Állatkísérletek az Állatkísérletek az orvostudományban- orvostudományban- In vitroIn vitro

modellek élő állatok modellek élő állatok helyettesítésérehelyettesítésére

Tuboly Eszter

Tanársegéd

Sebészeti Műtéttani Intézet

Az alternatívák szükségességeAz alternatívák szükségessége

• Élő modellek kiváltása

– Társadalmi megítélés, az igény egyre nő– Szervezeti fellépések– Törvényi szabályozás– Költségek, ellenőrzés

• 2013. 03.11-étől 2013. 03.11-étől Európai Unió megtiltotta a kozmetikai ipar számára folytatott állatkísérletek végzését

– SEURAT-1 (50 millió €)

• In vitro modellek előnyeiIn vitro modellek előnyei

– Csak a vizsgált mechanizmusra fókuszálnak– Egyszerűbb kezelni, kisebb a kockázat, felelősség– Sokszor szükségesek a publikáláshoz– Időmegtakarítás, elemszám

• HátrányokHátrányok

– Nem feltétlenül költséghatékonyabb– Nem igazán életszerű– Sejttenyészet: fertőződés (mycoplasma)– Krónikus, szisztémás reakciók vizsgálatára nem

alkalmas

A 3A 3 R: R:

• Replacement • Reduction• Refinement

Russell and Burch

A helyettesítés egyre hatékonyabbA helyettesítés egyre hatékonyabb

Lehetőségek élő állatmodellek helyettesítéséreLehetőségek élő állatmodellek helyettesítésére

• Csak kémiai komponensek• Szöveti homogenizátum,

izolált organellum • Ex vivo kísérletek• Sejt-és szövetkultúrák• Mesterségesen növesztett

szövetek, szervek• Invazív beavatkozás

helyett kezelés

• Biokémiai tesztek• Immunkémiai technikák (bakteriális

toxinok azonosítására)• Szerv, szövet vagy sejtkultúrák

(biokémiai kutatások céljára)• Mikroorganizmusok (karcinogén ill.

mutagén anyagok tesztelésére)• Magasabbrendű növények• Néhány metazoa parazita• Komputer szimulációs modellek

SejttenyésztésSejttenyésztés• 1907 óta létező technika• ’50-es évektől kezdve elterjedt eljárás

– Áttörések: antibiotikumok, médium, tripszin

• Társaságok, sejt-és szövetbankok• Izolált-és mai napig fenntartott

sejtvonalak (HeLa)• Tenyésztő eszközök rohamos fejlődése

(gyógyszergyártás)• Gén-és biotechnológia alappillére

(klónozás)• Rákkutatás (nanotechnológia)• Őssejt-és génterápia (etikai kérdések)• Szintetikus biológia (mesterséges

szervek, programozott sejtek)• Virológia (vakcinák készítése)

Vizsgálati lehetőségekVizsgálati lehetőségek• Az adott sejt életfolyamatainak

nyomonkövetése (sejtanalízis)• sejt-sejt kölcsönhatások, a

sejtkommunikáció vizsgálata (neuronok)• a sejtek különböző kémiai anyagokra adott

válaszának analízise (gyógyszerfejlesztés)• különböző sejteredetű fehérje termékek

előállítására (biotechnológiai ipar) • “tissue engineering” céljára

• Sejttenyészetek eredete:• szöveti explantok ("explant kultúrák") • sejtszuszpenzió ("szuszpenziós kultúrák")

Sejttenyészetek típusaiSejttenyészetek típusaiPrimer tenyészetek:

• embrionális ill. felnőtt szövetből• korlátozott ideig tarthatók fenn• élettartamuk véges (hetek,

néhány hónap)

• előnyük:– a sejtek nem tekinthetők módosított

ill transzformált sejteknek, mivel a tenyésztés kezdő lépéseként alkalmazott enzimatikus, vagy mechanikus disszociáción kívül a sejteket más hatás nem éri.

• hátrányuk: – a kultúrák korlátozott élettartama– minden egyes preparátum kicsit

eltér egymástól, teljesen homogén idegen sejtet nem tartalmazó tiszta tenyészetről nem beszélhetünk.

Sejtvonalak:

• abnormális, gyakran transzformált sejtek

• homogén sejtpopuláció• élettartamuk korlátlan• Leggyakrabban rákkutatási

célok• Könnyebb velük dolgozni, már

nem kell izolálni

Ami nélkül nem megy…Ami nélkül nem megy…

• Laminaris fülke• HEPA filter - steril levegő-áramot biztosít • Horizontális

– A levegő horizontálisan, a tenyésztő irányába áramlik– veszélyes anyagokkal való munkára nem alkalmas

• Vertikális– A levegő felülről lefelé áramlik– veszélyes anyagokkal való munkára ez a típus a

legalkalmasabb

• CO2 Inkubátorok (5-10 %, 100%-os páratartalom)• Fáziskontraszttal ellátott invert mikroszkóp

• Speciális tápfolyadék (médium)

• Ionikus homeosztázis

• Vitaminok, kofaktorok, fémek

• Fehérjék, lipidek• Energia• Szérum• Bakteriocid-fungicid

koktél

• Ablaktalan, fertőtlenített helység (meszelés)

• Steril öltözet• UV-védelem• Speciális

tenyésztőedények• Saját eszközök• Vízfürdő,

hűtőszekrény• 70%-os alkohol• Dezinficiens

• A tenyésztőedények felületének kezelésére használjuk:

• Kollagen (kötőszöveti fehérje)• Fibronectinek (sejtfelszíni és plazma fehérjék)• Laminin (heteromer glycoprotein)• Poly L-lysine (erősen pozitív töltésű polikationos

polimer)• Poly-L-Ornithin (polikationos poliaminosav)

• A tenyésztést segítő, a sejttenyésztő oldatokhoz

adott szuplementumok:• Foetal bovine vagy calf serum• Növekedési faktorok • Insulin

Alkalmas sejttípusokAlkalmas sejttípusok

• Általában bármilyen sejt, a legmacerásabbak az izom-és idegsejtek

• Vérsejtek: a keringési rsz.-be kerülve már nem osztódnak, rövid élettartam

• Fibroblaszt (kötőszövet): jól szaporodnak, generációs idejük rövid,gyorsan nőnek

• Epithel (hám): egyszerű dolgozni velük, gyorsan nőnek

• Embrionális sejtek: jól szaporodnak, kényesebbek

• Sejtvonalak: már régóta fenntartott sejtek, rengeteg információ, már izolált sejtek (HeLa, HEK, CHO)

Sejtkultúra előállításaSejtkultúra előállítása• Izolálás: szerv kiválasztása sejtciklus,

sejtorganellum, sejtkapcsolatok, mozgás alapján, esetleg anyagi és metodikai korlát miatt

• Konkrét állatmodell mellé in vitro bizonyítékok• neonatalis v. adult sejtek,embrionális sejtek, esetleg

hibridómák, transzformált sejtek• Kezdeti sejtszám, életképesség ideje, növekedés

üteme különböző• A felnőtt sejtek csak adherens módon képesek

növekedni: laminin, vagy kollagén plate, coated-plate (akár recept alapján)

• Szövetek szétválasztása sejtekké: emésztőenzimekkel vagy mechanikusan (hőfok, időtartam!), nyírőerő minimalizálása (potter)

• Mosás, szűrés• Sejtek médiumba ágyazása, kezelése • Sejtnövesztés inkubátorban• Sejtszámolás időről-időre (ePetri)• Minden típus esetén szükséges a rendszer ki-

titrálása• Kevert kultúrák esetén figyelem a fibroblasztokra• Passzálás • Viabilitási-tesztek• Proteomika, fagyasztás-felengedés (DMSO!)

A sejttenyésztő rémálma…A sejttenyésztő rémálma…

Befertőződés

• Kémiai anyagok által (lejárt médium)• Biológiai ágensek: baktériumok, gomba

(mycoplasma-tesztek, alkohol, szájmaszk)• Médiumban indikátor: fenolvörös: metabolikus

aktivitást jelez a pH változása• Fertőzésgyanúnál ki kell dobni a rendszert és

mikrobiológiai vizsgálatot kérni• Újra kell fertőtleníteni a helyiséget és az eszközöket• Autokláv, inkubátor vízcseréje, alkohol• Félévente speciális takarítás ajánlott

SzövettenyésztésSzövettenyésztés• Sejtek szövetekként történő növesztése egy

speciális vázon (scaffold)• Célja: pótolni a többé már nem funkcióképes

szöveteket, javítani az adott szerv funkcióját• Regeneratív medicína-szintetikus biológia-őssejt

terápia • Fontos az immunrendszer válaszának

minimalizálása (graft vs. host) így a legjobbak az autológ sejtek

• Alkalmaznak allogén sejteket is (immunszupresszió, MHC mutációk)

• Xenogén sejtek (sertés, anti-inflammációs gének KI- a jövő útja?)

ScaffoldScaffold• Hálózatos polymer, különböző anyagokból

készülhet (protein, poliszacharid, polipeptid)

• Lehetővé teszi a sejtek számára a növekedést, átjárható a tápanyagok számára, ECM képes rajta létrejönni

• Meg kell tartania a szövet eredeti 3D-s struktúráját

• Biztosítania kell a sejtek számára megfelelő mikrokörnyezetet

• Megengedi a sejtek migrációját

Egy ideális scaffold…Egy ideális scaffold…

• 3D• Keresztkötéseket tartalmaz• Pórusokat tartalmaz• Biológiailag lebontható• Megfelelő kémiai körülmények uralkodnak a

felszínén• Bírja a mechanikai terhelést• Biokompatibilis• Elősegíti a természetes gyógyulási folyamatokat• Hozzáférhető• Nagyüzemben gyártható

Leggyakoribb típusokLeggyakoribb típusok

• Polymerek– Kollagén– Laminin– Fibrin– Decellularized matrix (szív)

• Kristályos anyagok– Hydroxyapatite– Kálcium-foszfát– Bioglass

Elkopott porcok helyettesítéseElkopott porcok helyettesítése

– Porcsejtek– Kollagén váz– Nem igényel kiterjedt

érhálózatot

CsontnövesztésCsontnövesztés

• Őssejtek csontsejtekké történő differenciálódásával– A parancs növekedési

faktor függő

• Nem szabad túl nagynak lennie a váznak, különben a sejtek nem kapnak elég oxigént

3D Calcium- scaffold

BőrnövesztésBőrnövesztés

• Kollagén-kitozán, vagy hialuronsav scaffold

• Egyszerre egyféle sejt, 3 sejtréteg

• Égési sérülteknél siker

Cukorbetegek Cukorbetegek ßß-sejtjeinek pótlása-sejtjeinek pótlása

In vivo Islet of Langerhans in pancreas

Mesterséges Mesterséges véredényekvéredények

• By-pass műtéteknél használatos http://popularmechanics.com/

popmech/sci/tech/9805TUMDOM.html

Szív regenerációjaSzív regenerációja

• Szívizomsejt, véredények

• Felnőtt szívizomsejtek tenyésztése nehézkes

• Természetes scaffold (decellularized matrix)

• Sokféle sejttípus, bonyolult terület

Lehetőségek májbetegeknekLehetőségek májbetegeknek

BioprintingBioprinting• Feltaláló: Forgách Gábor (Missouri Egyetem)• Hidro-gél alapú vázra élő sejtek felvitele• Tintasugaras nyomtatófej juttatja rá a sejteket,

több rétegben, körben is (3D)• 2 nyomtatófejet használ: sejtek

nyomtatása+gélszerű, tápanyagokban gazdag médium adagolása

• Kalibráció: lézerrel történik, szoftver irányít• Véredények by-pass műtétekhez• Távolabbi célok : teljes szervek nyomtatása,

bőrpótlás, mint rutin kezelés

Köszönöm a figyelmet!!!Köszönöm a figyelmet!!!