PowerPoint Presentation
Metaboliti primariAcidul citric (acid 1,2,3 tricarboxi-2-
hidroxi- propionic)
Acidul citric (acid 1,2,3 tricarboxi-2- hidroxi- propionic)1784,
Carl Scheele (chimist suedez)1826, Anglia
1880, sintetizat din glicerol Grimoux si Adams1893, Wehmer
Penicillium sp.
UK Sturage Company by JOHN & EDMUNDItalia, 40 50 tone 1 tona
de acid citric presare si precipitare cu sare de calciuacid
tricarboxilic, 210,14 DaIzolat prima data din suc de lamaie in 1784
de catre CarlScheele, un chimist suedez (17421786). Este un acid
tricarboxilic, greutate moleculara: 210.14 Da.Un metabolit
intermediar universal, plante si animalePrimul proces comercial UK
Sturage Company by JOHN & EDMUND 1826 folosind lamai importate
din ItaliaCresterea importantei comerciale monopol al Italiei in
cursul sec 19.Sucul de lamaie sursa comerciala de acid citric pana
in 1919, cand primul proces industrial folosind o tulpina de
Aspergillus niger a fost dezvoltat in BelgiaIn 1893; Wehmer
observed occurrence of citric acid as a microbial product by using
penicillium.In 1922; Millard recorded accumulation of citric Acid
In culture of Aspergillus niger under condition of nutrition
deficiency.
2Productia de acid citricMicroorganisme producatoareFungi
filamentosi: Aspergillus niger, A. awamori, A. nidulans, A.
fonsecaeus, A. luchensis, A. phoenicus, A. wentii, A. saitoi, A.
flavus, Absidia sp., Acremonium sp., Botrytis sp., Eupenicillium
sp., Mucor piriformis, Penicillium janthinellum, P. restrictum,
Talaromyces sp., Trichoderma viridae si Ustulina vulgaris
Currie, 1917 A. niger concentratii ridicate de zaharuri si
saruri minerale,pH 2.5 3.5 acid citricsupresarea formarii de acid
oxalic si acid gluconicPfizer 1923, Statele Unite ale Americii
Productia de acid citricMicroorganisme producatoareLevuri:
Candida (C. tropicalis, C. catenula, C. guilliermondii si C.
intermedia), Hansenula, Pichia, Debaromyces, Torula, Torulopsis,
Kloekera, Saccharomyces, Zygosaccharomyces si Yarrowia.Substrat:
n-alcani si carbohidrati (Mattey, 1999).1960 si 1970, procese
comerciale - hidrocarburi si levuridezavantaj: acid izocitric
selectia mutantelor cu o activitate aconitazica redusa
principalul microorganism industrial producator: Aspergillus
niger
selectia de tulpini specifice in functie de tipul de proces
randamentul de productie 70% din cel teoreticConditiile de
desfasurare a procesuluiAcumularea de acid citric in mediu-+azot,
fosfati, urme de metalezaharuri, oxigenstudiate in 1930 si
1940evaluate diferite componente ale mediului de cultura
Mediul de cultivareCurrie, 1917Shu and Johnson, 1948tipul si
concentratia sursei de C,sursa de N, fosfatii, pH,
temperaturaaerare,concentratia urmelor de elemente,morfologia
microoganismului industrial producatorConditiile de desfasurare a
procesuluiMediul de cultivarepolizaharide
prelucratezaharoza/glucoza si fructoza invertaza activa la pH
scazutmelasa de sfecla de zahar, melasa de trestie de zahar, alte
polizaharide, contaminare (cationi) procesele anterioare -
precipitare cu ferocianida de K, rasini schimbatoare de ioniSursa
de carbonTipul de substratConcentratia 14 -22%Randamentul final de
acid citricConditiile de desfasurare a procesuluiMediul de
cultivareSursa de azot si fosforLaboratorsaruri de amoniu (NO3,
SO4) 0,3 1,5g/l NH4, niciodata nitrati, uree, extract de
drojdie/malt Scaderea valorii pH!acumularea de acid citricfosfatii
limitata (0,03%)Urme de metaleZn - 0,5 mg/l,
Mn - 3 g/l (sinteza de proteine)
Fe - 1 mg/l (cofactor al aconitiazei)conditii limitantemelase
K4Fe(CN)6 fixare in complexe insolubile Conditiile de desfasurare a
procesuluiMediul de cultivareValoarea pHImportanta in 2 etape ale
procesului:pH > 5: spori germinare,pH < 2, inhiba productia
de acizi organici nedoriti reduce riscul de contaminare cresterea
valorii pH la 4.5reducerea randamentului de productie cu pana la
80% Morfologia microorganismului industrial producator
Miceliu acidogenic tipic de A. niger cultivat pe un mediu
deficient in Mn intr-un bioreactor cu agitare mecanica, pH - 2se
observa tipul morfologic caracteristic in aceste conditii de
cultivare hife scurte, dilatate
M. Papagianni / Biotechnology Advances 25 (2007)
244263Reprezentarea schematica a reactiilor metabolice implicate in
productia de acid citric Reglarea biosintezei si acumularii de acid
citricBiochimia formarii acidului citric
Caile metabolice ce conduc la formarea de acid citric pornind de
la zaharoza debuteaza extracelular cu o enzima atasata de membrana
celulara - invertazaMembrana celularaTemperaturile ridicate din
cursul procesului de sterilizare glucoza si fructoza
Reglarea biosintezei si acumularii de acid citricBiochimia
formarii acidului citricHexokinaze
citratRegleaza fluxul de glucoza prin glicolizaGlucozo
oxidazaGlucozaAcid gluconicGlucozo oxidaza este indusa in
conditiile biosint si acumularii de acid citric (conc ridicate de
glucoza, aerare puternica si conc scazute de alti nutrienti) se
formeaza in etapele initiale ale procesului, si converteste o
cantitate semnificativa de glucoza la acid gluconic, insa efectul
sau este limitat deoarece enzima este inactivata in conditiile
scaderii valorii pH sub 3.5. nu este clar daca A. niger poate
folosi acidul gluconic pentru a forma acid citric in etapele finale
ale procesului.12Reglarea biosintezei si acumularii de acid citric2
Piruvat EMPMetabolismul glucidelor pana la piruvat implica la A.
niger participarea atat a caii EMP (glicolizei) cat si a caii
pentozofosfatilor (HMP)GlucideHMPEMP/HMP: 2:1 formarea de
biomasaEMP/HMP: 4:1 producerii de acid citricReglarea biosintezei
si acumularii de acid citricCiclul glicolizei
+
+Fosfofructokinaza enzima reglatoare cheie a ciclului glicolizei
(EMP)
Fosfofructokinaza
+ATP, Mn, citratNH4+, Zn, Mg si fructozodifosfat+
Reglarea biosintezei si acumularii de acid citricCiclul Krebs
(acizilor tricarboxilici)Catabolismul glucozei pe calea glicolizei
conduce la 2 moli de piruvat care sunt convertiti in 2 reactii
diferite in 2 precursori ai citratului: oxaloacetat si acetil
CoA
15Reglarea biosintezei si acumularii de acid citricConditiile de
mediu rol in acumularea intracelulara si in mediu a acidului
citric:Prezenta unei concentratii ridicate de zahar in mediu este
necesara pentru acumularea rapida de citratCitratul care se
acumuleaza rapid inhiba enzima izocitrat dehidrogenaza din ciclul
KrebsDeficienta de Fe2+ din mediu inhiba activitatea
aconitat-hidratazei (aconitiaza), al carei cofactor este
fierulConcentratia intracelulara mare de NH4+, determinata de
deficienta de Mn2+ inhiba -cetoglutarat dehidrogenaza.Cum se
explica faptul ca citratul format in reactia de condensare amintita
se acumuleaza in mediu si apoi in mediu, in loc sa fie metabolizat
mai de parte in ciclul 16
Concentratie mare de zaharReglarea biosintezei si acumularii de
acid citricPFK = fosfofructokinazaCS = citrat sintazaAH =
aconitrat-hidrataza (aconitaza)ICDH = izocitrat dehidrogenazaPC =
piruvat-carboxilazaReglarea biosintezei si acumularii de acid
citricRegenerarea NADH si fosforilarea oxidativaGlucozaAcid citric
+ H2O+ 3/2 O2Catena respiratorie standard in cursul careia NADH+H+
format in cursul glicolizei este reoxidat cu formare de ATPCale
alternativa de reoxidare a NADH+H+ citoplasmatic fara formare de
ATP1 molecula de ATP si 3 molecule de NADH+HReglarea biosintezei si
acumularii de acid citricTransportul extracelular al acidului
citricAlterarea permebilitatii membranei plasmatice si peretelui
celular datorita deficitului de Mn2+ din mediuscaderea
trigliceridelor si fosfolipidelor de la nivelul membranei
plasmatice cresterea cantitatii de chitina, scaderea beta-glucan si
alti polimeri ai galactozei de la nivelul peretelui celular
Cinetica producerii acidului citric
Stadiul de crestere a miceliului cuprinde trei faze:Faza
germinarii conidiilor consum de N si P din mediu scaderea valorii
pH 2,4-2,6 1,7-1,8Faza cresterii exponentialeFaza incetinirii
cresterii
stadiul de crestere a miceliului sistadiul de producere a
acidului citricCinetica producerii acidului citricStadiul de
producereFaza cresterii secundare 1,1g acid citric/h, Faza
producerii acidului citric 80% din concentratia finala de acid
citric nu este proportionala cu cantitatea de miceliu si sporularea
lui, ci miceliile subtiri si slab sau deloc sporulate produc
cantitati mai mari de acid citric fata de miceliile bine dezvoltate
si bine sporulate Producerea industriala a acidului citricrandament
maretehnologie simpla;asigurarea unor conditii de asepsie mai
bune;durata mai redusa a procesului.
2 procedee industriale de obtinere a acidului citric: Cultivarea
in suprafata - inocul sporulat al unei tulpini selectionate de A
niger - 7-10 zile randament: 60-90% acid citricCultivarea
submersaInocul vegetativ pellets (200-280 x 103 /l pellets)Procesul
dureaza 6 zileRandament 100% acid citricBioreactor: sarja /
semicontinue (100m3)
Inocul: 5-25X106 A. niger spori/L
Aerare
Temperatura
Agitare: 50-100rpm forte de frecare.
Fed-batch pentru reducerea inhibitiei determinate de substrat si
prelungirea fazei de productie la o zi/doua de la finalizarea
cresterii miceliului
Randament: 130 kg/m3
Producerea industriala23Limitation of nitrogen and phosphate
provoke an overflow in metabolism that results in an overproduction
of citric acid.Separarea si purificarea acidului
citricFiltrarePrecipitare - carbonat de calciu pentru a neutraliza
mediul si a forma citrat de calciu precipitat insolubil
(aproximativ 74% acid citric). CaCO3 + Acid citric CO2+ citrat de
calciu
Acid citric contaminatCSTRCitrat de calciu precipitat cu
contaminantiCarbonat de calciu, CaCO3Separarea si purificarea
acidului citricCitratul de calciu este apoi spalat, incalzit si
filtrat pentru a indeparta contaminantii.In functie schema de
purificare, filtrele pot fi plasate inainte de prima reactie cu
carbonatul de calciu sau intre 2 reactii de precipitare.Alegerea
filtrului in functie de natura contaminantului indepartatFiltrele
vor indeparta mai intai contaminanti de dimensiuni mai mari si mai
tarziu contaminanti de dimensiuni mai mici.Precipitat de citrat de
calciu si contaminatiFiltru
citrat de calciu, biomasa, apaProductia industriala de acid
citriccitric acid cu carbonat de calciuPrecipitatReactia
precipitatului cu acid sulfuricPercipitatAcid citric
purificatPurificari ulterioareAcidul citric poate fi produs in doua
forme monohidrat si anhidru. Aceste forme pot necesita etape de
purificare aditionale pentru a obtine puritatea dorita.
1. MonohidratContine o molecula de apa pentru fiecare molecula
de acid citric 2. AnhidruProcesat pentru a indeparta intreaga
cantitate de apa din produsul final Preparat prin dehidratarea
acidului citric monohidrat 36.6C
1.6 million tone acid citric/anual la nivel globalacidulant
industria alimentara si a bauturilor racoritoare (80%)detergenti si
sapunuri -16 %farmaceutica si cosmetice (8%) ex. prepararea
aspirinei solubilecitratii si esterii citratilor - plastifianti si
ca agenti de chelatare (Fe, Cu) stabilizarea uleiurilor si
grasimilor (7%).
Utilizari ale acidului citric
Tehnici de imobilizare= gama variata de metode de
atasare/aderare sau capturare a unui biocatalist (enzime, organite
celulare, celule)
enzime imobilizate avantaj: posibilitatea reutilizarii
acestoracelule imobilizate bariera protectiva cresterea
viabilitatii (probiotice)
aplicatii: industria alimentara si stiinte biomedicale
selectia suportului - in functie de natura biocatalistului -
stabilitate chimica, fizica - grupari functionale adecvate
capacitate inalta imobilizare Tehnici de imobilizareAdsorbtia
legaturi necovalente (van der Waals, de hidrogen, ionice);
enzime/celulereversibilasuport : carboximetilceluloza, carbune
activ, silica gel, oxid de aluminiu, titan, hidroxiapatita,
ceramica, sticla poroasa tratataTehnici de imobilizareAdsorbtia
legaturi covalentelegaturi disulfidice - legaturi covalente stabile
formate intre suportul activat si gruparile tiol libere (de exemplu
pe cisteina) de la nivelul biocatalist. reversibilausor desfacute
folosind un agent adecvat in conditii blandeimobilizarea
enzimelor
DitiotritilTehnici de imobilizareAdsorbtia legaturi
covalenteChelatarea sau legarea metalelor necesara regenerarea
suportului fara reducerea randamentul de imobilizare, legaturile
sunt puternice neexistand posibilitatea de desprindere a
biocatalistului se bazeaza pe capacitatea lanturilor laterale a
anumitor aminoacizi (Hys, Trp, Tyr, Cys si PheAla) de a substitui
liganzii legati slab in ionii metalici imobilizati prin chelatarea
gruparilor covalente legate la un suport posibilitatea selectiei
unei game largi de anioni de chelatare reversibilitatea - in doua
moduri: fie prin expunerea suprafetei (EDTA) sau prin folosirea
unui ligand competitor in exces Suporturile - materiale organice:
celuloza, chitina, alginat si transportori pe baza de silica, care
au fost activati prin legarea la gruparile nucleofilice prin
legaturi coordinative sau covalente.
Tehnici de imobilizareAdsorbtiaLegaturi covalente
ireversibilacontactul permanent dintre enzima si substrat datorita
lipsei oricarei bariere intre acestea, precum si localizarea
enzimei pe suprafata suportului legare covalenta a unei tulpini de
Saccharomyces carlsbergensis la bilute de silica poroase (16) si
privind imobilizarea de levuri (Saccharmyces cerevisiae,
Saccharomyces amurcea) si bacterii (Sarratia marcescents) prin
aceasta metoda pe borosilicat si zirconiu (17).
Tehnici de imobilizareparticulele sau celulele imobilizate sunt
capturate in matricea unui suport alginat, carrageenan, colagen,
poliacrilamida, gelatina, cauciuc silicon, poliuretan,
polivinilalcool cu grupari stirilpiridium
dezavantaje Capturarea
costurile de imobilizare,limitarile legate de posibilitatea de
difuzie,dezactivarea in cursul imobilizarii sidistrugerea
materialul suport in cursul folosirii.capacitatea de incarcare
redusa intrucat biocatalalizatorii trebuie incorporati in
materialul suport.
Tehnici de imobilizare metoda ireversibila de imobilizare.
biocatalizatorii incorporati intr-o capsula semipermeabila,
permitand un flux liber de substrat si nutrienti (atunci cand
celulele sunt folosite ca biocatalizatori), insa mentinand/pastrand
biocatalizatorul in interiorul capsuleiavantaje:
Incapsulareaprotejeaza biocatalistul de conditii nefavorabile de
mediu inconjurator. previne pierderea de biocatalit, crescand
astfel eficienta procesului , nu sunt necesare modificari chimice
ale biocatalistului imobilizat, astfel ca activitatea nu este
afectata/ramane intacta
Tehnici de imobilizare adecvata microorganismelor, celulelor
viabile precum si sistemelor multenzimatice pentru reactii
enzimatice secventiale, intrucat numerosi, diferiti biocatalizatori
pot fi incorporati in capsula, cu conditia sa se nu influenteze
negativ
Dezavantaje: necesitatea unui control foarte bun al dimensiunii
porilor, care este in special dificila in cazul biocatalizatorilor
de dimensiuni mici, precum unele enzime sau bacteriofagi.
IncapsulareaTehnici de imobilizare metoda de imobilizare
ireversibila ce nu necesita un suport de imobilizare, astfel se
reduc costurile.
2 variante ale acestei metode: Cross Linking Enzyme Aggregates
(CLEA) si Cross Linking Enzyme Crystals (CLEC) Legaturi
incrucisate
Etanol din sisteme de celule imobilizateindustria
fermentativamaterial suport folosit: perle de alginat de Na sau de
Ca sau coloana de K-carrageenanavantaj: productivitate mai mare -
influentata de pH si temperatura
Procedeu de cultivareSubstratProductivitate etanol
volumetricDiscontinuuMelasa2,8Continuu (celule
libere)Melasa3,35Continuu (celule imobilizate)Melasa28,6Etanol din
sisteme de celule imobilizateScade inhibitia prin produs final
datorita reducerii conc de etanol din micromediul inconjuratorScade
inhibitia prin substrat daca rata de fermentatie atinge sau
depaseste rata de difuzie a glucozei in celulaTransfer imbunatatit
al substratului in interiorul celulei microbiene si o eliminare mai
rapida a etanolului format datorita alterarii permebilitatii
membranei celulare in cursul procesului de imobilizare
Imobilizare celule levurice in sfere de alginat
Celulele levurice sunt mixate cu o solutie de alginat de sodiu,
si apoi imersate intr-o solutie continand cationi Ca 2+
Imobilizare celule levurice in sfere de alginatProcedura Se
omogenizeaza 2.5 grame de levura in 25 mL apa distilataSe incubeaza
la temperatura camerei timp de 10 minute pentru rehidratareSe
adauga 25 mL solutie alginat la suspensia de levuraSe omogenizeaza
bine pe un agitatorPreluati amestecul cu ajutorul unei seringi si
adaugati picatura cu picatura in solutia de clorura de calciu
Imobilizare celule levurice in sfere de alginat
Incubati timp de 5-10 minute pentru solidificarea sferelor in
solutia de clorura de calciuScoateti sferele din solutie si
depuneti-le intr-o solutie de zaharoza
Determinarea productiei de CO2
Colectarea dioxidului de carbon intr-o solutie 13% de clorura de
sodiu (dioxidul de carbon nu se dizolva in aceasta
solutie)Inregistrati volumul de gaz care a fost colectat dupa 5-7
zileCITRIC ACID PRODUCTION
CITRIC ACID PRODUCTIONThe first ever commercial production of
citric acid was launched in UK by Sturage Company by JOHN &
EDMUND; 1826In 1880; Citric acid was first synthesised from
glycerolIn 1893; Wehmer observed occurrence of citric acid as a
microbial product by using penicillium.In 1922; Millard recorded
accumulation of citric Acid In culture of Aspergillus niger under
condition of nutrition deficiency.In 1923; Pfizer began
fermentation based process in USAPRODUCTION1. Fermentation: A.
niger is the choice for production of citric acid for several
decades. Large number of other microbes such as P.luteum,
P.cirinum, pichia spp. Have also been used. Fermentation can be
carried out by any of following processes:a) KOJI PROCESS (solid
state fermentation): its a Japanese process in which special
strains of A.niger are used with solid substrate such as sweet
potato starch. Mold is used to which wheat bran was substituted.
The pH of bran was adjusted between 45 and additional moisture is
picked up during steaming so as to get water content of mash around
70 80%. After cooling the bran to 30 60oC the mass is inoculated
with KOJI which was made by a special strain of A.niger. Since bran
contains starch which on saccharification produces citric acid by
amylase of A.niger. Bran after inoculation is spread in trays to a
depth of 3 5 cm and kept for incubation at 25-30oC. After 5 8 days
koji is harvested and citric acid is extracted.b) Liquid Surface
Culture Process: in this case aluminium or stainless steel shallow
pans or trays are used. Sterilized medium contains molasses and
salts. Fermentation is usually carried out by blowing spores of
A.niger over the surface of the solution for 5-6days. Spore
germination occurs within 24 hours and a white mycelium grows over
the surface of the solution. After 8-10days of inoculation liquid
can be drained off and citric acid can be extracted from the
mycelia mat.c) Submerged Culture Process: this method is quite
economical. In this case A. japonicus (black mold) is slowly
bubbled in a stream of air through a culture solution. Since
organism shows subsurface growth and produces Citric acid in
culture solution the yields are inferior in comparison to liquid
surface culture fermentation.Separare: - biomasa este separata prin
filtrare- filtratul este prelucrat precipitare cu hidroxid de
calciu se formeaza tetrahidrat citrat de calciu se spala
precipitatul, se dizolva cu acid sulfuric diluat, cristalizare acid
citric anhidru sau monohidrat
Productia industriala de acid citriccitric acid cu carbonat de
calciuPrecipitatReactia precipitatului cu acid
sulfuricPercipitatAcid citric purificat
