Albrecht v. Graefes Arch. klin. exp. 0phthal. 194, 125--131 (1975) �9 by Springer-Verlag 1975

A1pha-l-Antitrypsin, Coeruloplasmin und Sekret-IgA im menschlichen Kammerwasser*

M. Zirm und 0. Schmut

Universit/~ts-Augenklinik Graz (Vorstand: Prof. Dr. H. Hofmann)

Eingegangen am 31. Oktober 1974

Alpha-l-Antitrypsin, Ceruloplasrain and Secretory-IgA in Human Aqueous Humor

Summary. Aqueous humor alpha-l-~ntitrypsin and ceruloplasmin concentration were de- termined by immunochemical methods. The absence of secretory IgA shows that aqueous humor is mainly a filtration product of serum.

Zusa~mmen[assung. Anhand der qualitativen und quantitativen immunologischen N~ch- weise yon Alpha-1-Antitrypsin und Coerulopl~smin sowie dem Fehlen von Sekret-IgA wird die iKeinung vertreten, dal] das Kammerwasser haupts~chlich ein Ultrafiltr~t des Serums darstellt.

Alpha-l-Antitrypsin wurde 1955 yon Schultze u. Mitarb. [1] aus raenschlichera Plasma isoliert und eharakterisiert. Seinen Naraen verdankt es seiner Eigenschaft Chyraotrypsin und Trypsin zu hemraen. Es handelt sich hierbei urn ein Glyco- proteid mit einera Kohlenhydratanteil yon 12,4% und einer Sediraentationskon- stante yon S 3,41. Es gibt einige raolekulare Varianten. Da es wie Coeruloplasrain wegen seiner geringen Konzentration im menschliehen Kararaerwasser bisher nieht quantitativ bestiramt werden konnte, versuehten wir die im folgenden erl~uterten Methoden anzuwenden.

Coeruloplasmin (oder Alpha-2-Coeruloplasrain) wurde erstmals yon gohenberg und Laurell [2--4] ira Jahre 1948 besehrieben. ~Tir kennen zwei Isoenzyrae (D und C) [5--7] woven das Coeruloplasrain C dureh Oestrogen aus den Geweben aktiviert wird. Das kupfertragende Plasraaprotein hat darfiber hinaus eine Oxydase- Aktivit/~t (8].

Sekret-IgA unterscheidet sich yon IgA dureh ein, durch Disulfidbrficken an die schwere Kette gebundenes, Sekretstiiek (Secretory-piece) (Abb. 1). Vor 50 Jahren vermutete Besredka ,,Kopro-Antik6rper" die gegen Darrakeine wirken wiirden. Heute wissen wir, dal] es s~ch urn IgA hande]t, das in den epithelialen Drfisen- zellen rait einera Sekretstfiek versehen wurde [9--11 ].

Das IgA ist ein 7 S Imraunglobulin rait einera Molekulargewicht yon 170000, das Sekretstfiek yon 45000. Als Sekret-IgA hat dus Molekfil eine Sedimentations- konstante yon 11 S. Zu finden ist das Iraraunglobulin in allen Sekreten yon der Tr/inenflfissigkeit bis zura Eileitersekret [12]. Da also das Sekret-IgA als Leistung sezernierender Zellen unzusehen ist, war es interessant, dieses ira Kararaerwasser rait iraraunologisehen Methoden nachzuweisen (Tabelle 1--3).

* Vorgetragen am li. 3. 1974 vor der Ophthalmologischen Gesellschaft in Wien.

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Abb. 1. Sehematische Darstellung des Sekret-IgA. Zwisehen den schweren Ketten das durch Disulfidbriicken verbundene Sekretsttick

Tabelle 1. Tabelle der biologischen Eigenschaften der Immunglobuline IgG, IgA und IgM

Biologisehe Eigensehaften yon IgG IgA IgM

Intravascul~rer Anteil in % 44 40 70

T/s umgesetzte IYlenge 3 12 12 in % der Gesamtmenge

Mittlere Konzentration im 1,07 0,25 0,077 Normalserum (g/100 ml)

Mittlere Konzentration im 0,014 0,004 0,003 Kammerwasser (g/100 ml)

Komplementfixation + -- +

Tabelle 2. Tabelle der physiochemischen Eigensehaften der Immunglobuline IgA und Seln'et-IgA

Physiochemische Eigensehaften yon IgA Sekret-IgA

Sedimenta~ionskonstante 7 S 11 S (9, 11, 12 S)

Molekulargewicht 170000 385000

Kohlenhydratanteil in % 9,9 11,7

Tabelle 3. Tabelle der Antik6rperaktiviti~ten der Immunglobuline IgA und Sekret-IgA

An~ikSrperaktivit~t yon:

IgA

Sekret-IgA

Neutralis~tion yon Toxinen. TStet nieht gram-negative Bakterien Mit Lysozym antibakterielle Aktivit/s FSrdert die Opsonierung Antivirale Aktivit~t

Antibakterielle und antivirale Aktivitg, t in Sekreten Schutzfunktion mnk6ser Oberflg:ehen Widers~andsf~hig gegen proteolytisehe Enzyme und reduzierende Agentien

Bestandteile des Kammerwassers 127

Abb. 2. Kombinierte Disk-Immunelektrophorese zum Naehweis yon Alpha-l-Antitrypsin

Methode Alpha-l.Antitrypsin wurde bei 142 Kammerwasserproben bestimmt. ])as Kammerwasser

stammte yon mannliehen und weiblichen Verstorbenen im Alter yon 15--96 Jahren. Als Bestimmungsmethoden wurden die kombinierte Disk-Immunelektrophorese naeh

Sehmut und Zirm (Abb. 2) und die radiale Immundiffusion naeh Maneini, Carbonara und Iteremans [14] herangezogen (Abb. 3).

Coeruloplasmin: Ein qualitativer Nachweis wurde dutch die Disk-Immunelektrophorese nach Sehmut und Zirm [13] geffihrt. Es wurden dabei gleichzeitig aui einer Seite alle ira Kammerwasser vorkommenden Proteine durch ein Misch-Antiserum nachgewiesen, diesen Pr/izipitaten gegenfiber konnte dureh ein Anti-Coeruloplasmin dieses genau lokalisiert und bestimmt werden (Abb. 4).

Mit der Radialen-Immundiffusion naeh Maneini, Carbonara und Heremans [14] wurde Coeruloplasmin quantitativ bestimmt. 3 ml Agar enthielten 80 ~l Anticoeruloplasminserum. Aufgetragen wurde jeweils 20 ~l :Kammerwasser.

Zum Nachweis yon SeCret IgA im Kammerwasser wurden ~olgende 1Viethoden angewandt. Ouehterlonyteehnik: Eine Prazipitinreaktion, bei der gelSstes Antigen und Antik5rper yon

zwei gestanzten LSehern aus in einem Gel gegeneinander diffundieren und in einer Aquivalenz- zone unlSsliehe Prazipitate ergeben. Auf der einen Seite wurde unkonzentriertes Kammer- wasser je naeh Versuehsanordnung in Mengen yon 2--20 ~zl aufgetragen. Als gelSster Anti- kSrper stand 1 : 50 verd/inntes Anti-Sekret IgA zur Veriiigung (Behringwerke).

In einer anderen Versuchsanordnun gwurde konzentriertes Sammelkammerwasser 1 yon 49 Augen untersueht. Mit Hilfe der Ouchterlonyteehnik wurde im Kammerwasser gleiehzeitig IgA naehgewiesen und Sekret IgA ausgeseh]ossen. Hierbei wurden zwischen 5 und 20 ~l Anti- IgA als aueh Anti-Sekret-IgA verwendet.

Zur Beweisfiihrung wurde auBerdem Speiehel yon normaler Konzentration und konzen- triert (entspreehend dem Proteingeh~lt des Serums) mit Anti-IgA und Anti-Sekret-IgA unter- sueht.

Mikro-Diskelektrophorese. Diese iVIethode wurde, wie in Literatur 13 beschrieben, durch- gefiihrt.

Die Radiale-Immundi]]~zsion naeh Mancini, Carbonara und tteremans [14]: Es wird ein Anti-Serum einer 1% Agar 10urum-LSsung beigegeben. Von gestanzten L6chern diffundiert das antigenhaltige Kammerwasser in den Agar und bildet naeh Erreichen des J~quivalenz- punktes Pr~izipitate, deren Durchmesser der Antigenkonzentration entspricht. Mit Hilfe einer Eiehkurve wird die Antigenkonzentration extrapoliert.

Zur Kontrolle wird IgA mit LC-Partigenplatten (Behring-Institut) nachgewiesen. Ffir die selbstgefertigten P]atten wird dem Gel NaN 3 zur Keimfreihaltung beigegeben [15].

Die ]sombinierte Dis/c-Immunele]ctrophore naeh Schmut und Zirm [13]: Mit ttilfe einer Mikro-Diskelektrophorese wird 50 ~zl Kammerwasser dureh ein Sammel- und ein daran an- sehlieBendes Trenngel elektrophoretiseh getrennt. Die aus den GlasrShrchen gepregten Gele werden, ohne sie zu fgrben, der Lange nach in die Nitre eines Objektrggers gelegt und mit 2 % igem Agar purum, gelSst in Diathylbarbituratpuffer, umgossen.

1 MINICON T~[-B (Fa. Amicon).

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Abb. 3. Radiale Immundiffusion, mit der Alpha-l-Antitrypsin quantitativ im Kammerwasser bestimmt wurde

Abb. 4. Kombinierte Disk-Immunelektrophorese zum Naehweis yon Coeruloplasmin im Kammerwasser des Mensehen

Aus den parallel zum Polyaerylamidgel angebraehten ginnen diffundierte im vorliegenden Fall das Angi-IgA bzw. das Anti-Sekret-IgA haltige Serum.

Zur Konzentrierung der geringen Kammerwassermengen bewiihrte sieh die Meghode mit MINICON TM-B (Fa. Amieon B. V. Holland). Hierbei wird eine eigene Kammer mit der zu konzentrierenden F1/issigkeit entlang einer Membran besehiekt. W~hrenddessen kommt es zu einer ansteigenden Konzentrierung dutch ein hinter der Membran befindliehes Adsorbens. AuI Grund der Besehaffenheit der 3/[embran erh~lt man Konzentrationen yon 5faeh, 10faeh, 25faeh, 50faeh und 100fa.eh.

Ergebnisse Alpha-l-Antitrypsin. Die durch die quant i ta t ive immunologische Bes~immung

ermi t te l ten Werte ergaben eine Variat ionsbrei te zwischen 4 und 17 mg/100 ml Kammerwasser . Der Mittelwert betrug 11,8 rag/100 ml.

Bestandteile des Kammerwassers 129

Coeruloplasmin. In der Disk-Immunelektrophorese wurde Coeruloplasmin durch ein Referenzserum genau erkanut und loka]isiert. Die Werte der Radialen-Immun- diffusion sehwankten zwischen 0,2 und 0,8 rag/100 m]. Der Mittelwert mit 0,3 rag/ 100 ml ist, entsprechend unserer Ansichten fiber die Filtrationsverh&Itnisse im Corpus ciliare, normal gegenfiber dem Serum (30 rag/100 ml).

Sekret IgA. Dutch die Ouchterlonytechnik wurde in unkonzentriertem Kam- merwasser entsprechend der oben genannten Versuchsanordnung kein Sekret- IgA nachgewiesen. Konzentriertes Kammerwasser zeigte beim Nachweis mit Anti- IgA eine Pri~zipitinreaktion.

Mit der kombinierten Disk-Immunelektrophorese wurde gleichzeitig IgA nachgewiesen und Sekret IgA ausgeschlossen. Auch (tie Radiale-Immundiffusion zeigte keine Pr/~zipitate bei Verwendung eines Anti-Sekret-IgA-Serums. Dagegen wurde im Speichel mit derselben Methode sowohl IgA ais auch Sekret-IgA nach- gewiesen.

Diskussion

Das Alpha-l-Antitrypsin wird mit allen anderen Alpha-l-Serumglobu]inen in der Leber synthetisiert und erscheint bei akuten und chronisehen Infektionen, bei Neoplasmen und in der Schwangerschaft erh6ht im Serum. Es geh6rt daher zu den ,,Akute-Phase-Proteinen' und ist auch bei Kollagenosen vermehrt zu linden. Alpha-l-Antitrypsin ist bei schwerem Lungenemphysem und Homozygoten er- niedrigt.

Coeruloplasmin (aueh Alpha-2-Coeruloplasmin) findet man vermehrt bei akuten Entzfindungen, malignen Tumoren und Lebererkrankrungen. Bei Leber- cirrhose ist der Serumspiegel vermindert.

Zur Kammerwasserdiagnostik wurden diese Proteine noch nicht herangezogen. Bei normalen Serumwerteu wfirden wir einer Erh6hung der Kammerwasserwerte diaguostische Bedeutung beimessen.

Die Untersuchungsergebnisse yon Alpha-l-Antitrypsin und Coeruloplasmin helien, das Medell einer Kammerwasser-Ultrafiltration aus der Sicht des Immuno- logen zu formen. Wie yon uns bereits publiziert [16], entsprechen ttaptog]obin (M. G. 100000), Haemopexin (M. G. yon 80000) und die C~-Komponente (Beta- 1-A-Globulin) mit einem M. G. yon 185000 unseren ,Musterproteinen", die als UltrafiRrat zu einem Hunderstel ihrer Serumkonzentration im Kammerwasser zu linden sind. Neu sind also das Alpha-l-Antitrypsin (M. G. 54000) und auch dus Coeruloplasmin mit 160000 M. G.

Unsere Vorstellung fiber die Filtration yon Kammerw~sser wird durch das eindeutige Fehlen von Sekret-IgA untermauert. Das heist, dal~ nur IgA in das Kammerwasser ~iltriert wird. Es besteht jedoch keine Sekretion yon Proteinen durch das Corpus ciliare. Elektronen-optisch finder man ebenso keine entsprechen- den Zellstrukturen, die daffir sprechen wfirden [17]. Diese Ansicht steht nicht im Gegensatz zu der Meinung Friedenwald's [18], d e r m i t seiner Redox-Pumpen- theorie einen eigenen Elektrolythaushalt des Kammerwassers annimmt, der ,,Pino- eytosetheorie" Holmberg's [19] wird jedoch widersprochen.

Wit sehen im Kammerwasser eine ~hnlich gebildete Flfissigkeit wie den Primer- liquor oder den Prims Das hell, t, dab unter physiologischen Verh/~ltnissen ein Ionenaustausch durch die EpRhelze]len und eine Proteinfiltration durch die

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Basa lmembraa und Epithellficken [20] vor sich geht. Dabei werdea alle Proteine /ihnlicher rgumlieher Konfigur~t ion u n d Molekul~rgewieht, wie eingangs erwi~hnt, ~uf ein Hunder ts te] ihrer Serumkonzent ra t ion in das Kummerwasser filtriert. Alle kleineren Eiweil~k5rper t re ten d~her wie yon uns naehgewiesen [16, 21, 22] ver- mehrt , alle grSBeren Proteine verminder t auf. Dadurch kSnn ten wir uns Vor- s tel lungen fiber die GrSl~enverh~tltnisse der Epithellficken maehen, die sieh erst un te r pathologisehen Bedingungen erweitern u nd so, beispielsweise bei Entzfin- dungen, den Proteingehal t im Kammerwasser ansteigen l~ssen. D a n n ist das Ver- hgltnis hoeh und nieder-molekularer Proteine ghnlich der Vertei lnng im Serum.

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