Pertanika 12(3), 341-347 (1989)

Aktiviti Bakterisidal in vitro Fagosit daripada Pesakit LupusEritematosus Sistemik (SLE)

M. MUSA, J. MAT ASAN dan YM. PANGJabatan lmunologi, Pusat Pengajian Sains Perubatan,

Universiti Sains Malaysia,11800 Minden, Pulau Pinang, Malaysia.

Kata Ponca: NeutroItl, monosit, in vitro, pesakit Lupus Eritematosus Sistemik.

ABSTRAKDi dalam kajian ini, neutrofil dan monosit daripada darah Periferi pesakit SLE telah diasingkan dan diujiaktiviti bakterisidalnya terhadap Staphylococcus aureus berbanding dengan sel daripada kontrol normal.Keputusan ujian ini menunjukkan bahawa neutrofil dan monosit daripada pesakit SLE masih mempunyaiaktiviti bakterisidal yang normal, walaupun sebelum ini pernah dilaporkan terdapat kecacatan pada fungsifagositosis dan kemotaksis. Fagosit daripada pesakit ini dapat membunuh bakteria dengan berkesan. Fungsiserumnya sebagai opsonin di dalam aktiviti bakterisidal juga didapati normal.

ABSTRACTNeutrophils and monocytes of the peripheral blood of patients with SLE were isolated and tested for theirbactericidal activity against Staphylococcus aureus, compared to cells obtainedfrom normal controls. Despitehaving abnormalities in phagocytic and chemotactic functions as previously reported, the results of this studyshowed that neutrophils and monocytes from patients with SLE exhibited normal bactericidal activity. Ph­agocytes of these patients were able to kill the bacteria very effectively. Their serum function as opsonin in thebactericidal activity was also normal.

PENGENALANLupus Eritematosus Sistemik (SLE), sejenispenyakit inflamatori sistemik wujud denganadanya manifestasi autoimun. Gangguan au­toimun ini umumnya berkaitan dengan kehadi­ran antibodi antinukleus (ANA) dan antibodianti-ds DNA di dalam serum pesakit. Oleh itu,patogenesis penyakit SLE dikatakan hasil dari­pada kesan buruk yang disebabkan olehpembentukkan kompleks imun berkenaan(Chia et al. 1979; Zvaifler 1981). Punca pem­bentukan antibodi tersebut masih tidak jelasdiketahui. Selain daripada kecacatan tersebut,fungsi imuniti sel pesakit juga dilaporkan ter­gangu berdasarkan gerak balas imuniti sel.Seterusnya setengah-setengah fungsi selleukositdaripada pesakit SLE seperti kemotaksis danfagositosis dilaporkan juga merosot (Ward1974; Svensson 1980). Kecacatan aktiviti fago­sitosis mungkin ada kaitan dengan kekuranganaviditi penerima Fc (Katayama et al. 1983) dan

juga kecacatan fungsi penerima komplemen selberkenaan (Hurst, Nuki dan Wallington1984). Seterusnya Salmon dan rakannya (1984)mendapati bahawa kecacatan pada fungsi fago­sitosis adalah disebabkan oleh proses penelananbukan pada perlekatan melalui penerima Fe.Walau bagaimanapun, semua kajian berkenaanhanya mengukur proses fagositosis atau pene­lanan partikel, oleh itu aktiviti bakterisidal ataupembunuhan bakteria yang merupakan fungsiutama fagosit di dalam pertahanan perumahmenentang jangkitan masih perlu dikaji. Disamping itu, selain daripada aktiviti sel, fungsiserum sebagai opsonin yang mempunyai pe­ranan penting di dalam aktiviti bakterisidalharus juga diperhatikan. Kajian ini dijalankanuntuk menentukan sarna ada terdapat kecacatanaktiviti bakterisidal pada fagosit (kecacatanintrinsik) daripada SLE dan seterusnya menelitijika ada kecacatan pada faktor serum pesakitSLE itu juga.

M. :VlUSA,j. MAT ASA

BAHAN DAN KAEDAH

Serum Pesakit SLE dan Kontrol NormalDarah periferi daripada 6 orang pesakit SLEdiperolehi daripada Hospital Besar, PulauPinang iaitu berdasarkan kriteria diagnosisuntuk SLE meliputi eiri klinikal dan laporanmakmal. Keenam-enam pesakit menunjukkaneiri klinikal meliputi anemia, ruam dan lesi kulit,Empat daripadanya mengalami gangguan sis­tern renal. Kesemuanya memberikan ujian ANAyang positif dengan titer yang tinggi. Kesemuapesakit baru saja menerima rawatan predniso­Ion dan berada di dalam wad ketika sampeldarah mereka diambil. Drug ini dipereayaimere neat gerak balas imun menerusi tindakan­nya ke atas limfosit. Empat daripada pesakitjuga merupakan kes berulang dan telahmempunyai riwayat SLE sebelumnya. Darahdaripada penderma Tabung Darah digunakansebagai kontrol normal. Setiap eksperiman,darah kontrol diambil daripada penderma yangpadan umur dengan pesakit. Serum daripadadarah yang dibiarkan beku diasingkan dan terusdigunakan untuk tujuan eksperimen.

BakteriaBakteria StatJhylococcus aureus diperolehi c!ari­pada stok Jabatan Mikrobiologi Perubatan,Universiti Sains Malaysia. Ampaian bakteria (fasalog) disediakan di dalam medium kultur RPM!(Sigma) pada kepekatan 2 x 105 sel/ml. Serumdaripada pesakit SLE atau kontrol normal(kepekatan akhir 10%) ditambah kepadaampaian bakteria.

Fagosit Pesakit sa dan Kontrol NormalDarah periferi berantikoagulan daripada pe­sakit SLE dan kontrol normal diperolehi se­perti di atas. eutrofil dan monosit diasingkandengan kaedah Histopaque 1.119/1.077(Sigma). Neutrofil dipungut daripada lapisaninterfasa 1.]] 9 dan ] .077, manakala selmononukleus yang mengandungi monositdipungut daripada lapisan interfasa 1.077 danplasma. Sel tersebut dibasuh dengan larutangaram seimbang Hanks (HBSS) (Sigma).Ampaian neutrofil yang mempunyai viabilitilebih daripada 95% dibuat di dalam mediumkultur RPMI pada kepekatan 2 x ]06 sel/ml.Ampaian sel mononukleus pula disediakan padakepekatan 4 x 106 sel/ml.

DAN YM. PANG

Penentuan Aktiviti Bakterisidal Neutrofildan MonositPenentuan aktiviti bakterisidal neutrofil dan.monosit dilakukan di dalam kolam-96 platmikrotiter (Linbro). Di dalam kolam plat ter­sebut, neutrofil (0.] ml) atau ampaian selmononukleus (0.1 ml) yang telah disediakandaripada pesakit SLE atau kontrol normal dier­amkan selama 1jam pada suhu 37°C/5% C02,udara. Selepas eraman, supernatan dibuang dansel dibasuh dengan medium kultur RPMI.Monosit yang melekat kepada plat selepaseraman dan basuhan seterusnya digunakanuntuk tujuan eksperimen. Cerakinan bakteri­sidal dilakukan seeara bersilang dan setiap satuseeara triplikat. Sel pesakit SLE atau kontrolnormal ditambahkan dengan ampaian bakteria(50 ul/kolam) yang sebelumnya telah disedia­kan sarna ada dengan serum kontrol normalatau serum pesakit SLE. Plat mikrotiter ke­mudiannya diemparkan selaju 800 g pada suhu4°C selama 5 minit. Kawalan untuk pertum­buhan bakteria disertakan juga iaitu tanpakehadiran sel. Plat kemudiannya dieramkanpada suhu 37°C/5% C02, udara. Bilanganhidup bakteria dilakukan pada 0 dan 60 minitmasa eraman. Ini dilakukan dengan menam­bah larutan 1% Triton x 100 (200 ul/kolam)untuk memeeahkan fagosit dan selepas di­baurkan, sampel (10 ul) diambil lalu disebar­kan di atas piring agar nutrien, dan dieramkansemalaman. Peratus pembunuhan bakteria di­tentukan dengan membandingkan bilanganhidup bakteria yang dieramkan bersama seldengan bilangan hidup bakteria kawalan (tanpasel) selepas eraman.

KEPUTUSAN

Aktiviti Bakterisidal Neutmfil sa Berbandingdengan Kontml NormalUntuk meneliti adanya keeaeatan intrinsikpada fungsi bakterisidal neutrofil daripadapesakit SLE, aktiviti bakterisidal neutrofildaripada pesakit SLE dan neutrofil kontrolnormal dengan kehadiran serum kontrolnormal sebagai opsonin dibandingkan. Hasilujian ini ditunjukkan di dalam Gambarajahl.Neutrofil SLE mempunyai aktiviti bakterisidalyang berkesan (membunuh lebih daripada50%) setanding dengan neutrofil daripada

342 PERTANIKA VOL. 12 NO.3, 1989

AKT1VITI BAKTERISIDAL IN VlTRO fAGOSIT DARIPADA PESAK.lT LUPUS ERJTEMATOSUS SISTEMIK (SLE)

•

100

ill

%

P 98

E1.1B 97UNUHA 96N

95

9.

•••

&

•SlE

•

..•,

Gambarajah 1. Peratus pemlnmuhan bakteria oleh neutrofil danpada pesakit SLE atau kontml nOT/nal dengan kehadi­ran serum opsonin kontml nOT/nal. Setiap comk pada histogram mewakili seomng pesakit dan kontrolnonnal dalam setiap eksperimen.

kontroI normal. Keputusan ini menunjukkantiada kecacatan pada fungsi bakterisidal neu­trofil daripada pesakit SLE.

Aktiviti Bakterisidal Monosit SLE Berbandingdengan Kontrol NonnalPenelitian yang serupa juga dilakukan ter­hadap fungsi ,bakterisidal monosit. Walaupun

peratus pembunuhan bakteria oleh monositberbeza dengan yang ditunjukkan oIeh neu­trofiI, monosit daripada pesakit SLE tidakmenunjukkan kecacatan .(lebih 50% pem­bunuhan) pada fungsi bakterisidal jika di­bandingkan dengan kontrol normal masing­masing di dalam setiap eksperimen yang dijal­ankan (Gambarajah 2). Setiap eksperimen

100

90

%

PE 80M8UNU 70HAN

60

50

••D

•

..

SLE

•D

•

•

..

KONTROL

Gambarajah 2. Peratus pembunuhan bakteria oleh monosit danpada pesakit SU atau kontml normal dengan kehadi­mn serum opsonin kontml nOT/nal. Setiap comk pada histogram mewakili seomng pesakit dan kontrolnonnal dalam setiap eksperimen.

PERTANIKA VOL. 12 NO.3, 1989 343

M. MUSA,J. MAT ASAN DAN YM. PANG

mewakili seorang pesakit SLE berserta kontrolnormal masing-masing.

Fungsi Serum SLE Berbanding dengan SerumKontrol Normal untuk Aktiviti BakterisidalUntuk menentukan sarna ada serum pesakitSLE mempengaruhi atau mengganggu aktivitibakterisidal fagosit daripada kontrol normal,

aktiviti bakterisidal neutrofil dan monositdaripada kontrol normal dengan kehadiransarna ada serum pesakit SLE atau serum kon­trol normal sebagai opsonin dibandingkan.Gambarajah 3 menunjukkan aktiviti bakterisidalneutrofil yang berkesan sarna ada dengankehadiran serum daripada pesakit SLE atauserum kontrol normal. Keputusan yang serupa

100.,--------------------------,

If

98

% 99

PEMBUNUHAN

97

If

•

c

"II

•

c..

""

96.l..------,------------,-----.......JSLE KONTROL

Gambarajah 3. Peratus pembunuhan bakteria oleh neutrofil daripada kontrol normal dengan kehadiran serum opsoninsama ada daripada pesakit SLE atau kontrol normal. Setiap corak pada histogram mewakili seorangpesakit dan kontrol normal dalam setiap eksperimen.

"

"!l100

90

%

pE 80MBUNU 70HAN

60

50SLE

"

KONTROL

Gambarajah 4. Peratus pembunuhan bakteria oleh monosit daripada kontrol normal dengan kehadiran sel1tm opsoninsarna ada daripada pesakit SLE atau kontrol normal. Setiap corak pada histogram mewakili seorangpesakit dan kontrol normal dalam setiap ekspelimen.

344 PERTAN1KA VOL. 12 NO.3, 1989

AKT1VIT1 BAKTERISIDAL IN VITRO FAGOS1T DARIPADA PESAKIT LUPUS ERITEMATOSUS S1STEM1K (SLE)

juga diperolehi untuk aktiviti bakterisidalmonosit pada eksperimen masing-masing(Gambarajah 4).

Penentuan Aktiviti Bakterisidal Neutrofit SLEdengan Kehadiran SerumnyaUntuk memastikan perjumpaan sebelum 101

iaitu tiada keeaeatan aktiviti bakterisidal sarnaada pada sel, fungsi serum atau kedua-duanyauntuk fagosit SLE, aktiviti bakterisidal neu­trofil SLE dengan kehadiran serumnya sendiridilakukan. Jika ada keeaeatan pada kedua-duafaktor tersebut kesan gandaan akan dapatdiperhatikan. Sebagai kontrol, aktiviti bakterisi­dal neutrofil kontrol normal dengan kehadiranserum SLE atau serum kontrol normal danneutrofil SLE dengan kehadiran serum kontrolnormal juga dilakukan. Gambarajah 5 menun­jukkan neutrofil daripada peakit SLE yangdieramkan dengan kehadiran serumnyamempunyai aktiviti bakterisidal yang berkesanberbanding dengan semua kontrol yang diser­takan. Keputusan ini mengesahkan lagi bahawatiada keeaeatan pada aktiviti bakterisidal sarnaada pada sel atau serum daripada pesakit SLE.

PERBINCANGAN

Beberapa keeaeatan imun telah dilaporkanuntuk penyakit SLE termasuk pembentukan

autoantibodi (Zvaifler 1981), kehadiran kom­pleks imun beredar di dalam serum (Koffler etat. 1971) dan kerentanan terhadap jangkitan(Staples et al. 1974). Kerentanan terhadapjangkitan kemungkinan ada kaitannya dengankeeaeatan fungsi fagosit. Landry (1977) telahmenunjukkan kaitan di an tara keeaeatan fago­sitosis imun in vitro dengan kekurangan gerakbalas keimunan sel. Keeaeatan pada gerak balasmetabolisme oksidatif fagosit SLE juga di­laporkan (Wenger dan Bole 1972). Keeaeatanpada sel telah dikaitkan dengan keeaeatan padafungsi penerima Fe dan komponen komple­men (Hurst, Nuki dan Wallington, 1984).Keeaeatan fagositosis menerusi penerimakomplemen dikaitkan dengan bilangan danfungsi penerima tersebut, sedangkan keeaeatanfagositosis menerusi penerima Fe dikaitkandengan fungsi penerima itu sendiri keranapertambahan penerima Fe pada monosit dari­pada SLE pernah dilaporkan (Hurst et at. 1984;Fries et at. 1984). Keeaeatan pada fungsi pen­erima dikatakan berlaku pada proses penelanantetapi tidak pada perlekatan (Salmon et at.1984). Meski pun banyak kajian telah dibuatterhadap aktiviti fagositosis atau lebih jelas lagipenelanan oleh sel daripada pesakit SLE, prosespembunuhan selepas penelanan berlaku masihtidak diketahui.

100

.. ....A

99 •II c

% 98 •• .. cp ..EM 97 cB • .U c

N 96UHAN 95 •

c

94e

93SERUM SLE SERUM KONTROL SERUM SLE SERUM KONTROL

SLE KONTROL

Gambarajah 5. Pewtus pembunuhan bakteria oieh neutrofil daripada pesakit SLE dan kontrol normal dengan kehadi­ran serum opsonin sama ada daripada pesakit SLE atau kontrol normal. Setiap comk pada histogrammewakili seorang pesakit dan kontrol normal dalam setiap eksperimen.

PERTAJ'I1KA VOL. 12 NO.3, 1989 345

M. MUSA,j. MAT ASAN DAN YM. PANG

Aktiviti pembunuhan bakteria oleh fagositmerangkumi beberapa peringkat termasukkemotaksis, perlekatan dan penelanan, degranu­lasi dan pembunuhan intrasel. Kajian kami cubamengukur hasil akhir daripada proses ke­seluruhan· pembunuhan iaitu aktiviti bakteri­sidal. Data kami menunjukkan neutrofil danmonosit daripada pesakit SLE mempunyaiaktiviti bakterisidal in vitro yang berkesan(peratus pembunuhan bakteria sentiasamelebihi 50%). Walaupun sampel darah untukkajian terpaksa diperolehi daripada pesakitSLE yang baru menerima rawatan drug imuno­supresif, data kajian menunjukkan ia tidakmempunyai kesan langsung ke atas fungsifogosit. Fogosit telah diketahui penting untukpertahanan tidak spesifik perumah. Kesan drugimunosupresif mungkin bertindak ke ataspengeluaran autoantibodi oleh limfosit didalam pesakit autoimun termasuk SLE.

Seterusnya serum daripada pesakit SLEjuga tidak mengganggu aktiviti bakterisidaloleh fagosit kontrol normal dan mempunyaifungsi opsonin yang normal. Sebelum ini Hurstdan rakannya (1984) juga menunjukkan ba­hawa serum daripada pesakit SLE yang mem­punyai kecacatan fagositosis tidak merencatfagositosis oleh monosit normal. Kajian kamihanya mengukur 'hasil akhir' daripada aktivitikeseluruhan bakterisidal. Oleh itu adalahmenarik jika pengukuran pembunuhan intra­sel selepas proses fagositosis tamat dapat di­tentukan. Meskipun proses fagositosis atau pe­nelanan fagosit SLE mempunyai kecacatanseperti yang dilaporkan, ini tidak bermaknatiada langsung bakteria dapat ditelan. Prosespembunuhan bakteria oleh fagosit umumnyaberlaku di dalam fagosom iaitu se1epas pene­lanan, tetapi agen pembunuhan dapat jugadikeluarkan ke ekstrasel dan pembunuhanboleh terjadi di permukaan membran sel(Okamura, Ishibashi dan Takano 1979). Kesim­pulan daripada kajian ini mencadangkan fa­gosit daripada pesakit SLE masih mempunyaiaktiviti bakterisidal yang berkesan meskipunterdapat kecacatan pada sesetengah peringkatpada proses pembunuhan bakteria. Kaitan dian tara aktiviti bakterisidal fogosit pesakit SLEdengan kerentanan terhadap infeksi masihperlu diselidik.

PENGHARGAAN

Ketja penyelidikan ini telah dibiayai oleh geranPenyelidikan Jangka Pendek, Universiti SainsMalaysia, Pulau Pinang. Kami juga melahirkanrasa terima kasih kepada pihak Hospital BesarPulau Pinang di atas kerjasama mereka.

RUJUKAN

CHIA, D., E.V. BERETI,j. YAJ'vIAGATA, D. &"lUTSON, C.RESTIVO & D. FURST. 1979. Quantitative andCharacterization of Soluble Immune ComplexesPrecipitated from Sera by Polyethylon Glycol(PEG). Clin. Exp. Immunol. 37: 299.

FRIES, L.F., W.w. MULLINS, KR. CHO, P.H. PLOTZ &M.M. FRANK. 1984. Monocyte Receptors for theFc Portion ofIgG are Increased in Systemic Lupuserythematosus. J. Immunol. 132: 695.

HURST, N.P., G. NUKl & T. WALLINGTON. 1984.Evidence for Intrinsic Cellular Defects of 'Com­ploment' Receptor-mediated Monocytes Phago­cytosis in Patients with Systemic Lupus erythema­tosus (SLE). Clin. Exp. Immunol. 55: 303.

KATAYAMA, S., D. CHIA, D.W. KHUTSON & E.V.BARNETI. 1983. Decreased Fc Receptor Avidityand Degradative Function of Monocytes fromPatients with Systemic Lupus erythematosus. J.Immunol. 131; 1217.

KAVA!, M., K LUKACS, 1. SONKONLY, K PALOCZI & G.Y.SZEGEDI. 1979. Circulating Immune Com­plexes and Monocyte Fc Function in AutoimmuneDisease. Ann. Rheum. (Dis). 38: 79.

KOFFLER, D., V. AGNELLO, R. THOBURN & H.G.KUNKEL. 1971. Systemic Lupus erythematosus:Prototype oflmmune Complexe Nephritis in Man..J. Exp. Med. (suppl). 134: 1695.

LANDRY, M. 1977. Phagocyte Function and CellMediatedJmmunity in Systemic Lupus erythema­tosus. Arch. Dermatol. 113: 147.

OKAMURA N., S. ISHIBASHI~ T. TAKANo. 1979. Evi­dence for Bactricidal Activity of Polymorphonu­clear Leukocytes without Phagocytosis. J. Biochem.86: 469.

SALMON, j.E., R.P. KiMBERLY, A. GIBOFSKY, & M.FOTINO. 1984. Defective Mononuclear Pha­gocyte Function in Systemic Lupus erythemato­sus: Dissociation of Fc Receptor-Ligand Bindingand Internalization. J. Immunol. 133: 2525.

STAPLES, PJ., D.N. GERDING,].1. DECKER & R.S.GORDAN. 1974. Incidence of Infection in Sys­temic Lupus erythematosus. Arthrit. Rheum. 17: 1.

346 PERTAJ"'JlKA VOL. 12 NO.3, 1989

AKTIVITI BAKTERISIDAL IN VITROFAGOSIT DARIPADA PESAKIT LUPUS ERITEMATOSUS SISTEMIK (SLE)

SVENSSON, B. 1980. Monocyte in vitro Function inSystemic Lupus erythematosus. 1. A Clinical andImmunological Study. Scand. j. Rheum. (Suppl).31: 29.

TEMPLE, A. & G. LOEWI. 1977. The Effect of Serafrom Patients with Connective Tissue Diseases onRed Cell Binding and Phagocytosis by Monocytes.Immunology 33: 109.

WARD, P.A. 1974. Leukotaxis and LeukotaeticDisorders. Am. j. Pathol. 77: 520.

WENGER, M.E. & G.G. BOLE. 1972. NitroblueTetrazolium Test in Systemic Lupus. N. Engl. j.Med. 287: 1150.

ZVAIFLER, NJ. 1981. Aetiology and Pathogenesisof Systemic Lupus Erythematosus. In Textbook ofRheumatology, ed W.N. Kelly, E.D. Harris, S. Ruddy,& C.B. Sledge, pp. 1079-1079. Philadelphia:W. B. Saunders.

(Diterima 10 Oktobl!1; 1989)

PERTANlKA VOL. 12 NO.3, 1989 347