1967 0. Dann, H. Roselieb und H. Sucker 161 Liebigs Ann. Chem. 710, 161-170 (1967)

Acetylcholin, XVII 1)

Acetokinase, Phosphotransacetylasen und Cholinacetylase der Honigbiene *)

von Otto Dann, Horst Roselieb 2) und Heinz Sucker

Aus dem Institut fur Angewandte Chemie der Universitat Erlangen-Nurnberg

Eingegangen am 9. Mai 1967

Aus dem waRrigen gepufferten Extrakt des Acetontrockenpulvers von Honigbienen werden durch fraktioniertes Erhitzen, Ammoniumsulfat-Fallung, Aceton-Fallung und zweimalige Molekulsiebchromatographie an Sephadex G-100 drei Enzym-Fraktionen erhalten, von denen Fraktion I die Aktivitat einer Phosphotransacetylase I, Fraktion I1 die einer Acetokinase und Fraktion 111 die eines Gemisches von Phosphotransacetylase I1 + Cholinacetylase aufweist. Die Phosphotransacetylasen zeigen keine Arsenolyse. Die Acetokinase der Bienen erweist sich, ebenso wie die Acetokinase aus Streptobacterium plantarum I0 S , Stubenfliegen und Hefe als frei von Carbamoylphosphatkinase-Aktivitat. - Acetylphosphat ist vermutlich am Ionenaustausch durch Zellmembranen beteiligt.

In zellfreien Extrakten und angereicherten Fraktionen der Stubenfliege (Musca dornestica) verlauft die enzymatische Synthese von Acetylcholin aus ATP und Acetat iiberraschend iiber Acetokinase zu Acetylphosphat (Gleichung l ) 3 ) , aus dem durch Phosphotransacetylase + Coenzym A Acetylcoenzym A gebildet wird (Gleichung 2), das mit Cholinacetylase Acetylcholin liefert (Gleichung 3)4).

Phosphotrans-

acetylase AcP + CoA -------- COA-AC + P (2)

Cholin-

acetylase CoA - Ac + Cholin ___ --f CoA+AcCh (3)

*) Die verwendeten Abkurzungen bedeuten: AcCh = Acetylcholin; AcP = Acetylphosphat; ATP, ADP, AMP = Adenosin-tri-, Adenosin-di-, Adenosin-5-mono-phosphat; AMP- Ac = Adenylacetat; CoA = Coenzym A; CoA-Ac = Acetyl-CoA; P = Phosphat; PP = Pyrophosphat.

1) 16. Mitteilung: H. Sucker, Pharmaz. Ind., im Druck (1967). 2) Aus der Dissertation H. Roselieb, Univ. Erlangen-Nurnberg 1966. 3) H. Sucker, Liebigs Ann. Chem. 683, 225 (1965). 4) 0. Dann und A . Roth, Liebigs Ann. Chem. 612, 34 (1958).

Liebigs Ann. Chem. Bd. 710 11

162 0. Dann, H. Rosetieb und H. Sucker Bd. 710

Acetokinase-Aktivitat wird von der Acetthiokinase (Gleichung 4) dadurch unterschieden, daR die Reaktion rnit kleinen Konzentrationen Hydroxylamin im Ansatz ohne Anwesen- heit von CoA verlauft, durch Fa-lonen hemmbar ist, und daB rnit Hilfe von Myokinase aus 1 Mol. ATP bis zu 2 Moll. AcP gebildet werden3).

Acetthiokinase ATP + Acetat +-- AMP-Acetat + PP (4)

Acetthiokinase AMP-Acetat + CoA - ' AMP + COA-AC

Inzwischen ist in tierischen Organen ein zweiter Bildungsweg von AcP aus Zitronensaure gefunden worden und der Nachweis von AcP als Silbersalz gelungens).

In der vorliegenden Untersuchung wurden die Enzym-Garnitur der AcCh-Synthese aus ATP in der Honigbiene (Apis melifera carnica) ermittelt und die beteiligten Enzyme der Honigbiene und der Stubenfliege verglichen.

Anreicherung der Aktivitaten Aus Honigbienen wurde nach Narkose rnit Kohlendioxid ein Acetontrockenpulver

und daraus nach Verreiben rnit Aluminium-Pulver mittels gepufferter KC1-Losung ein zellfreier Extrakt bereitets). Dieser lie13 sich gegen dest. Wasser dialysieren ; er wurde auch bei GroRansatzen rnit einem hochtourigen Mixer (Multimix) gewonnen.

Der Extrakt bildete rnit ATP und Hydroxylamin bei Abwesenheit von Coenzym A kolorimetrierbare Hydroxamsaure (Tab. 1 , Spalten 1 -5 ) . Diese Reaktion war durch FQ-Ionen vollig hemmbar (Tab. 1, Spalten 6 und 7); es wurden pro eingesetztes Mol ATP bis zu 1.5 Mol AcP gefunden (Tab. 1, Spalte 2). Damit war eine Acetokinase nachgewiesen, die der von Fliegen3), von Streptobacterium plantarum 10 S7) und von Backerhefe 8) vergleichbar war. Im Extrakt aus Acetontrockenpulver von Bienen war keine Acetthiokinase nachweisbar, wie sie in Thorax-Mitochondrien gefunden wurdeg).

Aus ATP und AcP bildete der Extrakt AcCh (Tab. 2), was die Anwesenheit von Phosphotransacetylase und Cholinacetylase beweist. Die Phosphotransacetylase- Aktivitat zeigt, ebenso wie die der Fliegen4) und der Hefes), keine Arsenolyse.

Die arsenolytische Aktivitat (Gleichung 5) der Phosphotransacetylase scheint auf manche Bakterienphosphotransacetylasen beschrankt zu sein "All).

AS(~) ,COA, KB + Acetat + P + H20 Phosphotrans-

acetylase (5)

5 ) M . F. Guly, T. N. Pechenova und L. I. Matusevich, Nature [London] 212, 36 (1966);

6 ) A . Wacker, A . Roth, H. Sucker und 0. D a m , Liebigs Ann. Chem. 601, 202 (1956). 7) H. Sucker, Liebigs Ann, Chem. 642, 207 (1961). 8) H. Sucker, Liebigs Ann. Chem. 683, 239 (1965). 9 ) D. D. Hoskins, V. H. Cheldelin und R . W . Newburgh, J. gen. Physiol. 39, 705 (1956)

10) E. R . Stadtman, G. D. Novelli und F. Lipmann, J. biol. Chemistry 191, 365 (1951); E. R.

11) R . D. Sagers, M . Benziman und S. M. Klein, J. Bacteriol. 86, 918 (1963).

[Ber. Akad. Wiss. UdSSR] 164, 686 (1965) [C. A. 64, 1120 (1966)l.

[C. A. 51, 622 (1957)l.

Stadtman, ebenda 196, 527, 535 (1952).

1967 Acetylcholin, XVII 163

Ferner konnten im Extrakt Myokinase (Tab. 1, Spalte 8), ATPase und eine au13er- ordentlich starke, saure Phosphatase, die nicht durch Fe-Ionen hemmbar war, nach- gewiesen werden. Die Anreicherung, wie sie bei Fliegen angewendet wurde3.4), lie13 sich auf den Bienenextrakt nicht iibertragen. Dagegen konnte durch fraktioniertes Erhitzen (1 5 Min., 50"), Ammoniumsulfat-Fallung bei 20 -48 g/Vol.- % Ammonium- sulfat, Aceton-Fallung rnit 33 -50 Vo1.- ?, und anschlieBende Ammoniumsulfat- Fallung rnit 0-48 g/Vol.- % Ammoniumsulfat eine Enzym-Fraktion erhalten werden, welche etwa 20 % des Extraktproteins enthielt und die Aktivitat von Acetokinase, Phosphotransacetylase und Cholinacetylase besal3 (Tab. 3). Die spezifischen Akti- vitaten der Acetokinase betrugen im Extrakt 35, in der Enzym-Fraktion 578 pMol AcP/(g Protein. Stunde).

Die Chromatographie dieser Enzym-Fraktion auf 1-m-Saulen an Sephadex G-100 ergab 3 Fraktionen (Abb. l), in denen sich die Hauptmenge der Aktivitaten von

Abbildung 1 Trennung der Enzyrn-Fraktion aus Bienen an Sephadex G-100 (vgl. S. 168)

1 b

l t 9 2 / 6 7 Z a - c ]

Abbildung 2. Rechrornatographie der Fraktionen Nr. 11-19 (Abb. 2a), 20-25 (Abb. 2b) und 26-35 (Abb. 2c) aus Abb. 1 an Sephadex G-100.

x - x Acetokinase, o - o Phosphotransacetylase, A -A Cholinacetylase, - - - Protein Versuchsbedingungen bei Abb. 1 und 2: Prufung auf Acetokinuse-Aktivitat wie bei Tab. 1 rnit 1 mg ATP-Na2 und 0.15 ccm der eluierten Fraktion. - Prufung auf Phosphotrunsace- ryluse-Aktivitat wie bei Tab. 2 rnit 1 mg AcP-Liz, 0.025 ccrn Fliegen-Cholinacetylase und 0.15 ccrn der eluierten Fraktion. - Prufung auf Cholinucetylase-Aktivitat wie bei Tab. 2 mit I rng AcP-Li2, 0.025 ccrn Fliegen-Phosphotransacetylase und 0.1 5 ccrn der eluierten Fraktion. - AcCh wurde chernisch bestimmt. - Die angegebenen Werte von E sind die in

den Hydroxanrsairretesten erhaltenen Extinktionen. 11'

164 0. Dann. H. Roselieb und H. Sucker Bd. 710

Acetokinase, Phosphotransacetylase und Cholinacetylase befand. Eine vollige Tren- nung lieB sich nicht erzielen. Die 3 Fraktionen wurden konzentriert und an der gleichen Saule erneut chromatographiert (Abb. 2). Es konnten dabei eine Bienen- Phosphotransacetylase I , unter Aktivitatsverlust eine Bienen-Acetokinase und ein Gemisch von Bienen-Phosphotransacetylase Z I + Cholinacetylase neben Acetokinase erhalten werden. Die spezifische Aktivitat der Bienenacetokinase betrug 2700 pMol AcP/(g Protein. Stunde).

Eigenschaften Acetokinase

Die Bienen-Acetokinase zeigte eine ausgepragte Spezifitat fur Acetat-Ionen. Pro- pionat und Lactat wurden etwa zu 20%, Butyrat etwa zu lo%, bez. auf Acetat, umgesetzt.

Mit Propionat als Substrat hat Acetokinase aus Escherichia coli nur 1/10 der Aktivitat wie mit Acetat12).

Wie bei der Acetokinase aus Hefeg), forderte auch bei derjenigen aus Bienen Mn20 die AcP-Synthese starker als Mg2Q. Mit logarithmisch steigender Mn-Konzentration nahm die AcP-Ausbeute linear zu, bis 1 Mol. Mangan einem Mol. eingesetztem ATP entsprach (Tab. 4). Andere Kationen, wie Na@, K0, NH40, Ca2@, Zn2@ und Cd20, forderten und hemmten die AcP-Synthese nicht. Ebenso hemmten weder Arsenit- noch Arsenat-Ionen.

Das pH-Optimum wurde unter den Versuchsbedingungen bei pH 6.8 gefunden und fallt jenseits von pH 7 steil ab.

Es gelang, Gleichung 1 unizukehren und aus AcP und ADP wieder ATP zu bilden; dabei wurde das noch vorhandene AcP bestimmt (Tab. 5). Es stellte sich innerhalb 4.5 Stdn. ein Gleichgewicht ein, nachdem etwa 1/3 vom eingesetzten ADP zu ATP umgesetzt worden war.

Die Michaelis-Menten-Konstantel3) wurde fur ATP bei 28" zu 1.1.10-3 Mol be- rechnet. Fur die Acetokinase von Escherichirr coli wurde 2.10-3 Mol bei 29" ge- f unden 12).

Carbamoylphosphatkinase aus Ratten- und Froschleber synthetisiert nicht nur ATP aus ADP und Carbamoylphosphat, sondern auch aus AcP; es wurde deshalb vermutet 14), da13 Carbamoylphosphatkinase und Acetokinase identische Enzyme

12) I . A . Rose, M . Grunberg-Manago, S. R. Korey und S. Ochoa, J. biol. Chemistry 211, 737

13) H. Lineweaver und D . Burk, J. Amer. chem. SOC. 56, 658 (1934). 14) S. Grisolea und P . Harmon, Biochem. biophysic. Res. Commun. 7, 357 (1962); W. B.

Novoa und S. Grisolea, J. biol. Chemistry 237, PC 2710 (1962); L. Raijman und S. Grisolea, ebenda 239, 1272 (1964); S. Grisolea und L . Raijmnn, Advances Chem. Ser. 44, 128 (1964) [C. A. 60, 14745 (1964)l.

(1954).

1967 Acetylcholin, XVII 165

seien. Die in zellfreien Extrakten aus Streptobacterium plantarum 10 S6,7), Stuben- fliegen3,4), Honigbienen und Hefe 8) enthaltenen Acetokinasen bildeten unter den Versuchsbedingungen aus ATP und Ammoniumcarbonat bzw. Ammoniumcarbaminat kein Carbamoylphosphat 151, welches mit Ornithin durch Ornithin-Transcarbamylase der Hefe in Citrullin ubergefuhrt worden ware16) (Tab. 6). Ein Extrakt aus Frosch- leber 17) lieferte dagegen unter den Versuchsbedingungen Citrullin. Der Versuch zeigt, da13 offensichtlich AcP-spezifische Acetokinasen und unspezifische Carbamoyl- phosphatkinasen gefunden werden.

Phosphotransacetylase

Die Aktivitat der Phosphotransacetylase wurde im optischen Test nach Stadtman18) durch die Zunahme der Extinktion bei 230 mp fur gebildetes CoA-Ac (Gleichung 2) bestimmt und mit CoA als Substrat die Michaelis-Menten-Konstante13) bei 22" zu 1.3.10-4 Mol berechnet. Wie im Extrakt konnte auch mit den angereicherten Phospho- transacetylase-Fraktionen keine Arsenolyse-Reaktion erhalten werden.

Acetylcholin-Synthese

Wie bereits bei den Fliegen-Enzymen gefunden4), wurde auch bei den Bienen- Fraktionen die Synthese von Acetylcholin aus AcP durch reduzierende Agentien, wie Cystein und Glutathion, nicht beeinflu&. Prostigmin steigerte die AcCh-Ausbeute durch Hemmung verschleppter Cholinesterase4) ; der Ersatz von Kaliumacetat durch Natriumacetat hemmte die AcCh-Synthese4) durch Forderung mitgeschleppter Acetylphosphatase3). Arsenit, sowie weniger ausgepragt Arsenat, verminderte die Ausbeute an Acetylcholin. Von den untersuchten 2 wertigen Kationen waren Mnze, Mgzs und Ca2a ohne EinfluB, Znz@ hemmte und Cdz@ forderte die AcCh-Synthese (Tab. 7). Eine Erklarung dieses gegensatzlichen Verhaltens der beiden mit Sulfhydryl- Gruppen reagierenden Ionen steht noch aus.

Diskussion der Ergebnisse

Die Versuche zeigen, da13 Bienen die gleiche Enzym-Garnitur wie Fliegen enthalten : Acetokinase, Phosphotransacetylase, Cholinacetylase und Acetylphosphatase. Die Proteine der einzelnen Enzyme verhalten sich bei der Aufarbeitung verschieden, die physiologischen Eigenschaften, z. B. gegen Hemmstoffe, sind gleich. So hemmen u. a.

15) J. Yasphe und L. Gorini, J. biol. Chemistry 240, 1681 (1965); S. Grisolea, in P. D. Boyer, H. Lardy und M . Myrback, The Enzymes, 2 . AuR., Bd. 6, S. 477, Academic Press, Tnc., New York 1962; R . L. Metzenberg, M. Marshall und P . P . Cohen, J. biol. Chemistry 233, 1560 (1958).

16) K . Kleczkowski und P. P. Cohen, Arch. Biochem. Biophysics 107, 271 (1964). 17) E. W. Brown und P . P . Cohen, J. biol. Chemistry 234, 1769 (1959). 18) E. R. Stadtman, J. cellular comparat. Physiol. 41, 89 (1953); Zusammenfassung bei

K. Decker, Die aktivierte Essigsaure, Enke-Verlag, Stuttgart 1959, S. 110- 162.

166 0. Dann, H. Roselieb und H . Sucker Bd. 710

auch die an Fliegen gepriiften substituierten Essigsauren 19) die Bienen-Enzyme; die Xanthenmonocarbonsaure-(9) erweist sich als starkster Hemmstoff 2). Der Befund legt den Schlul3 nahe, dal3 entweder die Acetat-Aktivierung (mittels ATP) oder die ATP-Synthese (aus CoA - Ac) im Insektenreich uber AcP als Zwischenprodukt ver- lauft. Es besteht die Moglichkeit, dal3 AcP eine bislang unbekannte Funktion besitzt : Die Adenosintriphosphatase wurde als wesentlicher Bestandteil fur den Naa/K@- Transport durch die Zellwand erkannt und ein Acylphosphat als enzymgebundenes Zwischenprodukt gefunden 201. Ferner wurde eine Acetylphosphatase-Wirkung der Zellmembran-ATPase beschrieben 21). Das starke Vorkommen von Acetylphosphatase in allen tierischen Organen, das Auffinden eines biogenen Hemmstoffs der Acetyl- phosphatase im Blutegel22) und die Hemmbarkeit der Acetylphosphatase durch Thyroxin23) erscheinen bemerkenswert und lassen erwarten, dal3 auch Acetylphosphat und Acetylphosphatase am Ionenaustausch durch Zellmembranen beteiligt sind.

Der Deutschen Forschungsgemeinschafl und dem Fonds der chemisehen Industrie haben wir f u r Sachbeihilfen zu danken.

Beschreibung der Versuche Der Proteingehalr wurde mit der Biuretreaktionz41, bei kleinen Proteingehalten (< I mg/

2 ccm) nach Lowry und MitarbeiternzV6) bei 750 m p oder mittels der Extinktion bei 280 mp27) im Zeiss-Spektralphotometer M4Q gemessen. - Acetylphosphat wurde rnit der Hydroxam- saurereaktionzs) fur Saureanhydride gemessen ; die angegebenen Werte beziehen sich auf das Dilithiumsalz. - Acetylcholin wurde biologisch rnit dem Blutegeltest 6.291, chemisch rnit der Hydroxamsaurereaktion30) fur Ester ermittelt ; die angegebenen Werte beziehen sich auf Acetylcholinchlorid. - Die pH- Werte wurden im Bereich von 4-6 rnit Spezialindikator- papier (Macherey, Nagel & Co.), im Bereich von 6-7 rnit dem Lyphan-Spezialindikator- papier (Kloz, Berlin) gemessen. - Fliegen-Phosphotransacetylase und -Cholinacetylase wurden nach Lit.41 gewonnen ; der Niederschlag der 3. Ammoniumsulfat-Fallung wurde aber nicht in der Halfte des Ausgangsvolumens, sondern in 1/10 Vol. vom verwendeten Extrakt auf genommen.

19) 0. Dann und H . Sucker, Arch. Pharmaz., Ber. dtsch. pharmaz. Ges. 295, 497 (1962). 20) L . E. Hokin, P . S. Sastry, T. R . Galsworthy und A. Yodq Proc. natl. Acad. Sci. USA 54,

21) H. Bader und A. K . Sen, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 118, 116 (1966). 22) 0. Dann und H . Sucker, Liebigs Ann. Chem. 705, 238 (1967). 23) I . Hurary, Biochem. biophysica Acta [Amsterdam] 25, 193 (1957). 24) A. C . Cornall, C . J. Barduwill und M. M. David, J. biol. Chemistry 177, 751 (1949). 25) 0. H . Lowry, N . J. Rosebrough, A . L. Farr und R . J . Randall, J. biol. Chemistry 193, 265

26) D. Glusser und R. Kleine, Pharmazie 17, 32 (1962). 27) 0. Warburg und W. Christian, Biochem. Z . 303, 40 (1939); 310, 384 (1941/42). 28) F. Lipmann und L . C. Turtle, J. biol. Chemistry 159, 21 (1945). 29) 0. Danri und R . Straller, Arch. Pharmaz., Ber. dtsch. pharmaz. Ges. 292, 723 (1959). 30) 5’. Hestrin, J. biol. Chemistry 180, 249 (1949).

177 (1965).

(1951).

1967 Acetylcholin. XVII 167

.Icetontrockenpulver. - Zur Narkose der Bienen (Apis melijera carnicaj31) wurde Kohlen- dioxid aus einer Stahlflasche in den Einwabenkasten rnit etwa 1 5 0 Bienen geleitet. Der Kasten stand in einem groBen Emailletopf, in dem das COz sich sammelte. Die narkotisierten Bienen (ca. 70 g) wurden in einem Becherglas unter COZ gewogen. In einem auf -15" vorgekuhlten Multimix (Braun) schiittete man die Bienen in die zehnfache Menge kaltes Aceton (-15") und zerkleinerte 2 Min. bei hochster Geschwindigkeit. Nach 15 Min. bei +4" wurde in vorge- kiihlten Metallbechern 15 Min. bei 3000 U/Min. zentrifugiert. Nach dem Dekantieren des gelben Uberstands wurde der Bodensatz rnit der gleichen Menge vorgekiihlten Acetons auf- geschwemmt. Nach 15 Min. im Eisschrank zentrifugierte man 20 Min. bei 3000 U/Min. Die Behandlung mit Aceton wurde wiederholt, der feuchte Riickstand in einer Reibschale trocken gerieben und das Pulver in dunner Schicht ausgebreitet, bis der Geruch nach Acetonver- schwunden war. Das Acetontrockenpulver war bei - 15' iiber Silikagel Ianger als 1 Jahr haltbar.

Extrakt. - 1 g Bienen-Acetontrockenpulver wurde rnit 1 g Aluminium-Pulver (Riedel-de Haen; feines Pulver) in einer vorgekiihlten Reibschale 2 Min. fest verrieben, in 20 ccm vor- gekiihlter Extraktionslosung (3.7 mg KCI + 1.74 mg K2HP04 pro ccm; p H 6.8 rnit 2nHCI eingestellt) suspendiert und 2 Stdn. lang jeweils 15 Min. unter kraftigem Reiben extrahiert; zwischendurch wurde die Reibschale gekiihlt. Die Suspension zentrifugierte man 30 Min. bei 20000 U/Min. und 0". Der klare, gelbbraune Uberstand (15- 16 ccm) war der zellf>eie Extrakt. - Fur GroJansiitze wurden bei +4" im Multimix 10 g Acetontrockenpulver, 10 g Aluminium-Pulver und 200 ccm Extraktionslosung wahrend 2 Stdn. nach je 15 Min. bei hochster Tourenzahl 2 Min. turbiniert und wie voranstehend zentrifugiert. Beide Extrakte enthielten 5 - 10 mg Protein/ccm (Biuretreaktion).

Anreicherung der Enzyme Erhitzter Extrakt: 80 ccm Extrakt wurden unter gelindem Umschwenken 15 Min. auf 50"

(Bad) erhitzt und anschlieBend rasch gekiihlt. Ammoniumsulfat-Fallungc In 80 ccm auf 0" gekiihlten erhitzten Extrakt loste man unter

kraftigem Umschwenken 16 g feinstgepulvertes Ammoniumsulfat (20 g/Vol.- %), belieR 15 Min. im Eisbad und zentrifugierte 15 Min. bei 20 000 U/Min. und 0". Der Niederschlag wurde verworfen. Zu der eisgekiihlten iiberstehenden Losung gab man erneut 22.4 g Am- moniumsulfat (20-48 g/Vol.-%) und verfuhr wie vorher. Der Niederschlag wurde in 80 ccm Extraktionslosung gelost und lieferte die Ammoniumsulfat-Fraktion 20-48 %.

Aceton-Fullung: 80 ccm Ammoniumsulfat-Fraktion 20-48 % wurden im Zentrifugenbecher unter Riihren rnit 40 ccm kaltem Aceton (-15') tropfenweise versetzt (0-33 Vo1.-%). Nach 15 Min. bei +4" wurde 15 Min. bei 4000 U/Min. und 0" zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen, die iiberstehende Losung wie voranstehend mit weiteren 40 ccm Aceton (33 - 5 0 Vol.- %) versetzt und zentrifugiert. Der Uberstand wurde verworfen; der Nieder- schlag, in 80 ccm Extraktionslosung gelost, lieferte die Aceton-Fraktion 33-50 %.

2. Ammoniumsulfat-Fallung: Zu 80 ccm Aceton-Fraktion 33-50% gab man 38.4 g Am- rnoniumsulfat (48 g/Vol.-%), zentrifugierte nach 15 Min. und nahm das Sediment in 8 ccm Extraktionslosung auf : Enzym-Fraktion rnit ca. 8 mg Protein/ccm.

31) Die Bienen verdanken wir Herrn Dir. Dr. F. K. Boettcher von der Bayer. Landesanstalt fur Bienenzucht, Erlangen. - Es handelte sich um weisellose Volker, die uns in den Mo- naten August und September iiberlassen wurden.

168 0. Dann, H. Roselieb und H. Sucker Bd. 710

Molekiilsiebchromatographie: Auf eine rnit Phosphatpufler (1.38 mg KH2P04 + 1.75 mg KzHP04 pro ccm; pH 6.7-6.8) aquilibrierte Saule von Sephadex G I 0 0 (2.1 x 90cm) wurden 3 ccm Enzym-Fraktion gebracht und bei Raumtemperatur rnit Phosphat-Puffer eluiert. Nach einem Vorlauf von 90 ccm wurden 80 Fraktionen zu je 1.8 ccm aufgefangen (Radirac Fraktionsschneider; LKB-Produkter, Stockholm). Die Eluate wurden optisch bei 254 m p mit dem Uvicord I (LKB-Produkter) kontrolliert. Aus den einzelnen Fraktionen wurden jeweils 0.3 ccm zur Prufung auf Acetokinase-Aktivitit (Versuchsbedingungen wie in Tab. 1 rnit 1 mg ATP-Na2), auf Phosphotransacetylase-Aktivitat (Versuchsbedingungen wie in Tab. 2 rnit 1 mg AcP-Liz + 0.025 ccm Fliegen-Cholinacetylase) und aut Cholinacetylase- Aktivitiit (Versuchsbedingungen wie in Tab. 2 rnit I mg AcP-Liz und 0.025 ccm Fliegen- Phosphotransacetylase) verwendet (vgl. Abb. 1). - Die Fraktionen Nr. I 1 -19, 20-25 und 26-38 wurden vereinigt. In den aus drei Aufarbeitungen gewonnenen Fraktionen wurden die Proteine rnit 50 g/Vol.-% Ammoniumsulfat gefallt und die Niederschlage in 3.5 ccm Extraktionslosung gelost. Man erhielt auf diese Weise Fraktion I (aus Frakt. Nr. 11 - 19), II (aus Frakt. Nr. 20-25) und III (aus Frakt. Nr. 26-38).

Bienen-Acetokinase. - 3 ccm Fraktion II wurden wie voranstehend chromatographiert, die Fraktionen auf Acetokinase-Aktivitat gepriift und die Fraktionen 28 -32 zur Bienen- acetokinase vereinigt (Abb. 2).

Bienen-Phosphotransacet)ilase I. - 3 ccrn Fraktion I wurden wie voranstehend chromato- graphiert, die Fraktionen auf Phosphotransacetylase-Aktivitat gepriift und die Fraktionen 21 -35 zur Bienen-Phosphotransacetylase I vereinigt (Abb. 2).

Bienen-Phosphotransacetylase I I + Cholinacetylase. - 3 ccm Fraktion III wiirden wie voransstehend chromatographiert, die Fraktionen auf Phosphotransacetylasen sowie auf Cholinacetylase-Aktivitat gepriift und die Fraktionen 35 - 39 zur Bienenphosphotransacetylase II + Cholinacetylase vereinigt (Abb. 2).

Auswertungen Tabelle 1. Acetat-aktivierendes Enzym im Bienen-Extrakt

Die rnit 0.1 n KOH auf pH 6.7 eingestellten Inkubationsansatze (2 ccm) enthielten auRer den angegebenen Zusatzen je ccm: 1 mg Cystein.HC1, 0.2 mg MnC12.4 H20, 9.8 mg Kalium- acetat und 0.05 ccm Hydroxylamin-Losung (2 g Hydroxylamin.HC1 in 10 ccm 2n KOHL Nach 14stdg. Inkubation bei 28" wurde rnit Wasser auf 3 ccm aufgefiillt und die Acethy- droxamsaure nach Lit. 28) bestimmt (2-cm-Kiivetten); ein Ansatz ohne ATP diente als Blind- probe. - Der Extrakt (Reibschale) wurde 16 Stdn. gegen dest. Wasser bei 4" dialysiert (dialys.

Extrakt).

Zusatz/ccm Inkubationslosung

mg - ATP-Na2 1 1 1 1 1 I 1 1 mg ADP-Na3

0.1 - 0.1 - mg CoA Extrakt (Reibschale) 0.25 - - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 ccm

ccm ccm Extrakt (Multimix) - - - - - - mg

- - - - - - - - - - -

- - - - - dialys. Extrakt - 0.25 -

K F - 0.25 - - 1 1 - - - -

- pg/ccm - - - AcP gef. Versuch 1 : 260 370 141 - Versuch 2: - - - 156 192 18 18 104pg/ccm

1967 Acetylcholin, XVII 169

Tabelle 2. Synthese von Acetylcholin aus ATP und AcP Die mit 0.1 n KOH auf pH 6.7 eingestellten Inkubationsansatze (2 ccm) enthielten, auBer den angegebenen Zusatzen, je ccm: 1 mg Cystein.HCI, 0.2 mg MgCl2.6 H20, 0.1 mg CoA,

0.25 mg Prostigmin. HBr, 1 mg Cholinchlorid, 9.8 mg Kaliumacetat.

Zusatz/ccm Inkubationslosung

mg 1 1 1 mg

ccm 0.25 - ccm

- - 0.25 ccm

- - - ATP-Na2 1 AcP-Liz -

Extrakt (Reibschale) 0.25 0.25 - - dialys. Extrakt - -

Extrakt (Multimix) -

AcCh gef. 6.29 95 53 120 75 pg/ccm

Tabelle 3. Erhitzter Extrakt, Ammoniumsulfat- und Aceton-Fallungen a) Die Acetokinase-Akfivitut wurde wie in Tab. 1 (mit 1 mg ATP-Na2) ermittelt. b) Die Phosphotransacetylase-Aktivituf wurde wie bei Tab. 2 (mit 1 mg AcP-Liz + 0.025

c) Die Cholinacefylase-Aktivitat wurde wie in Tab. 2 (mit 1 mg AcP-Liz + 0.025 ccm ccm Fliegen-Cholinacetylase) bestimmt.

Fliegen-Phosphotransacetylase) gemessen.

Zusatz/ccm Inkubationslosung a) b) C) pg AcP/ccm pg AcCh/ccm pg AcCh/ccm

Extrakt 0.25ccm 348 98 65

erhitzter Extrakt (zentrifugiert) 0.25 ccm 326 74 5 5

Ammoniumsulfat-Fraktion 20-48 % 0.25 ccm 348 145 100

Aceton-Fraktion 33-50% 0.25ccm 485 250 92 Enzym-Fraktion 0.025ccm 485 250 92

Tabelle 4. EinfluB von zweiwertigen Kationen auf die Acetokinase-Aktivitat Versuchsbedingungen wie in Tab. 1 (ohne MnC12, jedoch mit 0.25 ccm Bieuen-Acetokinase).

Zusatzlccm Inkubationslosung AcP-Lizlccm

0.025 mg (12 pMol) MnC12.4H20 0.075 mg (38 pMol) MnC12.4H20

0.125 mg (63 pMol) MnC12.4HzO 0.250 mg (126 pMol) MnC12.4H20

0.327 mg (165 pMol) MnC12.4H20 0.2 mg (126 pMol) MgC12.6HzO

0.2 mg (90 pMol) CaC12.6H2O

15 48

133

180 252

260

126 7

170 0. Dann, H. Roselieb und H. Sucker Bd. 710

Tabelle 5. Riickreaktion der Acetokinase Versuchsbedingungen wie bei Tab. 1 (ohne ATP und Hydroxylamin, jedoch mit 1 mg AcP-Liz + 0.25 ccm Bienen-Acetokinase). - Nach der angegebenen Inkubationszeit wurde das verbliebene AcP-Liz kolorimetrisch bestimmt 28) ; Blindwerte ohne AcP dienten zum Vergleich.

Zusatz/ccm Inkubationsdauer Inkubationslosung 4.5 Stdn. 8 Stdn.

AcP gef. 470 390 375 285 pg/ccm enzymat. abgebautes AcP-Liz - 89 - 92 pg/ccm

300 - 300 pg/ccm ber. Verbrauch an ADP-Na3 -

Tabelle 6. Priifung auf Carbamoylphosphatkinase Die Inkubationsansatze (2 ccm) enthielten, auBer den angegebenen Zusatzen, je ccm: 2.5 mg (25 pMol) (NH4)2C03, 0.13 mg (1 pMol) L-Ornithin, 0.47 mg (2.5 pMol) N-Acetyl-glutamin- saure32), 0.61 mg (2.5 pMol) MgS04.7H20 und 1.4 mg (2.5 pMol) ATP-Na2. - Inkubiert wurde 16 Stdn. bei 28". Zu den Ansatzen fiigte man 1 ccm Wasser, 1 ccm 0.5m Perchlorsaure, 0.25 ccm 3-proz. Diacetylmonoxim-Losung33) sowie 2 ccm Schwefelsaure + Phosphorsaure (1 : 3) und erhitzte 10 Min. im Dunkeln auf dem siedenden Wasserbad. Dann lie8 man durch Einstellen in Wasser bei Raumtemperatur 10 Min. im Dunkeln abkiihlen und ma8 die Ex- tinktion bei 490 m p in I-cm-Kiivetten. Ein jeweils analog angesetztes Rohrchen ohne ATP diente zum Vergleich. - Der verwendete Hefe-Exfrukt bildete mit Carbamoylphosphat34)

innerhalb 10 Min. 83 pg Citrullin.

Zusatz/ccm Inkubationslosung

ccni Extrakt aus Streptobacteriuin 0.25 - - - -

ccm Extrakt aus Stubenfliegen4) - - - ccm Extrakt aus Honigbienen - -

Extrakt aus Hefes) 0.05 0.05 0.05 0.25 - ccm - 0.25 ccm Extrakt aus Froschleber 17) - - -

plantarum 10 S6) 0.25 -

- 0.25 -

- 420 pg/ccm - 5 Citrullin gef. -

Tabelle 7. EinfluB von Zn20- und Cd2@-Ionen auf die AcCh-Bildung

0.15 ccm Fraktion Phopshotransacetyluse II + Cholinacetylase). Versuchsbedingungen wie in Tab. 2 (ohne MgC12.6H20, jedoch mit 1 mg AcP-Liz und

Zusatz/ccm Inkubationslosung

0.3 - mg 0.2 mg

ZnClz -

i-dClz - ~

AcCh gef. 40 12 73 pg/ccm

32) J. Yusphe und L . Gorini, J. biol. Chemistry 240, 1681 (1965). 33) 0. Diels und H. Josf, Ber. dtsch. chem. Ges. 35, 3290 (1902). 34) M. E. Jones, L . Spector und F. Lipmann, J. Amer. chem. SOC. 77, 819 (1955). [92/67]