หมวดท ๑ ขอมลทวไป

วชา TA 445 เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

(Plant Tissue Culture for Agricultural Technology)

รวบรวมโดย

ดร. เพชรรตน จนทรทณ

สาขาเทคโนโลยการเกษตร

คณะเทคโนโลยและนวตกรรม

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

เอกสารประกอบการสอน

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

ค ำน ำ

เอกสารประกอบการบรรยายรายวชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอ

การเกษตร รหสวชา TA 445 ไดเกดจากการคนควา หนงสอ เอกสาร ต าราเรยน แนวคด

และทฤษฎจากผเขยนผทรงคณวฒหลายทาน รวมถงองคความรตาง ๆ ทรวบรวมขน

เพอใหเกดความสมบรณในเนอหาและเปนประโยชนตอการศกษาของนกศกษามากทสด

อนง เอกสารประกอบการบรรยายรายวชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพช

เพอการเกษตร รหสวชา TA 445 เลมน เปนเพยงสวนหนงทใชเพอประกอบการเรยนการ

สอนเทานน นกศกษาควรศกษาและคนควาเพมเตมจากแหลงความรตางๆ ซงจะท าให

นกศกษาไดมความเขาใจในในเนอหามากยงขน

รวบรวมโดย ดร. เพชรรตน จนทรทณ

สาขาเทคโนโลยการเกษตรคณะเทคโนโลยและนวตกรรม

มนาคม 2556

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

สารบญ

บทท 1 ประวต และความส าคญ ของการเพาะเลยงเนอเยอพช 1-6

บทท 2 หองปฏบตการ วสดอปกรณทเกยวของกบการเพาะเลยงเนอเยอพช 7-16

บทท 3 เทคนคการท าใหปลอดเชอจลนทรย 17-25

บทท 4 อาหารเพาะเลยงเนอเยอพชและการเตรยมอาหาร 26-38

บทท 5 เทคนคการเตรยมชนสวนของพชและการแยกเนอเยอพช 39-51

บทท 6 ขนตอนของการเพาะเลยงเนอเยอพช 52-64

บทท 7 การเจรญและการพฒนาของเนอเยอพชในสภาพเพาะเลยง 65-79

บทท 8 การเพาะเลยงเนอเยอพชกบการถายยนในพช 80-88

บทท 9 แนวทางการเพาะเลยงเนอเยอพชสมนไพรเพอผลตสารทตยภม 89-92

บทท 10 ปญหาทพบส าหรบการผลตพชเพอการคาดวยวธเพาะเลยงเนอเยอพช 93-107

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

บทท 1

ความหมาย ประวต และความส าคญ ของการเพาะเลยง

เนอเยอพช

ความหมาย

การเพาะเลยงเนอเยอพชคอ วธการขยายพนธพชวธหนง ดวยการน าชนสวนของพชทยงมชวตอย ไดแก ปลายยอด ตาขาง กานชอดอก ใบ กานใบ ล าตน อบละอองเกสร เมลด เปนตน มาเพาะเลยงลงบนอาหารสงเคราะหในสภาพปลอดเชอทมการควบคมสภาพแวดลอม เชน อณหภม และแสง โดยชนสวนของพชนนสามารถ เจรญเตบโตและพฒนาไปเปนตนพชทสมบรณ ซงมทงสวนใบ ล าตน และรากทสามารถยายออกปลกในสภาพธรรมชาตได

ประวต

การน าชนสวนพชมาเพาะเลยงเพอบงคบใหมการเจรญเตบโตตามทตองการในสภาพปลอดเชอ หรอการเพาะเลยงเนอเยอพช จากหลกการในทฤษฎเซล ของ Schleiden (1838)and Schwann (1839) ทกลาวถงคณสมบตของเซลลแตละเซลลของสงมชวตมความสามารถทจะพฒนาไปเปนสงมชวตทสมบรณใหมไดอก เมออยสภาพแวดลอมทเหมาะสม ความสามารถดงกลาวของเซลลนนถกเรยกภายหลงโดย Morgan (1901) วา potipotency แนวคดนไดรบความสนใจมากจากนกพฤกษศาสตร ซงไดเรมตนในป ค.ศ.1902 เมอ Gottieb Haberlandt นกพฤกษศาสตรชาวเยอรมน ซงตอมาไดรบการยกยองวาเปนบดาของการเพาะเลยงเนอเยอพช ไดน าเซลลจากใบเลยงมาเลยงในอาหารเพอใหเซลลมการแบงตวและสามารถทจะเกดตนใหมทสมบรณโดยอาศยคณสมบตของเซลลดงกลาว แตพบวาเซลลมการขยายขนาดอยางเดยวและไมสามารถพฒนาไปเปนตนได เนองจากในเวลานนยงไมมการคนพบสารควบตมการเจรญเตบโตของพช ในป ค.ศ.

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

2

1930 ไดมการเพาะเลยงเซลลจากรากพชหลายชนดในสภาพปลอดเชอ จนกระทงในป ค.ศ. 1938 สามารถเพาะเลยงอวยวะและแคลลส ( Callus ) ของพชไดหลายชนด และตอมาไดมการคนพบสารควบคมการเจรญเตบโตหลายชนด เชน สารกลม cytokinin เชน kinetin (6-furfurylamonopurine) และ BA (6-benzylaminopurine) และมนกวทยาศาสตรอกหลายทานทพยายามพฒนาสตรอาหารตางๆ เชน สตรอาหาร Vacin and Went (1949) สตรอาหาร Murashige and Skoog (1962) สตรอาหาร Gamborg และคณะ (1968) สตรอาหารของ Chu และคณะ (1975) และสตรอาหารของ Schenk and Hildebrandt (1972) ซงเปนสตรอาหารส าหรบเพาะเลยงเนอเยอพชอกหลายชนด ทมการใชกนแพรหลายในปจจบน นบตงแตนนเปนตนมา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชไดมการพฒนาไปอยางกวางขวาง มการคนพบเทคนคใหมๆอกมากมาย ซงสามารถท าการเพาะเลยงพชเซลลเดยวและ โปรโตพลาสตของพชไดหลายชนด รวมถงการน าเทคโนโลยชวภาพ เชน การถายยนในพชเขามารวมดวยโดยใชเทคนคการเพาะเลยงเนอเยอพชเปนพนฐาน จงท าใหเทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอมบทบาทส าคญตอวทยาการแขนงอนๆ เชน ชวเคม พนธศาสตร การปรบปรงพนธพช โรคพช และเภสชศาสตร เปนตน (รงสฤษด, 2540; อารย, 2541)

ความส าคญของการเพาะเลยงเนอเยพช

เทคนคการเพาะเลยงเนอเยอพชไดถกน ามาประยกตใชกบงานทางดานชววทยาและเภสชวทยา เกษตรกรรม อตสาหกรรม และการแพทย ซงเทคนคดงกลาวมประโยชนดงน (กรมสงเสรมการเกษตร, 2556; อรด, 2542; อารย, 2541)

1. การขยายพนธพช (plant propagation)

เปนการน าขนสวนมาเลยงในสภาพปลอดเชอเพอเพมปรมาณ โดยมการพฒนาสตรอาหารทสามารถเพมจ านวนตนเปนทวคณ เรมตนพชทไดจากการเพาะเลยงเนอเยอพชเพยง 1 ตน และท าการยายเนอเยอ (subculture) เดอนละ 1 ครงในแตละเดอน ท าใหสามารถผลตตนพชไดถง 100,000-1,000,000 ตนในระยะเวลา 1 ป ซงเปนการขยายพนธพชทรวดเรว ปจจบนมการใชเพอผลตพชในเชงการคาอยางกวางขวาง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

3

2. การปรบปรงพนธพชและการคดเลอกสายพนธพช

ในดานการปรบปรงพนธพช สามารถน าเทคนคดงกลาวมาใชประโยชนในการปรบปรงพนธและคดเลอกสายพนธพชเพอผลตพชพนธตานทาน (resistant plant)โดยการเพาะเลยงในอาหารทมสภาวะตาง ๆ กจะสามารถคดเลอกสายพนธกลายได เชน การสรางพนธพชตานทานตอสารพษของเชอสาเหตโรค ตานทานตอแมลง หรอตานทานตอสารก าจดวชพช เปนตน หรอเพอการผลตพชพนธทนทาน (tolerance plant) โดยการคดสายพนธพชทนทานไดจากการเพาะเลยงในอาหารและสภาวะแวดลอมตางๆทก าหนด เชน การคดเลอกสายพนธพชทนเคมจากการเลยงเนอเยอในอาหารทมสวนผสมของเกลอ การคดเลอกสายพนธทนตอดนเปรยวจากการเลยงในอาหารทมสภาพเปนกรด การคดสายพนธททนรอนโดยการเพาะเลยงในสภาพทมอณหภมสง เปนตน นอกจากนยงสามารถใชเทคนคดงกลาวเพอชกน าใหเกดการกลายพนธ แลวคดเลอกเอาสายพนธดไว ซงอาจท าไดโดยการใชสารเคม การฉายรงส การตดตอยน (DNA ricombination) และการยายยน (gene transformation) เพอสรางพชสายพนธใหม (transgenic plants) ทตองการในพชบางชนด รวมทงในขนตอนของการเพาะเลยงในอาหาร เมอเนอเยอพชถกเลยงและยายอาหารไประยะเวลานานอาจจะมการเปลยนแปลงทางพนธกรรมทเรยกวา somaclonal variation สายพนธเซลลทกลายไปอาจจะเปนประโยชน เชน สายพนธมะเขอเทศทมน าในผลนอย จะเปนผลดตออตสาหกรรมการผลตซอส ซงจะชวยลดเวลาและคาใชจายในการลดปรมาณน าในผลตภณฑ

3. เพอการผลตพชทปลอดเชอไวรส (Virus-free plant propagation)

ปญหาส าคญของการผลตพช คอ โรค ซงอาจมสาเหตมาจากเชอรา แบคทเรย หรอไวรส ดงนนตนพชทผลตไดจากการเพาะเลยงเนอเยอพชจะปราศจากเชอราและแบคทเรย เปนอนดบแรกเนองจากในอาหารเพาะเลยงเนอเยอจะแสดงอาการปนเปอนของเชอ (contamination) ดงกลาวโดยจะแสดงกลม colony ของแบคทเรยหรอสปอรของเชอราใหเหนไดดวยตาเปลา ซงสามารเกบออกมาและท าการก าจดทงไป สวนกรณการปนเปอนของเชอไวรส ซงมอนภาคขนาดเลกมากและสามารถด ารงชวตอยไดกตอเมออาศยอยในเซลลสงมชวตชนดอนเทานน ซงตนพชทมการปนเปอนของเชอไวรสจะไมแสดงอาการปนเปอนบนอาหารใหเหน แตจะทราบไดกตอเมอเกดอาการบนตนพชเทานน ดงนนกอนท าการเพาะเลยงเนอเยอพชตองมการคดเลอกและตรวจสอบ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

4

เนอเยอหรอชนสวนของพชเพอใหปลอดจากเชอไวรสมากทสด โดยการใชสวนของ meristem ซงเปนเนอเยอเจรญทอยบรเวณปลายยอด หรอเนอเยอของคพภะ (embryo) ทอยในเมลด ซงเนอเยอดงกลาวไมมทอล าเลยงน า(xylem) และอาหาร(phloem) ทจะตดตอกบสวนอน ๆ ของตนพช ดงนนอนภาคของไวรสจงไมสามารถเขาไปได

4. การผลตสารทตยภม (Secondary metabolite)

พชบางชนดสามารถใหสารทมคณสมบตทางยา หรอมประโยชนทางดานเภสชกรรม อตสาหกรรม รวมทงการแพทย แตในบางครงปรมาณสารทตองการมอยในปรมาณนอยมาก และการเกบพชสมนไพรออกมาจากปาเปนจ านวนมากและบอยครง อาจท าใหสมนไพรนนสญพนธไป จงตองใชเทคนคการเพาะเลยงเซลลหรอเนอเยอพชมาชวยในการผลตเพอลดการเกบสมนไพรออกจากปา โดยน าชนสวนพชมาเลยงในสภาพแวดลอมและอาหารทเหมาะสมกอาจชกน าใหเกดการสงเคราะหสารทตองการไดมากขน ตนพชทไดในหลอดทดลองนนสามารถน ามาศกษาทางชวเคมและสรรวทยาของพช เพอทจะสามารถตดตามการพฒนาและการเปลยนแปลงไดงาย เชน การศกษาการตอบสนองของเนอเยอพชตอสารฆาแมลง ยาปราบศตรพช หรอตอสารควบคมการเจรญเตบโตของพช และการควบคมตวแปรตาง ๆ ในหลอดทดลอง จะท าไดงายไดกวาตนพชทปลกในสภาพธรรมชาต

5. เพอการเกบรกษาพนธพช (Germplasm conservation, gene bank)

ปจจบนมพชพรรณหลายชนดไดสญพนธไปหรอก าลงจะสญพนธ ซงอาจมสาเหตมาจากการเปลยนแปลงของสภาวะแวดลอมหรอเกดจากการท าลายของมนษยเอง ดวยเหตนนกเพาะเลยงเนอเยอพชจงไดพยายามคดหาวธทจะเกบรกษาพชพรรณตาง ๆ ไวในหลอดทดลอง โดยการเพาะเลยงเนอเยอในอาหารทมสวนผสมของสารชะลอการเจรญเตบโตบางชนด หรอมสารทท าใหเกดความเครยดของน าขนในหลอดทดลอง ท าใหพชมการเจรญเตบโตในอตราทชามาก ๆ เพอเปนการประหยดแรงงาน เวลา และอาหารในการทจะตองท าการยายเนอเยอพชบอย ๆ จนกวาเมอใดทตองการจะเพมปรมาณเนอเยอนนสามารถยายลงเลยงในอาหารสตรปกตของพชชนดนน ๆ อกวธหนงกคอ การเกบรกษาเนอเยอพชไวในไนโตรเจนเหลวท อณหภมต าถง -196 oC ในสภาพเชนนเซลลและเนอเยอจะคงสภาพและมชวตอยไดยาวนาน

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

5

6. เพอการแลกเปลยนพนธพชระหวางประเทศ

การเกบรกษาสายพนธพชในรปแบบตางๆ เชน เมลดเซลลเพาะเลยง เอมบรโอ หรอตนพชในหลอดทดลองท าใหสะดวกตอการแลกเปลยนพนธพชกบตางประเทศเพราะสะอาดปราศจากเชอโรค นอกจากการแลกเปลยนสายพนธพชแลว ปจจบนการผลตพชหลายชนดเพอการคาในตางประเทศหลายบรษททเปด website ทาง internet ซงเปนอกหนงชองทางการตลาด ไดมการซอขายพชในสภาพปลอดเชอในลกษณะของ tube หรอ flask ทท าดวยพลาสตก และมน าหนกเบาเพอลดคาใชจายในการขนสง ซงไมคอยมปญหาในการน าเขาพนธพช เนองจากตนพชอยในสภาพทปลอดเชอแลว ดงภาพท 1

ภาพท 1.1 ตนพชในหลอดทดลอง (tube) ทใชส าหรบแลกเปลยนพนธ

หรอซอ- ขายพนธพชระหวางประเทศ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

6

บรรณานกรม

รงสฤษด กาวตะ. 2540. การเพาะเลยงเนอเยอพช : หลกการและเทคนค. ภาควชาพชไรนา

คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. กรงเทพฯ. 219 หนา.

อรด สหวชรนทร. 2542. เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพช. ภาควชาพชสวน คณะเกษตร

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร

อารย วรญญวฒก. 2541. การเพาะเลยงเนอเยอเพอการปรบปรงพนธพช. มหาวทยาลยเทคโนโลย

สรนาร. นครราชสมา.

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

7

บทท 2

หองปฏบตการ วสดอปกรณทเกยวของกบการเพาะเลยง

เนอเยอพช

ปจจบนมหองปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอพชเกดชนหลายแหงทงในประเทศและตางประเทศ ซงไดมการสรางขนเพอท าการศกษาวจยและเพอการพาณชย ดงนนหองปฏบตการจงตองมความสะอาดและเปนหองทปลอดจากเชอจลนทรยมากทสด เพอไมใหเนอเยอพชทน ามาเพาะเลยงเกดการตายเพราะสาเหตจากการปนเปอนของเชอราหรอแบคทเรย ซงจะสงผลใหเหนถงความส าเรจของงานเพาะเลยงเนอเยอพชโดยเฉพาะการท าเพอเปนการคา หองปฏบตการทออกแบบไดด อาจมการปนเปอนเชอจลนทรยไมถง 1% สวนหองปฏบตการทออกแบบไมเหมาะสมอาจท าใหเกดการปนเปอนไดมากกวา 50% จะท าใหสญเสยแรงงาน เวลา และคาใชจายไปโดยไมจ าเปน อยางไรกตามการเลอกท าเลทจะสรางหองปฏบตการตองค านงถงสงตอไปนคอ

1. ควรเลอกท าเลทมฝนละอองนอยทสด และอยหางจากแหลงปนเปอนไดงาย ไมควรตงอยรมถนน หรอโรงงานอตสาหกรรมทท าใหเกดฝนผงมาก

2. ควรมระบบไฟฟาทด และควรมเครองก าเนดไฟฟาส ารอง (stand by generator) รวมทงมเครองตดไฟฟาอตโนมตในกรณทผดปกต เพอปองกนเครองใชไฟฟาตางๆเสยหาย เนองจากกระแสไฟฟาตกหรอกระชาก

3. ควรอยบรเวณทมแหลงน าสะอาด มระบบน าทดและเพยงพอส าหรบการปฏบตงาน

4. ควรเลยงพนท ทมความชนเกนไป เพราะความชนจะท าใหเกด การปนเปอนเชอจลนทรยไดคอนสงในการเพาะเลยง และควรหางไกลจากพนททมการเลยงสตว หรอโรงเรอนเพาะเหด

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

8

5. ควรอยในสถานททสามารถใชระบบควบคมอณหภมได

6. ควรหางจากจดทมการสญจรไปมาคบคง

การออกแบบหองปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอพช

การวางผงหองปฏบตการใหเหมาะสมนน ผออกแบบควรค านงถงวถการปฏบตงานโดยทวไปของการเพาะเลยงเนอเยอพช ซงสามารถแบงพนทออกเปนสวนๆ ไดดงน

1. หองส าหรบศกษาวจย จะใชเปนหองทมต ารา หรอเอกสารทางวชาการส าหรบการคนควาวจยและเขยนผลงาน ภายในหองอาจมคอมพวเตอรหรอเครองพมพ เพอเกบขอมล

2. หองส าหรบเตรยมอาหารและลางวสดอปกรณ จะแบงพนทส าหรบการปฏบตงานดงน

2.1 พนทส าหรบลางวสดอปกรณ ซงจะเปนบรเวณทใชส าหรบลางเครองมอ เครองใชและเครองแกวตางๆทใชในการเตรยมอาหารเพาะเลยงเนอเยอพช สวนนไมจ าเปนตองควบคมอณหภม และควรเปนพนทโลง อปกรณหลกส าหรบบรเวณนคอ อางซงคส าหรบลางภาชนะตางๆ และมตะแกรงตากส าหรบภาชนะหรอเครองแกวทลางเรยบรอยแลว ในสวนนอาจใชวางหมอนงความดน (autoclave) ส าหรบนงอาหารเพาะเลยงได และหมอนงความดนส าหรบขวดหรอภาชนะทมการปนเปอนจากเชอจลนทรย กอนทจะน าไปลางท าความสะอาด ดงนนพนและผนงควรใชวสดททนตอการเปยกชนสามารถลางท าความสะอาดงาย พนไมควรใชวสดทมลกษณะลนเพราะอาจเกดอนตรายได ทส าคญตองมทางระบายน าทตอเชอมลงกบระบบบ าบดน าเสย

2.2 พนทส าหรบเกบสารเคมและเครองแกวตางๆ ซงตองเปนพนทแหง มระบบระบายอากาศด เนองจากสารเคมบางชนดอาจมกลนรบกวนผปฏบตงาน หรอสารเคมบางชนดอาจเกดความชนได ควรมตส าหรบเกบสารเคมใหเปนหมวดหม ท าใหหยบใชไดงาย โดยตอาจวางกบพน หรอตดผนงกได พนทสวนนไมจ าเปนตองปรบอณหภมเนองจากสารเคมทใชในการเพาะเลยงเนอเยอสวนใหญสามารถเกบทอณหภมหองปกตไดแตไมควรใหแสงแดดสองผานเขามาโดยตรง เนองจากสารเคมบางชนดเสอมสภาพงายเมอโดนแสง ส าหรบสารเคมบางชนดทตองเกบอณหภมต าอาจใชตเยนแทนได

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

9

2.3 พนทส าหรบการเตรยมอาหารเลยงเนอเยอพช ควรเปนทแหงเชนกน แตอาจมอางซงคขนาดเลกได เพอความสะดวกในการปฏบตงาน เครองมอและอปกรณทตองใชมทงเครองมอทมความจ าเปนมาก ไดแก อปกรณส าหรบตวงปรมาตร ภาชนะส าหรบเตรยมและตกแบงอาหาร อปกรณทใหความรอนส าหรบตมวนใหละลาย อปกรณวดคาความเปนกรด-ดาง ตเยน และเครองมอทชวยในการอ านวยความสะดวกในการปฏบตงาน ไดแก ตอบความรอน เครองกรองน า ชดกรองพรอมแผนกรอง และอาจจะมโตะขนาดใหญส าหรบเตรยมอาหารและเตรยมสารละลาย stock solution (ภาพท 2.1)

ภาพท 2.1 พนทส าหรบการเตรยมอาหาร

3. หองส าหรบยายเนอเยอพช

พนทสวนนตองแหง มความสะอาด และปลอดเชอมากทสด ไมควรมลมโกรก ดงนนควรจะปดกนหองใหสนท และใหมคนผานเขาออกนอยทสดเทาทจ าเปน การปฏบตงานในพนทสวนนจะเปนการฟอกฆาเชอชนสวนพชเรมตน หรอการยายเปลยนอาหารเพาะเลยง ซงตองมเครองมอและอปกรณตางๆทจ าเปนมาก เชน ตยายเนอเยอ อปกรณประจ าตยายเนอเยอ สวนอปกรณทชวยในการอ านวยความสะดวก เชน กลองจลทรรศนเพอตรวจสอบเซลลและเนอเย อ และเครองหมนเหวยงเพอเกบรวมเซลลส าหรบวดปรมาณเซลล (ภาพท 2.2)

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

10

ภาพท 2.2 หองยายเนอเยอพช (บรษทแอรออรคด)

4. หองส าหรบเพาะเลยงเนอเยอพช ในการออกแบบหองนควรค านงถงอณหภม ความชนสมพทธ สภาพแสง และลกษณะชนวางตางๆ ซงสงตางๆเหลานขนอยกบขนาดของหอง ต าแหนงทตงของหอง และชนดของเนอเยอพชทเลยง ถาเปนหองปฏบตการทไมใหญนก หองนอาจจดอยรวมกบหองยายเนอเยอได ในท านองเดยวกนหองนตองมความปลอดเชอสงมากเชนกน และรกษาความสะอาดเปนพเศษ จงควรเปนหองทมคนผานนอยทสด โดยทวไปแลวหองเพาะเลยงควรเปนหองทปดสนทสามารถควบคมอณหภมได อาจออกแบบโดยใหมชองแสงธรรมชาตผานไดบาง แตไมควรมแสงแดดสองตรงมายงชนวางเนอเยอ เพราะแสงแดดจะท าใหอณหภมในขวดเพาะเลยงสงจนถงขนเปนอนตรายกบพชได (ภาพท 2.3)

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

11

ภาพท 2.3 หองปฏบตการทออกแบบโดยการใหมแสงจากธรรมชาตผานไดบาง

อปกรณและเครองมอทจ าเปนส าหรบการเพาะเลยงเนอเยอพช

1. หองเตรยมอาหาร ควรมอปกรณและเครองมอ ดงน

- เครองชง มทงแบบอยางหยาบ คอ ชงน าหนกต าสด 0.01 กรม และอยางละเอยดชงไดต าถง 0.001 กรม หรอ 0.0001 กรม

- ชอนตกสารเคม มทงแบบทเปนโลหะและทเปนพลาสตก

- เครองวดความเปนกรดเปนดาง

- เตาอนความรอนและเครองคน ใชส าหรบอนหรอหลอมอาหารพรอมดวยตวคนระบบแมเหลก

- เตาอบไมโครเวฟ ใชส าหรบเคยวหรอหลอมอาหาร นอกจากนสามารถใช เตาลวดความรอนหรอเตาแกสแทนได ในกรณทเตรยมอาหารคราวละมากๆ เตาแกสจะเหมาะสมกวา

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

12

- ตเยน สารเคมบางตวมความจ าเปนทจะตองเกบรกษาไวทอณหภมต า เพราะมฉะนนแลว จะท าใหเสอมคณสมบต ได เชน ฮอรโมน วตามน รวมทงสารละลายเขมขนของอาหาร

- เตาอบความรอน ใชส าหรบอบฆาเชอทตดมากบเครองมอ หรออปกรณทสามารถทนตอความรอนสงๆ ได เชน พวกทเปนเครองแกวและโลหะ โดยอาศยความรอนทใช คอ ประมาณ 180 เวลา oC นานประมาณ 3 ชงโมง

- หมอนงความดน ใชส าหรบนงฆาเชอในอาหารเพาะเลยงเนอเยอ และเครองมอทไมสามารถทนตอความรอนของเตาอบความรอนได ความดนทใชประมาณ 15 ปอนดตอตารางนว เวลานานประมาณ 15 นาท (ภาพท 2.4)

ก. ข.

ภาพท 2.4 หมอนงความดนไอน า

ก. แบบใชแกส ข. แบบใชไฟฟา

- เยอกรอง เนองจากมสารเคมบางชนดทไมสามารถผานการฆาเชอดวยหมอนงความดนได ท าใหเสอมคณภาพได จงตองกรองโดยมรกวางประมาณ 0.22 ไมครอน ซงสามารถกรองเอาอนภาคของแบคทเรยและสปอรของราได

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

13

- เครองแกวตางๆ เชน หลอดทดลอง ขวด ขวดรปชมพ ปเปต กรวยแกว แทงแกวคนสาร

2. หองยายเนอเยอพช ควรมอปกรณและเครองมอ ดงน

- ตยายเนอเยอ เปนตกรองอากาศใหบรสทธปลอดจากอนภาคของราและแบคทเรย

- ตะเกยง ใชตะเกยงแอลกอฮอล หรอแกส

- กระดาษกรอง

- จานแกว

- มดผาตดแบบตางๆ พรอมใบมด

- ปากคบ

3. หองเลยงเนอเยอพช ควรมอปกรณและเครองมอ ดงน

- เครองควบคมอณหภม ภายในหองจะตองมอณหภมประมาณ 25-27 oC

- ชนส าหรบวางขวดเลยงเนอเยอ ซงมขนาดทเหมาะสมสะดวกตอการท างานหรอตดตามการปนเปอนและการเจรญเตบโต ชนตองไมสงเกนไป ขนาดความสงของแตละชนควรสงประมาณ 18 นว และชนลางสดควรอยสงจากพนประมาณ 4 นว และตองมหลอดไฟใหแสงสวางดวยหลอดฟลออเรสเซนต ทใหความสวางประมาณ 1000-3,000 ลกซ

- เครองตงเวลา ใชส าหรบตงเวลาในการปดเปดไฟ เพอก าหนดความยาวของชวงแสง

- เครองเขยา ส าหรบเลยงเนอเยอพชในสภาพอาหารเหลว เพอใหชนสวนพชไดรบอากาศบาง เครองเขยามหลายแบบ และหลายขนาดใหเลอกใชงาน มทงทเปนการเขยาแบบแนวราบ (horizontal shaker) และแบบแนวนอน (vertical shaker) (ภาพท 2.5)

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

14

ภาพท 2.5 เครองเยา

ในการออกแบหองปฎบตการเพาะเลยงเนอเยอพชใหประสบความส าเรจ และเหมาะสมสามารถใชในการปฏบตงานไดจรงนนยงตองค านงถงเงนทนทใชดวย ซงการออกแบบหองปฏบตการเพอเชงการคากบหองปฏบตการเพองานวจยนนมความแตกตางกนมาก ดงนนผออกแบบตองท าความเขาใจกบจดนใหดเสยกอน

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

15

กจกรรม

นกศกษาฝกปฏบตออกแบบหองปฏบตการ โดยวาดแผนผง แสดงการแบงหองภายในหองปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอทช

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

16

บรรณานกรม

ค านญ กาญจนภม. 2542. การเพาะเลยงเนอเยอพช. ส านกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย.

กรงเทพฯ. 162 หนา.

สนธชย จนทรเปรม และ เสรมศร จนทรเปรม. 2549. เทคโนโลยชวภาพเพอการเกษตร. ในเอกสาร

ประกอบการฝกอบรมเชงปฏบตการ. คณะเกษตร ก าแพงแสน รวมกบศนย

เทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน, นครปฐม.

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

17

บทท 3

เทคนคการท าใหปลอดเชอจลนทรย

เทคนคการท าใหปลอดเชอจลทรย (Aseptic Technique) เปนเทคนคทมความส าคญอยาง

มากส าหรบการเพาะเลยงเนอเยอพช เรมตงแตหองปฏบตการเพาะเลยงโดยเฉพาะหองยายเนอเยอ

และหองเพาะเลยงเนอเยอพช ซงตองมความสะอาดอยตลอดเวลา มรองเทาและเสอกราวดทสะอาด

ส าหรบเปลยนกอนทจะเขาไปท างานเพอปองกนไมใหเชอจลนทรยจากภายนอกมาเปนสาเหตทท า

ใหเกดการปนเปอนได ประตหรอหนาตางควรปดสนทเพอปองกนฝละอองเขามา อปกรณตางๆท

เกยวของกบการเพาะเลยงเนอเยอควรเกบอยในตทมประตปดเพอปองกนฝนละอองเชนกน

อปกรณทส าคญและมความจ าเปนมากทสดส าหรบหองปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอพชคอ

ตปลอเชอ ซงมหลายแบบและมราคาแตกตางกนไปตงแตชนดทราคาถกสามารถใชงานไดใน

ระดบหนง จนถงชนดทมราคาแพงมากและใชกบงานบางประเภททมความจ าเพาะเจาะจงสง ต

ปลอดเชอทนยมใชกนในปจจบนเปนแบบ larminar air flow cabinet เนองจากราคาถกและงายตอ

การตดตง แตอยางไรกตามหลกการทวไปส าหรบตปลอดเชอคอ การเปาอากาศผานแผนกรองซงม

2 ชนดคอ แผนกรองหยาบ และแผนกรองละเอยดทมขนาดชองเปดเลกกวาขนาดของเชอจลนทรย

ซงแผนกรองละเอยดทนยมใชมากในปจจบนคอ HEPA filter (High Efficiency Particulate Air) ม

ขนาด 0.2 ไมโครเมตร ดงนนอากาศทไดจงสะอาดปราศจากเชอโรค 99.97% ความเรวลมทใชเปา

อากาศผานแผนกรองจะอยทประมาณ 90 ฟตตอนาท ภายในตยายเนอเยอจะมการตดตงหลอด UV

เพอใชส าหรบฆา เชอจลนทรย ดงนนกอนเขาปฏบตงานภายในต ตองเชดท าความสะอาดตปลอด

เชอดวยแอลกอฮอล 70% และเปด UV กอนประมาณ 30 นาท เพอฆาเชอจลนทรยใหหมดไป และ

เปดเครองเปาอากาศไว 15-30 นาท เพอไลอากาศเกาทคางอยภายในตใหหมด เมอปฏบตงานเสร

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

18

แลวกตองเชดท าความสะอาดและเปด UV ทงไว 30 นาทเชนกน (ค านณ, 2542; สนธชยและ

เสรมศร, 2549)

วธการท าใหปราศจากเชอจลนทรย

1. การฆาเชออาหารและภาชนะทใชส าหรบเพาะเลยง

อาหารทใช เพาะเลยงนนจ าเปนตองปลอเชอ เพราะในอาหารมสวนประกอบของ

สารอาหารและน าตาลทชวยใหเชอจลนทรยมการเจรญเตบโตไดด และเจรญเรวกวาเนอเยอพช ซง

อาจจะไปท าลายหรอยบยงการเจรญเตบโตของเนอเยอพช โดยการปลอยสารพษออกมาในอาหาร

ดงนนอาหารจงตองมความปลอดเชอกอนการน าไปใช โดยใชวธการฆาเชอดงน

1.1 การฆาเชอดวยความรอนชน (Moist heat sterilization)

แบบไมใชความดนไอน า (Sterilization by stream)

เปนการฆาเชอดวยไอน าเดอด เหมาะส าหรบการฆาเชอของ เหลว เชน อาหารเลยง

เพาะเลยงทไมตองการใหสารอาหารสญเสยคณคา โดยอณหภมทใชในการฆาเชอเทากบ 100 องศา

เซลเซยส นาน 1-1.5 ชวโมง ซงมงานวจยกบการเพาะเลยงกลวยไมพบวา การฆาเชอจลนทรยใน

อาหารดวยหมอนงไอน าเปนระยะเวลาอยางนอย 1 ชวโมง อาหารจะปลอดเชอจลนทรยได

เหมอนกบการฆาเชอจลนทรยดวยหมอนงแรงดนไอน าเปนเวลา 20 นาท โดยทอตราการตด

เชอจลนทรยไมมความแตกตางกน กลวยไมเอองพราวทเลยงในอาหารทฆาเชอดวยหมอนงไอน า

นาน 1 ชวโมง มการเจรญเตบโตดทสดเนองจากคณคาอาหารทเสอมไปดวยความรอนมนอยกวา

ดงนนการนงฆาเชอจลนทรยดวยหมอนงไอน าสามารถใชทดแทนการฆาเชอจลนทรยดวยหมอนง

แรงดนไอน าได ซงจะเปนประโยชนส าหรบประชาชนทวไปทอยากจะท าการขยายพนธกลวยไม

ดวยเทคนคการเพาะเลยงเนอเยออยางงาย (จกรกรชและคณะ, 2554)หรอพชชนดอนทสนใจ โดย

ไมตองใชเงนลงทนทสง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

19

แบบใชความดนไอน า (Sterilization by stream under pressure )

การฆาเชอแบบนไมเหมาะทจะใชกบภาชนะหรอวตถทสลายหรอเสยหายไดงาย เนองจาก

ใชอณหภมสงโดยทวไปจะใชอณหภมท 121 องศาเซลเซยส นาน 15-20 นาท ความดน 15 ปอนด

ตอตารางนว หมอนงความดนไอน าทใชแกสจะตองเรมจบเวลาเมออณหภมและความดนถงจดท

ตองการ เมอครบเวลาแลวจงปลอยใหความดนลดลงเองจนถงระดบบรรยากาศปกต ถารบรอนใน

การลดความดนอาจท าใหของเหลวตางๆกระเดนออกนอกภาชนะได วธการฆาเชอดวยวธนเปนวธ

ทประหยดตนทนทสด แตถาใชหมอนงไฟฟาจะมระบบท างานอตโนมต ซงไมตองเสยเวลาในการ

เฝาดเพอจบเวลา สามารถไปปฏบตงานอยางอนกอนได แตหมอนงแบบนมราคาคอนขางสง

ถาไมมตนทนส าหรบการซอหมอนงความดนไอน าไมวาจะแบบธรรมดาหรอแบบใช

ไฟฟา อาจใชหมอตนหรอหมอนงอาหารแบบธรรมดากได เพยงแตเพมระยะเวลาในการฆาเชอให

นานขน

ขอควรระวงของการนงอาหารดวยวธการใชความรอนชนคอ สารบางชนด เชน ฮอรโมน

พช อาจจะสลายตวไดเมอใชอณหภมทสงเกนไป วธแกไขอาจตองฆาเชอดวยวธการกรองแลวคอย

น ามาผสมกบอาหารทอณหภมไมสงมาก หรอสารบางชนดมการเปลยนแปลงทางเคมไดเมอนง

ปนกบสารชนดอน วธแกไขท าไดโดยการนงแยกตางหากแลวคอยน ามาผสมกน

ขอเสยของการใชหมอนงความดนไอน า

1. อาจท าใหคา pH ของอาหารเปลยนแปลงได

2. อาหารจะมสน าตาล ถาใชเวลาในการนงนานเกนไป และอาจเปนพษตอเนอเยอพชท

เพาะเลยง

3. การใชระยะเวลานานอาจท าใหเกลอตกตะกอน

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

20

4. สารบางชนดจะถกท าลาย เชน GA3 ยาปฎชวนะ เอนไซม

1.2 การท าใหปลอดเชอดวยวธการกรอง (Sterilization by Filtration)

เปนวธการก าจดเชอจลนทรยทปนเปอนอยในสารละลายทสามารถเสอมสภาพไดงายเมอ

ไดรบความรอนสง โดยเฉพาะสารควบคมการเจรญเตบโตบางชนดทใชกบการเพาะเลยงเนอเยอ

พชไดแก GA3 zeatin ABA หรอวตามนบางชนด ซงวธการกรองจะอาศยหลกการกรองผานแผน

กรอง (Filter) ทมรขนาดเลกมากและสามารถยดจบเซลล หรอสปอรของเชอราและแบคทเรย

ไมใหผานออกไปได ยกเวน เชอไวรสทไมสามารถใชวธการนไดเนองจากมขนาดเลกกวา ขนาด

ของร (Pore sizes) ของแผนกรองทใชคอ 0.22 ไมโครเมตร ซงมชดกรองแบบทใชครงเดยวแลวทง

กบชดกรองทใชซ าและเปลยนแผนกรองซงตองนงฆาเชอกอนใช

ในกรณทตองเตรยมอาหารปรมาณมากและตองก าจดเชอโดยการกรอง ตองใชชดกรอง

ขนาดใหญท าใหมตนทนสง ดงนนอาจะตองมการเตรยมอาหารทยงไมไดใสสารทสลายตวงายลง

ไปแลวนงฆาเชอปกต แลวจงละลายสารดงกลาวในตวท าละลายทเหมาะสมจากนนจงกรองดวย

แผนกรองกอนทจะตวงใหไดปรมาตรตามตองการ แลวเตมลงในอาหารทยงอนอยไดโดยท าในต

ปลอดเชอ

2. การฆาเชอเครองมอและอปกรณ

นอกจากอาหารเพาะเลยงเนอเยอตองปลอดเชอแลว อปกรณและเครองมอตางๆทใชใน

การปฏบตงานตองปราศจากเชอจลนทรยดวยเชนกน อปกรณเหลานไดแก จานแกว ใบมด ดามมด

ปากคบ ตะแกรงกรอง ทวางอปกรณ กระดาษ (ใชแทนจานแกว) กระดาษทชช ผาสะอาดส าหรบ

เชดภายในต เปนตน ซงสามารถน ามาฆาเชอไดดงน

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

21

2.1 การฆาเชอดวยความรอนความรอนแหง (Dry heat sterilization)

การฆาเชอดวยวธนสามารถใชกบอปกรณทเปนแกวหรอโลหะ ส าหรบจานเลยงเชออาจ

หอดวยกระดาษฟอยดกอนเขาอบ ซงใชอณหภมประมาณ 160-180 องศาเซลเซยส นานประมาณ 3

ชวโมง ส าหรบกระดาษ ส าล หรอพลาสตกชนดททนอณหภมสงเกน 100 องศาเซลเซยส ไมควร

ฆาเชอโดยการอบแหงแตสามารถนงฆาเชอโดยใชความรอนชนได

หลกการท างานของการฆาเชอโดยวธนคอ ความรอนจะไปท าใหเกดปฏกรยา oxidation

ของโปรตนของเชอจลนทรย ซงความรอนจะถกสงผานอากาศเขาไปโดยตรง ดงนนจงตองใช

ระยะเวลาในการฆาเชอนาน 2-3 ชวโมง

2.2 การฆาเชอโดยใชรงส (Sterilization by Radiation)

สวนใหญไมเปนทนยมส าหรบการเพาะเลยงเนอเยอพช เนองจากคาใชจายสงมากเมอ

เทยบกบการใชความรอนในการฆาเชอ การใชรงส เชน UV ซงมอ านาจทะลทะลวงต า สามารถฆา

เชอไดเฉพาะทบรเวณผวเทานน กอนเขาปฎบตงานในตปลอดเชอมกจะเปด UV เพอฆาเชอกอน

30 นาท

3. การฆาเชอทผวพช

สงทส าคญส าหรบการฆาเชอทผวพชคอ ตองท าใหเซลลพชยงมชวตอย ดงนนจงไม

สามารถใชความรอนกบเนอเยอพชได ยกเวนเนอเยอพชทตองการนนถกหอหมดวยเปลอกชนนอก

ทมความหนาพอสมควร เชน ฝกกลวยไม มะเขอเทศ สามารถใชวธการจมแอลกอฮอลและผาน

เปลวไฟได แลวจงน ามาผาเอาเฉพาะเมลดทอยขางในได อยางไรกตามยงมวธการอนทดกวาคอ

การใชสารเคมชนดตางๆ ทนยมใชกนมากคอ sodium hypochlorite 6% ซงซอไดทวไปในรป

ของน ายาซกผาขาว เชน คลอรอกซ หรอไฮเตอร โดยน ามาผสมกบน าทนงฆาเชอแลวประมาณ 5-

20% ทงนขนอยกบชนดของเนอเยอพช ถาเปนเนอเยอทมลกษณะออนและบอบบาง เชน ใบ อาจ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

22

ใชความเขมขนทนอยลงและใชระยะเวลานอยกวาเนอเยอทแขงแรงทนทาน เชน เมลดพชทม

ขนาดใหญ หรอหนอกลวย เปนตน

นอกจากนยงมสารฟอกฆาเชอชนดอนๆอก ไดแก ไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) ซล

เวอรไนเตรท(AgNO3 ) เมอรควรกคลอไรด (HgCl2 )เปนตน ซงสารแตละชนดมประสทธภาพและ

คณสมบตในการฆาเชอตางกน ดงนนความเขมขนและระยะเวลาทใชจงตองพจารณาตามความ

เหมาะสมขนอยกบชนดพชและชนสวนพช (ภาพท 3.1)

ภาพท 3.1 ตวอยางสารทใชส าหรบฟอกฆาเชอ

ขอควรระวงในการปฏบตงาน

เนองจากการปฏบตงานทางดานเพาะเลยงเนอเยอพชสวนใหญตองกระท าภายใตเทคนค

ปลอดเชอดงนน ผปฏบตงานตองมความระมดระวงในเรองตางๆ ดงตอไปน

1.ควรใชสารเคมทกชนดดวยความระมดระวง โดยเฉพาะขนตอนการฟอกฆาเชอ ทตองใช

สารละลายคลอรอกซ ซงอาจมผลตอหลอดลมและเสนเลอด และอาจเกดอาการคนเมอถกผวหนง

HgCl2 H2O2 Clorox

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

23

หามใชสารนภายใตแสง UV เพราะจะท าใหคลอรนแตกตวระเหยออกมา สวนสารเมอควรกคลอ

ไรด สามารถระเหยเปนไอไดทอณหภมหอง มพษรายแรง เปนอตรายตอสขภาพ

2. แสง UV เปนอนตรายตอสายตาและผวหนง รวมทงอาจท าใหเกดโอโซนซงเปนแกส

พษ เนองจาก UV มการท าปฏกรยากบสารเคมบางตว ท าใหมผลตอระบบหายใจและตาเกดการ

ระคายเคองไดดงนนจงไมควรท างานขณะทเปด UV

2. การปฏบตงานทเกยวของกบการใชไฟหรอความรอน ตองไมประมาทและมความ

ระมดระวงสงมาก โดยเฉพาะการลนไฟเผาอปกรณ เชน มด ปากคบ ไมควรจมลงในขวดใส

แอลกอฮอลทนท เพราะท าใหตดไฟได ส าหรบการท างานทเกยวกบการนงฆาเชออาหารดวยแกส

ตองระมดระวงอยางยงและตองคอยเฝาอยตลอดเวลา เพอไมใหความดนเกนก าหนดเพราะจะเกด

อตรายได รวมทงการท างานทเกยวของกบการใชเครองไมโครเวฟ ตองปฏบตตามค าแนะน าอยา

เครงครด เนองจากการใชวสดบางชนด เชน กระดาษฟรอยดหม อาจท าใหเกดการระเบดและ

กระจกแกวแตกได อาจเปนอนตรายกบตวเราหรอบคคลทอยใกลเครองไมโครเวฟ

3. กอนการท างานทกครงควรลางมอและแขนใหสะอาดทกครงดวยสบ เชดดวยผาสะอาด

และใชแอลกอฮอล 70% ฉดพนฆาเชอทมอและแขน

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

24

กจกรรม

นกศกษาฝกปฏบตในการเลอกและแยกชนดของวสดอปกรณทเกยวของกบการเพาะเลยง

เนอเยอพชเพอท าใหปลอดเชอจลนทรย

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

25

บรรณานกรม

ค านญ กาญจนภม. 2542. การเพาะเลยงเนอเยอพช. ส านกพมพแหงจฬาลงกรณมหาวทยาลย.

กรงเทพฯ. 162 หนา.

จกรกรช อนนตศรณย รยะ ปงเตะและอศรา อหม าหมาด. 2554 ผลของเทคนคการนงฆา

เชอจลนทรยในอาหารตอการเพาะเลยงเนอเยอเอองพราว. วารสารวชาการมหาวทยาลย

ราชภฏสงขลา. 4(1):1- 9.

สนธชย จนทรเปรม และ เสรมศร จนทรเปรม. 2549. เทคโนโลยชวภาพเพอการเกษตร. ในเอกสาร

ประกอบการฝกอบรมเชงปฏบตการ. คณะเกษตร ก าแพงแสน รวมกบศนย

เทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน, นครปฐม.

เทคโนโลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน.สงขลา. 127 หนา.

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

26

บทท 4

อาหารเพาะเลยงเนอเยอพชและการเตรยมอาหาร

อาหารทใชส าหรบเพาะเลยงเนอเยอพชมหลายสตร จะเลอกใชสตรใดขนอยกบพนธพช

ชนดและสภาพของชนสวนพชทจะน ามาเพาะเลยง รวมทงวตถประสงคของการเพาะเลยงเนอเยอ

พชนน อยางไรกตามอาหารทนยมใชมากทสด คอ อาหารทดดแปลงทประกอบดวยเกลอของธาต

อาหารทตองการครบถวน คอ สารประกอบอนนทรย และสารประกอบอนทรย ในปรมาณท

คอนขางสง แมพชทงตนจะมความตองการขนพนฐานในการเจรญเตบโตไมซบซอนมากนกกตาม

แตการน าชนสวนของพชมาเลยงในอาหารสงเคราะหนน มความตองการธาตอาหารและสาร

บางอย างท จ า เปนทมความซบซอนมากกว า คอ ตองการท งธาตอาหารหลก (macro-

elements/nutrients) และธาตอาหารรอง (micro-elements/nutrients นอกจากนยงตองการธาต

อาหารอน ๆ เชน แหลงของธาตคารบอน และวตามนอยางมาก ปกตแลวเซลลหรอเนอเยอพชท

แยกมาเลยงจะตองการวตามนและ สารควบคมการเจรญเตบโต (growth regulators) ตาง ๆ ซงปกต

สงเคราะหไดเองจากสวนหนงของตนเพอไปสะสมไวยงอกสวนหนงของตนพช แลวเคลอนยา ย

ไปยงสวนอนๆ เพอใชในกระบวนการเมตาโบลซม อยางไรกตาม ผลของแตละสารประกอบท

จ าเปนนยงไมเปนททราบชดสมบรณ โดยเฉพาะอยางยงในกรณของสารทไดจากกระบวนการเม

ตาโบลซม (secondary metabolites) เนองจากองคประกอบทางเคมของสตรอาหารทใชมกถก

ดดแปลงไปตามความมงหมาย เพอปรบปรงประสทธภาพการเจรญเตบโตของเซลล และการ

เปลยนแปลงพฒนาเพอก าเนดอวยวะ (organogenesis) และ/หรอ การก าเนดคพภะ (embyogenesis)

จงท าใหยากตอการหาขอสรปพนฐานทสอดคลองไปในทางเดยวกนไดโดยงาย

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

27

ชนดของอาหารเพาะเลยงเนอเยอพช

1. อาหารกงแขง (semi-solid medium) เทคนคทใชในยคแรก ๆ นน ใชวน (agar) เพอปรบ

สารละลายอาหารใหมสภาพเปนของแขงมากขน โดยนงในหมอนงความดนเพอหลอมละลาย

อาหารแลวเทใสภาชนะและทงใหแขงตวอยในสภาพอาหารกงแขง แตมกพบวาคณสมบตตาง ๆ

ของสารประกอบเคมในอาหารอาจไมไดรบสงสดเทากบอาหารเหลว (liquid medium) แตวนยงคง

ถกน ามาใชแตจ าเปนตองดดแปลงใหเหมาะสม และตองแนใจวามความบรสทธจรง ๆ ความ

เขมขนของวนทพอเหมาะส าหรบอาหารแตละชนดจะตองมการทดสอบเสยกอน อยางไรกตาม

ความเขมขนของวนทใชกนแพรหลายและไดผลดคอ 0.7-0.8 % สวนสารสงเคราะหพวก gelatin

และ silica gel ไดเคยมการใช และในปจจบนม การพฒนาสารประกอบพวก acrylamide gels

เชนเดยวกบ starch co-polymers กมการแนะน ามาใชแทนวน สารเหลานมขอดทไมจ าเปนตองตม

ใหเดอดเพอชวยใหละลายน าได แตยงมปญหาในเรองการปรบคา pH ส าหรบสารทเปนผงถาน

(charcoal) จะถกเตมในอาหารหลายสตร เพอชวยกระตนการเจรญเตบโตเนองจากสามารถดดซบ

สารพษพวก toxic metabolites ทเกดจากเนอเยอพชทเลยงไดด

2. อาหารเหลว (liquid medium) อาหารเหลวเปนทนยมใชอยางกวางขวาง เนองจาก

เนอเยอจะจมหรอแขวนลอยอยบนกระดาษกรองทจมในอาหารเหลวตลอดเวลา ในทางปฏบตอาจ

ใช glass wool ชวยพยงเนอเยอทเลยงไดเชนกน เชนเดยวกบการใช fabric support (100 %

polyester) ทอมตวดวยอาหารเหลว ซงจะชวยในการเจรญเตบโตและการเปลยนแปลงทางสณฐาน

เกดไดดขน เนอเยอทจมอยในอาหารเหลวอาจตองใชความเรวท 1 - 150 รอบตอนาท (rpm) เพอ

ชวยในการหายใจ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

28

สวนประกอบของอาหารส าหรบเพาะเลยงเนอเยอพช (สนธชยและเสรมศร, 2549)

โดยทวไปแลวอาหารเพาะเลยงเนอเยอพชจะประกอบดวย น า ธาตอาหารหลก ธาตอาหาร

รอง คารโบไฮเดรต วตามน และสารควบคมการเจรญเตบโต นอกจากนยงอาจมสารอนๆ เพมเตม

ไดอก เชน กรดอะมโนชนดตางๆ ยาปฏชวนะ antioxidant adsorbent ตางๆ สารอาหารทท าใหแขง

ตว เชน วน และสารประกอบเชงซอนทไดจากธรรมชาต เชน น ามะพราว (ซงสารเหลานไม

สามารถระบองคประกอบทชดเจน) สารตางๆทเตมลงไปในอาหารเหลานจะชวยใหชนสวนของ

พชมการเจรญเตบโตและพฒนาไปในแนวทางทตองการได โดยมสวนประกอบของอาหาร

ดงตอไปน

1. น า (water)

ในอาหารเพาะเลยงเนอเยอพชจะประกอบดวยน าประมาณ 95 % ในการท างานวจยควรใช

น าทบรสทธสะอาด เชน น ากลน หรอน ากรองระบบ reverse osmosis การใชน าประปาทไมผาน

การกรองจะมาตตางๆปนอยมาก ซงจะไปรบกวนองคประกอบทางเคมของสงตางๆทใสเขาไปใน

อาหารได

2. วน (agar)

เนอเยอพขสวนมากจะเลยงในอาหารแขงทมวนซงหนาทชวยพยงเนอเยอใหตงอยไดบน

อาหาร ในกรณทเลยงในอาหารเหลวจะวางบนเครองเขยา หรอเลยงบนสะพานกระดาษกรอง

(filter paper bridge) เพอใหเนอเยอไดรบอากาศเพยงพอ วนเปนสวนประกอบแพงทสด ในอาหาร

ผลตจากสาหรายทะเลท าใหอาหารแขงตว วนเปนพอลแซกคาไรด (polysaccharide) มโมเลกล

ใหญ วนทมคณภาพสง เชน difcoitek Agar มราคาแพงมากปราศจากสงเจอปน ในหองปฏบตการ

บางแหงใชวนประกอบอาหารแทนได วนจาก Difco Bacto มกใชในปรมาณ 0.6 - 1.0 % เหมาะ

ส าหรบการเลยงแคลลส สวนอะกาโรสเจล (agarose gel) หรอวนสงเคราะหใชเลยงเซลลเดยวหรอ

โพรโทพลาสต วนสงเคราะหเหลานจะท าใหเกดปญหาการฉ าน า (vitrification) ของเนอเยอพช

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

29

ผลตภณฑใหมของบรษทซกมา (Sigma) ชอ อะการเจล (Agargel) ชวยลดปญหานได การใชวนใน

ปรมาณทต า (0.5 %) จะท าใหอาหารไมแขงตวไหลไปมาได โดยเฉพาะเมอมpHต าจงไมสามารถ

พยงเนอเยอพชไวได แตถาใชวนในปรมาณทสง (1.0 %) จะท าใหอาหารแขงมากจนไมสามารถให

น าเพยงพอส าหรบการเจรญเตบโตของพช และยงท าใหพชดดอาหารไปใชไดยาก

3. แหลงคารบอน (carbon sources)

เปนสวนประกอบทส าคญของอาหารทกสตร เปนแหลงพลงงานทจ าเปนมากตอการ

เจรญเตบโต เนองจากเนอเยอพชยงไมมการสงเคราะหแสงในสภาพหลอดทดลอง หรอมการ

สงเคราะหแสงในอตราทต าเนองจากไดรบแสงนอย และมปรมาณของคารบอนไดออกไซดจ ากด

น าตาลทนยมใช คอ ซโครส (sucrose) ซงเปนชนดเดยวกบทพชสงเคราะหไดเอง และ มความ

จ าเปนอยางมากตอเนอเยอพชเกอบทกชนด โดยปกตมกใชในปรมาณ 3 - 5 % และมหลกฐานชวา

การสรางสารเมตาโบไลทบางชนดในเนอเยอท เลยง เปนผลมาจากความเขมขนของซโครส

ส าหรบน าตาลชนดอน เชน กลโคส (glucose) และฟรคโตส (fructose) มการใชบางปรมาณทใช

ขนอยกบชนดและอายของพช โดยทวไปพชจะเจรญเตบโตดขนเมอไดรบปรมาณ น าตาลเพมขน

จนถงจดหนง จากนนการเพมปรมาณน าตาลมากขนอกจะลดการเจรญเตบโตลง น าตาลอาจเปลยน

รปไดเมอถกนงฆาเชอ นอกจากนน าตาลพอลแซคคาไรดอาจเปลยนเปน มอโนแซดคาไรด เมอเกด

การแยกสลายดวยน า (hydrolysis)

4. เกลออนนทรย (inorganic salt)

ธาตอาหารมความส าคญในการเจรญเตบโตของเนอเยอพชรองลงมาจากน าตาล แยกออก

ไดเปนธาตอาหารทพชตองการมาก (macro nutrients) ไดแก ธาตอาหารหลก 6 ชนด คอ N P K Ca

Mg S และธาตอาหารทพชตองการนอย (micro nutrients) หรอธาตอาหารรอง ไดแก Fe Cu Zn

Mo B กรณของ Fe นนมกจะใชในรปของ NaFeEDTA แมวาสตรอาหารเพาะเลยงเนอเยอพชใน

ระยะแรกจะเหมาะสมตอการเลยงเซลลและ แคลลส แตในระยะตอมา เชน สตรของ Murashige

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

30

and Skoog (MS), Gamborg B-5 และของ Miller ไดรบการพฒนาใหเหมาะตอการเลยงสวนตาง ๆ

ของพชไดกวางขวางมากขน ทงยงมผลดอยางมากในการกระตนการก าเนดอวยวะ โดยมการ

ก าหนดปรมาณเกลออนนทรยใหเหมาะตอการเจรญของเซลลทเลยง ในแตละพช และในบางกรณ

เฉพาะตอแตละพนธ โดยปกตสารละลายเกลออนนทรยของ Murashige and Skoog (MS-salt

solution) ถกใชเปนสวนผสมหลกเพอการเจรญเตบโตของเซลลทเลยง สาเหตหนงคอ เกลอสตรน

มความเขมขนสง โดยเฉพาะอยางยง NH4+ อออน และ ธาตอน ๆ บางชนดมปรมาณทสงมาก ซง

จ าเปนตอเนอเยอพชเกอบทกชนดทจะพฒนา ทงยงพบวา NaH2PO4.2H2O ในสตรอาหาร MS

ยงใหผลดแกเนอเยอพชบางชนด ธาตอาหารรองทใชในสตรอาหารโดยปกตมการเจอปนของธาต

อนและให ธาตอาหารหลก N, P และ K เพมเตมในปรมาณทนอยมาก แตคณภาพของธาตอาหาร

รองเองกมสวนส าคญไมนอย ในเกลอสตร MS นน มปรมาณธาตอาหารรองคอนขางสงเปนพเศษ

เมอเทยบกบสตรอน โดยเฉพาะการมสาร chelating agents เชน EDTA ยงเปนหลกประกนวา ธาต

เหลกจะมประโยชนในปรมาณทมากพอ แมวาจะม pH เปลยนแปลงไปอยางมากกตาม

5. วตามน (Vitamins)

พชสามารถสงเคราะหวตามนทจ าเปนตอการเจรญเตบโตไดทกชนด แตเซลลพชทเลยงใน

สภาพหลอดทดลองตองการวตามนเพม โดยเฉพาะวตามนบ 1 เพอชวยในการพฒนา ใหเปนปกต

วตามนทใช เชน วตามนบ 1 (thiamine) วตามนบ 2 (riboflavin) วตามนบ 5 (pantothenic acid )

วตามนบ 6 (pyridoxine )วตามนเอม (folic acid) วตามนเอช (biotin ) และวตามนอ (tocopherol )

วตามนเหลานท าหนาทเปนตวเรงปฏกรยาตางๆในเซลลพช วตามนเหลานมความจ าเปนมาก

ส าหรบการเพาะเลยงเซลลทมจ านวนนอยๆ อยางไรกตาม วตามนในอาหารเพาะเลยงเนอเยอพชท

ใชกนนนมกจะใชตามกนมากกวาจะมการพสจนหรอทดสอบกอนวามความจ าเปน อยางแทจรง

หรอไม มเพยง thiamine-HCl เทานนทมความจ าเปน และเปนทตองการในการเจรญเตบโตหรอ

การเปลยนแปลงทางสณฐาน (morphogenesis)

6. คาความเปนกรดและดางของอาหาร (pH of nutrient medium)

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

31

pH ทเหมาะสมของอาหารทใชในการเพาะเลยงเนอเยอพชสวนใหญอยในชวง 5.0 - 6.5 ถา

ต ามากไป ( <4.5 ) หรอสงมากเกนไป (>7.6) จะท าใหพชหยดการเจรญเตบโต ถา pH สงกวา 6 จะ

ท าใหอาหารแขงมาก ถา pH ต ากวา 5 อาหารวนจะออนตว ไมเหมาะในการพยงเนอเยอพช

นอกจากนจากการศกษาพบวาผลในการกระตนการเจรญเตบโตและ การเลอกกระตนของอาหารท

ใชเลยงนนจะขนอยกบ pH ดวย ดงนนควรหลกเลยงอาหารทมคา pH สงหรอต าเกน เนองจากจะ

ไปขดขวางการน าธาตอาหารทเปนประโยชนไปใช ตวอยาง pH ทเปนดาง (>7.0) หรอเปนกรดจด

(<4.0) ท าใหกรดจบเบอเรลลนไมเปนประโยชนได การเตมสารประกอบ EDTA ลงในอาหารอาจ

มความส าคญในการรกษาความเปนประโยชนของธาตเหลกและธาต โลหะอน ๆ เนองจาก pH

จะเปลยแปลงไปตลอดเวลาขณะเพาะเลยง

7. สารควบคมการเจรญเตบโตของพช ( Plant growth regulators)

ฮอรโมนทสรางขนในตนพช (plant hormones) ท าหนาทกระตนและมสวนรวม ใน

กระบวนการตาง ๆ ทน าไปสการพฒนาของตนท เปนปกตการเจรญเตบโตตลอดจน การ

เปลยนแปลงพฒนาของเซลล เนอเยอ และ secondary metabolism เปนผลมาจากฮอรโมนเหลาน

ทงสน การเตมสารควบคมการเจรญเตบโตลงในอาหารจงอาจไมจ าเปนเสมอไปโดยเฉพาะในการ

เลยงแคลลส อยางไรกตามโดยปกตจะมสวนชวยในการเพมอตราการเจรญเตบโตและ /หรอการ

ก าเนดอวยวะ และมเนอเยอพชไมกชนดทสรางแคลลสไดในอาหารทปราศจาก สารควบคมการ

เจรญเตบโต

ฮอรโมนกลมออกซนและไซโทไคนนมความส าคญทสด พชบางชนดสรางสารเหลานอย

แลว แตควรเพมเขาไปในอาหารเพอชวยใหการเจรญดขน บางครงอาจตองใชจบเบอเรลลน หรอ

เอทลน การเกบฮอรโมนพชมกเกบในตเยนในรปสารละลายเขมขน การน าฮอรโมนพชไปใชอาจม

ปญหาการท าละลายของฮอรโมนพชในน า การละลายออกซนควรท าในดาง เชน 0.1 KOH ไซโท

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

32

ไคนนกเชนเดยวกน แตจบเบอเรลลนละลายไดไดในแอลกอฮอล ออกซนและไซโทไคนนทเตรยม

เปนสารละลายเขมขนควรเกบไวในทมด หรอใสขวดสชาเพราะจะเสอมสภาพเมอไดรบแสง

ฮอรโมนกลมออกซน (auxin) จะชวยเพมขนาดของเซลล มกใชรวมกบไซโทไคนนเพอ

ชวยใน การแบงเซลล การสรางราก แตการเจรญของรากจะถกยบยงถามออกซนในปรมาณทสง

ฮอรโมนกลมน ไดแก IAA (indole acetic acid) IBA (indole butyric acid) NAA (naphthalene

acetic acid) 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid) ใชในชวง 0.01- 10 มก/ล.

ฮอรโมนกลมไซโทไคนน (cytokinin) ไซโทไคนนทสงเคราะหไดในธรรมชาต คอ ซอะ

ทน (zeatin) ใชในการกระตนการเจรญเตบโต ไซโทไคนนทใชกนมากคอ ไคเนทน (kinetin) 2iP

(N6-isopentenyl adenine) BAP (benzyl aminopurine) มหนาทสงเสรมการแบงเซลลโดยเฉพาะถา

ใชรวมกบออกซน ถาใชในความเขมขนสงขนจะชวยในสรางราก แตยบยงการเจรญของราก

สงเสรมการสรางยอดโดยลดผลจากการทตายอดขมตาขาง มบทบาทในการเปลยน สภาพเซลลเปน

อวยวะไดและชกน าใหเกดเปนตน ไซโทไคนนทนความรอนไดดจงมกเตมในอาหารกอนฆาเชอ

บทบาทของออกซนและไซโทไคนนในพชทงตนและในสภาพหลอดแกวอาจจะเหมอนกนหรอไม

เหมอนกนกได

จบเบอเรลลน (gibberellin) ฮอรโมนพชกลมนม 60 กวาชนด แต GA3 เปนชนดทใชมาก

ทสด จบเบอเรลลนไมคอยใชกนมากนกในงานเพาะเลยงเนอเยอพช มบทบาทในการชกน าให

ปลองยาวขนหลงจากการสรางยอด ชวยใหเนอเยอเจรญมการเจรญเตบโตและชวยในการงอกของ

เมลด ไมควรน าฮอรโมนชนดนมาฆาเชอดวยหมอนงความดน เพราะจบเบอเรลลนสวนหนงจะ

เสอมสลายไปเมอไดรบความรอน ควรท าใหปลอดเชอโดยใชเครองกรองเมมเบรน

แอบซาซกแอซค (ABA; abscisic acid) มกยบยงการเจรญเตบโต ในสภาพปลอดเชอแต

ในบางครงพบวา ABA สงเสรมการเจรญของแคลลส และการเกด เปนตนใหม และการเกดเปนตน

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

33

ใหม ควรท าใหสารนปลอดเชอโดยใชเครองกรองเมมเบรน เอบเอมบทบาทเกยวกบ การ

สงเคราะหไซโทไคนนและเปนตวตอตานการท างานของ จบเบอเรลลน

เอทลน (ethylene) อวยวะพช แคลลส หรอเซลลในสภาพหลอดแกวมการผลตเอทลน จง

ไมควรปดหลอดแกวแนนเกนไปเพอไมใหเกดการสะสมของแกสน ผลของเอทลนมทงสงเสรม

และยบยงการเจรญเตบโต การเลยงเนอเยอในทมแสง จะมการสะสมเอทลนมากกวา ในทมด ถาม

มากเกนไปจะท าใหเกดการฉ าน าของพชได แกสนยงเปนสาเหตของการแกของเนอเยอพช

8. สารอนทรย (organic salt)

สารอนทรยจากผกหรอผลไมทส าคญมากคอ น ามะพราว น าสม น ามะเขอเทศ สารสกด

จากยสต น าแอปเปล กลวยบด สารเหลานไมควรใชในงานวจย เนองจากไมทราบสวนประกอบ

แนนอน และระยะทน ามาใช

สารอนทรยทมไนโตรเจนเปนสวนประกอบ เชน กรดอะมโน ชวยสงเส รม การ

เจรญเตบโต และท าใหเซลลมการเปลยนแปลงพรอมทจะเกดเปนตนได เชน แคซนไฮโดรไลเซท

(casein hydrolysate) 0.1 - 1.0 มก/ล. ทรพโทน (tryptone) 0.25 - 2.00 มก/ล. และสารสกดจาก

มอลท (malt extrat) 0.5 - 10 มก/ล. สารเหลานประกอบดวยวตามนและกรดอะมโน สวนสารสกด

จากยสต (yeast extract) ซงมวตามนบสงมกใชในปรมาณ 0.25 - 2.00 มก/ล. ดงตารางท 3

9. อะดนน (adenine)

การใสอะดนนในอาหารทใชเพาะเลยงเนอเยอมประโยชนคอ ชวยในการเพมปรมาณยอด

10. ผงถาน (activated charcoal)

มกใชในความเขมขน 0.2 - 3.0 % ในอาหารเลยงเนอเยอ ผงถานม ความสามารถในการดด

ซบสารบางตวออกจากอาหารได เนองจากผงถานมชองวางท ละเอยดมาก มพนทผวในชองวางสง

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

34

จงใชผงถานในการดดซบสารพษ เชน สารประกอบฟนอล (phenol) เอทลน ท าใหปรมาณสาร

ดงกลาวในอาหารลดลง เชน การดดซบฮอรโมนหรอ สารประกอบฟนอล ซงเปนพษกบเซลล

นอกจากนอาจใชผงถานในระยะทเกดรากเพอลดแสงบรเวณราก และท าใหรากเจรญเตบโตไดด

ผงถานจงส าคญตอการสรางเปนตนใหม สารทมคณสมบตเหมอนกนกบผงถาน คอ PVP

(polyvinyl pyrolidone) กสามารถดดซบสาร ฟนอลได หรอการเตม diethyl-dithiocarbonate

(DIECA) จะชวยปองกนการเกดออกซเดชนได

ปจจยอนทเกยวของ

นอกจากสตรอาหารซงเปนปจจยทางเคมในการเพาะเลยงเนอเยอแลว ยงมปจจยทางเคมท

ถกมองขามไปคอ ปจจยทางเคมทอยในชองวางอากาศในภาชนะทเพาะเลยง ปจจยเหลานระบได

ไมชดเจน และควบคมไดไมงายนก แตจากการวจยในระหลงพบวาสงเหลานมผลมากมายตอ

ความส าเรจของการเพาะเลยงเนอเยอพช ปจจยทตองค านงคอ

1. ความชน

ความชนในภาชนะปดของการเพาะเลยงเนอเยอพชจะอยประมาณ 95-100% ซงจะเปนตว

ยบยงการคายน า การล าเลยงแรธาตอาหารของพช ถามการเพมปรมาณวนในอาหารมากขนจะมผล

ท าใหความชนสมพทธลดลง ซงมกใชในกรณทตองการเตรยมพชออกปลกในสภาพธรรมชาต

เปนการกระตนใหพชมการคายน ามากขน และเรงการดงดดธาตอาหารผานระบบทอล าเลยงตาม

ธรรมชาต

2. กาซตางๆ

เกดขนเนองจากระบบ metabolism ของพชเอง และการแลกเปลยนกาซระหวางภาชนะ

และหองเพาะเลยง ถาไมพนฝาใหแนนดวยพลาสตก ระบบเพาะเลยงจะไมเปนระบบปด 100% จะ

มการแลกเปลยนกาซเกดขนไดบาง อยางไรกตามพบวามการสะสมของกาซเอธลน และกาซอนใน

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

35

ภาชนะเพาะเลยงได ซงถามกาซเอธลนมากเกนไปจะยบยงการเจรญและการพฒนาของตนพช

ตอมาภายหลงมหลายบรษทพยายามทจะออกแบบภาชนะเพาะเลยงใหมรระบายอากาศเพอลดการ

สะสมของกาซดงกลาว

3. ภาชนะเพาะเลยง

จะใชเปนเครองปองกนการปนเปอนของเชอจลนทรยจากภายนอก รปทรงปดของภาชนะ

จะเปนตวกนสงทอยดานในจากระบบภายนอกกอใหเกดเปนสภาพแวดลอมพเศษขนภายใน

ภาชนะ ซงมผลโดยตรงตอพชทจะเลยง คณสมบตทเหมาะสมของภาชนะเพาะเลยงมดงน

- ท าดวยวสดทแสงสองผานไดด

- ปองกนการสญเสยน าของเนอเยอพชทอยดานในได

- ปองกนการตดเชอปนเปอนจากภายนอก

- มการระบายอากาศไดเหมาะสม

- สามารถนงฆาเชอได หรอเปนภาชนะทใชครงเดยวแลวทง (disposable) ทผานการฆา

เชอมากอนแลว

ดวยคณสมบตหลกเหลานท าใหภาชนะทใชกนอยทวไปมความแตกตางกนอยางมากในแง

ของรปทรง ความกวางหรอความแคบของปากภาชนะ และภาชนะทเหนไดชดเจนจะเปนวสดท

อาจเปนแกว polystyrene polycarbonate หรออนๆ ซงแตละชนดมคณสมบตทแตกตางกนออกไป

รปแบบของภาชนะทเลอกใชจะมสวนเกยวของกบการถายเทอากาศภายในขวดบรเวณเหนอ

เนอเยอ กบอากาศเพาะเลยง ซงอาจเปนไดตงแตไมมการแลกเปลยนกาซเลยในภาชนะทปดแนน

สนท หรอมการแลกเปลยนกาซไดอยางอสระโดยใชภาชนะทออกแบบเปนพเศษใหมรระบาย

อากาศ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

36

การเตรยมสารละลายเขมขน (stock solution) ส าหรบอาหารเพาะเลยงเนอเยอพช

ในสตรอาหารเพาะเลยงเนอเยอพชจะมธาตอาหารทเปนสารอนนทรยหลายชนด ซงแตละ

ชนดใชในปรมาณนอย โดยเฉพาะธาตอาหารรองทเปน micronutrients ท าใหการชงสารเพอเตรยม

อาหารในแตละครงท าไดยากและมความคลาดเคลอน ดงนนการเตรยม stock solution จะชวย

แกปญหานได โดยการเตรยมใหมความเขมขนมากกวาสตรจรง 10-100 เทา

สตรอาหารทนยมส าหรบการเพาะเลยงเนอเยอพช

การทจะตดสนใจวาจะเลอกอาหารสตรใด เพอมาท าการเพาะเลยงเนอเยอพช ตองค านงถง

สายพนธ อายพช ชนสวนทใช โดยเฉพาะวตถประสงคของการเพาะเลยง แตถามวตถประสงคเพอ

การปรบปรงพนธ จะใชสตรอาหารทแตกตางจากการเพาะเลยงเนอเยอปกต เพอใหตนทไดม

ลกษณะเหมอนตนแม ตวอยางสตรอาหารทเปนทนยม และใชไดผลดม

1. สตร VW (Vacin and Went, 1949) ใชกบการเพาะเลยงเนอเยอกลวยไม

2. สตร MS (Murashige and Skoog; 1962) สามารถใชเพาะเลยงเนอเยอพชไดเกอบทกชนด

3. สตร Hidebrandt (1962) ใชเพาะเลยงแคลลสยาสบ

4. สตร White (1963) ใชเพาะเลยงสวนราก

5. สตร Miller (1963) ใชเพาะเลยงอบละอองเกสรของขาว

6. สตร Y 3 (Eeuwens; 1967) ใชเพาะเลยงเนอเยอตระกลปาลม เชน มะพราวกะท อนทผาลม

ปาลมน ามน

7. สตร B5 (Gamborg; 1970) ใชเพาะเลยงพชส าคญทางเศรษฐกจหลายชนด เชน ถวเหลอง เปนตน

8. สตร WPM (Lloyd and McCown: 1980) ใชเพาะเลยงพชทเปนไมเนอแขง (Woody species)

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

37

กจกรรม

นกศกษาฝกปฏบตเกยวกบการเตรยม stock solution และเตรยมอาหารเพาะเลยงเนอเยอพช

พรอมอภปรายผลรวมกน

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

38

บรรณานกรม

บญยม กจวธารณ. 2540. เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพช. ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร

มหาวทยาลยขอนแกน. ขอนแกน.165 หนา.

รงสฤษด กาวตะ. 2540. การเพาะเลยงเนอเยอพช : หลกการและเทคนค. ภาควชาพชไรนา

คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. กรงเทพฯ. 219 หนา.

สถาบนวจยและฝกอบรมเกษตรล าปาง. 2556. ความรทางดานการเพาะเลยงเนอเยอพช.

[ออนไลน]. เขาถงไดจาก: http://www.lartc.rmutl.ac.th/ptclab/Tissue Culture

(วนทคนขอมล : 22 มนาคม 2556).

สนธชย จนทรเปรม และ เสรมศร จนทรเปรม. 2549. เทคโนโลยชวภาพเพอการเกษตร. ในเอกสาร

ประกอบการฝกอบรมเชงปฏบตการ. คณะเกษตร ก าแพงแสน รวมกบศนย

เทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน, นครปฐม.

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

39

บทท 5

เทคนคการเตรยมชนสวนพชและการแยกเนอเยอพช

ปจจยส าคญทสดปจจยหนงทมบทบาทตอความส าเรจของการเพาะเลยงเนอเยอพชคอ การเตรยมชนสวนพชทจะน ามาพาะเลยง สภาพทางพนธกรรมพชหรอ genotype ซงมสวนส าคญตอพฤตกรรมการเจรญเตบโต กลาวคอ พชทมการเตบโตชาหรอขยายพนธไดงายในธรรมชาต จะยงคงมการเจรญเตบโตชาและออกรากยากในสภาพปลอดเชอเชนกน เนองจากเทคนคดงกลาวเปนเพยงแคเพมประสทธภาพของความสามารถตางๆทมอยในพชเทานน ไมอาจสรางความสามารถใหมทพชนนไมมในสภาพธรรมชาตได การเพาะเลยงเนอเยอพชทมพนธกรรมตางกนจะใหผลตางกนเสมอ (สรวช, 2533) ในการเตรยมเนอเยอพชจะพจารณาดสวนตางๆของพชทสามารถจะน ามาใชได เชน ดอก ใบ ตายอด ตาขาง ราก ล าตน เมลด หรอไหล (rhizome) เปนตน ซงแตละอาจจะตองใชวธการเตรยมทตางกน เมอเลอกชนสวนของพชไดแลว ขนตอไปกคอ การน ามาท าความสะอาดหลายๆครงและตดบรเวณทไมตองการออกไป เลอกเฉพาะสวนทดไมมโรค

อทธพลของสภาพเนอเยอกอนการเพาะเลยง (Pre-conditioning effects)

(สถาบนวจยและฝกอบรมเกษตรล าปาง. 2556)

สภาพของเนอเยอพชกอนทจะน ามาเพาะเลยงนนอาจมผลตอการเจรญและการพฒนาการไปเปนตนใหมทสมบรณได โดยมปจจยทเกยวของ ไดแก

1. ฤดกาล

ชวงแสง อณหภม และปจจยสภาพแวดลอมอน ๆ ทแตกตางกนในการเพาะเลยงจะมผลตอการเกดอวยวะ ชวงระยะเวลาการดแลรกษา ตลอดจนการใหปย และสารเคมทใช รวมทง ต าแหนงของเนอเยอทแยกออกมาจากตนในแตละฤดกาลมาใชกมผลเชนเดยวกน

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

40

2. ธาตอาหาร

ความอดมสมบรณของดน และธาตอาหารทพชไดรบ อาจมผลตอความแขงแรง สขภาพ และศกยภาพของเนอเยอพชทน ามาใช โดยเฉพาะการใสปยในชวงกอนแยกเอาเนอเยอมาใช อาจมผลท าใหการตอบสนองของเนอเยอเปลยนแปลงได

3. แสง

ความเขมแสงทพชได รบนน อาจท าใหการตอบสนองของเนอเยอและเซลลพชเปลยนแปลงไปได ตวอยางในยาสบ ความเขมขนแสงทเพมมากขนท าใหมการตอบสนองตอการเพาะเลยงเพมขน ขณะทการเพาะเลยงเซลลพชบางชนด โดยเฉพาะ โพรโทพลาสมความตองการแสงนอยลงหรอตองการสภาพมด

4. สารควบคมการเจรญเตบโตของพช

การใหสารควบคมการเจรญเตบโตกอนแยกเนอเยอพชมาใช มกชวยกระตนการตอบสนองใหดขน ตวอยางใชกรดจบเบอเรลลก (GA3) เพอชกน าใหเกด juvenile tissues ทงายตอการเพาะเลยงในยาสบ และสม หรอใชสารชะลอการเจรญเตบโต (growth retardants) เชน CCC (B-chloroethyl-trimethyl ammonium chloride) ในใบมะเขอเทศ ท าใหความแขงแรงของเนอเยอลดลง

5. การปนเปอนของเชอจลนทรย

การลดปรมาณจลนทรยในเนอเยอพชทเพาะเลยง โดยใชสารเคมตาง ๆ เชน สารก าจดเชอรา (fungicides) สารปฏชวนะ (antibiotics) เพอก าจดเชอแบคทเรย สารก าจดไวรส (antiviral agents เชน virozol) การใชความรอน (heating) หรอการอบแหง (drying out) อาจท าใหความชวตและความแขงแรงของเนอเยอลดลงได โดยปกตแลว พชทปลกในเรอนควบคมสภาพแวดลอม (growth chamber หรอ controlled room) มกใหชนสวนพชทสะอาดและปลอดโรค จงเหมาะตอการใชเพาะเลยงมากกวาพชทปลกในเรอนปลกพชทดลอง หรอในสภาพไร ซงยากตอการหลกเลยงการปนเปอนจาก จลนทรยและเชอโรค

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

41

การคดเลอกตนแมพนธเพอท าการเพาะเลยงเนอเยอพช

1. พนธพช เมอเลอกชนดพชทตองการท าไดแลว ควรพจารณาเลอกสายพนธพชไวหลายๆสายพนธ เนองจากความแตกตางกนของพนธกรรมคอ บางพนธอาจขยายพนธโดยการเพาะเลยงเนอเยองายกวาพนธอน ซงโดยทวไปพชทสามารถขยายพนธงายดวยวธการปกช า มกจะขยายพนธไดงายดวยวธการเพาะเลยงเนอเยอเชนกน

2. สภาพของตนแมพนธ ชนสวนพชเรมตนควรน ามาจากตนแมทแขงแรง ไมมโรคเขาท าลาย จะท าใหประสบความส าเรจมากกวาการน าชนสวนพชมาจากตนพนธทออนแอ แตในกรณทหลกเลยงไมได อาจจะตองท าการดแลตนแมพนธในโรงเรอนกอน โดยมการฉดสารเคมปองกนก าจดโรค จนกระทงตนแมพนธมความแขงแรงด และมการแตกยอดหรอใบใหม จงน ามาใชเปนชนสวนพชได

การพจารณาเลอกชนสวนของพชมาเพาะเลยง

1. ขนาดของชนสวนพช

เนอเยอพชทมขนาดใหญจะมการปนเปอนจากจลนทรยตาง ๆไดงาย ขณะทเนอเยอขนาดเลกมโอกาสหลกเลยงการปนเปอนไดมากขน อยางไรกตาม ขนาดของเนอเยอทเลกทสดทมประสทธภาพ เปนสงทควรพจารณา เนองจากเนอเยอเจรญทมขนาดเลกเกนไปอาจโตชา และไมตอบสนองตอการเพาะเลยงเทากบเนอเยอทมขนาดใหญ ในทางปฏบตนยมเลยงเนอเยอทมขนาดเลกหลาย ๆ ชนรวมกนในขวดเดยวกน เพอกระตนใหมการตอบสนองตอการเพาะเลยงมากขน โดยเฉพาะการเพาะเลยงชนสวนพชเพอชกน าใหเกดแคลลสซงจะโตเรวกวาการเลยงชนสวนพชเพยงชนเดยว แตอาจตองยายเปลยนอาหารบอยครงขน ซงเปนการสนเปลองทงเวลา แรงงาน และคาใชจาย รวมทงมความเสยงตอการปนเปอนจากเชอจลนทรยทมากขนดวย

2. ชนดของชนสวนของพช

ทกสวนของพชประกอบดวยเซลลทยงมชวตอยสามารถน ามาท าการเพาะเลยงเนอเยอได แตความสามารถในการเจรญเตบโตนนอาจแตกตางกนไป เนองจากเซลลแตละชนดมความตนตว

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

42

(active) ไมเทากน เนอเยอพชทมเซลลตนตวมากทสดคอเนอเยอเจรญ (meristem) ซงพบไดในสวนตาง ๆ ดงน

2.1 สวนปลายยอด (shoot apex) เปนบรเวณทเซลลมการแบงตวมากทสด สวนนนบจากปลายยอดสดลงมาไมเกน 5 มลลเมตร

2.2 สวนปลายราก (root apex) ถดจากสวนของหมวกราก กจะมสวนทประกอบดวยเนอเยอเจรญคลายกบสวนของปลายยอด

2.3 เนอเยอเจรญในทอล าเลยง (vascular cambium) เปนเนอเยอเจรญทพบในสวนของล าตนและราก ซงอยระหวางกลมของทออาหาร และทอน า

2.4 เนอเยอเจรญทอยระหวางปลอง (intercalary meristem) ซงจะพบในพชพวก ใบเลยงเดยว ท าหนาทในการเพมความยาวของปลอง

2.5 เนอเยอสวนอน ๆ ทสามารถน าท าการเพาะเลยงเนอเยอไดแก

- สวนของเปลอกชนใน (inner bark) ซงสวนนประกอบดวยเนอเยอของชน phloem และ cortex

- สวนไส (pith) เปนสวนทในใจกลางสดของล าตนซงประกอบดวยเซลลพวก parenchyma

- ใบ (leaf) ในสวนของใบมเซลลของแผนใบทเรยกวา palisade parenchyma และ spongy parenchyma อยจ านวนมาก ซงนยมใชส าหรบแยกโพรโทพลาสต

- ดอก (flower) สวนของดอกสวนใหญประกอบดวยเซลลพวก parenchyma ยกเวนในสวนของกานดอก (peduncle) และฐานรองดอก (receptacle) ซงอาจมเนอเยอเจรญอยดวยยกตวอยางในฐานรองดอกของเยอบราและ เบญจมาศทสามารถชกน าใหเกดตนไดด

- ผล (fruit) เนอเยอของผลสวนใหญประกอบดวยเซลลพวก parenchyma โดยเฉพาะอยางยงในผลสด (fleshy fruit) ชนดทผลมเปลอกหมผลนมทงผล มกมเมลดมากมาย (berry) เชน กลวย มะละกอ ละมด สวนผลมผนงชนนอกของเปลอกหมผล พฒนามาจากฐานรองดอก เมอผลแกผนง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

43

นจะแขงและเหนยวแนน ภายในผลนมทงผล (pepo) เชน พชตระกลแตง เปนตน และผลทมเปลอกหนาคลายหนงและมตอมน ามนจ านวนมาก ขางในผลแยกเปนสวนๆ ชดเจน (hesperidium) เชน พชตระกลสม เปนตน

- เมลด (seed) ในสวนของเมลดซงประกอบดวยคพภะ (embryo) ใบเลยง (cotyledon) และ endosperm ทงสามสวนนใหความส าเรจสงในการเพาะเลยง

การฟอกฆาเชอชนสวนพช

ชนสวนพชทจะน ามาเพาะเลยงจะตองผานการฆาเชอเพอก าจดเชอจลนทรยทอาจมตดอยทบรเวณผวของเนอเยอออกไปกอนดวยสารฆาฟอกฆาเชอ (sterilizing agent) ซงมอยหลายชนด การเลอกชนดของสารดงกลาวรวมทงระยะเวลาในการฟอกทเหมาะสม ส าหรบเนอเยอพชแตละชนด เปนสงส าคญทตองค านงถงและอาจจะตองมการท าการทดลอง สารเคมทนยมใชในหองปฏบตการใชคอ โซเดยมไฮโปคลอไรต (sodium hypochlorte) แคลเซยมไฮโปคลอไรต (calcium hypochlorite) ไฮโดรเจนเปอรออกไซด (hydrogen peroxide) เปนตน ส าหรบเมอรควรกคลอไรด กสามารถใชไดด แตมอนตรายมากกวาสารขางตน

หองปฏบตการสวนใหญใชน ายาฟอกผาขาวทมชอการคาคอ Clorox ซงมโซเดยมไฮโปคลอไรต 5.25 % อตราทใช คอ 10-20 % สารละลายโซเดยมไฮโปคลอไรตจะท างานไดไมดเมอม pH มากกวา 8 และจะมประสทธภาพสงทสดเมอสารละลายม pH 6 และเพอใหการท างานของคลอรนมประสทธภาพมากขนในการฆาเชอบรเวณผวพช ควรเตมน ายาลางจานหรอสบเหลวเขาไปในสารละลายโซเดยมไฮโปคลอไรต เชน Tween20 2 - 3 หยด ในขณะทท าการฆาเชอบรเวณผวพช ตองเขยาสารละลายโซเดยมไฮโปคลอไรต ตลอดเวลาหรออาจวางบนเครองเขยาได เวลาในการฆาเชอดวยสารละลายโซเดยมไฮโปคลอไรตขนอยกบชนดของพช วาทนตอสารละลายคลอรน นานแคไหน ถามความทนทานมากกใชเวลานานขนได มสารเคมหลายชนดและวธการตางๆ ทใชในการท าความสะอาดตวอยางพชใหมความปลอดเชอ ซงอยทดลยพนจในการเลอกใชใหเกดความเหมาะสม กบเนอเยอพชและประสทธภาพทจะไดรบ ซงมแนวทางในการเลอกใช ดงน

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

44

1. สารฆาเชอทมประสทธภาพด ใหเปอรเซนตความปลอดเชอสง

2. ราคาไมแพง และหาซอไดงาย

3. เตรยมไดงาย ไมมขนตอนทยงยาก

4. ไมเปนอนตราย หรอมอนตรายนอยทสดตอสงมชวตทงคนและชนตวอยางพช

ตวอยางการฟอกฆาเชอชนสวนตางๆของพช

ชนสวนปลายยอดและตาขาง

ตายอดและตาขางเปนชนสวนทมเนอเยอเจรญ (meristematic tissue) ทมการตนตว (active) อยตลอดเวลา เหมาะแกการเพาะเลยงเนอเยอ ซงจะมเปอรเซนตความส าเรจสง มขนตอนดงน

1. ตดสวนของปลายยอดหรอตาขางมาท าการแยกเอาใบและกานใบออกใหหมด หรอถามกาบใบทหอหมตาอยกใหแกะออกจนสงเกตเหนสวนของตา กรณทเปนพชมขน ตองขดขนออกเบาๆ จากนนลางชนสวนพชดวยสบเหลวและลางน าสะอาดหลายๆครง

2. แชชนสวนพชในสารละลายคลอรอกซ ความเขมขน 10 % หรอสารละลายโซเดยมไฮโปคลอไรต ความเขมขน 2 % ทเตม tween-20 ในอตราสวน 1-2 หยด ตอสารละลาย 100 มลลลตร หรอประมาณ 0.01 % เพอลดแรงตงผวและชวยใหสารละลายสามารถจบกบผวพชไดด

3. ท าการเขยาเปนระยะ ๆ หรอวางไวบนเครองเขยาเปนเวลาประมาณ 10-15 นาท

4. ลางเอาสารละลายออกดวยน าทนงฆาเชอแลว 3 ครง ๆ ละประมาณ 5 นาท

5. ยายตวอยางไปวางผงบนจานแกวใหแหงพอหมาด ๆ แลวท าการตดแตงพชตวอยาง เพอท าการเพาะเลยงในอาหารตอไป

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

45

ภาพท 5.1 ตวอยางชนสวนปลายยอดของตนหมอขาวหมอแกงลงบนอาหารสงเคราะห

ชนสวนของแผนใบ

ใบพชเปนอวยวะทคอนขางจะบอบบางและช างาย เนองจากประกอบดวยเนอเยอเพยงไมกชนเซลล โอกาสทเนอเยอจะตายหรอไดรบอนตราย จากสารเคมทใชฟอกฆาเชอนนมมาก จงมความจ าเปนทตองระมดระวงเปนพเศษ มขนตอนดงน

1. เลอกใบพชทมความสมบรณ ไมมโรค มาท าความสะอาดดวยสบเหลวและน าสะอาดหลายๆครง เพอขจดคราบฝนและเศษซากของแมลงทอาจตดอยกบใบ และเปนการชวยลดแรงตงผวของใบดวย

2. แชใบในสารละลายคลอรอกซความเขมขน 5 % เวลาประมาณ 5- 10 นาท ท าการเขยาเปนระยะ ๆ หรอวางบนเครองเขยา

3. ลางดวยน าทนงฆาเชอแลว 3 ครง ๆ ละ ประมาณ 5 นาท

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

46

4. ยายตวอยางลงในจานแกว เพอท าการตดแตงตวอยาง และทงไวใหแหง พอหมาด ๆ จงยายลงเลยงในอาหาร

ภาพท 5.2 ตวอยางชนสวนใบของตนกาบหอยแครงบนอาหารสงเคราะห

ชนสวนพชทเปนเมลด

เมลดพชเปนอวยวะทมความแขงแรงทนทานกวาสวนอน ๆ สามารถทนตอสารเคมทมความเขมขนสง ๆ ไดด จงเปนการสะดวกในการฟอกฆาเชอ ประกอบกบเนอเยอตาง ๆ ทอยภายในเมลด คอ คพภะ และใบเลยง มสภาพทมความปลอดเชอสง จงเหมาะแกการใชในการเรมตนการเพาะเลยงเนอเยอ เนองจากเมลดพชมความแตกตางกนมาก จงมเทคนคการฟอกฆาเชอแตกตางกนดวยดงน

1. การฟอกฆาเชอเมลดทมลกษณะแขง มขนตอนดงน

1.1 แชเมลดในแอลกอฮอล ความเขมขน 95 % นานประมาณ 5 นาท เพอการฆาเชอทตดมากบเมลด และชวยขจดคราบไขมนบรเวณผวเมลด

1.2 ถายเอาแอลกอฮอลออก ผงเมลดไวใหแหง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

47

1.3 แชเมลดในสารละลายคลอรอกซ ความเขมขน 20 % เตม tween-20 ประมาณ 0.01 % ทวไวประมาณ 20 นาท

1.4 ท าการลางเมลดดวยน าทนงฆาเชอแลว 3 ครง ๆ ละ ประมาณ 5 นาท

1.5 ยายเมลดลงเลยงในอาหารสงเคราะห

2. การฟอกฆาเชอเมลดทมความออนนมหรอเมลดทยงไมแกเตมท (immature seed) มขนตอนดงน

2.1 ถาเมลดมเยอหอหม เชน เมลดมะเขอเทศจะมลกษณะคลายวน หรอเมลดมะละกอทมผนงเมลดทเปนเยอใส ๆ และสารละลายเหลว ๆ หอหมอย กใหท าการก าจดออกเสยกอน เพราะสงดงกลาวเหลานนเปนตวยบยงการงอกของเมลด

2.2 แชเมลดในสารละลายคลอรอกซ ความเขมขน 15 % เตม tween-20 ประมาณ 0.01 % ทวไวประมาณ 15 นาท

2.3 ท าการลางเมลดดวยน าทนงฆาเชอแลว 3 ครง ๆ ละ ประมาณ 5 นาท

2.4 ยายเมลดลงเลยงในอาหาร

ภาพท 5.3 ตวอยางชนสวนเมลดของกาบหอยแครง

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

48

ชนสวนพชทเปนกงไม

สวนของกงไมประกอบดวยเนอเยอทยงมชวตทจะใชท าการเพาะเลยงเนอเยอได กคอ กลมเนอเยอของทอล าเลยงอาหาร เนอเยอแคมเบยม และเนอเยอตรงใจกลางของ ล าตน ซงเนอเยอดงกลาวอยในสวนภายในของกงหรอล าตน ซงมสภาพทปลอดเชออยแลว ฉะนนการฟอกฆาเชอจงท าเฉพาะผวนอกเทานน ซงมขนตอนดงน

1. น าสวนของกงหรอล าตนมาลนไฟ หรอจมแอลกอฮอลความเขมขน 95 % กอนแลวเผาไฟ กจะสามารถฆาเชอทตดมากบผวของตวอยางได

2. ใชมดผาและตดแยกเอาเฉพาะเนอเยอทยงมชวตอยดงกลาวขางตนลงเลยงในอาหารเพาะเลยง

ชนสวนพชทเปนดอก

การเพาะเลยงอบเรณมวตถประสงคเพอการผลตพชทมโครโมโซมชดเดยว (haploid plant) จากเซลลสรางสปอร (microspore mother cell) ทอยภายในอบเรณ มขนตอนดงน

1. เลอกดอกทยงตม โดยทกลบเลยงและกลบดอกยงไม เปดออก มาท าการฉดพนดวยแอลกอฮอล ความเขมขน 70 % ทวไวใหแหงพอหมาด ๆ

2. แชดอกสารละลายคลอรอกซ ความเขมขน 10 % เตม tween-20 ประมาณ 1 - 2 หยด ทงไวประมาณ 15 นาท โดยเขยาเปนระยะ ๆ

3. ลางดวยน าทนงฆาเชอแลว 3 ครง ๆ ละ ประมาณ 5 นาท

4. ยายดอกลงในจานแกว ผงใหแหงพอหมาด ๆ แลวท าการแกะดอกแยกเอาเฉพาะอบเรณลงเลยงในอาหารเพาะเลยง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

49

ภาพท 5.3 ตวอยางชนสวนดอกของหยาดน าคาง

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

50

กจกรรม

นกศกษาฝกปฏบตในการเตรยมตวอยางพชและเลอกชนดและชนสวนของพชเพอน ามาเพาะเลยง พรอมอภปรายผลรวมกน

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

51

บรรณานกรม

สถาบนวจยและฝกอบรมเกษตรล าปาง. 2556. ความรทางดานการเพาะเลยงเนอเยอพช.

[ออนไลน]. เขาถงไดจาก: http://www.lartc.rmutl.ac.th/ptclab/Tissue Culture

(วนทคนขอมล : 22 มนาคม 2556).

สรวช วรรณไกรโรจน. 2533. เอกสารประกอบการสอนวชาเพาะเลยงเนอเยอพช. ภาควชาพชสวน

คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตรก าแพงแสน. นครปฐม

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

52

บทท 6

ขนตอนของการเพาะเลยงเนอเยอพช

วธการเลยงเนอเยอพช มหลายวธ (สถาบนวจยและฝกอบรมเกษตรล าปาง, 2556)

1. การเพาะเลยงเนอเยอเจรญปลายยอด (shoot tip culture)

บรเวณปลายยอดของพชจะมกลมของเนอเยอเจรญทสามารถแบงตวตลอดเวลา ดงนน การน าเอาเฉพาะเนอเยอเจรญปลายยอดไปเพาะเลยงลงบนอาหารสงเคราะห เรยกวา การเพาะเลยงเนอเยอเจรญ (meristem culture) ถาน าเอาเฉพาะปลายยอดไปเพาะเลยงเรยกวา การเพาะเลยงปลายยอด หรอถามจดก าเนดของใบตดมาดวย เรยกวา shoot tip culture หรอ shoot apex culture

การเพาะเลยงเนอเยอพชโดยใชเทคนคปลอดเชอธรรมดาสามารถปองกนและ ก าจดไดเฉพาะเชอแบคทเรยและเชอราเทานน สวนเชอไวรสไมสามารถก าจดได แตสามารถเลยงก าจดโรคทเกดจากเชอไวรสไดโดยการเพาะเลยงเนอ เยอเจรญ ดงนนการเพาะเลยง เนอเยอเจรญปลายยอดของพชจงเปนเทคนคทใชผลตตนพชปลอดไวรสได เทคนคการเพาะเลยงเนอเยอเจรญปลายยอดของพชสามารถท าไดกบพชเกอบทกชนด เนองจาก เนอเย อเจรญปลายยอดมขนาดเลก จงจ าเปนตองใชกลองจลทรรศนชนด 2 ตา ชวยในการตดเอาเนอเยอ วธการน าเอาเนอเยอเจรญปลายยอดของพชแตละชนดอาจแตกตางกนไปบาง

2. การเพาะเลยงเนอเยอใบ (leaf culture)

ใบพชจะประกอบไปดวยแผนใบ และกานใบ การเจรญเตบโตของใบในระยะเรมแรกอยใกลกบปลายยอด โดยมจดก าเนดของใบเจรญและพฒนามาเปนใบ จดก าเนดของใบประกอบดวยเนอเยอเจรญ สามารถแบงตวไดจนถงระยะหนง จากนนจงมการเปลยนแปลงไปเนอเยอถาวรปฐมภม แผนใบประกอบดวยเนอเยอเอนปเดอมส ทงทางดานบนและดานลาง สวนระหวางกลางเปนกลมเนอเยอของเมโซฟล วธการเพาะเลยงใบหรอเนอเยอจากใบนนจะมความแตกตางกนไปขนอย

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

53

กบชนดของใบพช สวนใหญใบทน ามาเพาะเลยงมกจะใชใบทยงออนอย ซงประกอบดวยเซลลทสามารถแบงตวได เมอน าชนสวนใบมาเลยงบนอาหารสงเคราะห เนอเยอสามารถเจรญเตบโตไปเปนแคลลสหรอเจรญเตบโตเปนตนเลกๆตามบรเวณรอยตดหรอบนผวของใบ (ภาพท 6.1)

ภาพท 6.1 ใบจากตนกาบหอยแครงทสามารถพฒนาไปเปนตนไดเมอเพาะเลยงบนอาหาร

สงเคราะห

3. การเพาะเลยงราก (Root culture)

การเพาะเลยงรากของพชเพอใหสามารถพฒนาใหเปนตน ซงจะท าไดหรอไมนน ไมสามารถทจะก าหนดลงไปได ถงแมวาความส าเรจสวนใหญทรายงานไดท าการเพาะเลยงรากของพชใบเลยงคทเปนไมเนอออนเทานน จงท าใหเกดความเขาใจผดวารากของพชใบเลยงเดยวหรอพชไมเนอแขง เพาะเลยงยาก แมแตพนธทอยในสปชสเดยวกนกมความแตกตางกน

อาหารสงเคราะหทใชเลยงรากนนตองใสน าตาลซโครสเพอเปนแหลงคารบอน แตถาเปนรากของธญญพชอาจใชกลโคสไดด ความเปนกรดเปนดางทเหมาะส าหรบของเจรญของรากคอ 5.0 - 5.5 สวนความเปนกรด-ดาง 6.0 - 6.5 เหมาะส าหรบท าใหเกดรากแขนงไดด ความเขมของแสงในระดบต า ๆ สามารถท าใหการเจรญไดดในรากของพชบางชนด รากของพชบางชนดอาจถกยบยงการเจรญเตบโตเมอไดรบแสง อณหภมทเหมาะสมคอ 25 - 27 องศเซลเซยส

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

54

การน าเอารากของพชทปลกอยในเรอนเพาะช าหรอในแปลงปลก มาท าการเพาะเลยงนนจะมปญหาในการท าใหปราศจากเชอจลนทรยคอนขางยาก เนองจากเชอรา และแบคทเรยจะอาศยอยตามรอยแตกของรากและบางทกอาศยอยระหวางเซลลของพช การก าจดเชอจลนทรยจงอาจท าอนตรายแกรากได ดงนนการเพาะเลยงรากทนยมปฏบตสวนใหญควรน ามาจากการเพาะเลยงเมลดพชในสภาพปลอดเชอ แลวตดรากไปเพาะในอาหาร วธการทจะชวยใหปราศจากเชอไดดกโดยลอกเอาสวนของเปลอกหมเมลดออก การเพาะเมลดในทมดจะชวยในรากเจรญไดด รากเลกๆทเจรญมาจากแคลลสหรอสวนของอวยวะอน ๆ กสามารถน ามาใชเปนชนสวนได

ปจจบนมการเพาะเลยงรากพชทเกดจากการถายยนดวยเชอ Agrobacterium rhizogenes ซงสามารถชกน าใหเกดเปนตนไดเชนกน การเลยงโดยวธนเหมาะส าหรบพชสมนไพรทใชประโยชนทางยาหรอการผลตสารทตยภม (วราภรณ, 2551) (ภาพท 6.2)

ภาพท 6.2 ราก hairy roots ของเจตมลเพลงแดงทเลยงในอาหารเหลวและสามารถพฒนา

ไปเปนตนได

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

55

4. การเพาะเลยงคพภะ (Embryo culture)

คพภะของพชทอยในระยะรปรางกลม (globular stage) ประกอบดวยเซลล 50 เซลล เปนคพภะขนาดเลกทสามารถแยกและน ามาเพาะเลยงให เจรญเตบโตได ความพยายามทจะแยกเอาไซโกต (zygote) ของพชชนสงและเพาะเลยงใหเจรญเปลยนแปลงไปเปนคพภะในหลอดแกวนนยงไมส าเรจ เมอน าคพภะทเจรญเตมทแลวแตมขนาดเลกกวาปกตไปเลยงในอาหาร สงเคราะห คพภะสามารถเจรญเตบโตได ในทางตรงขามคพภะทยงไมมการเปลยนแปลงไป เปนสวนตาง ๆ นนม ความตองการอาหารมากขน อาจตองเตมอาหารเสรม เชน น ามะพราว ในบางกรณกตองใหความเขมขนของน าตาลซโครสเพมเปน 8 - 12 % การใหฮอรโมนพวกออกซนและไซโตไคนนในปรมาณทเหมาะสมกชวยใหคพภะเจรญ ไดดขน

5. การเพาะเลยงรงไข (Ovary culture)

การเพาะเลยงรงไขไดรบความส าเรจในพชบางชนด ซงมลกษณะทางสณฐานวทยาของรงไขแบบงาย ๆ และผลแกเรว ผลทเกดจากการเพาะเลยงรงไขจะมขนาดเลกกวาผลทเจรญมาจากตนโดยตรง การเจรญของรงไขกคลายคลงกบรงไขทเจรญอยบนตน ผลทสดกไมมลกษณะทผดปกต การเพาะเลยงรงไขซงไดรบการผสมแลว จะมเมลดทสมบรณซงสามารถเจรญเตบโตได แตจะมจ านวนของเมลดนอยกวาผลทแกจากตน

จดมงหมายของการเพาะเลยงรงไขสวนใหญกเพอศกษาการเกดผลประโยชน ทนาสนใจของการเพาะเลยงรงไขอกอยางหนงกคอในแงของการผสมพนธ พช เนองจากการผสมพนธพชบางชนดผลมกจะรวงไปกอนทจะแกเตมท ดงนนถาน าเอารงไขทผสมแลวมาเพาะเลยงกแนใจวา จะไดเมลด

ความตองการส าหรบการเลยงรงไข การเลยงรงไขควรดงเอากลบเลยงออกเสยกอนจะชวยใหการเจรญของรงไขดขน ส าหรบรงไขทเอามาจากดอกซงไดรบการผสมแลว 2 - 3 วน อาหารทใชเลยงไมตองใสฮอรโมน ตรงขามกบรงไขทเอามาจากดอกทไมไดรบการผสมตองใหออกซน และบางกรณใหไซโตไคนนหรอจบเบอเรนลนหรอทง 2 อยาง

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

56

6. การเพาะเลยงโอวล (Ovule culture)

การเพาะเลยงโอวลไดดดแปลงมาเพอใชเลยงคพภะ ซงจะเพาะเลยงโอวลกอนทจะเกดมคพภะในขนาดทเหมาะสม จนกวาคพภะมขนาดโตพอทสามารถแยกและเพาะเลยงได โอวลสามารถแยกมาเพาะเลยงไดหลงจากเกดการถายละอองเกสรแลว 2 - 3 วน แตไซโกต ยงไมแบงตว

7. การเพาะเลยงตาดอก (Flower bud culture)

มประโยชนในการศกษาสภาวะแวดลอมทสามารถท าใหเกดการเปลยนแปลงไปเปนสวนตาง ๆ ของดอก เชน เกสรตวผ เกสรตวเมย กลบดอกและสวนอน ๆ ไดอยางไร นอกจากนนยงเปนประโยชนในการศกษาเกยวกบการก าหนดเพศ (sex expression) และ ปรากฏการณของการสบพนธอน ๆ

การเพาะเลยงเนอเยอใหออกดอกในหลอดแกวอาจท าได 3 วธ คอ

1. ตดตาดอกน าไปเพาะเลยงโดยตรง

2. กระตนใหปลายยอดทเลยงออกดอก

3. ดอกเกดจากสวนอน ๆ ทน าไปเพาะเลยง เชน ล าตน ใบ รากและสวนอน ๆ

ภาพท 6.3 ตนหยาดน าคางทเลยงในอาหารและสามารถออกดอกไดในสภาพปลอดเชอ

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

57

ขนตอนการเพาะเลยงเนอเยอพช

ในการเพาะเลยงเนอเยอพชไมวาจะมวธการเลยงแบบใดดงทกลาวขางตน ซงทกวธการเลยงจะตองผานขนตอนหลกทส าคญ 4 ขนตอน คอ

การเพาะเลยงเนอเยอพชประกอบดวยขนตอนหลกทส าคญ 4 ขนตอนคอ

1. การฟอกฆาเชอชนสวนพช

2. การขยายพนธพชเพอเพมปรมาณ

3. การยดตนและการชกน าใหออกราก

4. การยายออกปลกในสภาพธรรมชาต

ขนตอนการฟอกฆาชนสวนพช

สวนใญแลวการตดเชอจลนทรยในการเพาะเลยงเนอเยอพชนนเกดจากพช (เชออยภายในพชหรอภายนอกพช) เกดจากอาหารซงฆาเชอไมหมดหรอมแมลง มด ตวเลกๆเดนเขาไป เกดจากอากาศไมสะอาด และผปฏบตงาน

ในขนตอนการฆาเชอชนสวนพชนน จะน าพชมาตดหรอลอกกาบทหมออก ลางดวยสบเหลวหรอน ายาลางจาน แลวลางดวยน าสะอาดหลายๆครง กอนทจะน าเขาหองปฏบตการยายเนอเยอพช เพอท าการฟอกฆาเชอดวยสารฆาเชอตอไป ซงวธการฆาเชอเรมจากการแชชนสวนพชในสาปฏชวนะเพอก าจดเชอแบคทเรย แลวจงน าไปจมแอลกอฮอล 70% ประมาณ 1 นาท จากนนน ามาแชในสารละลายคลอรอกซ 10-20% ขนอยกบขนาดและชนดของชนสวนพช ท าการลางดวยน านงฆาเชอประมาณ 3-4 ครง แลวตดเนอเยอบางสวนทถกท าลายดวยสารฆาเชอออกไป น ามาเลยงบนอาหารสงเคราะห

วธการดแลรกษาพชในสภาพปลอดเชอ

สภาพแวดลอมทส าคญในการเพาะเลยงเนอเยอ คอ แสง และอณหภม สวนความชนนนจะถกควบคมอยแลวเมอเลยงในสภาพปลอดเชอ การเพาะเลยงเนอเยอโดยมากจะเลยงทอณหภม

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

58

ประมาณ 20 – 25 oC ใชแสงจากหลอดฟลออเรสเซนต โดยใหมความเขมขนของแสงประมาณ 3,000 ลกซ แสงเทานกเพยงพอในการใหพชเจรญอยไดปกต แตไมเพยงพอตอการสงเคราะหแสงซงไมจ าเปนในระยะนเนองจากมน าตาลอยในอาหารแลว ชวงแสงใหประมาณ 12 - 16 ชวโมง บางครงใหไดรบแสงตลอด 24 ชวโมง

นอกจากนเนอเยอพชทเลยงทงบนอาหารกงแขงหรอในอาหารเหลวจะตองมการเปลยนอาหารใหมตามเวลาอนเหมาะสม การเลยงเนอเยอพชไวในอาหารเดมเปนเวลานาน จะท าใหเกดการขาดธาตอาหารและมของเสยท เนอเยอพชถายออกมาสะสมอย เปนผลใหเนอเยอหยดเจรญเตบโตและตายได โดยทวไปถาเปนอาหารแขงจะยายอาหารเพาะเลยงทก 4 - 6 สปดาห และอาหารเหลวจะท าทก 2 - 4 สปดาห แลวแตชนดของพช การถายเนอเยอในระยะแรกควรน าเนอเยอทไดทงหมดถายลงอาหารใหมจนกระทงไดเนอเยอทอยในสภาพทแขงแรงสมบรณ ชนสวนพชทพอเหมาะจะท าใหเนอเยอมโอกาสรอดชวตไดด แสงสวางมสวนชวยใหเนอเยอเจรญเตบโตไดเรวขน สงส าคญทตองระวงในการถายเนอเยอจะตองใชเทคนคทปราศจากเชอ

ขนตอนการขยายพนธเพอเพมปรมาณ

เมอเนอเยอพชหรอชนสวนพชสมารถเจรญเตบโตไดในสภาพปลอดเชอ จดประสงคตอไป คอ การเพมจ านวนยอด พชบางชนดจะเกดรากในอาหารพนฐานเชนเดยวกบกงปกช าเลก ๆ ซงเปนสงทไมตองการเนองจากวาควรมการเจรญเพมปรมาณยอดกอน พชบางชนดผลตยอดจ านวนมากโดยไมใชสารควบคมการเจรญเตบโต ดงนนการใชอาหารจงควรพจารณาระดบของสารควบคมการเจรญเตบโตทพชตองการ การเพมจ านวนท าไดหลายวธ

- ปลายยอดมการเจรญยดยาวเปนขอและปลอง ตดแตละขอไปขยายพนธได

- ตาขางผลตยอด ยอดดงกลาวผลตจากตาบรเวณซอกใบ ท าใหไดยอดจ านวนมาก

- พชหลายชนดสรางราก ยอด หวจากชนสวนพชซงปกตไมสรางอวยวะดงกลาววธการนเรยกวา organogenesis เปนวธทมประสทธภาพกวา 2 แบบแรก ตวอยาง เชน ใบ 1 ใบ สามารถผลตตาและยอดใหมไดเปนจ านวนมาก แตละตนจะมลกษณะเหมอนตนแมทกประการ

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

59

- การสรางเอมบรออยด (somatic embryogenesis) เปนวธทมศกยภาพมากทสดในการขยายพนธ โดยขนแรกเซลลเดยวจะผลตเอมบรออยด และพฒนาไปเปนตน การสราง เอมบรออยดเกดไดทงในเซลลแขวนลอยหรอการเลยงแคลลส การชกน าใหเกดเปนเอมบรออยดตองใชอาหารทมไนโตรเจนต ากวาปกต

โดยทว ๆ ไปอาหารทใชเพาะเลยงปกตแลว การเพาะเลยงเนอเยอเพอชกน าการเกดยอด (shoot initiation) และเพมจ านวนยอด (shoot multiplication) สามารถใชอาหารทมสวนประกอบหรออาจใชสตรอาหารทใกลเคยงกนได แตเนอเยอหรอชนสวนมความตองการกระตนจากสารควบคมการเจรญเตบโตทแตกตางกน พชสวนมากเปลยนแปลงพฒนาเปนอวยวะถาไดรบสารควบคมการเจรญเตบโต 2 กลม คอ ออกซน และ ไซโตไคนน ทงนผนแปรขนกบชนดของพช ระยะการเจรญเตบโตของชนสวน และระดบหรอสดสวนของสารควบคมการเจรญเตบโต ทง 2 ชนดทใชในสตรอาหาร มขอสงเกตส าคญคอ

- ถาสดสวนของไซโตไคนนตอออกซนสงขน (ไซโตไคนน > ออกซน) จะกระตนการเกดยอด (shoot formation)

- ถาสดสวนของออกซนตอไซโตไคนนสงขน (ออกซน >ไซโตไคนน) จะกระตนการเกดราก (root induction)

อยางไรกตามในกรณการสรางยอดและกระตนการแตกก งขาง สารควบคมการ เจรญเตบโตทง 2 ชนดนจะตองมอยในอาหารทใชเพาะเลยง ยกเวนในพชบางชนดทอาจตองการไซโตไคนนเพยงอยางเดยวเทานน ในทางปฏบตตองมการทดสอบหาสดสวนของสารควบคมการเจรญเตบโตทเหมาะสม

นอกจากนหลงจากผลตยอดไดจ านวนมากพอแลว จ าเปนตองใหยอดเหลานไดรบสภาพทเหมาะสมเพอเกดการยดตวของยอด โดยเลยงบนอาหารทไมมสารควบคมการเจรญเตบโต การเตมจบเบอเรลลนในอาหารมผลชวยท าใหปลองยดยาวขนได ถายอดมการผลตไดมปลอง ยาวพอแลวกไมจ าเปนตองผานขนตอนน จ านวนพชทผลตไดจากการเพาะเลยงเนอเยอ จะแตกตางไปตามสภาพทเลยง และ ชนดของพช ในการเพาะเลยงเนอเยอหรอชนสวนพชเพยงชนเดยวตอป ขนอยกบอตราการขยายพนธและจ านวนครงทมการถายเนอเยอ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

60

อตราการทวคณจ านวนตนสามารถค านวณไดเมอทราบสงส าคญ 2 ประการ คอ

1. อตราการขยายพนธ (ยอดตอชนสวน)

2. ระยะเวลาในการยายถายเนอเยอ (สปดาหตอครง)

ปจจยทมผลตอการเพมจ านวนตน

1. อาหารเพาะเลยง (culture media)

การเพาะเลยงเพอเพมจ านวนยอดสามารถใชอาหารทม สวนประกอบของเกลอสตร MS-salts ไดผลดและอาจใชสตรอาหารทใกลเคยงกนได อยางไรกตามในบางพชความเขมขนของเกลอดงกลาวอาจสงเกนไปหรอสงเกนความจ าเปน ความตองการสารกระตนการเจรญเตบโตของเนอเยอผนแปรขนกบระบบทใชใน การเพาะเลยง และวธการขยายหรอเพมจ านวนยอด

2. ฮอรโมน (hormones)

พชสวนมากเปลยนแปลงพฒนาเปนอวยวะถาไดรบฮอรโมน 2 กลม คอ ออกซน และไซโตไคนน ทงนผนแปรขนกบชนดพช ระยะการเจรญเตบโตของชนสวนพช และระดบหรอสดสวนของฮอรโมนทง 2 ชนด ทใชในสตรอาหาร ซงมขอสงเกตส าคญคอ

- ถาสดสวนของไซโตไคนนตอออกซนสงขน (ไซโตไคนน > ออกซน) จะกระตนการเกดยอด (shoot formation)

- ถาสดสวนของออกซนตอไซโตไคนนสงขน (ออกซน > ไซโตไคนน) จะกระตนการเปลยนแปลงพฒนาเพอก าเนดราก (root differentiation)

อยางไรกตามในกรณการสรางยอด (adventitious shoot formation) และกระตน การแตกกงขาง (enhanced axillary branching) ฮอรโมนทง 2 ชนด นจะตองมอยในอาหารทใชเพาะเลยง ยกเวนในพชบางชนดทอาจตองการไซโตไคนนเพยงอยางเดยวเทานน

3. แสงและอณหภม (light and temperature)

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

61

โดยปกตแลวการเพาะเลยงเนอเยอพชในอาหารสงเคราะหไมตองพงการสงเคราะหแสงมากนก แสงกยงมความจ าเปนตอกระบวนการเปลยนแปลงพฒนาทางดานสณฐานทถกควบคมดวยพนธกรรม โดยทว ๆ ไปแลวตองการความเขมแสงในชวง 1,000 - 5,000 ลกซ ทงนขนกบชนดของ ส าหรบความยาวนานของชวงแสง (photoperiod) กลาวไดวาไมคอยมขอจ ากด และนยมใชแสงนาน 16/8 ชวโมง กลางวน/กลางคน ส าหรบอณหภมคงท 25 oC นยมใชมากทสด แมวาในพชบางชนดอาจไดผลดกวาหากใชอณหภมสลบทสงหรอต ากวานกตาม

อาการฉ าน า (vitrification หรอ hyperhydricity)

บางครงอาจเกดขนได ถาหากมการยายเนอเยอบอยครง ซงจะท าใหเนอเยอ ลดความแขงแรง และผาเหลางาย ดงนนในการขยายพนธจงควรรกษาแมพนธไวโดยทไม ยายเปลยนอาหารบอยครง และการยายเปลยนอาหารบอยครงยงท าใหเกดรากมากขนดวย

การชกน าการเกดราก

หลงจากทไดจ านวนยอดตามตองการแลว ระยะตอไปคอ การชกน าใหยอดเกดรากในสภาพปลอดเชอ หรอโดยการปกช าธรรมดา ส าหรบพชทออกรากงาย การยายออกสภายนอกเพอใหออกรากจะประหยดกวา เพราะไมตองเสยคาใชจายในการเตรยมอาหารเพมและไมตองท างานภายใตสภาพปลอดเชอ ถาเปนพชทออกรากยากควรใหออกรากในอาหารทมการเตมสารควบคมการเจรญเตบโตกอนยายออกปลก

การใหพชออกรากภายนอกหลอดแกวหรอขวด จะตองจดสภาพการเลยงดใหเหมาะสมควรใหความชนสงเพอปองกนการแหง เหยวของพช อาจจมกงพชขนาดเลกทผลตไดใหออกรากไดในออกซนชนดผง หรอชนดน าเหมอนการปกช ากงธรรมดา ขอดของการใหกงพชออกราก ภายนอกคอ ปกตรากทสรางในสภาพหลอดแกว จะไดรบการปรบสภาพใหเหมาะสมกบสภาพน าหรออาหารทไดรบ แตไมไดปรบตวใหเขากบสภาพดน ดงนนรากเหลานอาจท างานไมดในสภาพดนปลก และจะตองสรางรากใหมทปรบสภาพไดในดนขนมาแทนหลงยายลงดน การยายลงดนเพอใหออกรากท าใหพชไมเสยพลงงานในการสรางรากชนดใหม ในพชบางชนดจะเหนรากฝอยเกดขนในระยะทมการเพมจ านวนตน บางชนดสามารถสรางรากไดในอาหารทไมมไซโตไคนน บางชนดกตองการสารควบคมการเจรญเตบโตในการสรางราก ทงนพชแตละชนดตองการสภาพ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

62

การเลยง สวนประกอบของอาหาร และระดบของสารควบคมการเจรญเตบโตทแตกตางกนไป เชนเดยวกบระยะอนของการขยายพนธในสภาพปลอดเชอ ปจจยตาง ๆ เชน pH และแสง เปนตนมผลเกยวของ การปรบสภาพของตนพชขนาดเลกทผลตไดกอนทจะยายลงไปยงอาหารทออก รากกชวยสงเสรมการเกดรากได เชน การใหแสงหรอการใหความเยน การปรบสภาพ ดงกลาวกชวยสงเสรมการเกดรากไดเชนกน

การยายตนพชออกปลกในสภาพธรรมชาต

เมอจะน าตนพชทไดจากการเพาะเลยงเนอเยอออกมาสสภาพแวดลอมภายนอก ตนพชตองเผชญกบสงแวดลอมใหม และจะเครยดถาไมมการเตรยมปองกนระยะน ซงถอวาเปนระยะวกฤตทสดในการขยาย พนธพชในสภาพปลอดเชอ อตราการตายของตนพชจะสงมากถามการจดการไมดพอ เนองจากในสภาพปลอดเชอพชไดรบความชนสง ไมมเชอปนเปอน ไดรบอาหารและความเขมของแสงทเหมาะสม ดงนนจงตองใหพชมการปรบตวทละนอยกอนยายออกปลก เพราะถาพชพบสภาพทเปลยนแปลงอยางรวดเรวจะตายได ตวอยางเชน ใบทผลตในสภาพหลอดแกวภายใตความชนสงและคายน าต า จะมชนของควตเคล (cuticle) ทบางและ ปากใบเปดมาก และการเลยงในสภาพความเขมของแสงต า ท าใหมการสรางคลอโรฟลลต า การใหพชปรบตวนนอาจจะมการลดความชนในขวดกอนโดยการคลายฝาขวด การเพมปรมาณวน การลดปรมาณน าตาล และการเพมความเขมของแสงให 1 สปดาหกอนทจะมการยายออกปลก อาจชวยใหเกดการสรางคลอโรฟลลเพมขนท าใหการสงเคราะหแสงเพมขน การดแลตนพชทยายออกมาจากสภาพปลอเชอจะเหมอนกบการดแลตนออนหนอกงออนปกช า ซงจะตองใหไดรบความชนสงและความเขมของแสงต าในตอนแรก แลวจงเรมเพมความเขมของแสง และลดความชนในสปดาหตอมา ส าหรบเครองปลกทใชในการปลกนนควรเกบความชนไดด และมการระบายน าด ดนทใช ไมจ าเปนตองฆาเชอ แตควรระวงเรองความสะอาดใหมากภายใตสภาพความชนสง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

63

สงทควรระวงในการยายปลกพช (มณฑา, 2540)

1. ตองลางวนออกจากรากใหสะอาด เนองจากอาหารวนเปนอาหารทดและเหมาะแกการเจรญของเชอจลนทรย

2. ควรมการปองกนก าจดศตรพชตางๆ เชน การใชสารปองกนก าจดเชอรา เชอแบคทเรย แมลงศตร และหอย

3. วสดปลกทใชควรละเอยดมการระบายน าด ซงจะท าใหรากถกท าลายนอยลง

4. ควรระวงเรองความเคมของวสดปลก

5. พชทยายปลกใหมๆ ควรอยในโรงเรอนทมความชนสมพทธสง และอณหภมไมควรสงเกนไป

สรปขนตอนของการเพาะเลยงเนอเยอพชดงภาพ

ภาพท 6.4 ขนตอนการเพาะเลยงเนอเยอพชกนแมลงสกลหยาดน าคาง

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

64

บรรณานกรม

มณฑา วงศมณโรจน. 2540. การยายปลกพชจากการเพาะเลยงเนอเยอพช. ใน เอกสารประชม

วชาการ ครงท 14 เรอง เทคนคของวธการทางวทยาศาสตรชวภาพ ณ ฝายปฏบตการวจย

และเรอนปลกพชทดลอง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร ก าแพงแสน นครปฐม.

11-14 ธนวาคม

วราภรณ ภตะลน. 2551. การเพาะเลยงเนอเยอพชสมนไพร: แนวทางการศกษาเพอผลตสารทตยภม

ทมฤทธทางเภสชวทยา. บรษทขอนแกนพมพพฒนา จ ากด. ขอนแกน. 120 หนา.

สถาบนวจยและฝกอบรมเกษตรล าปาง. 2556. ความรทางดานการเพาะเลยงเนอเยอพช.

[ออนไลน]. เขาถงไดจาก: http://www.lartc.rmutl.ac.th/ptclab/Tissue Culture

(วนทคนขอมล : 22 มนาคม 2556).

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

65

บทท 7

การเจรญและการพฒนาของเนอเยอพชในสภาพเพาะเลยง

เมอน าชนสวนใดๆ ของเนอยอพช ไปเลยงบนอาหารบนอาหารสงเคราะหเพอใหเกดเปนตนทสมบรณ จะมกระบวนการเปลยนแปลงในลกษณะตางๆจากเนอเยอธรรมดา (organized tissue) เชน ล าตน ใบ ราก มการพฒนาเปนเนอเยอทไมประกอบเปนอวยวะ (unorganized tissue) เชน แคลลส ซงเปนกลมเซลลทยงไมพฒนาเปนเนอเยอ (undifferentiated cell) แตเมอแคลลสไดรบอาหารและสภาพการเลยงทเหมาะสม กจะสามารถพฒนาไปเปนยอดและรากได การเพาะเลยงเซลล เนอเยอ และอวยวะมประโยชนในการศกษาการพฒนาการของเนอเยอ และความสมพนธระหวางเนอเยอพชกบ สารควบคมการเจรญเตบโตของพช ดงนนการพฒนาไปเปนตนพชจะผานกระบวนการ 2 กระบวนการ (สถาบนวจยและฝกอบรมเกษตรล าปาง, 2556 ; สมพร, 2549)

1. การเกดออรแกนโนเจเนซส (organogenesis) คอ การพฒนาเปนอวยวะ เชน การเกดยอด และราก

2. การเกดเอมบรโอเจเนซส (embryogenesis) คอ การเพาะเลยงเนอเยอผานการเกดแคลลส แลวจงมการพฒนาไปเปนตน ซงการพฒนาการของกระบวนการดงกลาวมดงนคอ เปนรปกลม รปหวใจ รปตอรปโต และตนกลา ตามล าดบ

การพฒนาการของตนพชผานกระบวนการตางๆสามารถสรปการเปลยนแปลงทางสณฐานวทยาไดดงภาพ (สมพร, 2549)

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

66

Eeplant isolation

Callus and unorganized growth

Meristematic growth centers

Organization

Organogenesis Unipolar structure Embriogenesis Unipolar structure

ภาพท 7.1 การเปลยนแปลงชนสวนของพชเมอเพาะเลยงในสภาพปลอดเชอ

ทมา: Soh และ Bhojwani, 1999

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

67

การพฒนาของเอมบรโอจากการเลยงในสภาพปลอเชอ

1. การพฒนาของเอมบรโอจากไขทไดรบการผสมหรอไซโกต โดยเรมจากไซโกต แบงตวออกเปน 2 เซลล ทมขนาดไมเทากน เซลลทมขนาดเลก เรยกวา apical cell ซงอยทางดานบน สวนเซลลทมขนาดใหญกวาอยทางดานลาง เรยกวา basal cell สวนทจะพฒนาเปนเอมบรโอ กคอ สวนของ apical cell ซงจะแบงตวเพมจ านวนเซลลมากขนเรอย ๆ จนมลกษณะเปนกอนกลม และเรยกระยะนวา ระยะ globular-shaped ตอจากนนกจะเปลยนเปนรปหวใจ จงเรยกระยะนวา ระยะ heart-shaped จนสดทายเมอเอมบรโอพฒนาเจรญเตมทจะมรปรางเหมอนตอรปโต จงเรยกระยะนวา torpedo-shaped สวนของ basal cell จะแบงตวทางดานขนาน (periclinal division) เทานน จะไดเปนเซลลแถวยาว ทเรยกวา suspensor ซงท าหนาทชวยยดตวเอมบรโอใหฝงอยใน mucellus และชวยดดซมอาหารใหแกเอมบรโอ เซลลทอยตรงรอยตอระหวางตวเอมบรโอกบ suspensor เรยกวา hypolysis cell ซงท าหนาเปนจดก าเนดของราก (radicle) เมอเอมบรโอพฒนาเจรญเตมทแลว สวนของ suspensor กจะหมดหนาทและ สลายตวไป

2. การพฒนาของเอมบรโอทไดจากเนอเยอของแคลลส เรมจากเซลลบางเซลลในกอนของแคลลสทมความตนตวมากกวาเซลลอน ๆ สงเกตไดจาการทดสอบดวยสยอม ซงจะตด สเขมกวาเซลลอน ๆ และเมอตดผานเซลล และตรวจสอบดวยกลองจลทรรศน พบว า เซลลเหลานนมไซโตพลาสซมทเขมขนและมออรแกนเนลหนาแนน เซลลดงกลาวนจะแบงตวเพมจ านวนขนอยางรวดเรวจนไดเปนกลม และปดยนออกมามลกษณะคลายระยะ globular-shaped ตอมากพฒนาเปนระยะ heart-shaped และ torpedo-sphaped

3. การพฒนาของเอมบรโอจากเซลลผว (epidermis cell) เซลลผวของพชจะพบไดทใบ กานใบ และล าตนทยงออนอย แตเซลลผวทนยมน ามาท าการเพาะเลยงเนอเยอสวนใหญ จะใชจากสวนของใบ เพราะใบมลกษณะเปนแผนบาง มพนทผวมาก ม เซลลผวทงดานบน (upper epidermis) และดานลาง (lower epidermis) การพฒนาของเอมบรโอจะเรมจากเซลลบางเซลลจากเซลลผว มการตนตว เปลยนแปลงไปเปนเซลลเจรญ ซงมการแบงตวอยางรวดเรว ในขณะทเซลลอน ๆ ขางเคยงไมมการแบงตว จนตอมากจะเกดเปนลกษณะ globular-shaped และพฒนาตอไปเปน heart-shaped จนในทสดกเปนเอมบรโอทสมบรณ รปรางแบบ torpedo-shaped อนงจาก

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

68

การศกษาการพฒนาของเอมบรโอจนซสของแผนใบ พบวา นอกจาก เซลลชนผวแลว เซลลชนอน ๆ คอ palisade cell และ spongy cell กสามารถทจะชกน าใหเกดเอมบรโอจนซสไดเหมอนกน

4. การพฒนาของเอมบรโอจากการเลยงเซลลเดยว (single cell culture) เซลลเดยวอาจไดมาจากการยอยเนอเยอดวยเอมไซม (pectinase enzyme) หรอไดจากการแยกเซลลจากแคลลส การเพาะเลยงกระท าในอาหารเหลว จงเรยกวธการเลยงเซลลแบบนวาการเลยงเซลลแขวนลอย การพฒนาของเอมบรโอเรมจากเซลลเดยว ๆ แบงตวออกเปน 2, 4 เซลล และทวคณไปเรอย ๆ จนไดเปนกลมเซลล ตอมาพฒนาเปนกอนกลม ๆ (globular-shaped) เจรญตอไปเปน heart-shaped และ torpedo-shaped ในทสด (สถาบนวจยและฝกอบรมเกษตรล าปาง, 2556)

ขอแตกตางระหวาง organogenesis และ embryogenesis มดงนคอ

1. การเชอมตอระหวางยอดและราก (shoot-root connection)

ในการเกดออรแกนโนเจเนซสนน การเกดยอดและรากจะเปนอสระตอกน คอ การเกดยอดและรากอาจจะไมตดตอกนกได รากอาจจะเกดจากบรเวณหนง สวนยอดจะเกดอก บรเวณหนง แมบนแคลลสกอนเดยวกน แตในบางครงอาจจะพบวา เนอเยอทเกดยอดและรากอยใกลกนอาจจะเจรญตดกนได หรอเนอเยอสวนยอดดานโคน อาจจะสามารถเกดรากขนมาจนเกดเปนตนพชทสมบรณได สวนในเอมบรโอเจเนซสสวนยอดและรากจะตองตดตอกน เน องจากพฒนามาจากเซลล ๆ เดยวกน

2. Polarity การเกดยอดหรอรากในแคลลสนน ขนอยกบปจจยภายนอกหรอสงทจะมากระตนใหเกดเปน meristematic cell และ meristematic cell เหลานจะพฒนาไปเปนยอดหรอรากกได ดงนนจงเชอวา polarity ของออรแกนโนเจเนซส เสยไป หรอ ไมม polarity สวนใน เอมบรโอเจเนซสนนจะม polarity ซงเปนแบบ bipolar เนองจากการพฒนาจากเซลล ๆ เดยวเปนกลมเซลลขน ดานหนงของกลมเซลลเหลานจะพฒนาไปเปนยอดเจรญขนไปบนอากาศ อกดานหนงพฒนาเปนราก เจรญลงสแนวดง เหมอนตนพชทเจรญทว ๆ ไป

3. การเชอมตอระหวางทอน าทออาหาร (Vascular bundle connection) ทอน าทออาหารของยอดและรากในขบวนการออรแกนโนเจเนซสอาจจะตอหรอไมตอกนกได แตโดยทว ๆ ไป มกจะตอถง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

69

กน โดยจะตอผานเนอเยอเดม แตในขบวนการเอมบรโอเจเนซส ทอน าและทออาหารของยอดและรากจะเชอมตอกน

การพฒนาของแคลลส

การพฒนาไปเปนยอดและ/หรอรากของแคลลส อาจจะผานขบวนการ ออรแกนโนเจเนซส หรอ เอมบรโอเจเนซส กได ทงนขนอยกบลกษณะของเซลล เชน ถาหากเกาะตวเปนกลม การพฒนาไปเปนตนและ/หรอรากจะผานขบวนการออรแกนโนเจเนซส ถาเปนเซลลเดยว การพฒนาไปเปนตนพชทสมบรณจะผานขบวนการเอมบรโอเจเนซสคลายกบ เอมบรโอ จงเรยกวา somatic embryogenesis

การก าหนดการพฒนาของแคลลส (Determination in Callus)

แคลลสเปนกลมเซลลทสามารถชกน าใหเจรญเตบโตไดจากหลายทาง ขนกบสารควบคมการเจรญเตบโตและสารเคมอน ๆ ทเตมลงในอาหาร พชหลายชนดโดยเฉพาะยาสบสามารถชกน าใหเกดแคลลสจากการเปลยนแปลงพฒนา ของราก และ/หรอ ล าตน ขนกบสดสวนของออกซนตอไซโตไคนน แคลลสบางชนดกลบไมเปนเชนนเพราะไมมการตอบสนอง เชอกนวาการทเซลลมความสามารถแรกเรมทจะเปลยนแปลงไปไดเปนสง จ าเปนอนดบแรก และอาจตองมการจดสภาพเพาะเลยงทเหมาะสมเพอชกน าใหเกดแคลลส จากนนเซลลจะมความสามารถ (competent) ทจะเปลยนแปลงการพฒนาหรอก าเนดพฒนาการอน ๆ กลาวไดวาเซลลมความพรอมและมการก าหนดพฒนาแลว กระบวนการทงสองนจ าแนกไดจากเซลลทมขนตอนการพฒนาอยางใหมเกดขน แตไมใชแยกออกมาจากขนตอนการพฒนาเดมทเปนอย แคลลสของพชบางชนดการเปลยนแปลงของกระบวนการเหลานสามารถชกน าและทด สอบได

แคลลสในกรณทมการก าหนดพฒนา (Callus as Determined Cells)

การก าหนดพฒนาของเซลลเปนสงจ าเปนในการก าเนดเปนโครงสรางตาง ๆ กตาม การทดลองโดยใชแคลลสชวาการก าหนดพฒนาเกดขนไดในเซลลทยงไมมการ พฒนาเปนอวยวะ ในรากปม (crown gall) ซงเซลลจะอยเปนกลมคลายแคลลส และไมมการพฒนาเปนอยางอน หรอในกรณเกดสภาพเปนกระบวนการทแคลลสซงปกตตองการ สารควบคมการเจรญเตบโตบางอยางท

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

70

จ าเพาะกลบไมตองการสารดงกลาว หรอกลาวอกนยหนงเปนอสระตอสารควบคมการเจรญเตบโตทไดรบจากภาย นอก จงสามารถเจรญเตบโตตอไปไดแมจะไมไดรบสารเหลานนกตาม ลกษณะดงกลาวเทาทพบคอ ในกรณออกซนและไซโตไคนน ส าหรบสารอน ๆ โดยปกตไมจ าเปนตองเตมลงไปในอาหารเพาะเลยง แมในบางกรณอาจจ าเปนตองเตมลงไปเพอยบยงการเกดอวยวะ หรอไปกระตนการเจรญเตบโตของคพภะ เซลลทไมตองการสารควบคมการเจรญเตบโตดงกลาวสามารถชกน าใหเกดได แตความตองการเฉพาะเซลลทไดจากลกผสมทมการสรางรากปมจะเจรญเตบโต ในอาหารทไมตองเตมสารควบคม การเจรญเตบโต จงกลาวไดวามความสามารถเกดรากปมไดเองแคลลสทสามารถสงเคราะหออก ซนและไซโตไคนนไดเองพบไดในพชหลายชนด

การก าหนดพฒนาของแคลลสเพอก าเนดคพภะ (Determination in Callus : Embryogenesis)

การสรางคพภะจากเซลลรางขณะเพาะเลยง (somatic embryo หรอนยมเรยกวา embryoids เพอใหตางจาก zygotic embryos ทเกดจากการปฏสนธของเซลลเพศ) เกดขนไดในแคลลสบางชนดเทานนกลาวคอ เฉพาะแคลลสและบางเซลลเทานนทมความสามารถสรางคพภะโดยไมตองผาน กระบวนการสรางเซลลเพศมารวมกนตามปกต การก าเนดคพภะในกรณนเกดโดยตรงจากเซลลทมความพรอมซงเรยกวา pre-embryonic determined cells (PEDC) เมอเซลลเหลานเกด dedifferentiation และเพมจ านวนเปนแคลลสกอนทจะมสภาพเปน PEDC เรยกเซลลเหลานวา induced embryogenic determined cell (IEDC) สมมตฐานทเกยวของคอ PEDC นนมความสามารถในการเกดคพภะ และตองการสภาวะแวดลอมทเหมาะสมเพอการก าหนดพฒนาไปเปนเซลลคพภะ ขณะท IEDC นนตองการชกน าใหมความสามารถเสยกอนทจะเรมมการก าหนดพฒนาเปน เซลลคพภะ เซลล PEDC นนรวมไปถงแคลลสทสามารถสรางคพภะไดโดยตรง เชนกรณของ epidermis cells ของ Ranunculus celeratus และ nucellar cells ของผลสม (citrus) ซงสามารถสรางคพภะไดโดยไมตองใชเพศ ขอสงเกตทพบเสมอคอ แคลลสทมสภาพเปนเซลลคพภะนนแรกสดตองไดรบออกซนสงเคราะห 2,4-D จากนนจงยายไปไวในอาหารทปราศจาก 2,4-D จะชกน าใหเกดคพภะได แคลลสดงกลาวเชอวาเปน IEDC และการไดรบ 2,4-D ท าใหเกดความสามารถพฒนาเปนคพภะเมอยายสงอาหารทแตกตางไปจากเดม แคลลสทเลยงจาใบถวอฟฟลฟา (Medicago sp.) และ Convolvulus sp. พบวาความสามารถในการก าเนด คพภะ ถกชกน าในอาหารชนดหนง และการก าเนดอวยวะ จะเกดขนในอาหารอกชนดหนง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

71

ปจจยทมผลตอการเจรญและพฒนาของเนอเยอ

1. ปจจยทางดานเคม

1.1 ธาตอาหาร

พชแตละชนดหรอแตละอวยวะตองการอาหารทแตกตางกนทงชนดและปรมาณ ฉะนนจงมความจ าเปนในการเลอกสตรอาหารใหเหมาะสมกบพชทจะท าการเพาะเลยง ซงผคดคนไวมากมายหลายสตร ตอไปนจะขอกลาวถงธาตอาหารบางตวทมบทบาทอยางส าคญใน การชกน าใหเกดเอมบรโอเจเนซสเพอเปนแนวทางในการปรบใชควบคไปกบการเลอกสตรอาหาร

- ธาตโพแทสเซยม (K) ชวยสงเสรมใหเกดเอมบรโอเจเนซส

- การลดปรมาณของไนโตรเจน (N) ใหต ากวาระดบปกต ในสตรอาหารชวยสงเสรมใหเกดเอมบรโอเจเนซสดขน

- น ามะพราวสงเสรมการเกดเอมบรโอเจเนซส

- น าตาลแซคคาโรส (saccharose) ทระดบความเขมขน 2 - 3 % ชวยสงเสรมใหเกดเอมบรโอเจเนซส

- ธาตแคลเซยม (Ca) ในปรมาณสง จะยบยงการเกดเอมบรโอเจเนซส

1.2 สารควบคมการเจรญเตบโต (plant growth regulators)

ซงมทงสงเสรมและยบยงในการเพาะเลยงเนอเยอพช สวนควบคมการเจรญเตบโตมความส าคญอยางยงเพอเปนแนวทางในการเลอกใช ทมผลตอการชกน าใหเกดเอมบรโอเจเนซส

- 2,4-D มความส าคญในการชกน าใหเกดเอมบรโอเจเนซส

- จบเบอเรลลค แอซด ยบยงการเกดเอมบรโอเจเนซส

- 7 aza-indole เปนสารทยบยงการสงเคราะหออกซน จงมผลในดานยบยงตอเอมบรโอเจเนซส

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

72

- เอททลน ยบยงการเกาะกลมของเซลลในระยะเรมแรก

- BAP, IAA, IBA และไคนตน ยบยงเอมบรโอเจเนซส

- เซอตน และ ALAR (succinic acid 2,7-methyl-hydrazide) สงเสรมการเกดเอมบรโอเจเนซส

2. ปจจยทางดานพช

2.1 ลกษณะทางพนธกรรม (genetic factor)

การเจรญและพฒนาไปเปนและ/หรอราก ของพชแตละชนดจะมความสามารถเจรญและพฒนาไดไมเหมอนกน พชบางชนดสามารถเจรญและพฒนาไปเปนตนและ/หรอรากไดงาย บางชนดกยาก แมวาไดเลยงบนหรอในอาหารทเหมาะสมแลวกตาม พชบางชนดการเจรญและพฒนาไปเปนตนและ/หรอราก โดยผานขบวนออรแกนโนเจเนซสบางชนดกผานขบวนการ เอมบรโอเจเนซส เชน การเพาะเลยงเนอเยอของยาสบจะพฒนาเปนตนยาสบทสมบรณไดโดยการพฒนาผานออรแกนโนเจเนซสในขณะทแครอทจะผาน เอมบรโอเจเนซส สวนเนอเยอ รงไข และอบละอองเกสรพฒนาผานขบวนการ เอมบรโอเจเนซส มากกวาขบวนการ ออรแกนโนเจเนซส

2.2 ฮอรโมน (Hormones)

ฮอรโมนทมอยภายในพช มบทบาทอยางมากกบขบวนการเกด การเกดลกษณะรปราง จากทฤษฎของโฮบ ไดมผพยายามพสจนวา การเกดลกษณะรปราง ควบคมดวยชนดและระดบของฮอรโมน ดงนนภายในเนอเยอพชทน ามาเลยงจงมฮอรโมนบางชนดสงเสรมการเกด การเกดลกษณะรปราง และมฮอรโมนอกบางชนดท ยบยงการเกดขบวนการน นอกจากนพบวาชนด (kinds) และระดบ (levels) ของฮอรโมนภายในชนสวนของพชจะแตกตางกนไปดงน

- ชนดของพช ภาย ในเนอเยอพชแตละชนดจะมปรมาณฮอรโมนชนดแตกตางกนออกไป เชน พชบางชนดอาจจะมออกซนในปรมาณทสง เมอน าเนอเยอของพชชนดนไปเลยงเนอเยอกสามารถพฒนาไปเปนแค ลลสและรากไดด พชบางชนดอาจจะมไซโตไคนนเนอเยอของพชชนดนเมอน าไปเลยงจะพฒนา ไปเปนหนอไดด เปนตน

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

73

- ชนดของเนอเยอ ในพชชนดเดยวกนหรอตนเดยวกน ปรมาณฮอรโมนในแตละสวนของตนพชจะไมเหมอนกน เชน สวนปลายยอดจะมออกซนปรมาณสงกวาสวนตน ในรงไขกมปรมาณออกซนคอนขางสง สวนในเมลดนอกจากจะมออกซนคอนขางสงแลว ปรมาณของ จบเบอรลลนดยงสงดวย เปนตน

ฮอรโมนของพชในพชแตละชนดมความแตกตางกน ซงสงผลตอการพฒนาของเนอเย อพช เนอเยอพชชนดเดยวกนแตตางกนทชนสวนเชน ยอด ใบ ราก กจะมฮอรโมนทอย ภายในแตกตางกน สภาพของเนอเยอ เชน เนอเยอทก าลงเจรญเตบโตกบเนอเยอทมการพกตวจะมสารควบคม การเจรญเตบโตทแตกตางกนซงสงผลตอการพฒนาของเนอเย อพชหลงจาก น ามาเพาะเลยง

2.3 สภาพของเนอเยอ

เนองจากเนอเยอพชมการเจรญและพฒนาอยเสมอ ดงนนชนดและระดบของฮอรโมนทมอยในเนอเยอจงมการเปลยนแปลงไป ตามสภาพของเนอเยอในระยะนน ๆ เปนทเชอกนวาการเปลยนแปลงชนดและระดบของฮอรโมนภายในเนอเยอ เปนสาเหตใหเนอเยอ มการเปลยนแปลงทางสรระ จงท าใหการเปลยนชนดและระดบฮอรโมนกบการเปลยนแปลงทางสรระเกดควบ คกนไปเสมอ เชน หวลล (lily) และซอมกลนฝรง (gladiolus) ขณะทเกบเกยวมาใหมจะมสารยบยงการเจรญเตบโต (Inhibitor) เชน abscissic acid (ABA) ในปรมาณคอนขางสง ดงนนถาน าเนอเยอในระยะนมาเลยงจะไมคอยประสบความส าเรจในการ เกดหวยอย (bulblets หรอ cormels) แตถาน าหวลล หรอซอนกลนฝรงนเกบไวสกระยะหนง ปรมาณ ABA กจะลดลง ขณะทจบเบอรลลเพมขน เมอน าหวระยะนไปเลยงโอกาสทจะประสพความส าเรจในการเกดหวยอยกม สงขน

3. ปจจยทางดานกายภาพ

3.1 แสง (light)

แสงทใหกบพชเปนปจจยทส าคญ พชทเจรญในแปลงปลกกบทเจรญในหลอดทดลองจะมความตองการแสงทแตกตางกน พชทเจรญในหลอดทดลองยงไมมการสงเคราะหแสงเนองจากไดรบคารโบไฮเดรตจากน าตาล อยางไรกตามแสงยงมความจ าเปนส าหรบการเจรญเตบโตของพช

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

74

ในหลอดทดลองเชน ชวยในการสรางราก การสรางตนใหมจากแคลลส เปนตน และตนพชทอยในชวงยายออกจากหลอดทดลองจ าเปนตองมการสงเคราะหแสงเพอเตรยมพรอมออกสภายนอกหลอดทดลอง แตถาความเขมแสงมากเกนไปอาจท าใหพชตายได ลกษณะของแสงทเกยวของไดแก ความเขมแสง (light intensity) ชวงแสง (photoperiod) และคณภาพของแสง (light quality)

- ความเขมแสง (light intensity) ม รายงานความเขมแสงทมผลตอ การเจรญเตบโตของพชในสภาพหลอดแกวมากกวาทางดานชวงแสง ถาหากพชในสภาพหลอดแกวไดรบความเขมแสงสงเทาในแปลงปลกพชอาจเปน อนตรายได เนองจากท าใหพชไดรบอณหภมสงไปดวย ควรเลยงภายใตสภาพแสงประมาณ 1,000-4,000 ลกซ (lux) ( 1 ฟตก าลงเทยน = 10.75 ลกซ) การทพชตองการความเขมแสงต า สนนษฐานวาการสงเคราะหแสงในสภาพหลอดแกวถกจ ากดดวยปรมาณของ คารบอนไดออกไซดทต า ในหนอไมฝรง เยอบราและสบปะรด ความเขมแสงทเหมาะสมในระยะเพมจ านวนคอ 1,000 ลกซ สวนในระยะทตองการใหตนพชเจรญเตรยมออกรากตองการความเขมแสงคอ 1,000-3,000 ลกซ โดยใหแสง 16 ชวโมงตอวนการใหแสงทมความเขมในระดบนจะมเปอรเซนตการรอดตาย สงเมอยายปลกลงดน

- ระยะเวลาในการใหแสง (light duration) ไมคอยมนกวจยทดลองดานชวงแสง กบการเจรญของเนอเยอในสภาพหลอดแกว มากนก โดยทวไปมกเพาะเลยงเนอเยอใหไดรบแสง 14-16 ชวโมง บางครงไดรบตลอด 24 ชวโมง หรอเลยงในทมดเชน การเลยงแคลลส การเพาะเมลดกลวยไม โดยหลกการแลวชวงแสงทเหมาะสมควรเปนชวงแสงทพชนนเจรญอยใน ธรรมชาต ชวงแสงมอทธพลตอการพฒนาของเนอเยอ ในการเจรญเปนรากและยอดของเนอเยอแคลลสยาสบและเนอเยอสวนปลายยอด ของหนอไมฝรง ชวงแสงทเหมาะสมคอ 16 ชม.ตอวน โดยใชความเขมแสง 1,000 ลกซ การเพาะเลยงเนอเยอกะหล าเพอใหสรางยอดจะใชความเขมแสง 4,000 ลกซ โดยรบชวงแสง 9 ชม.ตอวน การเพาะเลยงเนอเยอล าตนขององนพนธทเปนวนสนจะเกดรากเมอ ไดรบวนสน แตถาเพาะเลยงองนวนยาวจะออกรากเมอพชไดรบวนยาว อยางไรกตามระยะเวลาในการใหแสงกบความเขมของแสงจะมความสมพนธกน เชน ถาใหแสงทมความเขมสงอาจจะใชระยะเวลาในการใหแสงนอยลง เปนตน

-.คณภาพของแสง (light quality) จากการทดลองพบวาแสงสแดง (red light) และแสงสน าเงน (blue light) เปนตนกระตนใหเกดยอดของพชหลายชนด เชน ในการเลยงสวนใบของพทเนย

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

75

เนอเยอจะเกดยอดเปนปรมาณมากเมอไดรบแสงสแดงและเนอเยอจะเกดยอดนอย เมอไดรบแสงชนดไหนหลงสด กจะมผลตามแสงชนดนน

ตวอยางตอไปน

เนอเยอทไดรบ Red light จะเกดยอดปรมาณมาก

เนอเยอทไดรบ F-Red light จะเกดยอดนอย

เนอเยอทไดรบ Red…….F-Red light จะเกดยอดนอย

เนอเยอทไดรบ F-Red light ……..Red light จะเกดยอดมาก

จาก ผลอนนจงไดมสมมตฐานวา การเกดลกษณะรปราง ถกควบคมดวยระบบ phytochrome จงท าใหนยมใชหลอดฟลออเรสเซนต (fluorescent lamp) เหมาะทจะใชในการเพาะเลยงเนอเยอ หลอดไฟทใหแสงอลตราไวโอเลต จะยบยงการสรางยอด การใชแสงสแดงจะ ดกวาสน าเงนในการกระตนการเจรญเตบโตของเนอเยอยาสบ แสงสแดง (660 nm.) ยงท าใหเกดการสรางราก มรายงานวาแสงสขาวและสน าเงนจะท าใหการเจรญของแคลลสดกวาแสงสเขยว และสแดงหรอเมอเพาะเลยงในทมดโดยทวไปแสงสแดงและอนฟราเรดจะ กระตนการเกดยอด มเพยงบางรายงานทพบวาแสงสแดงยบยงการเกดยอดในมอส (Pohlia nutans) การสรางตายอดตองการแสงทงแสงสแดงและสน าเงน โดยถาไดรบแสงสแดง 11 ชวโมงตามดวยสน าเงน 6 ชวโมงทกวนจะท าใหเกดตายอดจ านวนสงสด แตถาใหแสงชนดเดยวจะไมชวยในการสรางยอด จากตวอยางแสดงใหเหนวาการเปลยนแปลงของเนอเยอเปนอวยวะสวนตาง ๆ ของพช ตองการคณภาพแสง ความเขมแสง และชวงแสงทเหมาะสม

3.2 อณหภม (temperature)

อณหภมทใชมกคงทประมาณ 24-26 ๐ ซ ในการทดลองอาจเลยงในหองควบคมอณหภม 17 ๐ ซ หรอสงถง 30 ๐ ซ อณหภมทเหมาะสมเพอการเจรญเตบโตของเนอเยอพช มกต ากวาในธรรมชาตจงควรเลยงเนอเยอทต ากวาธรรมชาต อณหภมทต ามากเกนไปเชนเยนจดถง 4 ๐ซ ท าใหพชหยดการเจรญเตบโต บางครงพชตองการอณหภมต าสลบการอณหภมสง เชน การสรางรากของ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

76

ทานตะวนจะดขนถาเพาะเลยงใหไดรบอณหภมกลางวน 26 ๐ซ กลางคน 15 ๐ซ การเลยงแคลลสของพชบางชนดใหผลเชนเดยวกน อณหภมท าใหพชเกดการพนระยะการพกตว (break dormancy) ใน gladiolus hortulans หวหรอตนทไดจากการเพาะเลยงเนอเยอจะพฒนาเปนตนพชทปลกลงดน ไดตองเลยงทอณหภม 2 ๐ซ นาน 4-6 สปดาหกอนการยายลงดนเชนเดยวกบลลตนจะพกตวจงตองท าใหพนระยะ การพกตวโดยเลยงทในทมดอณหภม 5 ๐ซ นาน 4 สปดาหกอนยายปลก

3.3 ความชน (humidity)

เนองจากความชนในหลอดแกวคอนขางสง ถาความชนในหองเพาะเลยงต า กจะเกดการสญเสยน าภายในหลอดสงผลท าใหอาหารแหงเรว แตถาความชนในหองเพาะเลยงสงเกดไปกจะเอออ านวยใหเชอจลนทรย เจรญไดด เกดการปนเปอนของเชอจลนทรยไดงาย และในบางค รงถาความชนภายในหลอดทดลองสงมากจะท าใหพชเกดอาการฉ าน า

3.4 ออกซเจน (oxygen)

เปนปจจยทมความส าคญ การเลยงบนอาหารเหลวอาจใชวธเพาะเลยงบนสะพานกระดาษ หรอ วางบนเครองเขยา

3.5 คารบอนไดออกไซด (CO2)

แมวาจะเปนแหลงพลงงานของพชซงเกดการสงเคราะหแสงแตถาเกดการสะสมมากเกนไปกจะเปนอนตราย

3.6 สารควบคมการเจรญเตบโตของพช (plant growth regulators)

สารควบคมการเจรญเตบโตของพชทเตมลงในอาหารเปนปจจยทมความส าคญ เปนอยางมากทจะกระตนใหพชเกดการเจรญของเนอเยอ สารควบคมการเจรญเตบโตของพชทเตมจากภายนอกจะตองเกดการสมดลยกบสาร ควบคมการเจรญเตบโตทมอยภายในเนอเยอพชจงจะกระตนใหเนอ เยอพชเกดการเจรญไปในทศทางทตองการ จ าเปนตองมการทดลองเพอหา จดสมดลย ซงพอจะแยกบทบาทของสารควบคมการเจรญเตบโตแตละชนดไดดงน คอ

สารกลมออกซน บทบาททมตอเนอเยอทเลยง ไดแก

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

77

- สงเสรมใหเนอเยอทน ามาเลยงเกดแคลลส เพอประโยชนในการทจะน าแคลลส นไปชกน าใหเปนตนพชตอไป

- กระตนใหตนออนทไดจากการเลยงเนอเยอเกดราก

สารกลมไซโตไคนน บทบาททมตอการเนอเยอทเลยง ไดแก

- สงเสรมการเจรญเตบโตของใบ

- ยบยงการเจรญเตบโตของราก

- เรงใหชนสวนของพชเกดหนอเปนจ านวนมาก

บทบาทของออกซนและไซโตไคนนรวมกน มผลในการเลยงเนอเยอถาหากเตม ออกซนและไซโตไคนนรวมกนจะมผลท าใหการเจรญเตบโตของเนอเยอดกวาการ ใชออกซนหรอ ไซโตไคนนอยางใดอยางหนงแตเพยงอยางเดยว

สารกลมอน ๆ เชน จบเบอรลลน พบวา ในการเลยงเนอเยอถาหากในอาหารม GA เปนปรมาณมากจะไปยบยงการเกด การเกดลกษณะรปราง แตในพชบางชนด เชน มนฝรง GA มความส าคญมากในการทใหเนอเยอมนฝรงเกดเปนหนอ สวนพวก ABA จะไปยบยงการเกดตนและ/ หรอราก จะไปยบยงการเกดเอมบรโอเจเนซสในแครอท และยบยงการงอกของสปอรเฟรน ส าหรบสารพวกอนพนธเพยวรน (purine derivative) เชน adenine หรอ guanine จะมผลคลาย ๆ กบสารในกลมไซโตไคนน คอ ชวยในการกระตนใหเกดหนอ

4. ปจจยอน

4.1 ขนาดของชนสวนทน ามาเลยง (size of explant)

ขนาดของชนสวนมความส าคญตอการประสพความส าเรจในการเลยงเนอเยอหรอการเกด การเกดลกษณะรปรางมาก การใชชนสวนขนาดใหญจะมโอกาสประสพความส าเรจมากกวาการใชชนสวนขนาดเลก

4.2 สภาพของการเลยงเนอเยอ (culture condition)

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

78

เปนสภาพภายในภาชนะทเลยงเนอเยอ เชน สภาพของอาหารเปนอาหารแขงหรออาหารเหลว เนอเยอบางชนดจะเกด การเกดลกษณะรปราง ไดบนอาหารกงแขงหรออาหารวน แตจะไมเกด การเกดลกษณะรปราง ในอาหารเหลว เชน กลวยไม แตเนอเยอบางชนดสามารถเกด การเกดลกษณะรปราง ไดทงบนอาหารกงแขง และในอาหารเหลว หรอถาปรมาณออกซเจนภายนภาชนะทใชเลยงมาก คารบอนไดออกไซดนอย เนอเยอจะเจรญเปนราก แตถาปรมาณออกซนนอย คารบอนไดออกไซดมากเนอเยอจะเจรญเปนยอด

4.3 การเปลยนอาหาร (subculture)

การยายเนอเยอจากอาหารเกาไปยงอาหารใหมหลาย ๆ ครง จะมผลท าใหการเกด การเกดลกษณะรปราง ลดลง ทงนอาจจะเปนเพราะวาเกด การเปลยนแปลงชดโครโมโซมขน ซงสาเหตทแทจรงยงไมทราบแนชด

4.4 สวนประกอบอาหารอน ๆ (medium component)

นอกเหนอจากสารควบคม- การเจรญเตบโตของพช อาหารบางชนดจะมผลตอการเกดลกษณะรปราง เชน ถามฟอสเฟตในอาหารเปนปรมาณสงจะเกดยอดไดดกวาทมฟอสเฟตในปรมาณต า ถาใหไนโตรเจนในรปของแอมโมเนยม (NH4+) ในปรมาณมาก เนอเยอจะเกดเอมบรโอเจเนซสมากกวาการเกดออรแกนโนเจนเนซสนอกจากน ยงพบวาปรมาณน าตาลกเปนตวควบคมการเกดลกษณะรปรางเหมอนกน เชน ถาในอาหารเลยงเนอเยอออยมน าตาล 2 % จะชวยใหเนอเยอออยเกดยอด ถา 3 % จะยบยงการเกดยอด สวนในการเลยงลลล พบวา น าตาล 2 % จะท าใหเกดทอน า ในกอนแคลลส และ 4 % จะท าใหเกดทออาหาร สวนน าตาล 3 % จะชกน าใหเกดทงทอน า และทออาหาร

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

79

บรรณานกรม

สถาบนวจยและฝกอบรมเกษตรล าปาง. 2556. ความรทางดานการเพาะเลยงเนอเยอพช.

[ออนไลน]. เขาถงไดจาก: http://www.lartc.rmutl.ac.th/ptclab/Tissue Culture

(วนทคนขอมล : 22 มนาคม 2556).

สมพร ประเสรฐสงสกล. 2549. การเพาะเลยงเนอเยอกบการปรบปรงพนธพช. คณะวทยาศาสตร

และเทคโนโลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน.สงขลา. 127 หนา.

Soh, W-Y. and Bhojwani. 1999. Morphogenesis in Plant Tissue Culture. Kluwer Academic

Publisher.

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

80

บทท 8

การเพาะเลยงเนอเยอพชกบการถายยนในพช

เทคนคการเพาะเลยงเนอเยอพชไดถกน ามาใชเปนเทคนคพนฐานส าหรบการถายยน เขาสเซลลพชโดยเปนการน ายนทสนใจ หรอยนทควบคมลกษณะบางอยางทตองการและเปนประโยชนเขาสโครโมโซมพชทมความส าคญทางเศรษฐกจ เพอปรบปรงพนธพชใหมลกษณะดตามความตองการของเกษตรกรและผบรโภค ทง พชไร พชสวน ไมดอกไมประดบ รวมถงการศกษาเพอใหเกดความเขาใจในกลไก หรอการท างานของยน (gene function) หรอกระบวนตางๆ ในทางชววทยา(biological process) โดยเมอถายยนเขาสพชแลวและยนดงกลาวมการแสดงออกในตนพช กจะสามารถอธบายหรอแสดงใหเหนถงบทบาทของยนและกระบวนการทเกดขนในพชไดระดบหนง รวมทงการศกษาในดานปฏสมพนธระหวางพชกบเชอโรคดวย (หนวยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต, 2556) นอกจากนยงมการน ามาใชส าหรบการปรบปรงพนธพชสมนไพรเพอใหไดสายพนธทมคณสมบตทางยาสง (วราภรณ, 2551)

ยนเดยว (a single gene) หรอ ยนกลมเลกๆ (a small cluster of genes) ทน ามาใชถายเขาสพช เพอปรบปรงพนธพชไดแก ยนควบคมแมลงศตรพช ยนตานทานไวรสพช ยนตานทานสารก าจดวชพช ยนควบคมการสกของผลไม ยนเปลยนสกลบดอกไม ยนควบคมคณคาทางโภชนาการของเมลดพชและยนควบคมการผสมตวเอง สวนพชเศรษฐกจชนดตางๆ ทม รายงานการถายยนใหแลว และยนดงกลาวท างานไดเมอเขาไปสอดแทรกในโครโมโซมพช ไดแก มะเขอเทศ มนฝรง ผกกาดหอม แคโนลา ฝาย ถวเหลอง ขาวโพด และขาว เปนตน การถายยนเขาสพชจงเปนการปรบปรงพนธพชใหมลกษณะดตรงตามความตองการไดอกวธหนง นอกเหนอไปจากการผสมพนธพชทปฏบตกนมานานโดยทวไป ทงนคาดหวงวาการถายยนใหกบพช จะมขอไดเปรยบบางประการ (หนวยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต, 2556)

1. สามารถผลตพชทมลกษณะทางพนธกรรม (genotype) ทด ทใชวธการ ผสมพนธพชแบบทวไป (conventional breeding) ท าไมได

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

81

2. สามารถเปลยนแปลงขอดอยบางอยางของพนธพชไดอยางมประสทธภาพ

3. สามารถเพมคณคาหรอคณสมบตในดานทเปนประโยชนทางการคาใหแกพช โดยใชวธการทชดเจนท าใหมการขอสทธประโยชนจากการด าเนน

ปจจยทมผลตอความส าเรจของการถายยนเขาสพช (หนวยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต, 2556)

1.การมระบบการเพาะเลยงเซลลและเนอเยอพชทสามารถพฒนาไปเปนตนพชทสมบรณไดและพชนนสามารถถายทอดลกษณะทางพนธกรรมไปสรนลกได

2. การมวธการทเหมาะสมในการน ายนจากภายนอกตนพชเขาสโครโมโซมของเซลลพช

ขนตอนการถายยนเขาสพช

1.โคลนยน ศกษารายละเอยดของยนทตองการถายยนเขาสพช (Gene cloning and identification) และจดท าพลาสมดส าหรบถายยน

2. พฒนาระบบเพาะเลยงเนอเยอหรอชนสวนพช ใหเปนตนพช (Plant regeneration) ซงจ าเปนส าหรบการพฒนาเซลลหรอ เนอเยอพชทถายยนแลวใหเปนตนพช

3. ถายยน (หรอดเอนเอ) เขาสโครโมโซมพช (Gene transfer to plant) ดวยวธการทเหมาะสมกบ explant

วธการถายยนเขาสพช แบงเปน 2 แบบคอ

1. การถายยนโดยใชเชออะโกรแบคทเรย (Agrobacterium-mediated gene transfer) 2. การถายยนโดยตรง (direct gene transfer) โดยการใชกระบวนการใดกระบวนการหนงเขา

ชวยคอการใชแรงดน การใชกระแสไฟฟา การใชสารเคม แตวธทนยมใชกนมากในปจจบน ไดแก ใชเครองยงอนภาค (Particle bombardment) และการใชวธ electroporation

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

82

ในการถายยนทง 2 แบบนเปนการถายยนเขาสโครโมโซมของพช แลวจงน าพชทไดรบการถายยนแลวมาเพาะเลยง ชกน าและพฒนาเซลลพชใหเจรญเปนตนพชตนใหม ซงจะท าใหพชทเพาะเลยงไดมลกษณะทางพนธกรรมเปลยนแปลงไป

ในการถายยนโดยใชเชออะโกรแบคทเรย ซงมพลาสมด ซงประกอบดวย ชดโครงสรางของ target gene, screenable marker และ selectable marker และชดโครงสรางของ T-DNA สวน vector ทใชในการถายยนดวยวธ electroporation และ particle bombardment ไมจ าเปนตองมชดโครงสรางของ T-DNA

วธการถายยนเขาสพชโดยการใชเชออะโกรแบคทเรยพช (หนวยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต, 2556)

การถายยนดวยวธนจดเปนวธการถายยนทใช vector เปนตวน าพายนเขาสเซลลเปาหมาย เนอเยอพชทเหมาะสมส าหรบการถายยนดวยวธนมหลายชนด เชน ใบเลยง (cotyledon) หรอตนออน (Hypocotyl) หรอ ใบจรง (true leaf) ของพชซงเมอน ามาเพาะเลยงบนอาหารสงเคราะหทเตมฮอรโมนตางๆ ในความเขมขนท เหมาะสมแลวสามารถพฒนาเปนยอดหรอคพภะของพชและเจรญเตบโตเปนตนพชได มกเรยกชอวธการถายยนวา leaf disc transformation มขนตอนสรปไดดงน

1. เพาะเลยงตนกลาพชหรอตนพชทมใบจรงโดยสมบรณในอาหารสงเคราะห

2. ตดชนสวนใบเลยงหรอตนออนใหมขนาดพอเหมาะ เพอใหเกดบรเวณทเปนรอยตดของเซลล

3. เตรยมเชออะโกรแบคทเรยซงภายในเซลลบรรจพลาสมด 2 ชนด (binary vectors) คอ

3.1 helper plasmid หรอ disarmed plasmid เปนพลาสมดทประกอบดวย trans-acting element ไดแก vir gene ซงจ าเปนตอการเขาสเซลลพชของเชออะโกรแบคทเรย

3.2 autonomous vector หรอ bacterial plasmid เปนพลาสมดทประกอบดวย cis-acting element คอยนเปาหมายทตองการถายเขาสพช พรอมดวย promoter และ terminator โดยมชนสวนดเอนเอ RB (Right border) และ LB (Left border) ขนาบขางไว เมอตองการถายยนทอยใน

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

83

autonomous vector เขาสพชกจะโยกยายพลาสมดนเขาสเซลล อะโกรแบคทเรยทม helper plasmid อยแลว เลยงเชออะโกรแบคทเรยบนอาหารแขงใหได single colony แลวยายโคโลนเดยวมาเลยงในอาหารเหลวเลยงเชอนาน 16 ชวโมง ตกตะกอนแยกเซลลแบคทเรยออกจากอาหาร เตมอาหารเหลวเพาะเลยงเนอเยอลงไปทดแทน ปรบปรมาณเชอใหเขมขนประมาณ 109-1012 CFU ใสในขวดแกวมฝาปด (บางกรณอาจเตมสาร acetosyringone ชวยกระตนการถายยนดวย)

4. น าชนพชทตดไวในขอ 2 มาใสแชในเชออะโกรแบคทเรยทเตรยมไว เขยาเปนครงคราวเปนเวลา 10-30 นาทพอใหเชอเกาะกบเซลล พชตรงบรเวณรอยตดของชนพช

5. ยายชนพชและน าออกมาวางบนอาหารแขงเพาะเลยงเนอเยอ ซงนยมใชเซลลแขวนลอยของพชบางชนด เชน ยาสบ มะเขอเทศ โรยบนผวหนาอาหาร วางกระดาษกรองทบดานบนอกหนงแผน วางชนพชบนกระดาษกรองสารจากเซลลแขวนลอยจะซมผานกระดาษกรองขนมาชวยกระตนใหเชออะโกรแบคทเรยเขาสเซลลพชไดอยางมประสทธภาพ บมไวไนทมด 2-3 วน

6. ยายชนพชออกวางเพาะเลยงบนอาหารแขงส าหรบเพาะเลยงชกน ายอดหรอแคลลส ซงเตมสารปฏชวนะก าจดเชออะโกรแบคทเรย เพอเพาะเลยง explant ใหเปนตนพชทสมบรณตอไป

ในกรณท plant vector มชดโครงสรางยนทเปน selectable marker จะเตมสารทจ าเปนส าหรบการคดเลอกเฉพาะซลลทไดรบการถายยนลงในอาหาร เเพาะเลยง explant ดวย ถาม screenable marker จะสามารถตรวจสอบการเกาะยดของเซลลแบคทเรยกบชนพช และการแสดงออกของ marker แบบ transient expression ไดภายใน 24-48 ชวโมง

เชอ Agrobacterium อกชนดหนงทใชถายยนไดคอ A. rhizogenes ซงเปนเชอสาเหตของโรค hairy root ซงตนพชทไดรบเขอดงกลาวจะมการสรางรากฝอยขนมามากมายตรงบรเวณทถก infect เชอชนดนจงเหมาะส าหรบถายยนใหกบพชทสามารถเพาะเลยงเนอเยอสวนรากใหพฒนาเปนตนได และเหมาะแกการชกน าใหเกดการขยายรากปรมาณมากๆ แลวน าไปสกดสารทรากสรางขนออกไปใชประโยชน เชน พชสมนไพรทใชรากเปนตวยา (สนธชยและเสรมศร, 2549) โดยมขนตอนการชกน า hairy root ดงภาพ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

84

ความส าเรจของการถายยนโดยใชเชอ Agrobacterium นอกจากจะขนอยกบความรนแรงของเชอ และความจ าเพาะเจาะจงตอพชอาศยแลว การท าใหเกดบาดแผลบรเวณเนอเยอเปาหมายกมความส าคญเชนกน ซงเทคนคในการท าบาดแผลและเทคนคเสรมบางอยางเพอเพมประสทธภาพในการถายยนนน ไดแก การท าบาดแผลโดยใชมดกรด โดยใชเครองก าเนดคลนเสยงทใความถสง(sonicator) โดยใชสาร sislicon carbide รวมทงการใชสญญากาศรวมกบการท าบาดแผล ดงนนการจะเลอกใชวธใดตองพจารณาปจจยหลายยอางประกอบกน เพอใหไดวธการทด คาใชจายไมแพงมาก แตตองมประสทธภาพและเปนท ยอมรบได และอาจจะตองใชหลายวธ รวมกน (สนธชยและเสรมศร, 2549)

ภาพท 8.1 แสดงวธการชกน าการเกดราก hairy root และการเพาะเลยง

ในอาหารสงเคราะห

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

85

วธการถายยนเขาสพชโดยการใชเครองยงอนภาค

เปนการถายยนโดยใชอปกรณทมแรงดนในการขบเคลอนอนภาคโลหะทเคลอบผวภายนอกไวดวยดเอนเอทจะถายเขาสพชใหเขาไปในเซลลเปาหมาย โดยมเปาหมายภายในเซลลเปนนวเคลยสหรอคลอโรพลาส หรอ ไมโตคอนเดรย แลวแตวตถประสงคของการถายยน และชนดของยนทตองการถายเมออนภาคดงกลาวเขาไปอยในเซลลพชแลว ดเอนเอทเคลอบผวกจะละลายออกมา และเกดกระบวนการเชอมตอเขากบดเอนเอของเซลลพชเปาหมาย ท าใหเกดการเพมยนทตองการเขาไปในเซลลพชได เมอน าเซลลเขาสกระบวนการคดเลอกและเพาะเลยง และสามารถชกน าใหมการพฒนาไปเปนตนทสมบรณ กจะไดพชดดแปลงทางพนธกรรม (transgenic plant) ทมลกษณะทถกควบคมดวยยนทถายเขาไปเพมขนมา (สนธชยและเสรมศร, 2549)

วธการทใชขบเคลอนอนภาคมชอเรยกตางกนตามกลไกในการขบเคลอน ไดแก วธ microprojectile และวธ transfer impulse หรอ Biolistic การถายยนจะเกดขนเมออนภาคโลหะขนาด 1-4 ไมครอน มแรงขบเคลอนทท าใหเกดความเรวประมาณ 300-600 เมตรตอวนาท และสามารถผานทะลผนงเซลลพชเขาไปได ซงกลไกของทง 2 แบบสามารถน ามาใชกบเซลลไดหลายชนดทงพช สตว สาหรายเซลลเดยวสเขยว และยสต ส าหรบพชใชไดกบ explant ทอยในสภาพเซลลแขวนลอย แคลลส เอมบรโอเจนคแคลลส คพภะ ตนออน และใบเลยงคแรกของตนกลา ใชไดกบพชใบเลยงคทวไป เชน ฝาย มะละกอ ยาสบ ถว และพชใบเลยงเดยว เชน ขาว ขาวโพด ขาวฟาง (หนวยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต, 2556)

อนภาคโลหะทนยมใชไดแก ทงสเตน และทอง น ามาเคลอบผวภายนอกดวยดเอนเอซง เปนพลาสมดสายผสมทมยนเปาหมายสอดแทรกอยสารทชวยเเคลอบดเอนเอตด กบอนภาคไดแก calcium chloride และ spermidine จากนนอาจผสมอนภาคกบ ethanol หรอ สารละลายชนดอนตามวธการเฉพาะทระบไวส าหรบอปกรณแตละแบบ อปกรณทใชท าใหเกดแรงขบเคลอนอนภาคมชอเรยกตางๆ ไดแก gunpowder device, microtargeting apparatus, pneumatic instrument, flowing helium instrument, biolistic device เปนตน ขนตอนการถายยนโดยทวไปมดงน (หนวยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต, 2556)

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

86

1. เตรยม explant ทจะใชถายยน โดยให explant วางอยบนอาหารแขงทใชเพาะเลยงเนอเยอ อาจมการใชสารชวยปรบสภาพเซลล เชน สารละลายน าตาล

2. เคลอบดเอนเอบนอนภาคทอง หรอทงสเตน ตามวธการทเหมาะสม

3. ใชอปกรณส าหรบขบเคลอนอนภาคสงอนภาคออกไปส explant ซงจะท าภายในต (chamber) ปลอดเชอขนาดเลกทชอมตอจากอปกรณขบเคลอน

4. น า explant ไปเพาะเลยงตอใหเปนตนพช และตรวจสอบผลการถายยน

การคดเลอกเซลลทไดรบการถายยน

เซลลพชทไดรบการถายยนจะม selectable marker บางชนดทแสดงออกไดในเซลลพชและท าใหเซลลดงกลาวเจรญไดอาหารเพาะเลยงทเตมสารบางชนดทสอดคลองกบ คณสมบตของ marker เชน เจรญไดในอาหารทเตมสารปฏชวนะ กานามยซน ซงเปนผลจากยน NPT II หรอเจรญไดในอาหารทเตมสารเคมก าจดวชพช Bialaphos ซงเปนผลมาจากยน bar เปนตน ปจจบนการใช selectable marker ชนดอนอก เชน ยนควบคมการใชน าตาลบางชนด เซลลทเจรญไดจะพฒนาเปนล าดบเมอเพาะเลยงในอาหารเพาะเลยงทใชในการพฒนาเซลลและเนอเยอจนเปนตนพชทสมบรณ ระยะเวลาของการเพาะเลยงขนกบชนดพช ซงมกจะใชเวลาไมนอยกวา 2-3 เดอน

การตรวจสอบตนพชทไดรบการถายน

ตนพชทพฒนามาจากเซลลและเนอเยอทไดรบการถายยน จดเปน transgenic plant หรอ พชจ าลองพนธรนแรก (R0) การตรวจสอบท าไดทงการใชวธการทาง อณชววทยาและชววทยาการวเคราะหและตรวจสอบวาพช R0 แตละตนมยนเปาหมาย สอดแทรกอยในโครโมโซมหรอไมนยมท าโดยการสกดดเอนเอจากโครโมโซมของพช แลวยอยดเอนเอดวยเอนไซมตดจ าเพาะ จากนนแยกขนาดดเอนเอดวยเทคนค gel electrophoresis แลวใชเทคนค Southern transfer ยายดเอนเอจากเจลไปสแผนเมมเบรน เพอตรวจหาแถบดเอนเอทมยน เปาหมายอยโดยใชดเอนเอตวตรวจ (DNA probe) นอกจากนอาจตรวจหายนเปา หมายบนโครโมโซมพชดวยเทคนค พซอาร (polymerase chain reaction, PCR) ไดอกวธหนง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

87

การตรวจสอบผลผลตของยนเปาหมายในพช R0 ท าไดจากการตรวจสอบ อารเอนเอสงขาว (mRNA) ดวยเทคนค Northern hybridization หรอ เทคนค RT-PCR และท าไดโดยการตรวจสอบโปรตนทเปนผลผลตยนดวยเทคนค ELISA และ Western blot analysis หรอตรวจหาเอนไซมทเปนผลผลตของยนดวยเทคนคทางชวเคม ในกรณทตองการตรวจสอบคณภาพของพชจ าลองพนธทไดวามลกษณะทาง พนธกรรมเปลยนไปตรงตามความประสงคอาจจ าเปนตองใชวธทดสอบทางชววทยา เชน การตรวจดความตานทานโรค แมลงศตรพช โดยการปลกเชอสาเหตโรคพชใหกบพชทไดรบการ ถายยนหรอใหแมลงดดกน กดกนพชทไดรบการถายยน แลวประเมนคณภาพพชทไดรบการถายยนวาดกวาพชทไมไดรบการถายยนหรอไมอยางไร

ส าหรบการตรวจสอยการถายทอดทางพนธกรรมจากรน R0 ไปสรน R1 และ R2 ใชวธการทางอณชววทยาเชนเดยวกบการตรวจสอบพชรน R0 รวมทงการทดสอบการกระจายตวของยนตามกฎของเมนเดล ซงอาจตรวจสอบจาก screenable marker หรอ selectable marker หรอ ตรวจคณภาพของพชทไดรบการถายยน โดยทพชทไดรบการถายยนรน R1 และ R2 จะตองไดมาจากการผสมตวเองของพชรน R0 และ R1 ตามล าดบ (หนวยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต, 2556)

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

88

บรรณานกรม

วราภรณ ภตะลน. 2551. การเพาะเลยงเนอเยอพชสมนไพร: แนวทางการศกษาเพอผลตสารทตยภม

ทมฤทธทางเภสชวทยา. บรษทขอนแกนพมพพฒนา จ ากด. ขอนแกน. 120 หนา.

สนธชย จนทรเปรม และ เสรมศร จนทรเปรม. 2549. เทคโนโลยชวภาพเพอการเกษตร. ในเอกสาร

ประกอบการฝกอบรมเชงปฏบตการ. คณะเกษตร ก าแพงแสน รวมกบศนย

เทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน, นครปฐม.

หนวยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยแหงชาต. 2556. การถายยนเขาสพช.[ออนไลน].

เขาถงไดจาก: http://www.rdi.ku.ac.th/GMOS/GMOs2/2_1/index4.htm.

(วนทคนขอมล : 22 มนาคม 2556)

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

89

บทท 9

แนวทางการเพาะเลยงเนอเยอพชสมนไพรเพอผลต

สารทตยภม

สารประกอบทตยภม (Secondary Metabolites)

พชสรางสารปฐมภม (primary metabolite) ขนมาเพอใชในการด ารงชวต และการเจรญเตบโต ไดแก โปรตน คารโบไฮเดรต น าตาล ไขมน เปนตน สารปฐมภมทพบในพชสามารถน าไปใชเปนอาหารส าหรบมนษย นอกจากน พชยงมคณคาส าหรบใชเปนแหลงยารกษาโรคตางๆ จะเหนไดวา สารสกดจากพชทมฤทธทางเภสชวทยา ไดถกน ามาใชเปนยา อาหารเสรม รวมถงการน ามาใชในการแตงส กลน ในเครองส าอาง สารทถกน ามาใชเหลานจดเปนสารทตยภม (secondary metabolite)

ปกตพชจะสรางสารทตยภมเพอท าหนาทปองกนตวเองจากการบกรกจากเชอจลนทรย แมลง และสตวตางๆทมารบกวนหรอบกรก ท าใหพชสามารถปรบตวเพอด ารงชวตในสภาพแวดลอมได โดยสารทตยภมทพบในพชสวนใหญจะพบในปรมาณทต า สารทตยภมกลมตางๆทพบในพช ไดแก alkaloid terpenoid phenolic steroid flavonoid เปนตน มการศกษาพบวา สารทตยภมในพชเปนสารทมฤทธทางยาและถกน ามาใชในการรกษโรค

ปจจบนความกาวหนาทางเทคโนโลยชวภาพไดพฒนาไปอยางรวดเรว เทคนคการ

เพาะเลยงเนอเยอพชจงถกน ามาประยกตใชในงานการขยายพนธพชสมนไพรเพอเพมปรมาณ และ

ใหไดสายพนธทสามารถสรางสารทมฤทธทางยาสงในระยะเวลาสน และมคณภาพดท าใหม

ประโยชนในเชงการคา โดยเฉพาะสมนไพรทมขอจ ากดในการขยายพนธในธรรมชาต หรอปจจย

อนๆ ซงการเพาะเลยงอาจไดจากการน าชนสวนพช (explants) หรออวยวะพชทเปนเนอเยอเจรญ

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

90

เชน ปลายยอด (shoot tip) หรอตาขาง (axillary bud) มาเลยงในสภาพปลอดเชอ ใหมการเจรญและ

พฒนาไปเปนตนจ านวนมากเพอน าไปปลกและขยายพนธตอไป หรอไดจากการน าชนสวนใบ ราก

และล าตน มาชกน าใหเกดแคลลส และท าใหเกดการเปลยนแปลงเปนยอดพเศษ (adventitious

shoot) จากนนจงท าใหเกดรากเพอใหไดตนออนทสมบรณ นอกจากนยงสามารถขยายพนธโดย

การชกน าใหเกด somatic embryo จากเซลลพช หรอจากการเพาะเลยงแคลลสไดเชนกน การ

เพาะเลยงเนอเยอเพอผลตสารทตยภมจงมขอดเหนอกวาการผลตโดยการใชการเพาะปลกใน

ธรรมชาตโดยไมมปจจยรบกวนจากภมประเทศ สภาพอากาศ และสภาพแวดลอมอนๆ สามารถ

ควบคมสภาวะในการเพาะเลยเนอเยอเพอใหเกบเกยวผลผลตไดตลอดเวลา ท าใหผลผลตทไดไมม

ความแตกตางกนระหวางรนการผลต และบางวธยงสามารถเพมผลผลตใหไดมากกวาตาม

ธรรมชาตอกดวย ไดแก การตรงเซลลโดยกกขงเซลลไวภายในสารทมโครงสรางตาขาย เชน อะกา

โรส polyacrylamide เปนตน (สมพร, 2549) การพฒนาใหเปนอวยวะทเหมาะแกการสรางหรอ

สะสมสารทตยภม การเตมสารตงตนของกระบวนการชวสงเคราะหและการเปลยนแปลงทาง

ชวภาพ การเตมสารซงสามารถกระตนหรอเหนยวน าใหเกดการสรางสารทตยภมเพมขน การ

รบกวนสภาพการเลอกผานของเยอหมเซลลและเยอหมแวควโอเพอใหมการปลดปลอยสารทตย

ภมออกมา รวมทงสรางแหลงสะสมเทยมในอาหารเพาะเลยงเพอใหเปนทสะสมสารทตยภมทอาจ

เปนพษตอเซลล ในท านองเดยวกน เทคนคทางพนธวศวกรรมอาจน ามาใชรวมกบเทคนคเหลาน

เพอผลตสารทตยภมทตองการในปรมาณมากขนได นอกจากนอาจผลตสารใหมซงไมพบจากตน

พชในธรรมชาตไดดวย ปจจบนไดมการน าพชสมนไพรมาใชส าหรบผลตยาแผนปจจบนแลว และ

ยงสามารถใชเปนแหลงของการผลตสารกงสงเคราะหในทางอตสาหกรรมยา และเปนสารตนแบบ

ในการน าไปสการพฒนายาใหมไดอกทางหนง (วราภรณ, 2551)

แนวทางการผลตสารทตยภมในพชสมนไพรโดยวธการเพาะเลยงเนอเยอพช

การศกษาวจยเพอเพมการผลตสารทตยภมทไดจากพช สามารถท าไดโดยใชเทคนคการเพาะเลยงเนอเยอพชเปนพนฐาน เพอใชในการพฒนาและปรบปรงวธการตางๆในการเพมปรมาณ

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

91

การสรางสาร รวมไปถงการเพมผลผลตของสารทเซลลพชผลตได โดยท าการเพาะเลยงนระดบอตสาหกรรมในถงเพาะเลยง (bioreactor) ทดแทนการเพาะปลกพชจากธรรมชาต ซงแนวทางการผลตคอ การน าพชจากธรรมชาตมาชกน าใหเกดแคลลส จากกนนน าแคลลสทไดปท าการเพาะเลยงเซลลแขวนลอยเพอผลตสาร หรอการชกน าแคลลสทไดใหเกดอวยวะ อาจท าการกระตนใหเกดยอด แลวท าการเพาะเลยงเฉพาะสวนยอด หรอกระตนใหเกดราก แลวท าการเพาะเลยงราก หรอชกน าใหเกดตนออนจากแคลลส เพอท าการขยายพนธพชสมนไพร นอกจากนยงสามารถท าการเพาะเลยงในลกษณะ รากลอย หรอทเรยกวา hairy root culture ทเกดจากการเหนยวน าโดยเชอแบคทเรย Agrobacterium rhizogines (วราภรณ, 2551)

ลกษณะการเพาะเลยงพชสมนไพรเพอน ามาผลตสารทตยภมสามาถสรปไดดงภาพท 9.1

ภาพท 9.1 การเพาะเลยงราก hairy root แคลลสและเซลลแขวนลอยของเจตมลเพลงแดง

เพอผลตสารทตยภม

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

92

บรรณานกรม

วราภรณ ภตะลน. 2551. การเพาะเลยงเนอเยอพชสมนไพร: แนวทางการศกษาเพอผลตสารทตยภม

ทมฤทธทางเภสชวทยา. บรษทขอนแกนพมพพฒนา จ ากด. ขอนแกน. 120 หนา.

สมพร ประเสรฐสงสกล. 2549. การเพาะเลยงเนอเยอกบการปรบปรงพนธพช. คณะวทยาศาสตร

และเทคโนโลย มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตปตตาน.สงขลา. 127 หนา.

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

93

บทท 10

ปญหาทพบส าหรบการผลตพชเพอการคาดวยวธ

เพาะเลยงเนอเยอพช

เทคนคการเพาะเลยงเนอเยอพชไดถกน ามาใชประโยชนในการขยายพนธพชหลายชนดทมความส าคญทางเศรษฐกจทงพชสวน พชไร ปาไม พชสมนไพรทมคณสมบตทางยา รวมถงพนธพชหายากและใกลจะสญพนธ ปจจบนมการน าเทคนคดงกลาวมาใชเพอประโยชนทางการคาและมสรางหองปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอพชอยางแพรหลายทงในประเทศและตางประเทศ โดยเฉพาะประเทศแถบทวปยโรป สหรฐอเมรกา แคนาดา และญปน ซงในอนาคตอาจจะมการพฒนาการผลตไปในเชงอตสาหกรรมมากขน และอาจจะไดพชสายพนธใหม ๆ ทมลกษณะเดนและมคณภาพดตามตองการ และสรางรายไดใหกบผประกอบการธรกจประเภทนเปนอยางมาก

ส าหรบประเทศไทยนนมผประกอบธรกจประเภทนมานานแลวเชนกน แตไมเปนทแพรหลายมากนกเหมอนในตางประเทศ โดยสวนใหญจะมงเนนการผลตและการปรบปรงพนธกลวยไม เนองจากเปนไมดอกเศรษฐกจของประเทศไทย และในเวลาตอมาจงไดมการผลตไมดอกและไมประดบใบชนดอนๆ เชน หนาวว ปทมมา ฟโลเดรนดรอน กฤษณา อะโกรนมา เปนตน ซงมรายชอของสถานประกอบการผลตพชโดยการเพาะเลยงเนอเยอพชดงตารางท 1

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

94

ตารางท 1 แสดงรายชอผประกอบการเพาะเลยงเนอเยอพช (กรมสงเสรมการเกษตร, 2556)

ล าดบท ชอ สถานทตดตอ เบอรโทรตดตอ พชทท าเพาะเลยงเนอเยอ

1 บรษท ยเซนฟลาวเวอร

(ประเทศไทย) จ ากด

163 ชน 11 อาคารไทยสมทรพาณชยประกนภย ถ.สรวงศ แขวงสรยวงศ เขตบางรก กทม. 10160

02-2351076, 02-236-0075 034-391127

กลวยไมสกลตาง ๆ

2 บรษทบางกอกฟลาวเวอร เซนเตอร จ ากด

34/19 หม 7 ถ.เพชรเกษม หนองแขม กทม. 10160

02-4210020-4, แฟกซ : 02 421-0025

กลวยไมสกลตาง ๆ เชน หวาย คทลยา ฯลฯ หนาวว

3 BOTANICAL GARDENS BANGKOK

687 ต.คหาสวรรค ภาษเจรญ กทม. 10160 02-4210500, 421-023,421-9506, แฟกซ : 02-421-1687

กลวยไมสกลตาง ๆ

4 บรษท เอกเซลออรคด จ ากด 63/3 ถ.เพชรเกษม 63 หนองแขม กทม. 10160

(02)455-6974-80 แฟกซ : (02) 454-1781

กลวยไมสกลตาง ๆ

5 บรษท สภาออรคด จ ากด 559/77 หม 3 ถ.เพชรเกษม ซ.92 บางแค ภาษเจรญ กทม. 10160

(02)413-0784,454-0797 แฟกซ : (02) 420-0321

กลวยไมสกลตาง ๆ

6 บรษท มนบร ออรคด เนสเซอร

9 หม 8 ถ.รามค าแหง มนบร กทม. 10510 (02)543-8298 แฟกซ : (02) 543-8289

กลวยไมสกลตาง ๆ

7 บรษท ไทยออรคดแลป จ ากด 73/4 หม 3 ถ.พทธบชา บางมด ราชบรณะ กทม. 10140

(02)870-6267,426-3429 แฟกซ : (02) 870-6269

ก ล ว ย ไ ม ไ ม ใ บ บ า ง ช น ด ไมดอก และอน ๆ

8 บรษท TOC Lab 73/3 หม 3 ซ.พทธบชา 39 ถ.พทธบชา บางมด เขตทงคร กทม. 10140

02-8748490 02-8748491

กลวยไมสกลตาง ๆ ไมใบ

9 หางหนสวนจ ากด เจาพระยาออรคด เนสเซอร

63/2 หม 1 ถ.สามโคก-เสนา อ.สามโคก จ.ปทมธาน

(02)593-1389-91 แฟกซ : (02) 593-1392

กลวยไมหวาย

10 บรษท กรงเทพอตสาหกรรมเมลดพนธ จ ากด

187 หม 13 ต.พฒนานคม อ.พฒนานคม จ.ล พ บ ร 15140 e-mail : cplabtc@hotmail.com

0-3649-1355-6 แฟกซ : 0-3649-1337

กลวยไมสกลตาง ๆ ไมใบตาง ๆ หนาวว

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

95

11 อาร ออรคดส (R.ORCHIDS) 99/22 หมบาน 99 ถนนงามวงศวาน ลาดยาว จตจกร กทม. 10900

(02)5611255 (01) 4904682

กลวยไมสกลตาง ๆ

12 บรษท กฤษณะ เอสเซนทออล จ ากด

126/2050 ซ. 19/1 ถ. ตวานนท ต.ปากเกรด จ . น น ท บ ร e-mail : info@thaiessential.com

(02)964-3488 (06)975-9959 แฟกซ : (02) 964-2684

กฤษณา

13 สวนเกษตร 32 170/1 ม.11 ต.โปงผา อ.แมสาย จ.เชยงราย (01)885-7433 แ ฟ ก ซ : ( 053) 646-113

หนาวว

14 บรษท ปากเกรด ฟลอรคลเจอร จ ากด

46/6 ม.1 ถ.ตวานนท ต.บางพด อ..ปากเกรด จ . น น ท บ ร 11120 e-mail : pakkretfloriculture.com

(02)961-9955 แฟกซ:(02)961-9956

กลวยไม,คทลยา,ขง,ไมใบตางๆ

15 บรษท สภาออรคดส อนเตอรแลบ จ ากด

111 ม.10 พทธมณฑลสาย 4 ต.ออมนอย อ.กระทมแบน จ.สมทรสาคร 74130

(02) 810-6381-9 กลวยไม

ปจจบนมผสนใจท าธกจนเพมมากขนและมการสรางหองปฏบตการเพาะเลยงเนอเยอพชขนมาเองโดยท าในลกษณะทงทเปนการคาหรอท าเพอเปนงานอดเรก อยางไรกตามในการสรางหองปฏบตการดงกลาวโดยเฉพาะการสรางเพอผลตในเชงการคานนควรค านงถงปจจยตางๆตอไปน

1. ท าเลของหองปฏบตการ (สนธชยและเสรมศร, 2549)

1.1 ควรเลอกท าเลทมฝนนอยทสด และอยหางจากแหลงปนเปอนไดงาย ไมควรตงอยรมถนน หรอโรงงานอตสาหกรรมทท าใหเกดฝนผงมาก

1.2 ควรมระบบไฟฟาทด ส าหรบในสถานททมไฟฟาเสยบอย ๆ ควรมเครองก าเนดไฟฟาส ารอง (stand by generator) และมตวตดไฟฟาอตโนมตในกรณผดปกต เพอปองกนเครองใชไฟฟาตางๆเสยหายอาจเนองจากกระแสไฟฟาตกหรอกระชาก

1.3 ควรมแหลงน าสะอาด และมระบบน าทดและเพยงพอส าหรบการปฏบตงาน

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

96

1.4 ควรเลยงพนท ทมความชนเกนไป เพราะความชนจะท าใหเกด การปนเปอนไดคอนสงในการเพาะเลยง และหางไกลจากพนททมการเลยงสตว หรอโรงเหด

1.5. ควรอยในสถานททสามารถใชระบบควบคมอณหภมได

1.6 ควรหางจากจดทมการสญจรไปมาคบคง

ถาไมสามารถเลอกท าลของหองปฏบตการตามหลกการทกลาวขางตนได อาจจะตองระวงในเรองของการปฏบตงานของผท างาน โดยใหผปฏบตงานนนปลอดเชอมากทสดเทาทจะท าได ซงกอนปฏบตงานอาจจะตองมอาบน าและสวมเสอสะอาดทจดไว หรอหองปฏบตการอาจะตองมการท าความสะอาดทก 2-3 วน ตรวจเชคขวดเพาะเลยงทมการปนเปอนเชอจลนทรยทกวน รวมทงมดหรอแมลงตวเลกๆทอาจเขาไปได

2. ตนทนการผลต

เปนสงจ าเปนทสดส าหรบการประกอบธรกจ การทจะสรางสถานประกอบการเพาะเลยงเนอเยอพชขนมา จะตองคดจากคาใชจายตางๆ ทเกดขนทงหมดในการผลต ไดแก คาเชาทดน คาปรบปรงพนท คาเสอมราคา คาโรงเรอน ระบบน า ระบบใหปย บาน เครองมอและอปกรณตางๆทเกยวของ คาตนพนธ วสดปลก แรงงาน หวหนาแรงงาน ปย ยาปราบศตรพช โรค และแมลง รวมถงระบบการขนสง ซงตนทนการผลตของสถานประกอบการแตละแหงจะมความแตกตางกนไป ขนอยกบวามทนมากหรอนอย แตการลงทนมากกมไดหมายความวาจะประสบผลส าเรจในธรกจเสมอไป ถามการจดการตางๆไมดพอ รวมทงไมไดมการศกษาความเปนไปไดของการตลาด อยางไรกตามโดยทวไปถาเปนสถานประกอบการทมขนาดใหญมกจะลงทนเปนหลกลานบาทขนไป แตถาเปนสถานประกอบการขนาดเลกหรอท าเพอเปนงานอดเรกจะลงทนขนต าประมาณ 230,000บาท ซงมกจะใชหองทมอยแลว และน ามาปรบปรงท าเปนหองปฏบตการทงนไมไดรวมคาแรงงาน คาตนพนธพช และการจดการดแล (ตารางท 2 และ 3)

ในบางครงผประกอบการธรกจประเภทนอาจจะไมจ าเปนตองมหองปฏบตการเปนของตวเองแตกสามารถประสบความส าเรจในธรกจนได ไมตองลงทนสงมากนก อยางนอยกลงทนคาตนพนธหรอคาแรง โดยอาศยสถานประกอบการเพาะเลยงเนอเยอพชในภาคเอกชนหรอ

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

97

ภาครฐบาลกได ซงสวนใหญมกจะเปนนกสะสมพนธไมแปลก และมการซอขายกนทางอนเตอรเนตในปจจบน

ตารางท 2 ประมาณตนทนการผลตส าหรบสถานประกอบการทมขนาดใหญ

รายการ ตนทน/ไร (บาท/ไร) ตนทนทงหมด (บาท)

1.หมวดเงนลงทนในทดน โรงเรอนและอปกรณ 20 ไร

คาเชาทดน 3,000 60,000

คาปรบปรงพนท 200,000

คาปลกสรางโรงเรอนและโตะวางกลวยไม 135,000 2,700,000

คาตดตงระบบน าละอปกรณ 30,000 600,000

คาตดตงระบบใหปย 5,000 100,000

คาปลกสรางเรอนเอนกประสงค 500,000

คาเครองมอเครองใช 2,000 40,000

คาใชจายอนๆ 15,000 300,000

รวมหมวดท 1 4,500,000

2.หมวดเงนลงทนตนพนธและวสดปลก

คาตนพนธ ไรละ 16,000 ตนๆละ 7 บาท 112,000 2,240,000

คาวสดปลก ไรละ 4,000 กอนๆละ 7 บาท 28,000 560,000

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

98

รวมหมวดท 2 2,800,000

3.หมวดเงนลงทนดานแรงงาน

คาแรงงานประจ า 10 คน/เดอน 4500*10คน*12ด. 540,000

คาแรงงานผบรหารสวน หรอหวหนาสวน 1 คน/เดอน 10,000*12ด. 120,000

รวมหมวดท 3 660,000

4.หมวด ปย ยาฆาแมลง ไรละ 3,000 บาท/เดอน 3,000*20*12ด. 720,000

รวมหมวดท 4 720,000

เงนลงทนเรมแรก 1+2+3+4 8,680,000

เงนส ารองเพอสภาพคลอง 500,000

ยอดเงนลงทนเรมแรก 9,180,000

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

99

ตารางท 3 ประมาณตนทนการผลตส าหรบสถานประกอบการทมขนาดเลก

รายการ จ านวน หนวยละ ราคา (บาท)

1.ชนวางเนอเยอพชในหอง LAB พรอมระบบไฟฟา

2. คาใชจายในการปรบปรงหอง LAB

3. ตปลอดเชอ

4. หมอนงความดน

5. เครองปรบอากาศ

6. เครองชงทศนยม 2 ต าแหนง

7. เครองวด pH

8. อปกรณยายเนอเยอพช (ดามมด forcep )

9. ใบมด

10. ตะเกยงแอลกอฮอล

11. ตเยน

12. สารเคม

13. ขวดแกว

14. หลอด UV ฆาเชอในหอง

15. กระถางนว วสดปลก กลองพลาสตก

ตนทนท าเฉพาะในหองปฏบตการ

5 ตว (4 ชน)

1

1

2

1

1

10 ชด

5 กลอง

2

1

5000

2

10,000

-

35,000

18,000

35,000

5,000

2,000

5,000

700

60

5,000

100,000

4

3000

3

50,000

20,000

35,000

18,000

70,000

5,000

2,000

5,000

3500

120

5,000

100,000

20,000

6,000

30,000

229,620

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

100

3. ชองทางการตลาด

สงทขาดไมไดส าหรบการประกอบธรกจเพาะเลยงเนอเย อพชคอการศกษาชองทางการตลาดและอนาคตความเปนไปไดของการตลาดเกยวกบพชทจะท าการผลต เนองจากความนยมของพนธไมแตละชนด ถาผประกอบการใดสามารถผลตพชไดกอนกจะไดเปรยบในเรองของการตงราคาสงได แตถาเมอใดทมผประกอบการอนผลตไดหรอเกดการแขงขนทางการตลาดเกดขน ราคาของพนธไมชนดนนกจะลดลงไป ดงนนผผลตอาจจะตองหาพนธพชชนดอนส ารองไวดวย หรอปรบปรงพนธใหมๆออกมาอยตลอดเวลา กจะท าใหธรกจมการเตบโตตอไปได ส าหรบพชบางชนด เชน พชกนแมลง บางครงมกจะเปนทนยมส าหรบผเลยงเฉพาะบางกลมเทานน ดงนนผประกอบการแตละแหงจะตองมวธการของตวเองทจะน าพาใหธรกจพชชนดนสามารถไปรอดได โดยการหาตลาดทงภายในประเทศและตางประเทศควบคกนไป ปจจบนสามารถใช internet หรอท าการสราง website ของผผลตเอง ซงกเปนอกหนงชองทางการตลาดทสามารถท ารายไดใหกบผผลตได ซงในตางประเทศมการซอขายกนทาง internet มากมาย มทงการขายตนพช เมลด หรอแมกระทงพชในหลอดแกว รวมทงการแลกเปลยนสายพนธพชไดเชนกน

4. การสงซอและการน าเขาตนพนธพชจากตางประเทศ

บางครงผผลตอาจจะตองกลาเสยงทจะลงทนในการซอหรอน าเขาตนพนธพชจากตางประเทศ ซงอาจจะใชวธการสงซอทาง internet หรออาจฝากเพอนทอยตางประเทศ หรอไปน าเขามาดวยตวเอง ซงนบวาเปนอกวธการหนงเพอทจะไดพนธพชชนดใหมทไมเคยมในประเทศได ซงถาสามารถผลตไดโดยการเพาะเลยงเนอเยอพชไดกจะเปนการสรางรายไดใหกบผผลตเอง สามารถลดการน าเขาพนธพชจากตางประเทศเพอมาขายในราคาทสงมากเกนไป นอกจากนยงเปนการสรางความหลากหลายของชนดพนธพชใหมในประเทศไทย ส าหรบการสงน าเขาตนพนธพชจากตางประเทศนน พชบางชนดอาจมปญหาเรองของการน าเขาตดอยทดานศลกากร ดงนนอาจจะตองซอใบปลอดโรค (phytosanitary) จากผขาย แตถาเปนเมลดมกจะไมมปญหาสามารถสงถงมอของผรบไดโดยตรง บางครงการน าเขาตนไมจากตางประเทศโดยเฉพาะตนพชในหลอดแกว อาจจะตองค านวณวนทจะสงมาถงมอผรบดวย เพราะเนองจากบางครงตรงกบวนหยดยาว ท าใหไมสามารถออกของได จงเปนเหตใหตนไมตายเนองจากอยในสภาพทอณหภมสง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

101

ปญหาและอปสรรคทพบส าหรบการเพาะเลยงเนอเยอพช (กรมสงเสรมการเกษตร, 2556; รงสฤษด, 2540)

เมอมการน าเทคนคการเพาะเลยงเนอเยอพชไปปฏบตจรง โดยเฉพาะเพอการขยายผลในเชงการคามกจะไมเปนไปตามเปาหมายทวางไวเนองจาก มการลงทนทคอนขางสงอยพอสมควร และอาจมปญหาอนๆเกดขนตามมาภายหลงจากทไดมการปฏบตงานไปแลว เชน มการเตรยมอาหารผดพลาดโดยใชความเขมขนของ stock solution หรอสารควบคมการเจรญเตบโตไมถกตอง ความผดปกตทเกดกบตนพช การปนเปอนของเชอรา และเชอแบคทเรย ในขวดเนอเยอพช สงทประสบปญหาเหมอนกนทกสถานประกอบการทมการสรางหองปฏบตการ (LAB) คอการปนเปอนของเชอจลนทรยไดแก เชอรา และเชอแบคทเรย ซงเปนสงทหลกเลยงไมได นบตงแตเรมฟอกเนอเยอเขามาใน LAB เพราะเชอจลนทรยอาจตดมากบชนสวนพช อยางไรกตามปญหาทพบเสมอส าหรบหองปฏบตการทงในสวนของภาคเอกชนและภาครฐบาลพอสรปไดดงน

1. การปนเปอนของเชอจลนทรย (contamination)

การปนเปอนเชอจลนทรยเปนปญหาทส าคญทสดและทกหอง LAB ตองพบอปสรรคเกยวกบปญหาน โดยเฉพาะเชอราและเชอแบคทเรย ทเกดขนในขวดเพาะเลยงเนอเยอพช ซงเรมจากผปฏบตงานอาจไมสะอาดเพยงพอ โดยเฉพาะการเขาไปปฏบตงานในสถานททไมสะอาดซงมเชอจลนทรยปะปนอยในอากาศ เชน แปลงเพาะปลกพช สถานทมฝนผลจ านวนมาก สถานทเปยกชนและสกปรก เปนตน นอกจากนยงมสาเหตมาจากเทคนคการท างาน ไดแก การนงฆาเชออาหารไมมประสทธภาพ การวางวสดอปกรณทไมไดผานการฆาเชอปนกนกบพวกทผานการฆาเชอแลว การฟอกชนสวนพชซงไมปลอดเชอเพยงพอ รวมถงการมมดหรอแมลงตวเลกๆทสามารถเขาไปตามเกลยวของฝาขวด โดยเดนจากขวดหนงไปยงอกขวดหนง ท าใหเกดการปนเปอนเชอดงกลาวได (ภาพท 10.1)

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

102

ก. ข.

ภาพท 10.1 การปนเปอนเชอจลนทรยภายหลงการเพาะเลยงชนสนพช

ก. เชอรา

ข. เชอแบคทเรย

2. ความผดปกตทเกดกบตนพช

จากการเพาะเลยงเนอเยอพชไประยะเวลาหนง อาจจะแสดงลกษณะทผดไปจากสภาพการเจรญเตบโตปกต ซงมสาเหตมาจากวธการด าเนนงาน ในแตละขนตอนของกระบวนการเพาะเลยงเนอเยอ เชน การใชสารควบคมการเจรญเตบโต ในอตราทเขมขนมากเกนไปเปนเวลานาน การทตนพชโดนแสง UV จากการตดตงหลอด UV เพอฆาเชอภายในหองเพาะเลยง อาการตางๆทเกดขนไดแก

- อาการใบดางขาว เปนอาการทใบพชจะเปลยนสจากเขยวเปนขาว มทงแบบสขาวทงใบ สขาวครงใบ หรอสขาว ตามขอบใบ

- อาการฉ าน า (Vitrification) เปนอาการผดปกตทเหนไดชดเจน บรเวณใบจะใสเหมอนแกว อาจมสาเหตจาก ปรมาณน าภายในเซลลมากเกนไป ถายายออกปลก มกจะตายในทสด

- ตนพชมการหยดเจรญเตบโต

- ตนพชมลกษณะบดเบยว ใบแคบเลก หรอไมมใบ

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

103

- ตนพชมการเจรญเตบโตและพฒนาไมพรอมกน ท าใหแผนการเพมปรมาณอาจผดพลาดไปได เนองจากตองคดเลอกตนทมความสงมาก เขาสระยะการชกน าราก สวนตนทมความสงนอย น ามาเพมปรมาณยอดตอไปได

3. พชทมปญหาการออกรากยาก

มพชหลายชนดทสามารถขยายเพมปรมาณไดมาก แตเมอถงระยะการชกน าใหออกราก ตนพชนนไมมการตอบสนองตอการเกดราก ถงแมวาจะผานการทดสอบในขนตอนดงกลาวแลวกตาม ปญหานมกจะพบกบพชไมเนอแขง เชน เปลานอย

4. ความนยมของสายพนธ

ปญหานสามารถเกดได เนองจากความนยมเรองสายพนธพช มเปลยนแปลงตลอดเวลาและคอนขางรวดเรว ดงนนพชทถกผลตออกมาจงไมเปนทนยมในขณะนน ท าใหสญเสยงบประมาณ แรงงานในการผลต แมวาไดสภาพการผลตทเหมาะสมแลวกตาม ทงนอาจจะตองแกปญหาโดยการผลตหลายๆสายพนธ หรอพยายามปรบปรงพนธใหมลกษณะทแตกตางจากพนธเดมทมอย

5. การขายตดราคากนทางการตลาด

เนองจากมการแขงขนทางตลาดสง พนธไมบางชนดราคาการผลตคอนขางคงทไมเปลยนแปลงท าใหผผลตสามารถขายไดราคาดตลอด แตพนธไมบางชนดโดยเฉพาะพชกนแมลง ผขายมกจะตดราคากนเอง จากราคาสงเปนหลกพนบาท เหลอราคาเปนหลกสบบาท ดงนนผประกอบธรกจนตองหาวธการทจะท าใหพชกนแมลงทถกผลตขนมานนขายไดตลอดไปแมวาราคาจะลดลงไปมาก ทงนขนอยกบการท ากลยทยของแตละสถานประกอบการ นอกจากนผผลตอาจจะพบกบปญหาการถกกดราคาสนคาใหต าลงจากผคาคนกลางได

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

104

6. ความแปรปรวนทางพนธกรรมของตนพช (Somaclonal variation)

มกจะพบเสมอกบตนพชทไดจากการเพาะเลยงเนอเยอ ทมการยายเปลยนอาหารเปนเวลานาน โดยเปนลกษณะของตนพชทแตกตางไปจากเดม อาจเปนการเปลยนแปลงโดยถาวรหรอกลบมาเปนแบบเดมได

ปญหาตาง ๆ ดงกลาวเมอเกดขนแลวตางสงผลใหตนพชเหลานน เจรญเตบโตนอยลง หรอตายในทสด การหาวธแกไขคงเปนไปไดยาก แตควรเรมตนท างานใหมดวยความระมดระวง ในทกล าดบขนตอน ตงแตการฟอกฆาเชอ วธการตด และวางเนอเยอพช สตรอาหารทใช เทคนคปลอดเชอ ความสะอาดของเครองมอทผานการฆาเชอแลว เปนตน แตปญหาอปสรรคทเกดกบงานขยายพนธพชดวยวธเพาะเลยงเนอเยอ เปนปญหาทแกไขได หากปฏบตตามหลกเกณฑและใหความส าคญกบเทคนคปลอดเชอ ผลส าเ รจของงานผลตและขยายพนธพชจะตองบรรลวตถประสงคแนนอน อยางไรกตามบางครงความแปรปรวนทางพนธกรรมกท าใหเกดผลด โดยไดตนพชทมลกษณะใหมทแตกตางไปจากเดม เชน ใบดาง ซงงมกจะเปนทตองการของตลาดตนไม

วธการปองกนการเกดการผนแปรทางพนธ กรรมทเกดจากการเพาะเลยงเนอ เย อพช (อภชาต ชดบร, 2556)

การปองกนการเกดการผนแปรทางพนธกรรมทเกดจากการเพาะเลยงเนอเยอพชม 2 ปจจย คอ

1. ปจจยจากพชเอง พชทเจรญเตบโตในธรรมชาตยอมมความปรวนแปรอนเนองมาจากสภาพแวดลอมการ เลยง การเปลยนแปลงนอาจเกดขนกบตนพชทงตน หรอเกดเฉพาะสวนใดสวนหนงของพช ดงนนการน าชนสวนจากตนพชทมความแปรปรวนมาท าการเพาะเลยง พชตนใหมทไดอาจจะไมเหมอนตนแมพนธ เดม ดงนน อตราการแปรปรวนมากนอยเพยงใดขนอยกบองคประกอบของเซลลเรมตน ถาเซลลเรมตนมความแปรปรวนในหลายลกษณะ พชทชกน าไดจะมความแปรปรวนในอตราทสง

2. ปจจยจากสภาพแวดลอมในการเลยง โดยเฉพาะการใชสารควบคมการเจรญเตบโตเชน 2,4-D ทเตมลงไปในอาหารเลยงเพอชกน าใหเกดตนพชใหม สารดงกลาวไปชกน าใหชนสวนพชใหมการแบงเซลลอยางรวดเรว ดงนนวงจรชวตในการแบงเซลล (cell cycle) จะถกเรงใหสนกวาปกต เมอเปนเชนนสารทจ าเปนตอกระบวนการแบงเซลลไดแก เอนไซม และโปรตน จะถกสราง

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

105

อยางรวดเรวเชนกนในบางครงอาจท าใหเกดความบกพรองในการสรางสารทจ าเปนบางชนด เซลลลกทไดหลงจากกระบวนการแบงเซลลจงผดปกต นอกจากนสารทเตมลงไปในอาหารเพาะเลยงยงไปมผลในการแยงทกบเอนไซมทจ าเปนตอกระบวนการแบงเซลล ผลทตามมาคอ ความผดปกตของเซลลลก

วชา เทคโนโลยการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการเกษตร

106

บรรณานกรม

กรมสงเสรมการเกษตร.2556. รายชอผประกอบการผลตพนธพชเพาะเลยงเนอเยอเชงพาณชย.

กลมงานเพาะเลยงเนอเยอ สวนพฒนาการเพาะเลยงและจดการพนธพช ส านกพฒนา

คณภาพสนคาเกษตร. [ออนไลน]. เขาถงไดจาก: http//: plantpro.doae.go.th/TISSUE.

(วนทคนขอมล : 22 มนาคม 2556).

กรมสงเสรมการเกษตร. 2556. ปญหาและอปสรรคทพบในการเพาะเลยงเนอเยอพช. กลมงาน

เพาะเลยงเนอเยอ สวนพฒนาการเพาะเลยงและจดการพนธพช ส านกพฒนาคณภาพสนคา

เกษตร. [ออนไลน]. เขาถงไดจาก: http//: plantpro.doae.go.th/TISSUE.

(วนทคนขอมล : 22 มนาคม 2556).

รงสฤษด กาวตะ. 2540. การเพาะเลยงเนอเยอพช : หลกการและเทคนค. ภาควชาพชไรนา

คณะเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. กรงเทพฯ. 219 หนา.

สนธชย จนทรเปรม และ เสรมศร จนทรเปรม. 2549. เทคโนโลยชวภาพเพอการเกษตร. ในเอกสาร

ประกอบการฝกอบรมเชงปฏบตการ. คณะเกษตร ก าแพงแสน รวมกบศนย

เทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน. นครปฐม.

มหาวทยาลยกรงเทพธนบร

107

อภชาต ชดบร. 2556. หลกการเพาะเลยงเนอเยอพชเพอการขยายพนธ. สถาบนวจยและฝกอบรม

การเกษตรล าปาง มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลลานนา. อางโดย ศนยสงเสรมและ

พฒนาอาชพเกษตร. กระบวนการผนแปรทางพนธกรรมทเกดจากการเพาะเลยงเนอเยอ

พช. [ออนไลน]. เขาถงไดจาก: . http//:www.aopdt10.doae.go.th/html/data_0412.html .

(วนทคนขอมล : 22 มนาคม 2556)