1

ALTERNATIVNO SPLAJSOVANJE

Nakon sekvenciranja kompletnih genoma čoveka i genoma model organizama,

pobrojavanjem gena za proteine ustanovljeno je da je njihov broj mnogo manji od očekivanog i

da ne može objasniti razlike u biološkoj složenosti eukariota. U postgenomskoj eri postalo je

jasno da su živi organizmi više od prostog zbira njihovih gena i da je biološka složenost nekog

organizama manje zavisna od broja gena u genomu a više od toga kako se oni koriste. Tome

doprinose epigenetički mehanizmi, regulatorne mreže proteina i RNK, i posttranskripcioni i

posttranslacioni mehanizmi koji povećavaju raznovrsnost transkriptoma i proteoma.

Alternativna obrada RNK, pre svega alternativno splajsovanje i editovanje RNK

omogućavaju stvaranje različitih setova proteina i RNK od jednog gena i predstavljaju glavne

mehanizme koji višestruko povećavaju informacioni potencijal genoma sastavljenog od

ograničenog broja gena. Alternativno splajsovanje RNK dovodi do rearanžmana originalne

RNK na velikoj skali uključivanjem različitih segmenata transkripata, prepisanih sa

dikontinuiranih gena eukariota, u zrele RNK. Editovanje RNK uvodi rearanžmane na maloj skali

i slično "search and replace" operaciji, selektivno prevodi jedan nukleotid u drugi ili inserira ili

deletira pojedinačne nukleotide.

1. ŠTA JE ALTERNATIVNO SPLAJSOVANJE RNK?

Alternativno splajsovanje podrazumeva uključivanje različitih segmenata transkripata

prepisanih sa dikontinuiranih gena eukariota u zrele RNK, koje bi bez takvog događaja bile

međusobno identične. Alternativno splajsovanje prekursora iRNK (pre-iRNK) opisano je ranih

osamdesetih godina prošlog veka. Jedan od prvih primera bilo je alternativno splajsovanje

pre-iRNK prepisanih sa gena za imuniglobuline, kada je ustanovljeno da su sekretovano antitelo

i antitelo vezano za membranu produkti istog gena. Broj primera pre-iRNK koje se alternativno

splajsuju je rastao tokom vremena, a savremene analize transkriptoma su iznenadile podatkom

da se transkripti 40% gena Drosophila-e melanogaster i čak 92 do 94% gena čoveka

alternativno splajsuju. I ne samo da se veliki procenat pre-iRNK alternativno splajsuje, već je i

broj alternativno splajsovanih zrelih iRNK nastalih od jedne pre-iRNK često zadivljujući.

Spektakularan primer za to je pre-iRNK gena Dscam (eng. Down syndrome cell adhesion

molecule) D. melanogaster, od koje teorijski može nastati 38 016 izoformi iRNK, broj koji više

nego duplo premašuje broj gena u genomu ovog organizma (~14 500). Za veliki broj gena sve

varijante iRNK nastale alternativnim splajsovanjem još nisu identifikovane, a u velikom broju

primera predominantna varijanta iRNK u određenom tkivu ili tipu ćelije još nije poznata.

Alternativno splajsovanje uvodi 80% različitosti u otvorene okvire čitanja i takvi događaji

značajno doprinose povećanju različitosti proteoma. Ostalih 20% različitosti uvodi se u regione

iRNK koji se ne translatiraju, a nastale promene utiču na cis-elemente koji kontrolišu stabilnost,

lokalizaciju i efikasnost translacije takvih iRNK. Dalje, oko 1/3 događaja alternativnog

2

splajsovanja uvodi prevremeni stop kodon, koji pokreće degradaciju iRNK posredovanu

prevremenim stop kodonom (eng. nonsense mediated decay, NMD). Na osnovu navedenog,

efekti alternativnog splajsovanja na ekspresiju gena mogu se svrstati u tri grupe: 1)

stvaranje većeg broja proteina od jednog gena, označenih kao proteinske izoforme; 2)

stvaranje većeg broja zrelih iRNK od jednog gena, označenih kao izoforme iRNK, koje se na

posttranskripcionom nivou različito regulišu, a kodiraju iste proteinske izoforme; 3) uključivanje

ili isključivanje ekspresije nekog gena (on-off regulacija), kada jedan obrazac splajsovanja

dovodi do stvaranja funkcionalnog proteina, a drugi pokreće degradaciju iRNK. Navedeni efekti

alternativnog splajsovanja ukazujuju da regulacija ovog procesa kontroliše vremensku i

prostornu ekspresiju različitih fukcionalnih proteinskih izoformi, posttranskripcionu ekspresiju

gena, kao i on-off regulaciju gena degradacijom iRNK mehanizmom NMD. Alternativno

splajsovanje je kao takvo integralni deo programa za razviće i diferencijaciju i doprinosi

identitetu ćelija i tkiva. Poremećaji alternativnog splajsovanja uzrokuju veliki broja bolesti

čoveka.

Neočekivano veliki broj gena koji se alternativno splajsuje, i u nekim primerima

zadivljujući broj izoformi iRNK nastalih od jednog gena, svakako nameće pitanje da li su sve

izoforme iRNK i proteina funkcionalne? Ne bi treablo a priori odbaciti funkciju svake alternativno

splajsovane izoforme, ali je istovremeno teško dokazati funkciju svake od njih. Relativno je mali

broj gena kod koga je fukcija svih alternativnih izoformi dobro izučena. Najveći broj proteinskih

izoformi je specifičan za određeno tkivo ili određenu fazu razvića, neke imaju različitu

lokalizaciju u ćeliji, dok su neke solubilne ili vezane za membranu. Različite proteinske izoforme

mogu obavljati iste ili slične funkcije, ali pružaju mogućnost i za alternativne ili čak

antagonističke funkcije.

Sa evolucionog aspekta, opšte je prihvaćeno da je alternativno splajsovaje doprinelo

usložanjavanju organizama među eukariotima. Stepen korišćenja alternativnog splajsovanja je

veći kod sisara u odnosu na D. melanogaster i Caenorhabditis elegans, a kada se poredi stepen

zastupljnosti alternativnog splajsovanja u različitim tikivima sisara, onda je ono najzastupljenije

u centralnom nervnom sistemu.

2. PRIMERI ALTERNATIVNOG SPLAJSOVANJA

Skoro svi događaji alternativnog splajsovanja se odvijaju po jednom od sledećih modela (slika

1): (1) produžavanjem egzona (eng. exon extended) usled korišćenja alternativnih 5’- ili

3’-mesta splajsovanja u intronima, (2) uključivanjem ili isključivanjem (preskakanje) kompletnog

egzona (eng. exon skipping), tako da nastala iRNK sadrži ili ne sadrži jedan kompletan egzon;

posebna grupa kasetnih egzona organizovanih u klastere su međusobno isključivi egzoni (eng.

mutually exclusive exons) — uključivanje jednog egzona iz klastera istovremeno dovodi do

isključivanja svih drugoih egzona iz klastera, (3) zadržavanjem kompletnog introna (eng. intron

retained) u zrelu i-RNK, (4) istovremenim alternativnim korišćenjem dva egzona kada nastaje

smeša dve različite iRNK.

3

Slika 1. Modeli alternativnog splajsovanja — produžavanje egzona selekcijom alternativnog 5'- ili 3'-mesta splajsovanja, uključivanje ili isključivanje kompletnog egzona — kasetni egzoni i međusobno isljučivi egzoni, zadržavanje introna. Egzoni su predstavljeni pravougaonicima, a mogući obrasci splajsovanja predstavljeni su linijama ispod i iznad pre-iRNK

Pre-iRNK prepisana sa gena KCNMA1 (eng. potassium large conductance calcium-

activated channel, subfamily M, alpha) sadrži veći broj alternativnih 5'- i 3'-mesta splajsovanja, i

veći broj kasetnih egzona, tako da može dati više od 500 izoformi iRNK (slika 2a). Protein

KCNMA1 je veliki kanal za jone K+ koji se aktivira depolarizacijom membrane i povećanom

unutraćelijskom koncentracjom jona Ca2+. Obavlja važnu ulogu u ekscitabilnosti neurona i

kontroli tonusa glatke muskulature. Različite izofrome KCNMA1 formiraju kanale različitih

kinetičkih osobina.

Pre-iRNK prepisana sa gena Dscam Drosophila-e je dugačka 61,2 kb i sastoji se od

20 konstitutivnih egzona i 95 kasetnih egzona organizovanih u 4 klastera. U okviru jednog

klastera egzoni su međusobno isključivi (slika 2b). Klaster 4 sadrži 12, klaster 6 sadrži 48,

klaster 9 sadrži 33, a klaster 17 sadrži dva međusobno isključiva kasetna egzona. Zrela iRNK je

duga 7,8 kb i sadrži 24 egzona: 20 konstitutivnih i po jedan iz četiri navedena klastera. S

obzirom da su događaji splajsovanja u svakom od 4 klastera egzona međusobno nezavisna,

ukupan broj potencijalnih izoformi iRNK je 38 016 (12x48x33x2).

Model međusobnog isključivanja egzona jednog klastera zasnovan je na formiranju

dvolančane strukture RNK u pre-iRNK između mesta označenih kao mesto spajanja (eng.

docking site) i mesto selektovanja (eng. selector site). U intronu ispred klastera egzona postoji

jedno mesto spajanja, dok ispred svakog od egzona u klasteru postoji po jedno mesto

selektovanja (slika 7). Mesta selektovanja nisu međusobno identična, ali svako od njih može

formirati hibrid sa mestom spajanja. Kada jedno mesto selektovanja napravi hibrid sa mestom

spajanja, poptuno se isključuje mogućnost da neke drugo mesto selektovanja uradi isto, čime

se objašnjava međusobna isključivost egzona jednog klastera.

4

Slika 2. Primeri pre-iRNK čijim alternativnim splajsovanjem nastaje čitav repertoar izoformi iRNK: a) pre-iRNK KCNMA1 kod čoveka sadrži veći broj alternativnih 5'- i 3'-mesta splajsovanja i veći broj kasetnih egzona, čijim alternativnim splajsovanjem nastaje preko 500 izoformi iRNK. Konstitutivni egzoni su predstavljeni plavom bojom, a alternativni crvenom i žutom. Mogući obrasci splajsovanja za svaki egzon predstavljeni su linijama ispod i iznad pre-iRNK; b) pre-iRNK Dscam kod Drosophile sadrži 20 konstitutivnih egzona (prikazanih plavom bojom) i 4 klastera međusobno isključivih egzona. Klaster egzona 4 sadrži 12 egzona (prikazanih žutom bojom), klaster 6 48 (prikazanih narandžastom bojom), klaster 9 33 (prikazane crvenom bojom), dok klaster 17 sadrži dva egzona (prikazana ljubičastom bojom). Broj potencijalnih izoformi iRNK je 38 016 (12x48x33x2). Svaka izofroma iRNK sadrži 24 egzona i to 20 konstitutivnih i po jedan iz četri klastera međusobno isključivih egzona; c) 28 izoformi iRNK mod(mdg4) kod Drosophile nastaju trans-splajsovanjem dve pre-iRNK. Jedna pre-iRNK sadrži konstitutivne (prikazane plavom bojom) i alternativne egzone (prikazane ljubičastom bojom) i prepisuje se sa jednog lanca DNK gena mod(mdg4). Druga iRNK sadrži samo alternativne egzone (prikazane ljubičastom bojom) i transkribuje se sa drugog lanca DNK u supotnom smeru. Mogući obrasci splajsovanja svakog egzona predstavljeni su crnim linijama, dok su moguće pozicije poli-A repova predstavljene zelenim linijama. Preuzeto iz Nilsen & Graveley, Nature, 2010.

Protein Dscam se eksprimira na povšini ćelija. Poseduje transmembranski domen,

kodiran egzonom klastera 17, domen sličan fibronektinu, kodiran konstitutivnim egzonima, i 10

imunoglobulinskih domena, od kojih su tri kodirana egzonima klasterima 4, 6 i 9. Protein ima

dvostruku funkciju: važan je za razviće nervnog sistema i predstavlja komponentu urođenog

imunskog sistema Drosophile koja prepoznaje antigene. Tokom razvića nervnog sistema protein

Dscam učestvuje u interkcijama između ćelija, i to tako da ćelija koja eksprimira određenu

izoformu proteina Dscam stupa u interakciju sa ćelijom koja eksprimira tu istu izoformu. Smatra

se da je ovakava selektivnost u interkacijama nervnih ćelija važna za formiranje ispravnih

neuronskih mreža u mozgu. U urođenom imunskom sistemu, različite izoforme proteina Dscam

prepoznaju ogroman broj različitih antigena, slično antitelima sisara. Smatra se da je evolucioni

pritisak za održavanjem ogromnog broja izoformi proteina Dscam rezultat selekcije za njegovu

funkciju u imunskom sistemu.

Gen mod(mdg4) (eng. modifier of mdg4) Drosophila-e daje 28 različitih izoformi iRNK

nastalih trans-splajosvanjem – splajsovanjem egzona koji se nalaze u dva različita molekula

5

pre-iRNK (slika 2c). Jedna pre-iRNK, koja sadrži dva konstitutivna i set alternativnih egzona,

transkribuje se sa jednog lanca DNK, dok se druga pre-iRNK, koja sadrži samo set alternativnih

egzona, prepisuje sa drugog lanca DNK u suprotonom smeru. Tačan broj i tačne pozicije

početka i kraja konstitutivnih i alternativnih egzona nisu sasvim poznate. Protein mod(mdg4) je

komponenta proteinskog kompleksa koji se vezuje za insulator i smatra se da kontroliše

represivne hromatinkse funkcije drugih komponenti kompleksa.

3. REGULACIJA ALTERNATIVNOG SPLAJSOVANJA

Alternativno splajsovanje može biti konstitutivno i regulisano. Konstitutivno

alternativno splajsovanje podrazumeva da jedan gen uvek kodira više od jedne izoforme

iRNK ili proteina, dok regulisano alternativno splajsovanje podrazumeva da se različiti

obrasci splajsovanja dešavaju u različitim uslovima u ćeliji. Regulisano alternativno splajsovanje

je najčešće karakteristično za tip ćelije i/ili fazu razvića, tako da je njegova regulacija

tkivno-specifična ili uslovljena razvićem i diferencijacijom. Dodatno, neki obrasci alternativnog

splajsovanja modulišu se kao odgovor na spoljašnje signale, kao što su aktivacija signalnih

puteva u ćelijama ili depolarizacija neurona. Dakle, regulisano alternativno splajsovanje

omogućava da se određena izoforma RNK ili proteina eksprimira u tačno određeno vreme i na

tačno određenom mestu, tako da promene u obrascu splajsovanja modulišu mnoge aktivnosti

ćelije. Većina dobro izučenih primera alternativnog splajsovanja je regulisana.

Splasjovanje je visoko-precizan i secifičan proces. Imajući u vidu (1) diskontinuiranu i

složenu strukturu gena viših eukariota sa prosečnom dužinom egzona oko 150 bp i prosečnom

dužinom introna oko 3 kb (varira između 150 bp i 800 kb), (2) relativno nizak nivo

konzervisanosti mesta splajsovanja i (3) veliki broj alternativnih događaja splajsovanja tokom

obrade jedne pre-iRNK, jasno je da je preciznost splajsozoma u prepoznavanju egzona u

"moru" introna i u prepoznavanju odgovarajućih mesta splajsovanja impresivna. Situacija se

dodatno komplikuje postojanjem velikog broja potencijalnih mesta splajsovanja koja se ne

koriste i formiraju pseudoegzone. Procenjeno je da su pseudoegzoni u genomu čoveka deset

puta zastupljeniji u odnosu na egzone.

Visoki stepen preciznosti i specifičnosti (alternativnog) splajsovanja ostvaruje se nizom

mehanizama koji su veoma složeni i nedovoljno proučeni. Da li će neko mesto splajsovanja biti

iskorišćeno ili ne zavisi od jačine mesta splajsovanja i kombinatornog efekta drugih

cis-elemanta u molekulima RNK i trans-faktora (regulatornih proteina). Regulacija

splajsovanja i alternativnog splajsovanja postaje komplikovanija ako se procesi ne posmatraju

kao statični, već kao visoko-dinamični i ako se uzme u obzir da je obrada RNK kuplovana sa

transkripcijom. U tom smislu faktori koji utiču na obrazac splajsovanja su kompeticija između

mesta splajsovanja i brzina transkripcije.

Jačina mesta splajsovanja, regulatorni elementi u pre-iRNK, regulatorni proteini,

kompeticija između mesta splajsovanja i kinetika elongacije RNK polimerazom II nisu dovoljni

da u potpunosti objasne regulaciju alternativnog splajsovanja. Regulatorni elementi u pre-iRNK

nisu uvek konzervisani između gena, a nekada se transkribuju sa greškom i ipak ispravno

6

regrutuju odgovarajući set faktora splajsovanja na određeni egzon. Brzina transkripcije RNK

polimerazom II utiče na ishod splajsovanja, ali nije jasno do koje mere procesivnost RNK

polimeraze II može biti modulisana in vivo, kao i kako se reguliše brzina elongacije RNK

polimerazom II. Dakle, moglo se pretpostaviti da u ćelijama postoje dodatni mehanizmi koji

doprinose kontroli alternativnog splajsvoanja. Niz otkrića, počevši od 2001. godine, ukazuju da

su struktura hromatina i epigenetički mehanizmi ključni modulatori alternativnog

splajsovanja.

Jačina mesta splajsovanja i regulacija alternativnog splajsovanja

Kod sisara, 5'-mesto splajsovanja je okruženo konsenzusnom sekvencom

YAG/GURAGU (Y - pirimidinski nukleotid, R je A ili G, / je 5'-mesto splajsovanja) koja se bazno

sparuje sa U1 snRNK. Uzvodno od 3'-mesta splajsovanja nalaze se mesto grananja, koje stupa

u interakciju sa U2 snRNK, i polipirimidinski niz, koji vezuje pomoćni faktor U2 snRNP (U2AF).

Sve sekvence važne za splajsovanje su konsenzusne sekvence, tako da svaka od njih ne

vezuje komponente splajsozoma istim afinitetom. Jačinu 5'-mesta splajsovanja određuje

stepen komplementarnosti okolne konsenzusne sekvence sa U1 snRNK, dok jačinu 3'-mesta

splajsovanja određuje dužina polipirimidinskog niza — veći stepen komplementarnosti sa U1

snRNK i duži polipirimidinski niz obezbeđuju veći afinitet za komponente splajsozoma.

Regulacija alternativnog splajsovanja cis-elementima i trans-faktorima

Pored mesta splajsovanja, pre-iRNK nosi dodatne cis-elemente koje obezeđuju

informacije za ispravno prepoznavanje i odgovarajuće splajsovanje egzona. Oni obuhvataju

kratke konsenzusne sekvence koje služe kao mesta vezivanja za, zatim dužinu egzona i introna

i sekundarnu strukturu RNK.

U odnosu na svoju lokaciju i aktivnost konsenzusne sekvence u pre-iRNK koje

obezbeđuju informacije za regulaciju (alternativnog) splajsovanja podeljene su na pojačivače

splajsovanja u egzonima (eng. exon splicing enhansers, ESEs) i intronima (eng. intron

splicing enhansers, ISEs) i prigušivače splajsovanja u egzonima (eng. exon splicing

silencers, ESSs) i intronima (eng. intron splicing silencers, ISSs) (slika 3). Trans-faktori su

proteine koji regulišu splajsovanje i altrnativno splajsovanje u pre-iRNK. Obuhvataju pozitivne

regulatore (aktivatore), koji se vezuju za pojačivače splajsovanja, i negativne regulatore

(represore/utišivače), koji se vezuju za prigušivače splajsovanja.

Slika 3. Pojačivači i prigušivači splajsovanja — Dodatni cis-elementi u pre-iRNK koji regulišu (alternativno) splajsovanje se u odnosu na svoju lokaciju i aktivnost dele na pojačivače splajsovanja u

7

egzonima (eng. exon splicing enhansers, ESEs) i intronima (eng. intron splicing enhansers, ISEs) i prigušivače splajsovanja u egzonima (eng. exon splicing silencers, ESSs) i intronima (eng. intron splicing silencers, ISSs). Pojačivači aktiviraju susedno mesto splajsovanja ili antagonizuju efekat prigušivača, dok prigušivači reprimiraju korišćenje mesta splajsovanja ili efekat pojačivače splajsovanja. Uključivanje ili isključivanje nekog egzona rezultat je kompeticije jedinstvenog seta pojačivača i prigušivača u i oko egzona, koja je uslovljena relativnom koncentracijom pozitivnih i negativnih regulatora splajsovanja.

Svaki egzon ima jedinstvenu kombinaciju pojačivača i prigušivača splajsovanja.

Pojačivači splajsovanja služe kao vezivna mesta proteine i komplekse koji usmeravaju

komponente splajsozoma na odgovarajuće mesto splajsovanja ili antagonizuju efekat

prigušivača splajsovanja. Prigušivači splajsovanja služe kao platforme za regrutovanje proteina

koji onemogućavaju korišćenje nekog mesta splajsovanja ili reprimiraju efekat pojačivača

splajsovanja. Najbolje okarakterisani ESE promovišu splajsovanje vezivanjem proteina familije

SR, dok najbolje okarakterisani ESS i ISS reprimiraju splajsovanje vezivanjem proteina familije

hnRNP, što ukazuje da alternativno splajsovanje koristi iste cis-elemente i trans-faktore kao i

konstitutivno splajsovanje.

Interesantno je da je među regulatorima alternativnog splajsovanja najmanji broj onih

koji specifično regulišu jedan ili nekoliko događaja alternativnog splajsovanja. Primer za

to su faktori koji diktiraju kaskadu događaja alternativnog splajsovanja za određivanje pola kod

D. melanogaster. Takođe, poznat je mali broj tkivno-specifičnih proteina koji kao

master-regulatori koordinisano kontrolišu veliki broj događaja alternativnog splajsovanja u

određenim tkivima. Takvi proteini, na primer, pripadaju familijama NOVA, FOX, MBNL i CELF.

Najveći broj regulatora alternativnog splajsovanja je široko eksprimiran, iako je zapaženo

da nivo njihove ekspresije može varirati između tkiva. Primeri takvih regulatora alternativnog

splajsovanja su familije proteina SR i proteina hnRNP (heterogenih nuklearnih

ribonukleoproteinskih čestica).

Regulatorni proteini splajsovanja prepoznaju kratke konsenzusne sekvence u pre-iRNK i

svoje funkcije ostvaruju stimulisanjem regrutovanja komponenti splajsozoma, sternim

blokiranjem mesta splajsovanja i olakšavanjem ili blokiranjem komunikacije između mesta

splajsovanja.

Familija proteina SR

Proteini familije SR su multifunkcionalni RNK-vezivni proteini: imaju ključnu ulogu u

obeležavanju egzona tokom splajsovanja formiranjem kompleksa za prepoznavanje egzona

(eng. cross‑exon recognition complex) i obavljaju funkciju aktivatora konstitutivnog i regulisanog

alternativnog splajsovanja. Neki proteini SR prate iRNK u citoplazmu i mogu stimulisati

translaciju ili pokrenuti degradaciju neispravnih iRNK

Članovi familije proteina SR na N-kraju poseduju jedan ili dva RNK-vezivna domena:

motiv RRM (eng. RNA recognition motif), a nekada i motiv RRMH (eng. RNA recognition motif

homolog), koji obično ostvaruje slabije interakcije sa RNK u odnosu na motiv RRM (slika 4). Na

C-kraju poseduju domen RS, koji je naziv dobio po dugim motivima bogatim dipeptidnim

ponovcima Arg (R) i Ser (S) (slika 4). Domen RS posreduje u interakcijama sa proteinima

splajsozoma. Serinski ostaci u ovim domenima su mesta koja podležu dinamičnoj fosforilaciji,

čime se reguliše aktivnost ovih proteina. Familija SR proteina kod čoveka ima 12 članova

8

označenih kao faktori splajsovanja bogati serinom i argininom (eng. serine/arginine-rich splicing

factor, SRSF) (slika 4).

Slika 4. Domenska organizacija familije proteina SR kod čoveka — Dvanaest faktora splajsovanja bogatih serinom i argininom (eng. serine/arginine-rich splicing factor, SRSF) čini familiju proteina SR kod čoveka. Svaki član sadrži motiv za prepoznavanje RNK (eng. RNA recognition motif, RRM i/ili RNA recognition motif homolog, RRMH) na N-kraju, praćen domenom bogatim argininom i serinom (eng. arginine/serine (RS) domain). RRM su odgovorni za vezivanje za RNK, dok su domeni RS odgovorni za interakcije sa proteinima splajsozoma. Preuzeto iz Busch & Hertel, WIREs RNA, 2012.

Proteini SR su pozitivni regulatori splajsovanja koji se posredstvom RNK-vezivnih

domena vezuju za ESE i usmeravaju/regrutuju komponente splajsozoma ka različitim mestima

splajsovanja u različitim uslovima. RS domen proteina SR vezanog za ESE direktno stupa u

interakciju sa RS domenom faktora splajsovanja i na taj način olakšava regutovanje komponenti

splajsozoma kao što su U1 snRNP ili U2AF (slika 5a).

Familija proteina hnRNP

Proteini familije heterogene nuklearne iRNP (hn iRNP) se grubo definišu kao proteini

heterogenih nuklearnih RNK (koje uključuju pre-iRNK i druge nuklearne iRNK) koji nisu stabilne

komponente drugih ribonukleoproteinskih čestica, kao na primer snRNP. Kao i proteini familije

SR, prepoznaju kratke konsenzusne sekvence u iRNK i neki prate iRNK u citoplazmu, dok drugi

bivaju zadržani u nukelusu.

Proteini familije hnRNP sadrže RNK-vezivne domene: motiv RRM ili domen KH (eng.

K-homology domain), a većina sadrži i domene za interakcije protein-protein: domen RGG

(sadrži ponovke tripeptida Arg-Gly-Gly), domen bogat Gly ili domen bogat Pro. Proteini familije

hnRNP negativno regulišu splajsovanje i alternativno splajsovanje velikog broja transkripata

vezivanjem za prigušivače splajsovanja u egzonima ili intronima. Krajnji efekat je

onemogućavnje komponenti splajsozoma da se vežu za mesta splajsovanja (slika 5b). Jedan

9

od najpoznatijih hnRNP sa ulogom negativnog regulatora alternativnog splajsovanja je hnRNP I

ili protein koji se vezuje za polipirimidinski trakt (eng. polypyrimidine tract-binding protein,

PTB).

Slika 5. Interakcije cis-elemenata egzona i trans-faktora splajsovanja — Protein familije SR vezan za pojačivač u egzonu (eng. exon splicing enhanser, ESE) preko stupa u interakciju sa komponentama splajsozoma posredstvom interakcija domena RS. Interakcije proteina SR sa U2AF35 (eng. U2 snRNP auxiliary factor 35) i U1 snRNP olakšavaju prepoznavanje 3'- i 5'-mesta splajsovanja, redom. Protein familije hnRNP vezan za prigušivač u egzonu (eng. exon splicing silencer, ESS) interferira sa asocijacijom komponenti splajsovanja sa pre-iRNK. Preuzeto iz Busch & Hertel, WIREs RNA, 2012.

Proteini hnRNP različitim mehanizmima utiču na ishod splajsovanja (slika 6). (1)

Negativno regulišu splajsovanje direktnim blokiranjem regrutovanja komponenti splajsozoma.

Na primer, PTB blokira vezivanje komponenti splajsozoma direktnim vezivanjem za

polipirimidinski niz. (2) Negativna regulacija direktnom kompeticijom podrazumeva da se

sekvence ESS i ESE u egzonu međusobno preklapaju, tako da je vezivanje negativnih (hnRNP)

i pozitivnih regulatora (SR proteina) međusobno isključivo. Ukoliko negativan regulator ima veći

afinitet vezivanja ili je prisutan u većoj koncentraciji u odnosu na pozitivan regulator, alternativni

egzon će biti isključen i obrnuto. (3) Utišavanje savijanjem egzona podrazumeva postojanje

identičnih mesta ISS uzvodno i nizvodno u odnosu na alternativni egzon. Dimerizacijom

negativnih regulatora vezanih za ISS dolazi do savijanja egzona koji usled toga biva isključen.

(4) Utišavanje kooperativnim vezivanjem podrazumeva da alternativni egzon poseduje veći broj

ESE i ESS elemenata koji se međusobno ne preklapaju. U odsustvu negativnih regulatora, za

elemente ESE se vezuju pozitivni regulatori i dolazi do uključivanja egzona. U prisustvu

negativnih regulatora, jedan negativni regulator se vezuje sa velikim afinitetom za ESS i inicira

kooperativno vezivanje dodatnih negativnih regulatora, koji otklanjaju vezane pozitivne

regulatore ili sprečavaju njihovo vezivanje, što dovodi do preskakanja takvog egzona. U

prisustvu drugih aktivatora, koji imaju veći afinitet vezivanja za pojačivače splajsovanja, dolazi

do dereperesije. Smatra se da derepresiju efekta PTB na alternativno splajsovanje imaju tkivno-

ili razvojno-specifični aktivatori splajsovanja. Savijanje egzona i kooperativno vezivanje

10

negativnih regulatora čine egzon "nevidljivim" za splajsozom i indirektno ometaju vezivanje

pozitivnih regulatora jer se njihova mesta vezivanja ne preklapaju.

Slika 6. Modeli inhibicije splajsovanja proteinima familije hnRNP: Direktno blokiranje regrutovanja komponenti splajsozoma. Direktna kompeticija između pozitivnih i negativnih regulatora splajsovanja usled prekalpanja sekvenci ESE i ESS. Savijanje egzona usled međusobne interkacije negativnih regulatora vezanih sa za ISS koji se nalaze sa obe strane egzona. Negativni regulatori se kooperativno vezuju za egzon, maskiraju njegovu kompletnu sekvencu i indirektno ometaju vezivanje pozitivnih regulaotra.

Tkivno-specifični regulatori alternativnog splajsovanja

Nekoliko regulatora, karakterističnih za regulisano ali ne i konstitutivno splajsovanje,

eksprimira se na tkivno-specifičan način. Takvi regulatori na koordinisani način kontrolišu

alternativno splajsovanje velike mreže (grupe) ciljnih transkripata i označavaju se i kao

master-regulatori.

Proteini NOVA (eng. neuro-oncological ventral antigen) se specifično eksprimiraju samo

u neuronima. NOVA 1 se visoko-eksprimira u motornim neuronima, dok se NOVA2 eksprimira u

neuronima korteksa, hipokampusa i dorzalne kičmene moždine. Predstavljaju RNK-vezivne

proteine koji prepoznaju motive YCAY, lokalizovane u intronima susednim egzonu koji se

alternativno koristi. Egzoni čije je alternativno splajsovanje regulisano sa NOVA2 naročito su

zastupljeni u genima za proteine uključene u migraciju neurona i različite sinaptičke funkcije,

kao što su sinaptogeneza i modulacija sinaptičke plastičnosti u neokorteksu.

11

Familija FOX proteina sisara (FOX1, FOX2 i FOX3) predstavlja homologe proteina

FOX1 C. elegans, kodiranog genom feminizing gene on X gene product, koji kontroliše obrazac

alternativnog splajsovanja receptora za faktor rasta fibroblasta u mišićima (FGFR). Ova funkcija

je evoluciono očuvana, tako da FOX2 sisara reguliše obrazac alternativnog splajsovanja

FGFR2. Familija FOX proteina sisara se specifično eksprimira u mozgu, srčanom i skeletnim

mišićima. FOX proteini specifično prepoznaju RNK element konsenzusne skevence UGCAUG,

lokalizovan u nizvodnom intronu u odnosu na egzon koji kontrolišu u velikom broju transkripata,

i uglavnom antagonizuju efeke PTB-a.

Ubikvitno eksprimirani PTB negativno reguliše veliki broja egzona u mioblastima i

progenitorima nervnih ćelija. Tokom diferencijacije ovih ćelija, ekspresija PTB-a se uglavnom

gubi, što dozvoljava uključivanje egzona koji su do tada bili reprimirani. Dodatno, tokom

neuronalne diferncijacije dolazi do eksprimiranja neuronalne forme PTB-a (PTBP2), čija se

ekspresija zadržava i u zrelim neuronima. Isključivanje ekspresije PTB-a i uključivanje

ekspresije PTBP2 dovodi do reprogramiranja obrasca splajsovanja velikog broja transkripata,

što je važno za funkcionisanje i preživaljavanje neurona.

Familija proteina CELF ima važnu ulogu u alternativnom splajsovanju u mozgu i

mišićima. CUG-vezivni proteini 1 (CUG-BP1) se vezuje za regione bogate GU ponovcima i

reguliše alternativno splajsovanje velikog broja transkripata u mišićnim ćelijama. Slabo proučeni

članovi familije proteina CELF se specifično eksprimiraju u mozgu (CELF4, CELF5 i izoforma

CUG-BP2 specifična za neurone, NAPOR), gde verovatno regulišu veliki broj događaja

alternativnog splajsovanja. Mehanizma njihovog delovanja nije potpuno poznat, ali je pokazano

da antagonizuju efekte PTB-a.

Slika 7. Antagonistički efekat MBNL i CUG-BP1 u regulaciji alternativnog spljsovanja — Odnos nivoa regulatora splajsovanja MBNL1 i CUG-BP1 u nukleusu reguliše razvojno zavisno splajsovanje transkripata prepisanih sa gena za hloridni kanal 1 (ClC1), srčani troponin (cTNT) i receptor za insulin (IR). U embrionalnim ćelijama nivo MBNL1 u nukleusu je nizak, dok je nivo CUG-BP1 visok. Tokom razvića, nuklearni nivo MBNL1 raste, dok nivo CUG-BP1 opada. Ovo dovodi do tranzicije embrionalnog u adultni obrazac splajsovanja ciljnih pre-iRNK. Tako se u adultnim ćeijama eksprimira forma IR koja uključuje egzon 11, forma cTNT koja ne sadrži egzon 5, i forma ClC1 koja ne sadrži egzon sa prevremenim stop kodonom. Kod miotonične distrofije tip 1 odnos nivoa ova dva regulatora odgovara embrionalnom odnosu usled toga što se nivo funkcionalnog MBN1 smanjuje jer se on zarobvljava ne dugim dvolančanim strukturama RNK koje grade transkribovani ekspandovani ponovci CUG i CCTG, a nivo CUG-BP1 raste usled njegove fosforilacije i stabilizacije. Fosforilaciju vrši protein kinaza C koja se

12

aktivira dvolančanom RNK formiranom sparivanjem ekspandovanih ponovaka. Preuzeto iz Lee & Cooper, Biochemical Society Transactions, 2009.

Proteini MBNL su regulatori alternativnog splajsovanje, pre svega, u skeletnim i srčanim

mišićnim ćelijama. Skoro polovina događaja alternativnog splajsovnja tokom razvića srca je pod

kontrolom nivoa i balansa proteina familija CELF i MBNL. MBNL i CUG-BP1 ostvaruju

antagonističke efekte u razvojno-regulisanom splajsovanju transkripata prepisanih sa gena za

hloridni kanal 1 (ClC-1) u skeletnim mišićnim ćelijama, srčani troponin (cTNT) i receptor za

insulin (IR). CUG-BP1 promoviše eksprimiranje embrionalnih izoformi navedenih proteina, dok

MBNL promoviše eksprimiranje adultnih izoformi (slika 7). Oba regulatora splajsovanja se

eksprimiraju i u embrionalnim i u adultnim ćelijama, a koji će od njih ostvariti efekat zavisi od

odnosa njihovog nivoa. U nukleusima embrionalnih ćelija nivo CUG-BP1 je veći i favorizuje se

embrionalni obrazac splajsovanja. Tokom razvića nivo MBNL1 se povećava, tako da je u

nukleusima adultnih ćelijama nivou MBNL veći u odnosu na CUG-BP1 i favorizuje se obrazac

splajsovanja karakterističan za adultne ćelije (slika 7). Kod miotonične distrofije tip 1 odnos

nivoa ova dva regulatora odgovara embrionalnom odnosu usled pojave duge dvolančane RNK

koju grade transkribovani ekspandovani ponovci CUG i CCTG. Mutirana RNK zarobljava

MBNL1 i time smanjuje nivo funkcionalnog MBNL1. Istovremeno, mutirana RNK doprinosi

povećanju nivo CUG-BP1, verovatno tako što aktivira proteinsku kinazu C, koja fosforiliše i

stabilizuje CUG-BP1 (slika 7) .

Familija proteina Hu su RNK-vezivni proteini uključeni u posttranskripcionu regulaciju

ekspresije gena. Oni se preferncijalno vezuju za elemente ARE (eng. AU-rich element) u

3'-UTR-ovima ciljnih iRNK i blokiraju njihovu degradaciju. Smatra se da utiču i na njihov

transport i translaciju. Proteini HuB, HuC i HuD se specifično eksprimiraju u neuronima i imaju

važnu ulogu u neuronalnoj diferencijaciji. Smatra se da bi slično ortologu D. melanogaster,

mogli uticati na splajsovanje i poliadenilaciju brojnih ciljnih transkripata.

Pored regulatornih proteina, molekuli RNK mogu se, takođe, vezivati za pre-iRNK i

uticati na izbor mesta splajsovanja ometajući efekte regulatornih proteina. Pre-iRNK za

serotoniski receptor 2C (5HT-2CR) sadrži dva alternativna 5'-mesta splajsovanja u egzonu V.

Korišćenjem distalnog mesta splajsovanja dolazi do uključivanja egzona Vb i nastaje iRNK koja

kodira funkcionalni protein pune dužine (slika 8). Korišćenjem proksimalnog mesta splajsovanja

nasteje iRNK koja ne sadrži egzon Vb i kodira okrnjen, nefunkcionalan protein. Regulatorni

element između ova dva mesta splajsovanja vezuje nepoznati protein koji negativno reguliše

korišćenje Vb mesta splajsovanja. Ovaj utišivač splajsovanja se može inaktivirati A-u-I

editovanjem određenih nukleotida, što omogućava uključivanje Vb egzona. Međutim, u

needitovanim transkriptima, isti utišivač splajsovanja može biti blokiran komplementarnim

vezivanjem specijalne snoRNK, označene kao HBII-52, što opet vodi uključivanju egzona Vb

(slika 8). HBII-52 RNK je slična po strukturi C/D familiji snoRNK i transkribuje se sa

imprintovanog regiona - visoko se eksprimira u mozgu i to sa paternalnog alela.

Alternativno splajsovanje nekih pre-iRNK regulisano je editovanjem A-u-I takvih

transkripata, procesom koji je takođe prostorno i vremenski strogo regulisan (videti kod

Editovanja RNK).

13

Slika 8. SnoRNK HBII-52 reguliše alternativno splajsovanje needitovane pre-iRNK za serotoninski receptor 2C (5-HT2CR) komplementarnim vezivanjem za utišivač splajsovanja egzona Vb, što onemogućava vezivanje negativnog regulatora splajsovanja i dovodi do uključivanja egzona Vb. a) Struktura gena za 5-HT2CR, gde P i D predstavljaju alternativna mesta splajsovanja, a UAA(P) i UAA(D) su stop kodoni koji se koriste pri splajsovanju u mestu P, odnosno D. Predstavljene su i izoforme iRNK, od kojih jedna sadrži, a jedna ne sadrži egzon Vb, kao i proteini koje kodiraju. Region kodiran egzonom Vb je druga unutrćelijska petlja, gde se nalaze i aminokiseline kodirane editovanim kodonima. b) Komplementarnost između snoRNK HBII-52 i pre-iRNK za 5-HT2CR. Popunjene strelice od A do E označavaju mesta editovanja A-u-I, dok prazna strelica P označava proksimalno mesto splajsovanja (preuzeto iz Kishore et al., Science 2006).

Kombinatorni model regulacije alternativnog splajsovanja

Svaki egzon poseduje specifičan set identifikacionih elemenata koji omogućavaju

njegovo pravilno splajsovanje. Tako, svaki egzon ima jedinstveni par mesta splajsovanja i

jedinstvenu kombinaciju pojačivača i prigušivača splajsovanja (slika 3). Njegova okolina, takođe,

sadrži jedinstvenu kombinaciju pojačivača i prigušivača splajsovanja u intronima (slika 3). Za

pojačivače i prigušivače splajsovanja vezuju se pozitivni i negativni regulatori. Isti regulatori

učestvuju u velikom broju različitih događaja alternativnog splajsovanja, a njihovo prisustvo i

relativna koncentracija mogu se razlikovati u različitim ćelijama ili u različitim fazama razvića.

Dalje, skoro svi regulatori splajsovanja mogu delovati kao pozitivni ili negativni regulatori u

zavisnosti od pozicije njihovog mesta vezivanja u odnosu na ciljni egzon, što ukazuje da

kontekst utiče na funkciju i što daje dodatni nivo složenosti u regulaciji alternativnog i

splajsovanja. Na primer, faktor splajsovanja specifičan za neurone, NOVA2, funkcioniše kao

aktivator splajsovanja kada je pozicioniran uzvodno od mesta splajsovanja, a kao represor kada

je pozcioniran nizvodno od mesta splajsovanja.

Prethodno navedeno omogućava da skoro svaki događaji alternativnog splajsovanja

bude kombinatorno regulisan. Prema ovom modelu odabir određenog mesta splajsovanja

zavisi od dinamičnog zajedničkog delovanja RNK-vezivnih mesta u pre-iRNK, tkivno- ili

razvojno-specifičnog obrasca ekspresije faktora splajsovanja i nivoa njihove aktivnosti.

14

Kompletni setovi cis-elemenata i trans- faktora koji diktiraju gde i u kojem kontekstu će se desiti

različiti događaji splajsovanja označen je kao “kod splajsovanja” (eng. “splicing code”).

Pojedinačni cis-elementi i trans-faktori koji regulišu alternativno splajsovanje često imaju

antagonistički efekat, tako da je kombinatorni efekat rezultat njihove međusobne kompeticije.

Na primer, antagonsitičke efekte imaju SR i hnRNP, NOVA i PTB, FOX i PTB, CELF i PTB,

MBNL i CELF. Usled postojanja suprotnih klasa regulatora splajsovanja kombinatorni model

regulacije alternativnog splajsovanja označava se i kao "yin-yang" model. Po ovom modelu,

korišćenje nekog mesta splajsovanja je određeno kompetitivnim efektom većeg broja pozitivnih

mesta (na primer, proteina SR vezanih za pojačivače splajsovanja u egzonima) i negativnih

mesta (na primer, proteina hnRNP-ova vezanih za utišivače splajsovanja u egzonima i

intronima). Kada efekat pozitivnih mesta za regulatore premaši efekat negativnih, koristi se

određeno mesto splajsovanja, i obrnuto. Danas se smatra da je ovaj model daje nepotpunu

sliku o regulaciji alternativnog splajsovanja.

Kompeticija između mesta splajsovanja

Kompeticija dva mesta splajsovanja može se ilustrovati primerom u kome snažan

utišivač splajsovanja (za koji se vezuje hn-RNP) ne dovodi do isključivanja mesta splajsovanja

koje kontroliše, već svoj represivni efekat ostvaruje samo ako je prisutno i mesto splajsovanja

sa kojim postoji kompeticija (slika 9). Kada su u hipotetičnoj pre-iRNK prisutna dva 5'-mesta

splajsovanja koja su u kompeticiji i kada nema odgovarajućeg represora splajsovanja, U1

snRNP se vezuje za oba mesta splajsovanja, a U2 snRNP se vezuje za nizvodno 3'-mesto

splajsovanja. U ovoj situaciji distalno 5'-mesto splajsovanja se preferencijalno koristi (na slici

ozačeno punom linijom).

Slika 9. Kinetički efekat utišivača splajsovaja na alternativno splajsovanje: Objašnjenje u tekstu Preuzeto iz Nilsen & Graveley, Nature, 2010.

U prisustvu hnRNP, koji se vezuje za ESS uzvodno od distalnog 5'-mesta splajsovanja,

učestalost njegovog korišćenja se značajno smanjuje, što promoviše korišćenje proksimalnog

5'-mesta splajsovanja. U slučaju kada je proksimalno 5'-mesto splajsovanja odsutno, vezivanje

15

hnRNP za utišivač splajsovanja nema efekat na korišćenje distalnog 5'-mesta splajsovanja. U

slučaju kada su oba 5'-mesta splajsovanja pod kontrolom utišivača splajsovanja, vezivanje

hnRNP-ova za oba utišivača nema efekat na izbor mesta splajsovanja, tako da se koristi

distalno 5'-mesto splajsovanja (kao da represori splajsovanja nisu ni vezani). Ovaj primer

ilustruje i da klasičan utišivač splajsovanja, za koji se vezuje hnRNP, ne funkcioniše tako što

direktno inhibira korišćenje mesta splajsovanja.

Kinetika hemijskih procesa utiče i na alternativno spajsovanje gena Dscam D.

melanogaster. Zadivljujuća različitist izoformi Dscam iRNK (više od 38 000 izoformi iRNK)

nastaje međusobnim isključivim splajsovanjem egzona koji su grupisani u četiri velika nezavisno

kantrolisana klastera (slika 2b). Međusobno isključivo splajsovanje egzona klastera 6 uključuje

formiranje dvolančane strukture RNK između mesta spajanja, koje se nalazi u uzvodnom

intronu i jednog od mesta selektovanja koje se nalazi uzvodno u odnosu na svaki od 48 egzona

klastera 6. Koji će od 48 egzona iz klastera 6 biti iskorišćen pri alternativnom splajsovanju

Dscam pre-iRNK delom zavisi od kinetičke kompeticije u formiranju dvolančanih struktura

RNK između mesta spajanja i jednog od mesta selektovanja i od balansa kompetirajućih

regulatornih proteina, HRP36 iz familije hnRNP i proteina familije SR (slika 10). Protein

HRP36 aktivno reprimira svaki od 48 egzona iz klastera 6. Na slici 10 na levoj strani je

prikazana interakcija mesta selektovanja egzona 6.3 sa mestom spajanja. Nakon uspostavljanja

ove interakcije uklanja se opšta represija uzrokovana proteinom HRP36, što omogućava

vezivanje proteina SR. Smatra se da je lokalno oslobađanje opšte inhibicije egzona 6.3 direktan

rezultat formiranja sekundarne strukture dvolančane RNK ili strukture koju prepoznaje protein

koji otklanja represiju. Rezultat ovih procesa je uključivanje egzona 6.3 u zrelu iRNK. Na slici 10

na desnoj strani je prikazana situacija kada se, po istom principu, u zrelu iRNK uključuje egzon

6.47. Ukoliko nema aktivnosti proteina HRP36, veći broj sekvenci iz klastera egzona 6 se može

naći u zreloj iRNK. Međutim, ukoliko istovremeno nema ni aktivnosti proteina SR, ponovo samo

jedna od 48 sekvenci iz klastera egzona 6 ulazi u sastav zrele iRNK.

Slika 10. Uticaj kinetike hemijskih procesa na alternativno spajsovanje gena Dscam D. melanogaster: koji će se od 48 egzona klastera 6 neći u zreloj iRNK zavisi od kompeticije formiranja dvolan;ane RNK nastale hibridizacijom mesta selektovanja i jednog od 48 mesta spajanja, kao i od kompeticije regulatora splajsovanja, kao što su HRP36 i jedan od proteina iz familije SR. Preuzeto iz Nilsen & Graveley, Nature, 2010.

Alternativno splajsovanje egzona klastera 6 Dscam pre-iRNK je funkcija kinetičke

kompeticije između sparivanja 48 potencijalnih mesta spajanja i mesta selektovanja, stabilnosti

dvolančane RNK koja se formira između mesta spajanja i određenog mesta selektovanja,

Docking site

Selector site

Docking site

Selector site

16

balansa proteina HRP36 i SR, ali i udaljenosti mesta selektovanja od mesta spajanja, kao i

brzine transkripcije kroz klaster egzona 6. Smatra se da bi i splajsovanje drugih međusobno

isključivih egzona moglo biti regulisano sličnim kinetičkim parametrima.

Kinetika elongacije RNK polimerazom II i regulacija alternativnog splajsovanja

Procesi transkripcije i obrade pre-iRNK su kuplovani, što ukazuje da transkripciona

mašinerija i mašinerija za splajsovanje međusobno stupaju u interkaciju i da kinetika jednog

procesa utiče na ishod drugog. Efikasna koordinacija između transkripcije i obrade pre-iRNK je

specifična osobina RNK Pol II, posebno njenog C-terminalnog domena katalitičke subjednice,

koji u zavisnosti od svog obrasca fosforilacije "vodi" proces transkripcije i obrade pre-iRNK.

Obeležavanje mesta splajsovanja i neki događaji splajsovanja se odgiravaju kotranskripciono,

tako da brzina transkripcije, sa kinetičkog stanovišta, ostvaruje efekat na alternativno

splajsovanje.

Brzina sinteze rastućeg transkripta utiče na njegovo prostorno savijanje, što može imati

efekat na dostupnost vezivnih mesta za komponente splajsozoma i regulatore

splajsovanja. Na ovaj način, neka mesta splajsovanja mogu biti u kompetitivnoj prednosti ili

smetnji u odnosu na druga mesta splajsovanja. Novije studije ukazuju da egzoni u rastućim

transkriptima ostaju "privezani" (eng. tethered) za elongacioni transkripcioni kompleks tokom

sinteze, što je izgleda neophodno da bi postali deo zrele iRNK. Pretpostavlja se da je glavni

mehanizam "privezivanja" zapravo brzina transkripcije. U odsustvu regulatora splajsovanja,

kada RNK polimeraza brzo transkribuje deo gena sa egzonom, dolazi do preskakanja takvog

egzona, dok oni egzoni koji se sporo transkribuju, ostaju efikasno "privezani" i bivaju uključeni u

zrelu iRNK (slike 11 i 13).

U prisustvu slabog i jakog 3'-mesta splajsovanja, brza elongacija RNK polimerazom II

favorizuje regrutovanje komponenti splajsozoma na jako 3'-mesto splajsovanja nizvodnog

introna, umesto na slabo 3'-mesto splajsovanja uzvodnog introna, što dovodi do preskakanja

egzona (slika 11a, levo). Suprotno, spora elongacija dozvoljava regrutovanje komponenti

splajsozoma na slabo 3'-mesto splajsovanja, što rezultuje uključivanjem egzona (slika 11a,

desno). U uslovima kada su oba 3'-mesta splajsovanja jednako jaka i kada uzvodni intron sadrži

vezivno mesto za negativni regulator koji inhibira uključivanje egzona (NF), brza elongacija

favorizuje regrutovanje komonenti splajsozoma na oba introna, što rezultuje uključivanjem

egzona (slika 11b, levo). Suprotno, spora elongacija obezbeđuje dovoljno vremena za

regrutovanje negativnog regulatora na ISS pre nego što se komponente splajsozoma vežu za

5'-mesto splajsovanja nizvodnog introna i definišu egzon, što rezultuje isljučivanjem egzona

(slika 11b, desno)

17

Slika 11. Uticaj kinetike elongacije RNK polimerazom II na altrnativno splajsovanje. Objašnjenje u tekstu.

4. EPIGENETIČKI MEHANIZMI KAO KLJUČNI REGULATORI ALTERNATIVNOG

SPLAJSOVANJA

Struktura hromatina i regulacija alternativnog splajsovanja

Jedan od prvih eksperimenata koji je pokazao da je struktura hromatina važna za

obrazac alternativnog splajsovanja bilo je ispitivanje uticaja hormon-senzitivnih promotora na

splajsovanje reporterskog gena CD44. Tretman sa različitim sterioidnim hormonima indukovao

je promene u alternativnom splajsovanju CD44 samo ako je on bio pod kontrolom promotora

zavisnog od odgovarajućeg sterioida i ako je bio prisutan specifični receptor za odgovarajući

18

steroid. Uspostavilo se da obrazac alternativnog splajsovanja zavisi od regrutovanja specifičnog

koregulatora hormonskog receptora koji remodeluje hromatin. Dalje, pokazano je da kompleksi

koji utiču na strukturu hromatina (kompleksi za remodelovanje nukleozoma i enzimi za

modifikaciju N-krajeva histona) stupaju u interakciju sa komponentama splajsozoma i

olakšavaju njihovo ispravno asembliranje na pre-iRNK. Na primer, histon-acetil transferaze

(Gcn5 kod kvasca i STAGA kod čoveka) stupaju u interakciju sa U2 snRNP, dok histon-arginin

metiltransferaza stupa u interakciju sa U1 snRNP. Kompleks za remodelovanje nukleozoma

SWI/SNF kod Drosophila-e i čoveka stupa u interakciju i regrutuje U1- i U5 snRNP, nezavisno

od svoje ATP-zavisne aktivnosti u remodelovanju neukleozoma.

Mapiranje pozicija nukleozoma na nivou celog genoma pokazalo je da nukleozomi nisu

nasumično raspoređeni duž gena već da su češće prisutni na granicama intron-egzon. Uočeno

je da je ovakav raspored nukleozoma evoluciono očuvan kod životinja i biljaka. Zbog ove

osobine smatra se da pozicioniranje nukleozoma1 ima ulogu u markiranju/definisanju

egzona. Interesantno je da dužina DNK u nukleozomima (147 bp) slična prosečnoj dužini

egzona kod sisara (~150 bp). Smatra se da markiranje egzona nukleozomima ima ulogu u

regulaciji splajsovanja, s obzirom da je pozicija nukleozoma nezavisna od ekspresije gena.

Uočeno je da se izolovani egzoni između dugih introna odlikuju većim stepenom pozicioniranja

nukleozoma nego grupisani egzoni odvojeni malim intronima. Takođe, primećeno je da su

egzoni koji se alternativno uključuju bogatiji nukleozomima u odnosu na one koji se isključuju,

kao i da gustina nukleozoma varira u zavisnosti od jačine mesta splajsovanja i to tako da postoji

jače pozicioniranje nukleozoma u egzonima definisanim slabijim mestima splajsovanja.

Kod biljaka i životinja, zajedno sa nukleozomima, različitu distrbuciju duž gena ima i

RNK polimeraza II, koja se preferencijalno akumulira u egzonima. Nukleozomi se ponašaju

kao barijera koja lokalno moduliše kinetiku elongacije RNK polimeraze II indukujući njeno

pauziranje. Uočeno je da je RNK polimeraza II sporije transkribuje alternativno splajsovane

egzone u odnosu na konstituitivne. Zajedno sa sposobnostima RNK polimeraze II da stupa u

interkaciju sa modifikatorima N-krajeva histona (kao što je histon 3 lizin 36 (H3K36)

metiltransferaza Set2) i da regrutuje regulatore splajsovanja (kao što su proteini SR i

subjedinice U2 snRNP), pozicioniranje nukleozoma može modulisati gustinu RNK polimeraze II

na egzonima, a time i efikasnost splajsovanja.

Iako za sada nema eksperimentalnih dokaza, može se pretpostaviti i da bi metilacija

DNK mogla direktno, ili indirektno, preko modifikacije histona sa kojom je tesno povezana, da

utiče na izbor mesta splajsovanja. Za sada je pokazano da metilacija DNK nije slučajno

raspoređena duž genoma i da specifično markira egzone.

Novija saznanja, akumulirana poslednjih nekoliko godina, ukazuju da bi modifikacije

histona mogle da budu glavni modulatori alternativnog splajsovanja. Analiza distribucije

42 vrste modifikacija histona na nivou celog genoma pokazala je da one nisu slučajno

raspoređene duž genoma, i da su neke modifikacije prisutnije u egzonima u odnosu na njihove

1 Zbog dinamičke prirode interakcije DNK i histonskog oktamera, nukleozomi uglavnom nemaju fiksnu

poziciju. U ređim slučajevima postoji tačno određena lokalizacija nukleozoma poznata kao pozicioniranje nukleozoma.

19

okolne introne. Modifikacije histona kao što su H3K36me3, H3K4me3 i H3K27me2 su češće u

egzonima, dok je H3K9me3 ređa. Ono što podržava ulogu nekih modifikacija histona u regulaciji

spajsovanja jeste da njihov nivo nije u korelaciji sa transkripcionom aktivnošću. Tako, u genima

koji se aktivno transkribuju modifikacija H3K36me3 je manje prisutna u egzonima koji se

alternativno splajsuju u odnosu na konstituitivne.

Dalji dokazi o ulozi modifikacija histona u regulaciji alternativnog splajovanja vezani su

za eksprimente na humanom genu FGFR2 (eng. human fibroblast growth factor receptor 2).

Pre-iRNK FGFR2 se alternativno splajsuje u dve međusobno isključive i tkivno-specifične

izoforme, FGFR2-IIIb i FGFR2-IIIc. U zavisnosti od obrasca splajsovanja gen FGFR2 je

obogaćen određenim tipovima modifikacija histona: modifikacije H3K36me3 i H3K4me1 se

akumuliraju duž alternativno splajsovanog regiona u mezenhimskim ćelijama, kod kojih se

uključuje egzon IIIc, dok su modifikacije H3K27me3 i H3K4me3 obogaćene u epitelnim

ćelijama, koje koriste egzon IIIb. Modulacija H3K36me3 i H3K4me3 nivoa prekomernom ili

smanjenom ekspresijom odgovarajućih metiltransferaza menja tkivno-specifičan obrazac

alternativnog splajsovanja pre-iRNK FGFR2.

Dakle, lokalne promene u strukturi hromatina i lokalne promene u obrascu modifikacija

histona duž alternativno splajsovanih regiona mogu uticati na ishod splasjovanja.

Kako modifikacije histona regulišu alternativno splajsovanje?

Epigenetičke modifikacije i dinamična struktura hromatina modulišu brzine elongacije

RNK polimeraze II, čime ostvaruju posredni uticaj na regulaciju alternativnog splajsovanja.

Zajedničko delovanje brzine elongacije transkripcije, strukture hromatina i modifikacije histona

na alternativno splajsovanje prikazano je na slici 12. Hipotetični gen sadrži tri egzona

upakovana u nukleozome. Egzoni koji se konstitutivno splajsuju su prikazani zelenom bojom i

upakovani su u nukleozome koji sadrže modifikaciju tipa H3K36me3 (označene žutim

krugovima). U ćelijama koje ne koriste alternativni egzon, prikazan ružičastom bojom, izostaje

modifikacija H3K36me3 u nukleozomu koji ga pakuje. RNK polimeraza II (braon oval) koja

transkribuje gen brzo prolazi preko alternativnog egzona, on ne ostaje privezan za RNK

polimerazu II, i splajsozom (narandžasti krug) ga ne uključuje u zrelu iRNK. Suprotno, kada

nukleozom koji pakuje alternativni egzon sadrže modifikaciju H3K36me3, dolazi do usporavanja

transkripcije, što dozvoljava da se alternativni egzon uključi u sekvencu zrele iRNK.

Dodatni mehanizam kojim modifikacije histona mogu regulisati obrazac splajsovanja je

regrutovanje faktora splajsovanja posredstvom adaptorskog kompleksa. Naime, modifikacije

histona duž gena su vezivna mesta za adaptorne proteine koji "čitaju" specifične

modifikacije histona i istovremno regrutuju određene faktore splajsovanja.

20

Slika 12. Zajedničko delovanje brzine transkripcije, strukture hromatina i modifikacije histona na regulaciju alternativnog splajsovanja. Objašnjenje u tekstu. Preuzeto iz Nilsen & Graveley, Nature, 2010.

Uporedno mapiranje setova histonskih modifikacja duž nekoliko gena čije alternativno

splajsovanje zavisi od proteina PTB, pokazalo je da postoji snažna korelacija između nekoliko

tipova modifikacija histona duž alternativno splajsovanih regiona i ishoda splajsovanja. U

alternativno splajsovanim regionima gena češće su prisutne modifikacije H3K36me3, dok su

modifikacije H3K4me3 ređe. Promena ovih histonskih modifikacija je dovoljna da promeni

PTB-zavisno alternativno splajsovanje egzona. Modifikacija H3K36me3 formira platformu koja

regrutuje PTB na rastući transkript preko adaptornog proteina, MRG15, koji se specifično vezuje

za H3K36me3 (slika 13). Visoki nivo H3K36me3 duž alternativno splajsovanog regiona

regrutuje MRG15, koji dalje stupa u interakciju sa PTB i regrutuje ga na nascentnu RNK.

Suprotno, u tipovima ćelija gde je nivo H3K36me3 nizak, represor splajsovanja PTB se slabo

regrutuje na rastuću pre-iRNK, a kao posledica toga favorizovano je uključivanje PTB-zavisnih

egzona.

Iako je jasno da modifikacije histona imaju direktnu ulogu u regulaciji splajsovanja,

interesantno je da modifikacije histona nisu samostalne determinante ishoda splajsovanja, već

pre deluju kao modifikatori ishoda splajsovanja. Izučavanje PTB-zavisnog obrasca alternativnog

splajsovanja na nivou genoma pokazalo je da se događaji splajsovanja koji su najosetljiviji na

promene modifikacije histona oslanjaju na slabim mestima vezivanja za PTB, dok događaji

alternativnog splajsovanja koji uključuju jaka mesta vezivanja za PTB nisu zavisni od

H3K36me3. Navedeno ukazuje da epigenetičke modifikacije deluju zajedno sa

RNK-vezivnim elementima kako bi pojačali njihov efekat.

Postoji dovoljno razloga da se veruje da H3K36me3-MRG15-PTB nije jedini adaptorni

kompleks između strukture hromatina i procesa splajsovanja. Druge kombinacije modifikacija

histona, proteina koje ih prepoznaju i regrutuju specifične faktore splajsovanja verovatno

formiraju složenu mrežu komunikacija između hromatina i RNK. S obzirom da su duge

ncRNK uključene u formiranje strukture heterohromatina, moguće je da se neke duge ncRNK

specifično transkribuju i asociraju sa regionima gena koji se alternativno splajsuju.

21

Slika 13. Adaptorni sistem između modifikacija nukleozoma i splajsovanja — U slučaju egzona čije alternativno splajsovanje zavisi od slabog vezivnog mesta za protein PTB (eng. polypyrimidine tract binding protein), visok nivo modifikacije trimetilovanog lizina 36 u histonu H3 (H3K36me3) je vezivno mesto za faktor MRG15. MRG15 deluje kao adaptorni protein i protein-protein interkacijama pomaže u regrutovanju PTB-a na njegova slaba vezivna mesta u pre-iRNK, što za posledicu ima preskakanje odgovarajućih egzona. Ukoliko je prisutan visok nivo drugog tipa modifikacije histona (na primer, H3K4me3), MRG15 se ne vezuje, izostaje regrutovanje PTB-a na pre-iRNK, što za rezultat ima uključivanje egzona. Preuzeto iz Luco et al., Cell, 2010.

Integrisani model regulacije transkripcije i alternativnog splajsovanja

Model kombinatorne regulacije alternativnog splajsovanja zasnovan je na aditivnom

efektu cis-elemenata u molekulima RNK (mesta splajsovanja, vezivna mesta za regulatore

splajsovanja i sekundarne strukture RNK) i trans-faktora, odnosno regulatora splajsovanja.

Prema ovom modelu odabir određenog mesta splajsovanja zavisi od kombinacije RNK-vezivnih

mesta u pre-iRNK, tkivno- ili razvojno-specifičnog obrasca ekspresije faktora splajsovanja, i

nivoa njihove aktivnosti. Otkrića da je obrada pre-iRNK kuplovana sa transkripcijom i da lokalne

promene u strukturi hromatina mogu uticati na ishod splasjovanja ukazala su da kombinatorni

model daje pojednostavljenu sliku o regulaciji alternativnog splajsovanja (slika 14). Danas je

poznato da odabir određenog mesta splajsovanja ne zavisi samo od cis-elemenata u

molekulima RNK i trans-faktora, već i od kinetike elongacije RNK polimerazom II i lokalne

strukature hromatina (slika 14). Krajnja determinanta u odabiru mesta splajsovanja je

regrutovanje faktora splajsovanja na ciljnu RNK, međutim kada će i koji faktori splajsovanja biti

regrutovani ne pre-iRNK ne zavisi samo od cis-elemenata u molekulima RNK, već u velikoj meri

zavisi od kinetike transkripcije i lokalne strukture hromatina.

22

Integrisani model regulacije transkripcije i alternativnog splajsovanja podrazumeva

da faktori koji kontrolišu lokalnu strukturu hromatina i (elongaciju) transkripcije i istovremeno

doprinose i regrutovanju i asembliranju splajsozoma na tačno određenim mestima splasovanja

(slika 13). Epigenetički mehanizmi (pozicioniranje nukleozoma, modifikacije N-krajeva histona,

metilacija DNK) utiču kako na transkripciju, tako i na splajsovanje: 1) remodelovanje i otvaranje

hromatina omogućava regrutovanje faktora elongacije transkripcije koji modulišu kinetiku

elongacije RNK polimerazom II i obradu pre-iRNK; 2) pozicioniranje nukleozoma duž egzona i

prisustvo određenog tipa modifikacija histona moduliše regrutovanje faktora splajsovanja.

Navedeni efekti bi mogli da se ostvaruju kroz pauziranje RNK polimeraze II, što favorizuje

formiranje splajsozoma kroz interakcije protein-protein, ili kroz specifično regrutovanje faktora

splajsovanja na slaba RNK-vezivna mesta preko adaptorskog proteina.

Slika 14. Integrisani model regulacije alternativnog splajsovanja — Obrazac alternativnog splajsovanja određen je kombinacijom sledećih parametara: cis-regulatornih elemenata u molekulima RNK (vezivna mesta za regulatore splajsovanja), sekundarnim strukturama RNK (označenih narandžastom bojom), i osobinama transkripcije i hromatina koji modulišu regrutovanje faktora splajsovanja na iRNK (označeno plavom bojom). Preuzeto iz Luco et al., Cell, 2010.

Hromatin kao memorija za obrazac alternativnog splajsovanja

Mnogi događaji alternativnog splajsovanja odigravaju se na način specifičan za ćeliju i/ili

tkivo. Postavlja se pitanje na koji način se specifičan obrazac alternativnog splajsovanja

uspostavlja, održava i nasleđuje? Obrazac alternativnog splajsovanja specifičnog za ćeliju i/ili

tkivo očigledno nije determinisan samim RNK-vezivnim mestima u pre-iRNK, s obzirom da su

identični u svim tipovima ćelija. Sa druge strane, iako postoje razlike u ekspresiji regulatora

splajsovanja koje su specifične za tip ćelije i/ili tkiva, teško je zamisliti da globalne promene u

količini faktora splajsovanja u određenom tipu ćelija ili tkiva mogu objasniti složenu regulaciju

pojedinačnih egzona, često i u okviru pojedinačnog gena. Tako, neki egzoni treba da budu

isključeni, neki uključeni, dok neki zahtevaju aktivaciju kriptičnih mesta splajsovanja.

Tkivno-specifična ekspresiju master regulatora alternativnog splajsovanja, koji regulišu veliku

mrežu alternativno splajsovanih transkripata u određenim ćelijama, takođe, ne može u

23

potpunosti objasniti prostorno i vremnski specifičnu regulaciju alternativnog splajsovanja usled

malog broja identifikovanih master regulatora. Navedena regulacija je pre izuzetak nego pravilo.

Imajući u vidu ulogu strukture hromatina u uspostavljanju, održavanju i nasleđivanju seta

gena koji se u jednoj ćeliji eksprimiraju i seta gena koji ostaju zaključani, kao i postojeće dokaze

da struktura hromatina utiče na alternativno splajsovanje, atraktivno je pretpostaviti da bi sistem

zasnovan na epigenetičkim mehanizmima mogao obezbediti informaciju kojom se uspostavlja i

održava obrazac alternativnog splajsovanja i dalje propagira na kćerke ćelije (slika 15). Takav

sistem bi mogao uključivati specifično markiranje alternativno splajsovanih regiona

modifikacijama histona, koje bi ili lokalno menjale brzinu elongacije RNK polimerazom II ili bi

regrutovale faktore splajsovanja preko adaptorskih proteina. Sistem bi istovremeno

obezbeđivao epigenetičku memoriju za obrazac alternativnog splajsovanja koja bi se prenosila

na kćerke ćelije tokom proliferacije i koja bi se mogla menjati tokom diferencijacije. Jasno je da

bi epigenetička memorija obrasca alternativnog splajsovanja i dalje zahtevala odgovarajući

obrazac ekspresije faktora splajsovanja, proces koji je i sam kontrolisan epigenetičkim

mehanizmima. Bez obzira na tačan mehanizam kako se ostvaruje, izgleda da epigenetička

regulacija nije ograničena samo na kontrolu regiona genoma koji se eksprimiraju, već i kako se

splajsuju.

Slika 15. Hromatin kao memorija za obrazac transkripcije i alternativnog splajsovanja — Kombinacija modifikacija histona (histonski kod) duž gena uspostavlja, održava i nasleđuje tkivno-specifičan obrazac transkripcije (levo), ali i tkivno-specifičan obrazac alternativnog splajsovanja. Preuzeto iz Luco et al., Cell, 2010.