion to 3.5-billion-year-old)

microfossils from Warrawoona Group, Australia, Science (80-. ). 237 (1987) 70–

73. doi:10.1126/science.11539686.

[28] S. Bengtson, V. Belivanova, B. Rasmussen, M. Whitehouse, The controversial

“Cambrian” fossils of the Vindhyan are real but more than a billion years older.,

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (2009) 7729–7734.

58

doi:10.1073/pnas.0812460106.

[29] J.E. Graham, L.W. Wilcox, L.E. Graham, Algae (2nd Edition), Benjamin

Cummings, 2009.

[30] F.E. Round, R.M. Crawford, D.G. Mann, Diatoms: Biology and Morphology of

the Genera, Cambridge University Press, 2007.

[31] V. Revenstorf, Der Nachweis der aspirierten Etränkungsflüssigkeit als Kriterium

des Todes durch Etrinken., Vereteljahresschs Geritchl. Med. Off. Sanitaetswes.

27 (1904) 274–279.

[32] M. Ming, X. Meng, E. Wang, Evaluation of four digestive methods for extracting

diatoms., Forensic Sci. Int. 170 (2007) 29–34.

doi:10.1016/j.forsciint.2006.08.022.

[33] B. Ludes, M. Coste, N. North, S. Doray, A. Tracqui, P. Kintz, Diatom analysis in

victim’s tissues as an indicator of the site of drowning., Int. J. Legal Med. 112

(1999) 163–6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10335878 (accessed

February 22, 2011).

[34] L. Vörös, ed., Balatoni Természetkalauz, MTA Balatoni Limnológiai

Kutatóintézet, Tihany, 2011.

[35] D.G. Mann, P. Vanormelingen, An Inordinate Fondness? The Number,

Distributions, and Origins of Diatom Species, J. Eukaryot. Microbiol. 60 (2013)

414–420. doi:10.1111/jeu.12047.

[36] A. Auer, M. Möttönen, Diatoms and drowning., Zeitschrift Fur Rechtsmedizin. J.

Leg. Med. 101 (1988) 87–98. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3188674.

[37] N.K. Ibrahim, F.B. Mustafa, Spatial and Temporal Variations of Silica in a

Disturbed Tropical River Basin, Sains Malaysiana. 39 (2010) 189–198.

[38] A.J. Peabody, Diatoms in forensic science, Forensic Sci. Soc. 17 (1977) 81–87.

doi:10.1016/S0015-7368(77)71130-2.

[39] E.J. Armstrong, K.L. Erskine, Water-Related Death Investigation: Practical

Methods and Forensic Applications, CRC Press, 2010.

[40] M.K. Thakar, R. Singh, Diatomological mapping of water bodies for the

diagnosis of drowning cases., J. Forensic Leg. Med. 17 (2010) 18–25.

doi:10.1016/j.jflm.2009.07.016.

[41] K. Verma, Role of Diatoms in the World of Forensic Science, J. Forensic Res. 4

(2013) 2–5. doi:10.4172/2157-7145.1000181.

[42] Y. Fukui, M. Hata, S. Takahashi, K. Matsubara, A new method for detecting

diatoms in human organs., Forensic Sci. Int. 16 (1980) 67–74.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7399380.

[43] E.J. Payne-James, A. Busuttil, W. Smock, eds., Forensic Medicine: Clinical and

59

Pathological Aspects, Greenwich Medical Media, 2002.

[44] E. Kakizaki, S. Kozawa, N. Imamura, T. Uchiyama, S. Nishida, M. Sakai, N.

Yukawa, Detection of marine and freshwater bacterioplankton in immersed

victims: Post-mortem bacterial invasion does not readily occur., Forensic Sci. Int.

(2011). doi:10.1016/j.forsciint.2011.03.036.

[45] B. Ludes, S. Quantin, M. Coste, P. Mangin, Application of a simple enzymatic

digestion method for diatom detection in the diagnosis of drowning in putrified

corpses by diatom analysis., Int. J. Legal Med. 107 (1994) 37–41.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7999644.

[46] T. Takeichi, O. Kitamura, Detection of diatom in formalin-fixed tissue by

proteinase K digestion., Forensic Sci. Int. 190 (2009) 19–23.

doi:10.1016/j.forsciint.2009.05.005.

[47] P.A. Díaz-Palma, A. Alucema, G. Hayashida, N.I. Maidana, Development and

standardization of a microalgae test for determining deaths by drowning.,

Forensic Sci. Int. 184 (2009) 37–41. doi:10.1016/j.forsciint.2008.11.015.

[48] R. Singh, Deepa, R. Kaur, Diatomological mapping of water bodies--a future

perspective., J. Forensic Leg. Med. 20 (2013) 622–5.

doi:10.1016/j.jflm.2013.03.031.

[49] M.S. Pollanen, C. Cheung, D. a Chiasson, The diagnostic value of the diatom test

for drowning, I. Utility: a retrospective analysis of 771 cases of drowning in

Ontario, Canada., J. Forensic Sci. 42 (1997) 281–5.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9068187.

[50] M.S. Pollanen, The diagnostic value of the diatom test for drowning, II. Validity:

analysis of diatoms in bone marrow and drowning medium., J. Forensic Sci. 42

(1997) 286–90. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9068188.

[51] B. Gylseth, G. Mowé, A. Watson, Diatoms in lung tissue, Lancet. 314 (1979)

1375. doi:10.1016/S0140-6736(79)92865-4.

[52] F. Bortolotti, G. Del Balzo, R. Calza, F. Valerio, F. Tagliaro, Testing the

specificity of the diatom test: search for false-positives., Med. Sci. Law. 51 Suppl

1 (2011) S7–S10. doi:10.1258/msl.2010.010057.

[53] B. Schellmann, W. Sperl, Diatomeen-Nachweis im Knochenmark (Femur)

Nichtertrunkener, Zeitschrift Für Rechtsmedizin. 83 (1979) 319–324.

doi:10.1007/BF01882178.

[54] V. Schneider, Bemerkungen zu der Arbeit von B. Schellmann und W. Sperl

“Diatomeen-Nachweis im Knochenmark (Femur) Nichtertrunkener,” Zeitschrift

Für Rechtsmedizin. 85 (1980). doi:10.1007/BF00201295.

[55] J. Payne-James, A. Busuttil, W. Smock, eds., Forensic Medicine: Clinical and

Pathological Aspects, 1st editio, Greenwich Medical Media, 2002.

[56] P. Lunetta, A. Miettinen, K. Spilling, A. Sajantila, False-positive diatom test: a

60

real challenge? A post-mortem study using standardized protocols., Leg. Med.

(Tokyo). 15 (2013) 229–34. doi:10.1016/j.legalmed.2013.03.002.

[57] T. Koseki, Fundamental examinations of experimental materials and control

animals on the diagnosis of death from drowning by the diatom method, Acta

Med Biol. 15 (1968) 207–219.

[58] A.M. Langer, A.D. Mackler, I. Rubin, E.C. Hammond, I.J. Selikoff, Inorganic

Particles in Cigars and Cigar Smoke, Science (80-. ). 174 (1971) 585–587.

doi:10.1126/science.174.4009.585.

[59] A. Morel, Y.-H. Ahn, F. Partensky, D. Vaulot, H. Claustre, Prochlorococcus and

Synechococcus: A comparative study of their optical properties in relation to

their size and pigmentation, J. Mar. Res. 51 (1993) 617–649.

doi:10.1357/0022240933223963.

[60] M. Kane, T. Fukunaga, H. Maeda, K. Nishi, The detection of picoplankton 16S

rDNA in cases of drowning., Int. J. Legal Med. 108 (1996) 323–6.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8793643 (accessed February 11, 2014).

[61] P. Fernández, L. Morales, C. Vázquez, A.M. Bermejo, M.J. Tabernero, HPLC–

DAD determination of opioids, cocaine and their metabolites in plasma, Forensic

Sci. Int. 161 (2006) 31–35. doi:10.1016/j.forsciint.2005.10.016.

[62] M. Mayer, A. Benko, A. Huszar, K. Sipos, A. Lajtai, A. Lakatos, Z. Porpaczy,

Simultaneous Determination of 4-Substituted Cathinones (4-MMC, 4-MEC and

4-FMC) in Human Urine by HPLC-DAD, J. Chromatogr. Sci. 51 (2013) 861–

866. doi:10.1093/chromsci/bms183.

[63] J. Hürlimann, P. Feer, F. Elber, K. Niederberger, R. Dirnhofer, D. Wyler, Diatom

detection in the diagnosis of death by drowning., Int. J. Legal Med. 114 (2000)

6–14. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11197630.

[64] P.F. Kemp, J.J. Cole, B.F. Sherr, E.B. Sherr, eds., Handbook of Methods in

Aquatic Microbial Ecology, CRC Press, 1993.

[65] B.A. Whitton, M. Potts, eds., The Ecology of Cyanobacteria: Their Diversity in

Time and Space, Springer Science & Business Media, 2000.

[66] L.M.L. Nollet, L.S.P. De Gelder, eds., Handbook of Water Analysis, Third

Edition, CRC Press, 2013.

[67] P.S. Walsh, D.A. Metzger, R. Higuchi, Chelex 100 as a medium for simple

extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material., Biotechniques.

10 (1991) 506–13. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1867860 (accessed

October 19, 2011).

[68] U. Nübel, F. Garcia-Pichel, G. Muyzer, PCR primers to amplify 16S rRNA genes

from cyanobacteria, Appl. Environ. Microbiol. 63 (1997) 3327–3332.

[69] F. Chen, K. Wang, J. Kan, D.S. Bachoon, J. Lu, S. Lau, L. Campbell,

Phylogenetic diversity of Synechococcus in the Chesapeake Bay revealed by

61

Rilbulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase (RuBisCO) large subunit

gene (rbcL) sequences, Aquat. Microb. Ecol. 36 (2004) 153–164.

doi:10.3354/ame036153.

[70] S. Abe, M. Suto, H. Nakamura, H. Gunji, K. Hiraiwa, T. Suzuki, T. Itoh, H.

Kochi, G. Hoshiai, A novel PCR method for identifying plankton in cases of

death by drowning., Med. Sci. Law. 43 (2003) 23–30.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12627677.

[71] L.-K. Kang, F.-H. Tsui, J. Chang, Quantification of diatom gene expression in

the sea by selecting uniformly transcribed mRNA as the basis for normalization.,

Appl. Environ. Microbiol. 78 (2012) 6051–8. doi:10.1128/AEM.00935-12.

[72] M.W. Fawley, K.P. Fawley, H.A. Owen, Diversity and ecology of small coccoid

green algae from Lake Itasca, Minnesota, USA, including Meyerella planktonica

, gen. et sp. nov, Phycologia. 44 (2005) 35–48. doi:10.2216/0031-

8884(2005)44[35:DAEOSC]2.0.CO;2.

[73] C.V. Moro, O. Crouzet, S. Rasconi, A. Thouvenot, G. Coffe, I. Batisson, J.

Bohatier, New design strategy for development of specific primer sets for PCR-

based detection of Chlorophyceae and Bacillariophyceae in environmental

samples, Appl. Environ. Microbiol. 75 (2009) 5729–5733.

doi:10.1128/AEM.00509-09.

[74] C. Blum, J. Shield, Toddler drowning in domestic swimming pools, Inj. Prev. 6

(2000) 288–290. doi:10.1136/ip.6.4.288.

[75] H. Donson, A. Van Niekerk, Unintentional drowning in urban South Africa: a

retrospective investigation, 2001-2005., Int. J. Inj. Contr. Saf. Promot. 20 (2013)

218–26. doi:10.1080/17457300.2012.686041.

[76] L. Quan, P. Cummings, Characteristics of drowning by different age groups., Inj.

Prev. 9 (2003) 163–8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12810745.

[77] A.D. Kiakalayeh, R. Mohammadi, D.S. Ekman, S.Y. Chabok, B. Janson,

Unintentional drowning in northern Iran: a population-based study., Accid. Anal.

Prev. 40 (2008) 1977–81. doi:10.1016/j.aap.2008.08.008.

[78] K. Ahlm, B.-I. Saveman, U. Björnstig, Drowning deaths in Sweden with

emphasis on the presence of alcohol and drugs - a retrospective study, 1992-

2009., BMC Public Health. 13 (2013) 216. doi:10.1186/1471-2458-13-216.

[79] P. Lunetta, M.P.H.G.S. Smith, F.T.P. Lillsunde, D.I.K. Valonen, F.T.I. Ojanperä,

Drowning under the influence of drugs and alcohol, (2013).

[80] S. Becker, S. Weng, Seasonal patterns of deaths in Matlab , Bangladesh, Int J

Epidemiol. 27 (1998) 814–823.

[81] E. Salib, Trends in suicide by drowning in the elderly in England and Wales

1979-2001., Int. J. Geriatr. Psychiatry. 20 (2005) 175–81. doi:10.1002/gps.1211.

[82] C. The Royal Life Saving Society, A profile of Ontario drowning and water-

62

related injuries, 1987-2004., The Drowning Report, Ontario. (2008).

http://www.lifesavingsociety.com/.

[83] T.R. Driscoll, Review of the role of alcohol in drowning associated with

recreational aquatic activity, Inj. Prev. 10 (2004) 107–113.

doi:10.1136/ip.2003.004390.

[84] M.M. Peden, K. McGee, The epidemiology of drowning worldwide, 10 (2003)

195–199.

[85] A. Iqbal, T. Shirin, T. Ahmed, S. Ahmed, N. Islam, A. Sobhan, A.K. Siddique,

Childhood mortality due to drowning in rural Matlab of Bangladesh: magnitude

of the problem and proposed solutions., J. Health. Popul. Nutr. 25 (2007) 370–6.

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2754022&tool=pmce

ntrez&rendertype=abstract (accessed October 18, 2014).

[86] W.R. Pitt, K.P. Balanda, Childhood drowning and near-drowning in Brisbane:

the contribution of domestic pools., Med. J. Aust. 154 (1991) 661–5.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2034145 (accessed October 18, 2014).

[87] L. Yang, Q.-Q. Nong, C.-L. Li, Q.-M. Feng, S.K. Lo, Risk factors for childhood

drowning in rural regions of a developing country: a case-control study., Inj.

Prev. 13 (2007) 178–82. doi:10.1136/ip.2006.013409.

[88] T.J. Pikora, R. Braham, C. Hill, C. Mills, Wet and wild: results from a pilot study

assessing injuries among recreational water users in Western Australia., Int. J.

Inj. Contr. Saf. Promot. 18 (2011) 119–26. doi:10.1080/17457300.2010.540333.

[89] E. Kakizaki, S. Kozawa, H. Matsuda, E. Muraoka, T. Uchiyama, M. Sakai, N.

Yukawa, Freshwater bacterioplankton cultured from liver, kidney and lungs of a

decomposed cadaver retrieved from a sandy seashore: possibility of drowning in

a river and then floating out to sea., Leg. Med. (Tokyo). 12 (2010) 195–9.

doi:10.1016/j.legalmed.2010.03.008.

[90] P. Cummings, B.A. Mueller, L. Quan, Association between wearing a personal

floatation device and death by drowning among recreational boaters: a matched

cohort analysis of United States Coast Guard data., Inj. Prev. 17 (2011) 156–9.

doi:10.1136/ip.2010.028688.

[91] H. Cattell, Suicide in the elderly, Adv. Psychiatr. Treat. 6 (2000) 102–108.

doi:10.1192/apt.6.2.102.

[92] F. He, D. Huang, L. Liu, X. Shu, H. Yin, X. Li, A novel PCR-DGGE-based

method for identifying plankton 16S rDNA for the diagnosis of drowning.,

Forensic Sci. Int. 176 (2008) 152–6. doi:10.1016/j.forsciint.2007.08.005.

[93] V. V Vavilova, W.M. Lewis, Temporal and altitudinal variations in the attached

algae of mountain streams in Colorado, (1999) 99–106.

[94] P. Tiselius, B. Kuylenstierna, Growth and decline of a diatom spring bloom

phytoplankton species composition, formation of marine snow and the role of

heterotrophic dinoflagellates, J. Plankton Res. 18 (1996) 133–155.

63

doi:10.1093/plankt/18.2.133.

[95] M. Funayama, S. Mimasaka, M. Nata, M. Hashiyada, Y. Yajima, Diatom

numbers around the continental shelf break., Am. J. Forensic Med. Pathol. 22

(2001) 236–8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11563730 (accessed July 3,

2014).

[96] F. Watermann, H. Hillebrand, G. Gerdes, W.E. Krumbein, U. Sommer,

Competition between benthic cyanobacteria and diatoms as influenced by

different grain sizes and temperatures, Mar. Ecol. Prog. Ser. 187 (1999) 77–87.

doi:10.3354/meps187077.

[97] P.D. Redekar, A.B. Wagh, Relationship of fouling diatom number and

chlorophyll-a value from Zuari estuary , Goa ( West coast of India ), Seaweed

Res. Utiln. 22 (2000) 173–181.

64

8. PUBLIKÁCIÓK LISTÁJA

I. A disszertáció alapjául szolgáló közlemények

Rácz, E., Könczöl, F., Mészáros, H., Kozma, Z., Mayer, M., Porpáczy, Z., Poór, V.S.,

Sipos, K. (2015). Drowning-related fatalities during a 5-year period (2008–2012) in

South-West Hungary – A retrospective study. J Forensic Legal Med, 31, 7–11.

doi:10.1016/j.jflm.2015.01.001 IF: 0,870

Rácz, E., Könczöl, F., Tóth, D., Patonai, Z., Porpáczy, Z., Kozma, Z., Poór, V.S., Sipos,

K. (2016). PCR-based identification of drowning: four case reports, Int J Legal Med.

doi:10.1007/s00414-016-1359-7 IF: 2,862

Összes impakt faktor: 3,732

II. Egyéb közlemények

Poór, V.S., Lukács, D., Nagy, T., Rácz, E., Sipos, K. The rate of RNA degradation in

human dental pulp reveals post-mortem interval, Int J Legal Med. 130 (2016) 615–619.

doi:10.1007/s00414-015-1295-y. IF: 2,862

Simon, G., Rácz E., Mayer, M., Heckmann, V., Tóth, D., Kozma Zs. (2016) Suicide by

Intentional Air embolism, J For Sci. doi:10.1111/1556-4029.13320 IF: 1,322

Közlemények összes impakt faktora: 7,916

65

III. Konferenciaszereplések

Poszterek

2010. május 18-21. Poór V.S., Pandur E., Nagy J., Rácz E., Miseta A., Sipos K.: A

hepcidin és az alfa-1 savas glikoprotein interakciója

Megjelenés: 40. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg

2012. május 15-18. Pandur E., Rácz E., Rapp J., Poór V.S., Sipos K.: A

vasanyagcserében szerepet játszó gének expressziós vizsgálata

SHSY5Y neuroblasztóma sejtvonalban

Megjelenés: 42. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg

2013. május 21-24. Rácz E., Poór V. S., Pandur E., Patonai Z., Könczöl F., Porpáczy

Z., Sipos K.: Egy különleges vízbefulladásos eset diagnózisának

igazolása PCR alapú módszerrel

Megjelenés: 43. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg

2013. május 21-24. Poór V.S., Lukács D., Frank D., Rácz E., Sipos K.: RNS

degradáció vizsgálata fog pulpában

Megjelenés: 43. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg

2014. május 20-23. Pandur E., Marton M., Tamási K., Varga E., Dudás R., Rácz E.,

Miseta A., Sipos K.: A vasanyagcserét befolyásoló gének mRNS

expressziós vizsgálata SH-SY5Y neuroblasztóma és differenciált

SH-SY5Y sejteken

Megjelenés: 44. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg

2014. május 20-23. Rácz E., Pandur E., Varga E., Poór V.S., Könczöl F., Simon G.,

Tóth D., Sipos K.: A diatóma teszt csapdái és egy lehetséges

megoldás

Megjelenés: 44. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg

66

2014. május 20-23. Varga E., Pandur E., Marton M., Tamási K., Júlia K., Rácz E.,

Márton J., Sipos K.: A THP-1 monocita/makrofág sejtvonal

vasanyagcseréjének vizsgálata

Megjelenés: 44. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg

2015. május 19-22. Pandur E., Marton M., Tamási K., Varga E., Dudás R., Rácz E.,

Miseta A., Sipos K.: Bakteriális sejtfalalkotó lipopoliszacharid

(LPS) és lipoteichoic sav (LTA) hatása a humán neuroblasztóma

SHSY-5Y sejtvonal vasanyagcseréjére

Megjelenés: 45. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg

2015. május 19-22. Poór V.S., Rácz E., Sipos K.: Igazságügyi DNS minták stabilitása

különböző körülmények között

Megjelenés: 45. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg

Előadások

2010 Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar,

Tudományos Diákköri Konferencia

2010 Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Tudományos

Diákköri Konferencia

2010 Sipos K., Poór V. S., Rácz E., Porpáczy Z., Huszár A.: Molekuláris

biológiai módszer vízbefulladás bizonyítására

Magyar Igazságügyi Orvosok Társaságának XIV. Konferenciája

2011 Pécsi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar,

Tudományos Diákköri Konferencia

2012 Pécsi Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Tudományos

Diákköri Konferencia

2014 Rácz E., Márton J., Angyal M., Kricskovics A., Bozó Cs., Ujvári

Zs., Sipos K.: A holttest fekvésének hatása a talaj

mikrobiológiájára

Fiatal Igazságügyi Orvosszakértők Fóruma, Hosszúhetény

67

2014 Kricskovics A. (társszerzőként Rácz E.): A talaj szerves nitrogén

tartalmának változása a fekvési idő függvényében

Fiatal Igazságügyi Orvosszakértők Fóruma, Hosszúhetény

2015 Kricskovics A., Angyal M., Árvay Gy., Rácz E., Porpáczy Z.,

Bozó Cs., Újvári Zs., Sipos K.: Pilot kísérlet Sus scrofa domestica

tetem forenzikus ökológiai szempontú vizsgálatára

Magyar Parazitológusok Társasága Jubileumi Konferencia

2015 Rácz, E., Könczöl, F., Mészáros, H., Kozma, Zs.,Tóth, D., Simon,

G., Sipos, K.: Drowning-related fatalities during a 5-year period

(2008–2012) in South-West Hungary

7th International Student Medical Congress Košice (ISMCK 2015)

2015 Tóth D. (társszerzőként Rácz E.): A vízbefulladás bizonyítása

molekuláris biológiai módszerekkel

MIOT Konferencia 2015, Debrecen

2016 Poór V. S., Rácz E., Simon G., Heckmann V., Sipos K., Kozma

Zs.: Vízbefulladás? - Új diagnosztikai módszerek bemutatása egy

eseten keresztül

Magyar Igazságügyi Orvosok Társasága (MIOT) kazuisztikai

tudományos nap (Budapest)

68

9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Jelen munkámat a PTE ÁOK Igazságügyi Orvostani Intézetben végeztem. 2009-

ben kezdtem a témával foglalkozni Tudományos diákköri munka keretében, amelyet

később PhD hallgatóként folytattam. Ez alatt az idő alatt témavezetőm, dr. Sipos Katalin

és állandó munkatársam, Poór Viktor Soma segítették a munkámat, és lehetővé tették

számomra a megfelelő kutatási téma megtalálását és elvégzését, valamint

iránymutatásukkal és szakmai tanácsaikkal támogatták a munka előrehaladását. Emiatt

köszönettel tartozom nekik.

Hálával tartozom dr. Könczöl Franciska docens asszonynak, aki ez idő alatt az

intézet vezetője volt, és aki lehetővé tette számomra, hogy az intézetben végezhessem

kutatómunkámat. Fontos megerősítés volt számomra, hogy mindvégig támogatott abban

az elképzelésben, hogy ennek a témának helye van az igazságügyi orvostanban.

Köszönetet szeretnék mondani a Balatoni Limnológiai Kutatóintézet minden

Munkatársának, akik többek között a kísérletek elindításához szükséges algatörzseket

biztosították számomra. Kiemelt hálával tartozom Vörös Lajos Professzor Úrnak, aki két

rövid tanulmányutam alatt számos értékes szakmai tanáccsal látott el, sokszor éjszakákba

nyúlóan foglalkozott a felmerült problémáimmal és szakmai tanácsaival számos ponton

előrelendítette a kutatás előrehaladását. Köszönöm Tugyi Nórának, hogy eligazított az

alga-mikroszkopizálás világában, segített meghatározni a fajokat és elkészíteni a

mikroszkópos fotókat a dolgozatomhoz.

Köszönöm továbbá dr. Kozma Zsolt kinevezett intézetvezető úrnak, dr.

Bajnóczky István†, dr. Simon Gábor, dr. Tóth Dénes, dr. Mayer Mátyás, dr. Porpáczy

Zoltán, dr. Heckmann Veronika, dr. Jegesy Andrea†, dr. Patonai Zoltán, Nagy Gergely,

Dömse Angéla, dr. Pauka Dénes, dr. Pandur Edina, Tamási Kitti, Varga Edit és Wéber

Tünde munkatársaimnak a segítségüket és a baráti légkört, amelyet az évek alatt

teremtettek.

Köszönettel tartozom Pohner Zsuzsannának (ELTE, Mikrobiológiai Tanszék),

amiért megosztotta velem tapasztalatait a diatóma DNS izolálás rejtelmeivel

kapcsolatban.

Nem utolsó sorban szeretnék köszönetet mondani Mirkónak és a Családomnak;

megértő türelmük, támogatásuk, szeretetük nélkül nem jutottam volna idáig.

Köszönöm szépen!

69

FÜGGELÉK

F/1. táblázat

A vízbefulladások számának változása a Dél-Dunántúlon (2008-2012).

Korcsoport Férfiak Nők Mindkettő együtt

Esetszám % Esetszám % Esetszám %

0-10 1 0,88 0 0 1 0,88

11-20 12 10,53 1 0,88 13 11,40

21-30 7 6,14 0 0 7 6,14

31-40 10 8,77 3 2,63 13 11,40

41-50 8 7,02 4 3,51 12 10,53

51-60 21 18,42 10 8,77 31 27,19

61-70 13 11,40 7 6,14 20 17,54

71-80 6 5,26 5 4,39 11 9,65

81-90 1 0,88 3 2,63 4 3,51

nem meghatározható 2 1,75 0 0 2 1,75

Összesen 81 71,05 33 28,95 114 100

F/2. táblázat

A vízbefulladásos esetek nemenkénti és korcsoportonkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (2008-

2012).

Évek Esetszám %

2008 12 10,53

2009 25 21,93

2010 21 18,42

2011 28 24,56

2012 26 22,81

Ismeretlen 2 1,75

Összesen 114 100

70

0,20‰ alatt (20 mg%) az alkoholfogyasztás nem bizonyítható

0,21-0,50‰ (21-50 mg%) fogyasztott alkoholt, de alkoholosan nem volt befolyásolt

0,51-0,80‰ (61-80 mg%) igen enyhe

0,81-1,50‰ (81-150 mg%) enyhe

1,50-2,50‰ (150-250 mg%) közepes

2,51-3,50‰ (251-350 mg%) súlyos

3,50‰ felett (351 mg%) igen súlyos fokú alkoholos befolyásoltság

F/3. táblázat

Az alkoholos befolyásoltság vizsgálata során figyelembe vett határértékek Magyarországon

(Országos Igazságügyi Orvostani Intézet, 13. módszertani levél).

Évszak Esetszám %

tavasz 29 25,44

nyár 56 49,12

ősz 13 11,40

tél 12 10,53

ismeretlen 4 3,51

Összesen 114 100

F/4. táblázat

A vízbefulladásos esetek évszakonkénti megoszlása a Dél-Dunántúlon (2008-2012).

Vízbefulladás

helyszíne Esetszám %

tó 42 34,21

folyó 39 36,84

patak 6 5,26

árok 3 2,63

otthon* 8 7,02

kút 8 7,02

egyéb 8 7,02

Összesen 114 100

F/5. táblázat

A dél-dunántúli vízbefulladások helyszínei (2008-2012).

* Kivéve kút (ld. külön kategóriaként).

71

Vízbe

kerülés oka Férfiak Nők Esetszám %

öngyilkosság 4 11 15 13,16

emberölés 1 1 2 1,75

baleset 53 15 68 59,65

ismeretlen 23 6 29 25,44

Összesen 81 33 114 100

F/6. táblázat

A vízbe kerülés oka a dél-dunántúli vízbefulladásos halálesetek körében (2008-2012).