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METODOLOGIA PARA LA SELECCION DE LINEAS DE FRIJOL Phaseolusvulgaris L. PORESTRES DE TEMPERATURA A NIVEL MICROGAMETOFITICO

Luz Marina Vásquez*Consuelo Montes R.*

Jeffrey W. White**William Roca* *

COMPENDIO

Los trabajos realizados en varias especies de plantas revelan que una porción significativa de los genes que se ex-presan en el esporofito también lo hacen en el grano de polen, en consecuencia la presión de selección a nivel depolen debe conducir a modificaciones en caracteres cualitativos o cuantitativos de las progenies derivadas. Para com-probar esta hipótesis en fríjol se estudió el efecto de estrés por temperaturas altas sobre granos de polen,en tres va-riedades de phaseolus ~aris L. y sus generaciones FI y F2, mediante las técnicas de germinación "in vitro" y po-linización controlada con polen estresado. El porcentaje de germinación "in vitro" estuvo inversamente relaciona-da con el nivel de estrés por temperaturas altas y el tiempo de exposición al estrés. 50°C resultó ser la temperaturaa la cual el polen que se había sometido a estrés durante sesenta minutos presentó disminución considerable en sugerminación. No se detectó avance para tolerancia a altas temperaturas a nivel de microgametofito cuando se eva-luó germinabilidad de polen entre progenies. Un avance en la selección a nivel de microgametofito se puede lo-grar trabajando con mayores cantidades de polen lo que dará la oportunidad de seleccionar por vigor, además esimportante explorar el origen de la variabilidad en la germinación de polen dentro de un material en la fase de flo-ración.

ABSTRACT

Studies of various plant species have shown that a significant portion of the genes that are expressed in the spo-rophyte are also expressed in rhe microgametophyte (pollen grain). Consequen tly, selection pressure applied topollen may aid in the modification of qualitative or quantitative characters of the derived progeny. To verify thishypothesis in common bean (Phaseolus vulgaris),a study of the effect of high temperature stress on pollen grainin three cultivars in FI and F2 generations was conducted by means of 'iD. vitro" germination techniques and con-trolled pollinization with stressed pollen. In yitro germination was inversely related with the level and dararion ofhigh temperature stress. As 50°C the stressed pollen showed considerable decrease in germination. Evaluation ofgermination of pollen between progenies showed no increase in tolerance to high temperature of microgametophy-tes. Greater progress in selection of microgametophytes be obtained using larger quantities of pollens,which wouldprovide greater opportunity to select for vigor. The origen of the variability in the germination of pollen in culti-vars in the flowering period should also be examined.

1. INTRODUCCION

En fríjol, Phaseolus vulgaris L., la naturale-za de la tolerancia al calor aún es un interro-gante y los trabajos realizados sobre el temaplantean explicaciones contrastantes.Summer (1982) utilizó la producción de vai-nasen estrés, con temperaturas día /nochede 25/43°- 28/43°C, y concluyó que el carac-ter en una línea sedebía a la acción de ungen dominante simple, mientras que en otrassedebía a dos genesde acción epistática. Por

el contrario, Weaver.!llE.! (1985) le atribuyerona la tolerancia a temperaturas altas una segre-gación transgresiva. Farlow et & (1978) obtu-vieron germinación de polen tratado a 48° C(por 38 a 62 horas); Dickson y Boettger (1984),registraron disminución en la cantidad de semi-lla cuando se fertilizó con polen de plantas cre-ciendo a 30°C, en comparación con el polen deplantas a 20 y 25°C. Haterlein et ª-'. (1980) afir-man que el efecto del estrés sobre el polen semanifiesta en mayor grado despuésde la fertili-zación y no sobre su viabilidad.

* Estudiantes de pregrado. Universidad Nacional de Colombia. Palmira.

** Centro Internacional de Agricultura Tropical- CIAT. A. A. 6713, Cali, Colombia

Acta Agron. Vol. 40 (1·2) 7.14.1990 7

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Durante el período 1920 -1962, se afirma-ba que la habilidad del polen para fertilizar ge-neralmente era independiente de su constitu-ción genética, y que la transmisión del polende un solo genomio llevaba a tasasde segrega-ción diferentes a las mendelianas. Esto parecíaestar asociado con la presencia de un mecanis-mo selectivo el cual semanifestaba en genera-ciones posteriores, mediante alteraciones delgene (mutación) y de las frecuencias zigóticas(Pthaler, 1967).

En las últimas décadas (1967-1988), la ma-yoría de los autores coinciden en afirmar quebuena porción (60 o/o) de los genesque seex-presan en el esporofita, también lo pueden ha-cer en el grano de polen y, en consecuencia, lapresión de selección a nivel de polen debe con-ducir a modificaciones en caracteres cualitati-vos o cuantitativos de las progenies derivadas(Tanksley ru; gj, 1981; Mulcahy ru.al, 1982).Otros autores sostienen que la habilidad com-petitiva a nivel de polen puede afectar la trens-misión de dichos genes.

Paramuchas especiescultivadas, y en parti-cular para fríjol, Phaseolus vulgaris L., la utili-zación de un sistema de selección microgame-tofítica, ofrece potencialmente varias venta-jas en fitomej oram iento: uso de in di vi duoshaploides, eliminando de esta manera los efec-tos de dominancia; disponibilidad casi ilimita-da de material para la selección, reducción detiempo, espacio y costos. Por esta razón esnecesario desarrollar una metodolog ía quepermita establecer el grado de asociación en-tre caracteres del esporofito y la respuestadelos granos de polen, a cierto tipo de estrés:por ejemplo altas temperaturas.

Con baseen lo anterior se plantearon lossiguientes objetivos: seleccionar el medio decultivo más adecuado para la germinación Invitro de grano de polen de fríjol; identificarla prueba de laboratorio más eficiente paraevaluar el grado de viabilidad de polen, some-tido a estrés por altas temperaturas; evaluarla capacidad de polen estresado para fecun-dar, y hacer selección temprana (en la F ¡ y

F2 ) de materiales tolerantes a altas tempera-turas, mediante polinización controlada deparentales, utilizando polen sometido a dife-rentes niveles de estrés.

2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

El trabajo se realizó entre abril de 1987 ydiciembre de 1988, en las instalaciones delCentro Internacional de Agricultura Tropical(CIAT). Se seleccionaron como materialesparentales las variedadesJamapa (tolerante atemperaturas altas), Diacol- Calima (modera-damente susceptible) y Radical SanGil (sus-ceptible).

Se definieron como variables indicadorasde viabilidad del polen el porcentaje de ger-minación in vitro y el porcentaje de fertili-zación en campo, obtenido mediante polini-zación controlada.

Previo al montaje del ensayo definitivo, seejecutaron 11 ensayossecuenciales 'tendientesa definir aspectos relacionados con medio decultivo apropiado para lograr germinaciónin vitro de polen, metodología para indu-cir estrés al polen por temperaturas altas,tem-peratura crítica y tiempo de exposición delmaterial experimental al estrés, pruebas detinción como mecanismo alterno para eva-luar viabilidad de polen, sistema de transpor-te, instrumentación y técnicas adecuadas pa-ra lograr fertilización con polen estresado,etc.

Las fasesde experimentación correspon-dientes al ensayo definitivo,incluyeron: estu-dio del crecimiento del tubo poi ínico en pa-rentales y F¡ cuando sesometió el polen aestrés, determinación del diámetro del granode polen en parentales, F ¡ y F 2, comporta-miento de la germinación del polen de paren-tales, F 1 , F2 Y retrocruzas a la madre (F¡ RC!y F2 RC! ).

Paraestudiar la calidad de los granosde po-len de los parentales y definir la temperaturade estrés de su progenie se exploraron 7 nive-

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les de temperatura (25,36,37,50,60,70,80 y90°C) con un tiempo estándar de 60 minutos,utilizando las metodologías de flores en "ca-mara húmeda" y polen directamente en rrediode cuItivo. La pr imera consisteen colocar lasflores en una caja de petri recubierta en su in-terior con papel filtro humedecido para garan-tizar una adecuada humedad relativa, facto rdeterminante en la germinación del polen(Weaver, 1987), y para la segunda se constru-yó un dispositivo que permitiera someter elpolen directamente a estrés y luego trasladar-lo al campo. Este consiste en una caja de pe-tri con hendiduras no muy profundas en cu-yos compartimientos sesiembra el polen, lue-go escolocada en "cámara húmeda" igual quelas flores.

El diseño experimental en todos los ensayesfue completamebte al azar y para facilitar elmanejo estadístico de la información en algu-nos de ellos, los tratamientos se agruparon enestructuras factoriales ej: (3 materiales x 8temperaturas x 2 métodos), la variable de res-puesta cuantificada fue porcentaje de germi-nación de polen y la unidad experimental es-tuvo conformada por el polen de una flor, lamuestra fue aleatoria evaluando 200 granos/placa. El número de repeticiones en la mayo-ría de los ensayos fue 50 (10 flores/d ía x 5días) en cada metodolog ía.

x JamapaD - Calima

I~-------------~~Fl

x JamapaR. San Gil

La siembra del material experimental en elcampo se planeó teniendo en cuenta factorescomo óptimo desarrollo de las plantas, dispo-nibilidad suficiente de semilla, facilidad demanejo, etc. Paradar cumplimiento al pro-grama de retrocruzas (Figura 1) se efectua-ron siembras escalonadas con el fin de preve-nir desfases en la época de floración.

3. RESULTADOS Y DISCUSION

En los ensayos preliminares sedefinió co-mo tamaño de muestra 200 granos por pla-ca, se adoptó como criterio de grano germi-nado la relación longitud de tubo/diámetrode grano. Un grano secalificó como germina-do cuando la relación era por lo menos 2/1.

La prueba de tinción como mecanismo al-terno para evaluar viabilidad de polen,produ-jo resultados incosistentes con respecto alporcentaje de germinación in vitro compro-bando que las dos metodoloqías no están co-rrelacionadas. Esto esexplicable si se tieneen cuenta que la tinción califica viabilidadcon baseen el contenido del grano, pero, ungrano morfológicarnente bueno, puede care-cer de capacidad para germinar.

El medio de cultivo para la germ inacióndel polen depende del cultivar empleado. Los

Retrocruzas

D - Calima x Fl = Rc1FlR. San Gil x F2 = Rc1F2

D - Calima x F 1

Fig. 1. Esquema que indica el programa de cruzas

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Ae9fA AGRONOMUSA _

- Jamapa ~ Radical San Gil -4r- Calima

" M germlnaclon promedio60 ----------- - --------_.---------------

50

____ -L --1 L . -L- ....J

40

30

20

10

o --------- ----- -------

-10O 8020 100

Fig. 2. Tendencia en el comportamiento en el porcentaje real de germinaciónde polen in vitro con tres variedades de fríjol bajo estrés de temperatu-ra utilizando flores

~- Jamapa -+- Radical San Gil -*- Calima

15

10

-6O 20 40 60 80

Temperatura (grado. centigrado.)100

Fig. 3. Tendencia en el comportamiento en el porcentaje real de germinaciónde polen in vitro con tres variedades de frijol bajo estrés de temperatu-ra. Utilizando polen directamente.

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más altos porcentajes de germinación in vi-tro del polen de Phaseolus vulgaris L. seobtuvieron en un medio compuesto por 100ppm H3 B03; 250 ppm Ca (N03)1 .4~0);100 ppm MgCI1, 100 ppm KN03;2ooppmCaS04• 2Hl O); incluye 28 % de sacarosa yun pH de 7.2 .

Se adoptaron dos metodologías para pro-mover estrés al polen por temperaturas altas:confinamiento de las flores en cámara húme-da e incubación a las temperaturas desea-das, y maceración de quillas en medio decultivo e incubación.

La temperatura crítica para la germinaciónde polen se fijó en 50° C y el tiempo de expo-sición al estrés se estandarizó en 60 minutos(Figura 2 y 3). Estas metodologías, conjun-tamente con adecuada instrumentación, selec-ción de botones aptos y la técnica de poliniza-ción y enmasculación, garantizaron la obten-ción de cruzamientos efectivos con polen es-tresado. Este hecho se evidenció con la obser-vación de tubos polínicos sometidos a tempe-raturas de 60° C llegando a la base del ovario.

No fue posible establecer un avance sign ifi-cativo en la selección por estrés de altas tem-peraturas a nivel microgametofítico, cuandose evaluó el porcentaje de germinación de po-len entre progenies (F, RC, -25 vs F¡ RC¡-37)(Cuadros 1 y 2). Aunque la variable porcen-taje de germinación de polen no resultó ser elcriterio más eficiente para la selección de ge-notipos por tolerancia al estrés de altas tempe-raturas a nivel microgametofítico, al compararla germinación del polen en retrocruzas a lamadre con polen previamente estresado, seobservó cierto avance hacia el progenitor tole-rante.

Se observó acentuada variabilidad en el ta-maño de los granos de polen de la F" lo quehizo suponer la existencia de una presunta re-lación entre el genotipo del gametofito y eltamaño de los granos de polen. Los resulta-dos comprobaron que existe estrecha asocia-ción entre tamaño del grano de polen y geno-

tipo del material. Las variedades O-Calima yRadical San Gil, en su condición de materia-les susceptibles y moderadamente susceptibles,presentaron granos de polen de tamaño gran-de, mientras que Jamapa, material tolerante,se caracterizó por su grano mediano. Las pro-gen ies F ¡ y F2 heredaron la cond ición de gra-no mediano, siendo evidente la dominanciaque exhibi6 Jamapa para el rasgo tamaño me-diano de los granos de polen. La variabilidaden el tamaño de polen de la F¡ con respecto ala variabilidad promedio de sus parentales fuede 47 % superior, lo cual otorga validez a lapremisa sobre la posibilidad de hacer se lec-ció n temprana a nivel m icrogametofítico.

4. CONCLUSIONES

4.1. No se detectó avance significativo en se-lección por estrés de altas temperaturasa nivel microgametofítico, cuando se eva-luó el porcentaje de germinación de po-len en progenies (F ¡ Re ,-25 vs F, RC ,-37).

4.2. Los porcentajes de germinación de polenen retrocruzas a la madre con polen pre-viamente estresado, señalaron una ten-dencia hacia el progenitor tolerante.

4.3. Para promover estrés al polen de fríjolpor temperaturas altas, se pueden adop-tar dos metodolog ías con resu Itados sa-tisfactorios en ambos casos: la primeraconsiste en incubar las flores a las tem-peraturas deseadas, confinadas en undispositivo denominado cámara húme-da. La segunda consiste en macerar lasquillas en medio de cultivo de tal modoque el polen pueda someterse di recta-men te al estrés en las incubadoras. Es-ta última deja expresar de manera másacentuada, las diferencias entre materia-les tolerantes y susceptibles a temperatu-ras altas.

4.4. Cuando se sometió a estrés por tempera-turas altas, el polen de las variedades pa-rentales manifestó respuestas diferencia-les en el porcentaje de germinación, en

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Cuadro 1

Comparación del porcentaje promedio de germinación de polen in vitro en tres variedades dePhaseolus vulgaris L. y plantas t'¡ y F 2 provenientes de retrocruza, cuando se someten las

flores a estrés de temperatura

Tem~eratura (oC}Materiales 25 37 49

Diaco1-Ca1ima 30.14 A 30.25 A 12.74 DJamapa 54.07 B 43.17 C 13 .01 DF1RCl (25) 34.69 A 29.44 A 11.28 DF1RC1 (37) 41.74 B 33.96 A 13.33 DF2RC1(25) 32.94 A 27 .04 A 9.68 DF2RCl (37) 35.15 A 30.99 A 11.57 D

No. Observo 48 45 32


R. San Gil 37.94 B 38.71 B 12.97 DJamapa 54.07 B 43.17 C 13.01 DF1RCl (25) 40.57 C 4l.18 C 15.47 DF1RC1 (37) 3l. 53 B 33.34 A 11.13 DF2RCl (25) 44.53 e 44.41 C 11.92 DF2RC1(37) 23.40 A 30.60 A 13.60 D


* Promedios con la misma letra no presentaron diferencias significativasNivel de significancia P = 0.05. Análisis de varianza anidado y pruebade F para efectos principales e interacción.

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Cuadro 2

Comparación del porcentaje promedio de germinación de polen ín vitro en tres variedadesde Phaseolus vulgaris L. y plantas F I provenientes de retrocruza, cuando se somete el polen

directamente a estrés de temperatura

Tem~eratura (oC}Materict~es 25 37 49

Diacol-Calima 20.37 A 17.83 A 11.60 BJamapa 21.19 A 13.56 B 11.19 BF1RC1(25) 18.40 A 18.62 A 12.75 BF1RC1 (37) 18.18 A 18.77 A 12.87 B



R. San Gil 26.33 A 16.85 B 17.69 BJamapa 21. 20 A 13.56 B 11.19 BF1RCl (25) 23.05 A 12.57 B 10.70 BF1RCl (37) 25.00 A 18.43 B 14.05 B


* Promedios con la misma letra no presentaron diferencias significativasNivel de significancia P = 0.05. Análisis de varianza anidado, prueba deF para efectos principales e interacción.

relación directa con la calificación portolerancia: Jamapa (tolerante), 0- Cali-ma (moderadamente susceptible), Radi-cal San Gil (susceptible). Este hec hoconfirmó la eficacia de las rnetodoloqíaspara promover estres por temperaturasaltas.

4.5. Existió relación inversa entre el porcen-taje de germinación in vitro del polen,el nivel de estrés por temperaturas altasal cual se someta y el tiempo de exposi-ción al estrés. Una temperatura de 50" Cse fijó como crítica para la germinación.

Un tiempo de 60 minutos fue el másapropiado.

4.6. Se detectó la presencia de tubos políni-cos de polen estresado a 600 C llegandoal ovario. Este evento confirma la posi-bilidad de obtener cruzas efectivas conpolen estresado a temperaturas altas, su-jeto al grado de refinamiento en la técni-ca de fertilización.

4.7. Cuando se aplicó estrés (600 C) sobre gra-nos de polen ubicados en la punta del es-tigma, se presentaron drásticas reduccio-

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nes en la longitud del tubo poi ínico, 24horas después de incubados (0.18 mm a25°C vs 0.09 mm a 60°C).

4.8. Al caracterizar el comportamiento deldiámetro de los granos de polen en pa-rentales Jamapa (J), O-Calima (C), Radi-caISanGil(R)yF¡(Cx J, Rx J) sepudo establecer clara dominancia del ras-go tamaño mediano del grano asociado alparental tolerante a altas temperaturas(Jamapa), sobre el tamaño grande carac-terístico de los parentales R- San Gil y0- Calima (susceptible y moderadamentesusceptible) .

4.9. La variabilidad en el diámetro del polende la F¡ fue aproximadamente 50 %

más alta que la variabilidad promedia delos parentales. Este resultado ratificó laposibifidad de hacer selección tempranaa nivel de microgametofito, aprovechan-do la variabilidad en la F 1

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