1

Proteine, Peptide i Aminoacizi

Proteinele reprezint dup ap constituenii cei mai importani ai organismelor vegetale i animale. n aceste organisme, proteinele ndeplinesc roluri multiple i variate: intr n structura celulelor din diverse esuturi i organe, sunt constitueni principali ai enzimelor, au rol n aprare, sunt hormoni ce intervin n reglarea proceselor metabolice.

Indiferent de originea lor, de specia de la care provin, proteinele sunt constituite din 20

aminoacizi deosebii structural unii de alii, ceea ce confer proteinelor o diversitate i o complexitate extraordinar. Deoarece numeroase proprieti ale proteinelor se datoresc faptului c sunt constituite din aminoacizi, este necesar n prealabil prezentarea aminoacizilor care intr n constituia lor, precum i unele proprieti ale acestora.

n afara faptului c reprezint unitile funcionale ale lanurilor polipeptidice i proteice,

L--aminoacizii i derivaii lor particip la desfurarea unor funcii biologice diverse, cum ar fi transmiterea impulsului nervos, biosinteza porfirinelor, purinelor, pirimidinelor, ureei, etc.

Polimeri mici ai aminoacizilor numii peptide joac roluri importante n sistemul neuro-endocrin, acionnd ca hormoni, regulatori ai secreiei hormonale, neuromodulatori, neurotransmitori. n

timp ce proteinele conin numai L--aminoacizi, microorganismele pot sintetiza peptide care

conin att L-- ct i D--aminoacizi. Unele dintre aceste polipeptide au o valoare terapeutic acionnd ca antibiotice (bacitracina, gramicidina S) sau ca ageni antitumorali (bleomicin). Alte peptide microbiene pot fi toxice. De exemplu microcistina i nodularina, peptide secretate de cianobacterii, sunt letale n doze mari, n timp ce n doze mici induc apariia unor tumori hepatice. Oamenii i organismele superioare sunt incapabile s sintetizeze n cantiti suficiente pentru

funcionarea normal a organismului 10 din cei 20 L--aminoacizi, astfel nct este important ca hrana s conin cantiti suficiente din aceti aminoacizi eseniali.

1. Aminoacizii

Aminoacizii reprezint o clas de compui difuncionali cu o semnificaie biologic deosebit,

datorit faptului c ei sunt unitile de baz care intr n alctuirea proteinelor. Deoarece cele dou

grupri funcionale dintr-un aminoacid sunt una cu caracter acid i cealalt cu caracter bazic, aceti

compui sunt amfoteri, iar molecula lor exit preponderent sub form desare intern sau amfion

(zwitterion). De exemplu glicina, cel mai simplu aminoacid se prezint mai curnd ca afion dect ca

specie neionizat.

H3NCH

2COO

+ -H

2NCH

2COOH

amf ion (zwitterion) f orma neionizata

Aminoacizii i datoreaz importana faptului c au capacitatea de a forma o legtur amidic ntre

dou molecule de aminoacid. O astfel de legtur se numete legtur peptidic, iar compuii rezultai

se numesc peptide.

2

glicil-glicina

dipeptida

H3NCH

2C

+ -O

NHCH2COO

legatura peptidica

n funcie de numrul aminoacizilor componeni putem ntlni di-, tri-, tetra-, oligopeptide. Pe

msur ce numrul aminoacizilor componeni crete, se obin polimeri care alctuiesc clasa

polipeptide. Proteinele sunt polipeptide a cror secven de aminoacizi este determinat genetic.

1.1. Aminoacizi care intr n constituia proteinelor (aminoacizi proteinogeni)

Prin hidroliza acid, bazic sau enzimatic a proteinelor, rezult -aminoacizi, care reprezint

unitile chimice de baz ale macomoleculelor proteice.

C

COOH

NH2 H

R

L--aminoacid

(conf iguratie S)

f ormula perspectiv ica proiectie Fischer

HNH2

R

COOH

Din cei peste 300 aminoacizi naturali, numai 20 sunt cei care intr n alctuirea proteinelor,

acest lucru fiind determinat prin codul genetic, care este universal pentru toate vieuitoarele. Structura

celor 20 aminoacizi este prezentat n Tabelul 1, mpreun cu abrevierile acceptate n mod

convenional (de trei litere i de o liter). Ambele tipuri de abrevieri pot fi utilizate pentru a reprezenta

succesiunea aminoacizilor n peptide i proteine.

3

Tabelul 1. -Aminoacizi naturali care intr n alctuirea proteinelor. Structurile prezentate sunt cele care predomin la pH-ul fiziologic (pH = 7,3 pentru om).

Nume

Simbol

Formul structural

pKa1

(-COOH)

pKa2

(-NH2)

pKa3

(R)

Abundena

medie n

structura

proteinelor

Aminoacizi cu lan alifatic monoamino monocarboxilici

Glicin

Alanin

Valin*

Leucin*

Izoleucin*

Gly

(G)

Ala

(A)

Val

(V)

Leu

(L)

Ile

(I)

-

+

H CH

NH3

COO

-

+

CH3

CH

NH3

COO

-

+

CH

NH3

COO

CH3

CH3CH

-

+

CH

NH3

COOCH3CHCH

2

CH3

-

+

CH

NH3

COOCH3CH

2CH

CH3

2,4

2,4

2,2

2,3

2,3

9,8

9,9

9,7

9,7

9,8

7,5%

9.0%

6.9%

7.5%

4.6%

Aminoacizi cu grupri hidroxil (OH)

Serin

Treonin*

Tirozin*

Ser

(S)

Thr

(T)

-

+

HOCH2

CH

NH3

COO

-

+

CH3CH C

H

NH3

COO

OH

Vezi mai jos

2,2

9,2

9,2

9,1

13

13

7.1%

6.0%

4

Aminoacizi cu sulf

Cistein

Metionin*

Cys

(C)

Met

(M)

-

+

HSCH2

CH

NH3

COO

-

+

CH3SCH

2CH

2CH

NH3

COO

1,9

2,1

10,8

9,3

8,3

2.8%

1.7%

Aminoacizi monoaminodicarboxilici i amidele lor

Aspartat acid aspartic

Glutamat acid glutamic

Asparagin

Glutamin

Asp

(D)

Glu

(E)

Asn

(N)

Gln

(Q)

-

+

OOCCH2 CH-COO

NH3

-

-

+

OOCCH2CH

2 CH-COO

NH3

-

-

+

H2NCCH

2 CH-COO

NH3

O

-

+

H2NCCH

2CH

2 CH-COO

NH3

O

2,0

2,1

2,1

2,2

9,9

9,5

8,8

9,1

3,9

4,1

5.5%

6.2%

4.4%

3.9%

Aminoacizi cu grupri bazice

Lizin*

Arginin*

Histidin*

Lys

(K)

Arg

(R)

His

(H)

-

+

CH-COO

NH3

+H

3NCH

2CH

2CH

2CH

2

-

+

CH-COO

NH3

NH2

+

H2NCNHCH

2CH

2CH

2

-

+

CH

NH3

COO

NHN

CH2

2,2

1,8

1,8

9,2

9,0

9,3

10,8

12,5

6,0

7.0%

4.7%

2,1

5

Aminoacizi cu resturi fenil

Fenilalanin*

Tirozin

Phe

(F)

Tyr

(Y)

-

+

CH-COO

NH3

CH2

-

+

CH-COO

NH3

CH2

OH

2,2

2,2

9,2

9,1

10,1

3,5%

3,5%

Aminoacizi heterociclici

Histidin*

Prolin

Triptofan*

His

Pro

(P)

Trp

(W)

Vezi mai sus

N

H H

CO

O

+

-

-

+

CH

NH3

COO

NH

CH2

2,0

2,4

10,6

9,4

4,6

1,1

*Aminoacizi eseniali

Aminoacizii naturali care intr n compoziia poteinelor difer doar prin substituentul R ataat la

carbonul . Marea varietate a acestor substitueni laterali este ceea ce confer proteinelor diversitatea

lor structural i n consecin marea lor diversitate funcional. Codul genetic specific 20 L--

aminoacizi care intr n constituia proteinelor. Unele proteine conin i ali aminoacizi care apar

datorit modificrii biochimice a unui aminoacid deja prezent n protein. Astfel de transformri includ

conversia unei peptidil-lizine sau peptidil proline n peptidil-hidroxilizin i respectiv peptidil-

hidroxiprolin, metilarea, formilarea, acetilarea, fosforilrea, etc. a diverselor resturi aminoacil. Astfel

de modificri mresc gradul de complexitate al proteinelor producnd modificri ale solubilitii,

stabilitii, ca i asupra interaciilor cu alte proteine.

Toi cei 20 de aminoacizi au o serie de caracteristici stucturale comune:

- au o grupare amino n poziie , cu excepia prolinei, care conine o grupare imino, membr a

unui ciclu pirolidonic;

6

- cu o singur excepie, glicina, toi aminoacizii au atomul de carbon chiral (centru de

chiralitate), avnd deci activitate optic;

- atomul de carbon are configuraie S (cu excepia cisteinei, explicai de ce!); n proiecie

Fischer gruparea NH2 este orientat spre stnga, deci aminoacizii naturali sunt L--aminoacizi;

- prezena simultan a celor dou grupri, carboxilic si amino, nvecinate spial, face posibil

formarea legturii peptidice, legtur cu mare importan biologic.

Cu excepia glicinei, atomul de carbon din poziia este chiral, deci unii aminoacizi sunt dextrogiri iar

alii sunt levogiri. Toi au aceeai configuraie cu L-glicerinaldehida, deci fac parte din seria L.

Exist un numr de -aminoacizi liberi cu roluri importante n procesele metabolice. De

exmplu ornitina, citrulina i argininosuccinatul particip la sinteza ureei; tirozina ia parte la formarea

hormonilor tiroidieni; glutamatul este implicat n biosinteza unor substane neurotransmitoare. Exist

i D-aminoacizi care se ntlnesc n natur: D-serina i D-aspartatul se gsesc n esutul cerebral; D-

alanina i D-glutamatul se gsesc n pereii celulari ai bacteriilor gram-negative, etc.

1.2. Aminoacizi care nu intr n constituia proteinelor

n afara celor 20 aminoacizi care intr n structura proteinelor, n natur exist o serie de aminoacizi

care sunt constitueni ai altor biomolecule sau produi intermediari n diferite procese biochimice.

Tabelul 2. Aminoacizi neproteinogenici

Formul

Denumire

Rol biologic

H2N-CH2-CH2-COOH

H2N-(CH2)3-COOH

H3C-NH-CH2-COOH

CH2

COO

N(CH3)

3

+

-

H2N-CH2-CH2-SO3H

-alanin

Acid -aminobutiric

(GABA)

sarcozin

betain

taurin

component a dipeptidelor carnozin i anserin a acidului pantotenic i coenzimei A

transmiterea impulsului nervos; agent de

blocare a sinapselor

utilizat n tratamentu cancerului

rol lipolitic

component a acizilor biliari

7

CH

NH2

COOHH2N-(CH

2)

3

CH

NH2

COOHHN-(CH2)

3NH

2C

O

ornitin

citrulin

intermediar al cilului ureogenetic

intermediar al cilului ureogenetic

1.3. Proprietile aminoacizilor

Gruprile COOH i cea NH2 pot exista att n forma neutr, cat i n form ionizat.

R-COOH R-COO- + H+

R-NH3+ R-NH2 + H

+

Aminoacizii pot fi ncrcai pozitiv, negativ, sau pot avea sarcina net zero. Dei ambele grupri R-

COOH i R-NH3+ sunt slab acide, R-COOH este mult mai tare dect R-NH3

+. La pH-ul fiziologic (pH

= 7,3-7,4) gruprile carboxil se gsesc preponderent n stare ionizat R-COO-, iar gruprile amino

predominant ca R-NH3+.

Moleculele care conin un numr egal de grupri ionizabile cu sarcini opuse se numesc amfioni sau

zwitterioni.

+NH

2

OH

R H

O

H3N

O

R H

O amf ion

(zwitterion)

A B

Aminoacizii din fluidele biologice (snge, majoritatea esuturilor) trebuiesc scrii ca amfioni. Structura

B nu poate exista ntr-o soluie apoas deoarece la orice pH suficient de mic pentru a protona gruparea

carboxil, gruparea amino va fi i ea protonat. Analog, al un pH suficient de mare pentru ca gruparea

amino neprotonat s predomine, gruparea caroxil va dona i ea un proton, transformndu-se n

carboxilat, -COO-. Formula B se folosete ns de multe ori atunci cnd reaciile nu implic echilibre

acido-bazice. Mai jos este prezentat efectul pH-ului asupra gradului de ncrcare electric a acidului

aspartic.

8

NH3

OH

O

OH

O

NH3

O

O

OH

O

NH3

O

O

O

O

NH2

O

O

O

O

+ +

-

+

-

-

-

-

H+ H+ H+

pKa1=2,09

(-COOH)

pKa2=3,86

(-COOH)

pKa3=9,82

(-NH3+)

Tria aminoacizilor este exprimat de indicele pKa (Tabelul 1). Gruparea imidazol din histidin i

gruparea guanidino din arginin exist sub forma unor hibrizi de rezonan cu sarcina pozitiv

distribuit ntre cei doi atomi de azot (histidin) sau cei trei atomi de azot (arginin).

NN

R

H

H NN

R

H

H

+ +

RNH-C-NH2

+NH

2

RNH=C-NH2

+RNH-C=NH

2

+NH

2NH

2

O specie molecular care are un numr egal de sarcini pozitive i negative este neutr din punct de

vedere electric (form izoelectric). Valoarea pH-ului la care moleculele de aminoacid sunt au suma de

sarcini negative egal cu suma sarcinilor pozitive este cunoscut ca pH-ul izoelectric (pI) al

aminoacidului respectiv. La pH-ul izoelectric, sarcina net a unui aminoacid este zero. n cazul

unui aminoacid monoamino monocarboxilic,

pI =

pKa1 + pKa2

2

De exemplu, pI pentru alanin este:

= 6,02pI =

2,35 + 9,69

2

n mediu puternic

bazic (pH > 11) sarcina net = - 2

n mediu puternic

acid (pH < 1) sarcina net = +1

pH 3,

sarcina net = 0

pH 6-8,

sarcina net = - 1

9

Pentru acizii polifuncionali, pI este tot o medie ntre pKa-urile aflate de o parte i de alta a pI-ului. De

exemplu, pI pentru acidul aspartic este:

pI =

pKa1 + pKa2

2= 3,02

2,09 + 3,96

2=

iar pentru lizin,

pI =

pKa2 + pKa3

2= 10

9,2 + 10,8

2=

Calcule similare se folosesc i pentru acizii poliprotici (de exemplu proteinele), indiferent de numrul

gruprilor disociabile prezente.

Valoarea pKa a unei grupri disociabile este un parametru care depinde de natura mediului care

nconjoar gruparea respectiv. Vecintatea unei grupri disociabile poate influena pKa-ul gruprii.

Valorile pKa ale gruprilor R (prezentate in Tabelul 1) reprezint valori determinate n soluii apoase

pure ale aminoacizilor respectivi. Aceste valori ne dau doar o idee asupra valorilor pKa ale acelorai

aminoacizi cnd sunt prezeni ntr-o protein. Un mediu polar favorizeaz o form ncrcat electric

(R-COO- sau R-NH3

+), pe cnd un mediu nepolar favorizeaz apariia formelor nencrcate electric (R-

COOH i R-NH2). Aadar, un mediu nepolar mrete valoarea pKa gruprii carboxil (fcnd-o un acid

mai slab) dar n acelai timp scade pKa-ul unei grupri amino (fcnd-o un acid mai tare). Existena

unor grupri adiacente ncrcate electric poate s accentueze sau s diminueze efectele solventului. Prin

urmare, pKa-ul unei grupri funcionale este dependent de poziia sa n molecula de protein. n funcie

de vecintile unei grupri, pKa-ul su se poate schimba chiar cu cteva uniti de pH. Diferene de 2-3

uniti de pH fa de valorile pKa prezentate n Tabelul 1. sunt frecvente n special n situsurile active

ale enzimelor. Ca un exemplu extrem, un reziduu de acid aspartic ngropat n structura unei enzime

numit tioredoxin are pKa > 9, observndu-se un salt mai mare de 6 uniti de pH.

Solubilitatea i punctul de topire al aminoacizilor: dovad a caracterului lor ionic.

Prezena gruprilor ncrcate electric in structura lor face ca aminoacizii s fie solubili n solveni polari

(ap, etanol), dar insolubili n solveni nepolari (benzen, hexan, eter). Aminoacizii sunt substane

solide, albe, cristalizate. Anumii aminoacizi sunt mai greu solubili n ap (tirozina, cisteina). Datorit

acestei insolubiliti, cisteina n anumite condiii formeaz o calculoz renal cisteinuria.

Aminoacizii nu absorb n domeniul vizibil, aa nct sunt substane incolore. Tirozina, fenilalanina i

mai ales triptofanul prezint un maxim de absorbie n UV (250-290 nm), prin urmare prezena

10

triptofanului n structura unei proteine i confer acesteia proprietatea de a absorbi lumina ultraviolet

n jurul valorii de 280 nm.

Gruprile -R sunt importante pentru proprietile unui aminoacid. De multe ori glicina,

cel mai mic aminoacid (R = H), este gsit n locurile unde lanul proteic se ndoaie puternic, deoarece

ea poate ptrunde n locurile inaccesibile celorlali aminoacizi. Gruprile R hidrofobe din fenilalanin,

tirozin i triptofan se gsesc n special spre interiorul proteinelor citosolice. Gruprile R ncrcate

electric din aminoacizii cu caracter bazic sau acid stabilizeaz conformaia unei molecule proteice prin

intermediul legturilor ionice. Astfel de grupri funcioneaz ca tafete de sarcin n timpul catalizei

enzimatice. Histidina, de exemplu, joac un rol unic n cataliza enzimatic, datorit pKa-ului protonului

imidazolic care i permite s funcioneze la pH-ul fiziologic att ca acid ct i ca baz. Gruprile OH

din serin sau SH din cistein sunt buni ageni nucleofili i pot funciona ca atare n cataliza

enzimatic. n acelai timp, gruparea OH (alcool secundar) din treonin, dei un bun nucleofil, nu se

bucur de aceeai importan n cataliza enzimatic. Gruprile OH din serin, treonin i tirozin pot

participa la reglarea activitii unor enzime a cror activitate enzimatic depinde de gradul de

fosforilare a acestor grupri.

Gruprile funcionale determin reactivitatea chimic a aminoacizilor. Gruprile

funcionale ale aminoacizilor prezint majoritatea reaciilor caracteristice gruprii respective. Astfel,

gruparea carboxil din aminoacizi se poate esterifica, poate forma amide, anhidride, cloruri acide, azide;

gruprile amino se pot acila, gruprile OH i SH se pot oxida, esterifica, etc.

Aminoacizii dau o reacie de culoare cu ninhidrina, reacie des utilizat pentru detectarea i

cuantificarea aminoacizilor. Ninhidrina formeaz un produs purpuriu cu gruparea -amino din -

aminoacizi i un produs galben cu gruparea imino din prolin i hidroxiprolin. n urma reaciei cu

ninhidrina, numai azotul gruprii amino apare n produsul final.

11

OH

OH

O

O

O

O

O

NH2

O

O

N CH

R

O

O

..

O

O

NH2

O

O

N CHR

..

OH

HO

O

N CHR

O

+ RCH

O

O

O

O

OO

O

N

H

O

OO

O

N

+ H2O

+ RCHCOO-

C ....-

+ H2O

..

..-

+ CO2

-

+ H2O

produs colorat

ninhidrina

aminoacid

+ HO-

+ HO-

Reacii ale gruprii carboxil cu importan biologic

Formarea de amide constituie un proces de mare importan biologic, avnd loc n mod

continuu n organism.

NH3

OO

OH

O

NH3

OO

NH2

O

NH3

O

O

OH

O

NH3

O

O

NH2

O

+ +

++

NH3 H2O

NH3 H2O

Glu

Asp

Gln

Asn

- -

- -

12

-Aminoacizii se pot decarboxila, formnd aminele respective. Reaciile de decarboxilare a

aminoacizilor sunt catalizate de enzime numite aminoacid decarboxilaze care aparin clasei liazelor i

folosesc drept coenzim piridoxal fosfatul (derivat de la vitamina B6).

NH

3

O

R

O R NH2

+

aminoacid decarboxilaza+ CO

2

-

Multe amine produse n organism prin decarboxilarea aminoacizilor au aciuni remarcabile, sau sunt

intermediari n diverse reacii metabolice.

Tabelul 3. Exemple de amine biogene formate prin decarboxilarea aminoacizilor n organism

Aminoacidul

de origine

Denumirea

aminei

Formul Rol biologic

Glu

Cys

Ser

Lys

Tyr

His

acid -aminoglutaric

cisteamin

etanolamin

cadaverin

tiramin

histamin

HOOC-(CH2)3-NH2

HS-CH2-CH2-NH2

HO-CH2-CH2-NH2

H2N-(CH2)5-NH2

HO-C6H4-(CH2)2-NH2

NH

N

CH2-CH

2-NH

2

mediator chimic; transmiterea

impulsului nervos

component al coenzimei A

component al fosfolipidelor

diamin toxic

hipertensiv, contracia uterului

mediator chimic; transmiterea

impulsului nervos

Reacii ale gruprii amino

Alchilarea aminoacizilor poate avea loc in vitro n prezena iodurii sau sulfatului de metil, sau

poate avea loc in vivo sub aciunea unei substane specializate pentru aceast reacie: metionina activat

sau S-adenozil-metionina (SAM).

13

CH2

COO

NH2

CH2

COO

N(CH3)3+

Gly betaina

SAM- -

Betaina se administreaz n cazurile de insuficien hepatic.

Dezaminarea este o reacie prin care aminoacizii se transform n cetoacizi, intermediari

metabolici de mare importan.

-CH

COO

NH2

Rdeaminaza

-R

-C

O

COO

-aminoacid -cetoacid

NAD+ NADH + H+

Cea mai important reacie a aminoacizilor o constituie formarea legturii peptidice (legturile

ncercuite).

+

NH

NH

O

OSH

O

O

NH3

alanil-cisteinil-glicina

1.4. Aminoacizi eseniali

Biosinteza proteinelor specifice unui organism este direct corelat cu aportul de aminoacizi

exogeni provenii din alimentaie. Sinteza tuturor celor 20 -aminoacizi ce intr n constituia

proteinelor nu poate fi fcut n totalitate dect de plante i microorganisme. n cursul evoluiei,

organismele umane i animale au pierdut capacitatea de a sintetiza 8 aminoacizi, pe care nu i pot

obine dect prin aport exogen din proteinele de natur vegetal sau microbian.

Aminoacizii care sunt absolut necesari pentru creterea i dezvoltarea organismelor umane i

animale i care sunt furnizai prin alimentaie se numesc aminoacizi eseniali (indispensabili, vezi

Tabelul 1). Lipsa acestor aminoacizi din alimentaie provoac tulburri foarte grave.

Doi aminoacizi, histidina i arginina, sunt indispensabili organismelor n cretere, sinteza lor

endogen nefiind suficient pentru a acoperi nevoile mai mari din periodele de cretere (aminoacizi

semieseniali). Ceilali aminoacizi pot fi sintetizai n organism printr-o serie de reacii care au ca

14

puncte de plecare diveri metabolii; ei sunt aminoacizi neeseniali (dispensabili) i prin urmare pot

lipsi din hran. Carena n anumii aminoacizi prin aport alimentar insuficient se manifest printr-o

simptomatologie complex, ca de exemplu:

carena n lizin: determin ncetinirea creterii;

carena n triptofan: determin tulburri vasculare i modificarea tabloului leucocitar;

carena n tirozin: determin atrofierea tiroidei i hipofizei;

carena n tioaminoacizi: determin atrofierea testiculelor, degradarea ovarelor i sterilitate.

2. Peptide

2.1. Clasificarea i nomenclatura peptidelor.

Peptidele sunt substane naturale sau sintetice constituite dintr-un numr restrns de aminoacizi

care se obin formal prin condensarea intermolecular a unei grupri carboxil de la un aminoacid cu

gruparea amino de la aminoacidul urmtor. Peptidele alctuite din 2-10 aminoacizi se definesc ca

oligopeptide (di-, tri-, tetra-, etc.). Peptidele alctuite din 10-50 aminoacizi se definesc ca polipeptide.

Ca origine, peptidele prezente n organismul uman pot proveni fie din aminoacizi, prin biosintez, fie

ca produi intermediari n procesele biochimice de degradare i biosintez a proteinelor. Cu excepia

peptidelor ciclice, o polipeptid conine o grupare NH2 liber (captul N-terminal) i o grupare

carboxil liber (captul C-terminal).

NH2

NN COOH

R

RO

O RH

Hn

aminoacid N-terminal aminoacid C-terminal

Prin convenie, structura unei peptide este prezentat cu aminoacidul N-terminal n stnga i cu

aminoacidul C-terminal n dreapta. Pentru a denumi o peptid se specific n ordinea de succesiune -

ncepnd cu aminoacidul N-terminal numele radicalilor aminoacizilor, iar la sfrit se adaug numele

15

ntreg al aminoacidului C-terminal. Deoarece denumirile devin complicate, de multe ori se prefer

abrevierile prezentate n Tabelul 1.

H3NCH

2C NHCHCOO

CH3

O+ -

H3NCH

2C NHCHC

CH2C

6H

5

O+

NHCH2COO

-O

glicilalanina

Gly -Ala, sau GA

H3NCH

2C NHCHC

CH2OH

O+

NHCHC-

O

NHCHCOO

CH2C

6H

5CH

2SH

O

glicilserilf enilalanilcisteina

Gly -Ser-Phe-Cy s, sau GSFC

Exerciiu: denumii tripeptida a

Dac se utilizeaz codul de abreviere cu trei litere (Tabelul 1), aminoacizii se pot separa prin cratime;

dac se utilizeaz codul de o liter, cratimele se omit. Cnd este cunoscut doar identitatea

aminoacizilor fr a fi cunoscut i ordinea lor, aminoacizii se separ prin virgule. n pentapeptida

reprezentat mai jos, aminoacidul N-terminal este valina, iar histidina este aminoacidul C-terminal.

Aminoacizii sunt numerotai ncepnd cu aminoacidul N-terminal. Astfel, restul de glutamat este Glu 4,

deoarece este al patrulea aminoacid de la captul N-terminal.

Glu, Cys, His, Val, Ala 1Val-2Cys-3Ala-4Glu-5His

2.2. Structura legturii peptidice

Datorit delocalizrilor electronice, legtura peptidic are aproximativ 40% caracter de legtur

dubl. Atomii de carbon din doi aminoacizi adiaceni se gsesc n poziie trans unul fa de cellalt

datorit mpiedicrilor sterice care determin stabilitatea configuraiei trans n detrimentul configuraiei

cis.

Pentapeptida conine aminoacizii indicai,

dar ordinea lor nu este cunoscut Pentapeptida conine aminoacizii

n ordinea indicat

a

16

N

R

R

H

O

..N

R

R

H

O

+

-

Din cauza caracterului parial de dubl legtur, rotaia liber in jurul legturii peptidice este

mpiedicat. Atomii de carbon i azot care aparin legturii peptidice, precum i ceilali doi atomi de

care acetia sunt legai direct formeaz un plan rigid. Aceast coplanaritate local influeneaz modul

n care un lan polipeptidic se poate plia, cu implicaii directe asupra structurii tridimensionale a

polipeptidelor i proteinelor.

N

R

OH

NN

R

R

H

OH

O

NN

R

R

H

OH

O

NN

R

R

H

OH

O

Singurul tip de legtur covalent care mai apare n structura unei peptide n afara legturii peptidice

este legtura disulfidic. Aceasta poate lua natere ntre dou resturi de cistein.

2 HSCH2CHCO

NH3+

-O

OCCHCH2S SCH

2CHCO

O O--

NH3

NH3+ +

Disulfurile, R-S-S-R se formea n urma oxidrii slabe a tiolilor, iar legtura disulfidic poate fi uor

redus pentru a regenera tiolii.

2R SH S S RR

configuraie trans

oxidare slab

cistein cistin

reducere

oxidare

Figura 1. Fragment dintr-un lan polipeptidic. Planul definit de fiecare legtur peptidic

este reprezentat ca un patrulater haurat. Gruprile R legate de C- alterneaz de o parte i de alta a scheletului polipeptidic

17

Cnd o astfel de legtur apare ntre dou resturi de cistein, se poate forma o bucl, aa cum se

formeaz de exemplu n hormonul hipofizar oxitocin.

S S

Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2

Dac resturile de cistein se afl n lanuri diferite, legturile disulfidice fac lagtura ntre cele dou

lanuri, ca n cazul insulinei.

Gly -Ile-Val-Glu-Gln-Cy s-Cy s-Thr-Ser-Ile-Cy s-Ser-Leu-Ty r-Gln-Leu-Glu-Asn-Ty r-Cy s-Asn

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cy s-Gly -Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Ty r-Leu-Val-Cy s-Gly -Glu-Arg-Gly -Phe-Phe-Ty r-Thr-Pro-Ly s-Ala

S

S

S

S

S S

Insulina este un hormon secretat de pancreas care controleaz nivelul glucozei din snge prin reglarea

metabolismului glucozei. Insulina este o polipeptid dimer alctuit dintr-un lan mai scurt ( lanul A,

21 aminoacizi) i unul mai lung (lanul B, 30 aminoacizi). n structura sa ntlnim att puni disulfidice

intracatenare, ct i puni disulfidice intercatenare.

Legtura peptidic este nencrcat electric indiferent de pH. Peptidele sunt ins ncrcate

electric la pH-ul fiziologic datorit gruprii amino libre de la captul N-terminal i datorit gruprii

carboxil libere de la captul C-terminal, ca i datorit eventualelor resturi de aminoacid cu grupri

bazice sau acide. Prin urmare, polipeptidele sunt polielectrolii. Ca i n cazul aminoaciziilor, pKa-urile

gruprilor ionizabile depind mult de natura mediului care le nconjoar. Peptidele sunt i ele

caracterizate de pI, (pH-ul izoelectric, pH-ul la care suma sarcinilor pozitive este egal cu suma

sarcinilor negative). n Tabelul 34 sunt prezentai parametrii ctorva peptide simple n soluie apoas.

Tabel 4. Valorile pKa pentru cteva peptide sintetice

Peptida pKa1

COOH

pKa2 +NH3

pI

Gly-Gly

Gly-Ala

Ala-Gly

Gly-Gly-Gly

Ala-Ala-Ala-Ala

3.14

3.15

3.17

3.23

3.42

8.25

8.23

8.18

8.09

7.94

5.70

5.69

5.68

5.66

5.68

oxitocin

lan A:

lan B:

legtur intracatenar

legturi intercatenare

18

2.3. Oligopeptide cu rol biologic.

n organismul uman au fost identificate i caracterizate peptide care ndeplinesc importante

funcii biochimice. Principalele dipeptide naturale sunt carnozina i anserina, cu structuri

asemntoare. Ambele dipeptide sunt considerate atipice nefiind constituite numai din -aminoacizi.

Ele sunt componente specifice esutului muscular, carnozina fiind prezent n muchiul mamiferelor,

iar anserina n muchiul pectoral al psrilor. Ambele iau natere prin condensarea histidinei cu -

alanina, diferena constnd n faptul c anserina conine o grupare metil n ciclul imidazolic.

N

N

CH3

NH

H3N

O

O

O

N

N

H

NH

H3N

O

O

O+ +

- -

Ambele dipeptide au rolul de substane tampon meninnd pH-ul fiziologic n timpul contraciei

musculare. Carnozina exercit o aciune hipertensiv i este un stimulator al secreiei glandulare. Joac

un rol activ n transportul acidului fosforic n cursul procesului de glicoliz i n formarea

creatinfosfatului. Sub form de carnozinfosfat este donor de grupri fosfat n contracia muscular.

Glutationul este o tripeptid prezent n toate celulele de origine vegetal i animal. Este un

tripeptid atipic, format din glutamat, cistein i glicin.

NN

O

H O

HSH

O O

O

NH3

O

- -

+

carnozin

-alanilhistidin

anserin

-alanil-N-metilhistidin

glutation

-glutamilcisteinilglicin

19

Prezena unei grupri tiolice libere, provenit de la cistein, confer glutationului proprieti

reductoare. Hidrogenul gruprii tiolice poate fi cedat unei substane acceptoare de hidrogen cu unirea

a dou molecule de glutation, formndu-se glutation oxidat.

G-SH + HS-G G-S-S-G

Funcia principal a glutationului este de a detoxifia organismul de diveri ageni oxidani toxici care

apar n diferite procese biochimice redox. Agenii oxidani sunt implicai n procesele de mbtrnire

sau de inducere a diferitelor cancere, iar glutationul are capacitatea de a-i reduce, diminundu-le astfel

potenialul toxic.

Encefalinele sunt pentapeptide sintetizate de corp pentru a controla durerea. Ele au fost

denumite i analgezice naturale. Aceti compui diminueaz senzaiile de durere prin legarea de

anumii receptori cerebrali. O parte din structura lor tridimensional este probabil similar cu cea a

morfinei, deoarece se leag de aceeai receptori.

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Tyr-Gly-Gly-Phe-Met

Bradikinina, vasopresina i ocitocina sunt nonapeptide cu rol hormonal. Bradikinina inhib

inflamarea esuturilor. Vasopresina controleaz tensiunea arterial prin reglarea pe care o exercit

asupra contraciei muchilor netezi, fiind n acelai timp i antidiuretic. Ocitocina provoac contraciile

n timpul naterii i stimuleaz secreia laptelui la femeile lehuze. Vasopresina i ocitocina posed o

legtur disulfuric intracatenar, iar cruparea carboxil C-terminal este preponderent sub form

amidic. n ciuda rolului fiziologic diferit, vasopresina i ocitocina difer structural doar prin doi

aminoacizi.

S S

S S

Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg

Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2

Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2

glutation redus

glutation oxidat

leucin-encefalin metioninin-encefalin

bradikinin

vasopresin

ocitocin

20

n Tabelul 5 sunt consemnate i alte polipeptide cu roluri biologice foarte divers, n special

hormonal.

Tabelul 5. Hormoni polipeptidici

Denumire Numr de aminoacizi Roluri biologice

insulina

glucagonul

corticotropina

gastrina I

gastrina II

secretina

hormonul melanocit

()

hormonul melanocit

()

51

29

39

17

17

27

13

18

aciune hipoglicemiant

aciune hipergicemiant

stimuleaz biosinteza hormonilor corticosteroizi

stimularea secreiei gastrice

stimularea secreiei gastrice

controleaz secreia pancreasului

stimuleaz producerea de pigment n celulele melanocite ale pielii

stimuleaz producerea de pigment n celulele melanocite ale pielii

Antibioice cu structur polipeptidic. Exist o serie de polipeptide naturale eliberate de

microorganisme (bacterii) dintre care unele manifest aciune antibiotic, prezentnd un larg interes n

chimioterapia modern. Din aceast catgorie fac parte gramicidine, tirocidiine, bacitracine, polimixine,

actinomicine, kapreomicine, walinomicine, etamicine, etc. Caracteristica esenial a acestor substane

este prezena n lanul peptidic al acestora, alturi de aminoacizii din seria L, a unor aminoacizi din

seria D, formnd uneori o structur ciclic. Frecvent n structura acestora se ntlnesc acizii L-aspartic

i L-glutamic.

Gramicidina S este un antibiotic decapeptidic cu structur ciclic. Conine aminoacizii L-

ornitin (L-Orn), D-ornitin (D-Orn) i D-fenilalanin. (Ornitina este un aminoacid asemntor lizinei,

cu o grupare metilen mai puin).

21

L-ValL-Orn

L-Leu

D-Phe

L-ProL-Val

D-Orn

L-Leu

L-Phe

L-Pro

H3NCH

2CH

2CH

2CHCOO

NH3

-+

+

3. Structura proteinelor

Proteinele sunt biocomponente structurale i funcionale de nsemntate primordial pentru

procesul vieii i care prezint cel mai inalt grad de complexitate, varietate i specificitate. Denumirea

de protein deriv de la cuvntul grecesc proteos, primul, n deplin acord cu rolul fundamental al

acestor substane n lumea vie. Proteinele ndeplinesc funcii extrem de variate, rolurile biologice fiind

diferite, n funcie de tipul proteinelor.

Din unirea unui numr mare de aminoacizi (de regul mai mare de 50) rezult lanurile

peptidice din constituia proteinelor. Aceste lanuri difer unele de altele sub raportul lungimii, naturii

i secvenei aminoacizilor constitutivi. De multe ori n constituia unei proteine nu intr un singur lan

polipeptidic, ci mai multe, iar acestea nu sunt desfurate n lungime ci rsucite sau cu catena dispus

in zigzag, n mai multe planuri. Pe de alt parte, datorit diverselor grupri funcionale libere din

radicalii aminoacizilor, lanurile se pot consolida prin stabilirea unor legturi intra- sau intercatenare.

innd seama de toate acestea, la moleculele proteice se ntlnete o organizare special, care const n

patru categorii de structuri sau niveluri de organizare: 1) Structura primar, determinat de

succesiunea aminoacizilor n catena polipeptidic i de poziia punilor disulfurice. 2) Structura

secundar descrie fragmente cu conformaie regulat din constituia lanului proteic i cum acesta se

pliaz n spaiu. 3) Structuta teriar descrie structura tridimensional a ntregii molecule proteice. 4)

Structura cuaternar descrie modul n care lanurile proteice individuale se aranjeaz n spaiu n

raport cu alte poteine.

ornitin

gramicidin S

22

Proteinele ndeplinesc cele mai diverse funcii n organism. Exist o reea proteic intracelular

cu rol structural care asigur forma i integritatea celular. Filamentele de actin i miozin formeaz

aparatul contractil al muchiului. Hemoglobina transport oxigen, n timp ce anticorpii ndeprteaz

agenii strini celulei. Enzimele catalizeaz practic toate reaciile din organism. Receptorii confer

celulei capacitatea de a sesiza diferite semnale hormonale sau produse de ali mesageri chimici. Un

scop primordial al medicinii moleculare l constituie identificarea acestor proteine a cror prezen,

absen sau deficien este asociat cu anumite stri fiziologice sau boli. Determinarea structurii

primare a proteinelor ofer datele necesare identificrii precum i informaia necesar identificrii i

clonrii genei care o codific.

3.1. Purificarea proteinelor

Pentru a putea determina secvena aminoacizilor dintr-o protein, este esenial ca aceasta s fie

n prealabil izolat n stare pur. O celul conine mii de proteine diferite, fiecare n cantiti diferite.

Izolarea unei anumite proteine n cantitate suficient pentru a putea fi analizat poate presupune mai

multe etape succesive de purificare. Metodele clasice se bazeaz pe diferenele de solubilitate a

proteinelor n funcie de pH (precipitare izoelectric), n funcie de polaritate (precipitare cu etanol sau

aceton) sau n funcie de trie ionic (precipitare cu sulfat de amoniu). Ulterior precipitrii

difereniale, proteinele se purific prin metode cromatografice i electroforetice.

La separrile cromatografice se realizeaz partiia moleculelor ntre dou faze: una mobil i

cealalt staionar. Pentru separarea moleculelor mici (aminoacizi, monozaharide) faza staionar poate

fi hrtie cromatografic (cromatografie pe hrtie) sau un strat subire de celuloz, silicagel sau oxid de

aluminiu (cromatografia n strat subire)

Cromatografia pe coloan. Cromatografia pe coloan a proteinelor utilizeaz ca faz

staionar o coloan de particule sferice de celuloz, acrilamid sau silicagel. De obicei, suprafaa

acestor sfere este mbrcat cu grupri funcionale, astfel nct s se permit interacii ntre faza

staionar i moleculele proteice, interacii bazate pe ncrcarea electric, hidrofobicitate sau legare de

ligand. Un amestec proteic se aplic pe coloan, dup care faza mobil este trecut (eluat) prin aceast

coloan, antrennd diferit moleculele proteice. Pe masur ce eluantul trece prin coloan, antreneaz

diferenial moleculele proteice.

23

Cromatografia de partiie. Separarea prin cromatografie pe coloan depinde de afinitatea

relativ a diferitelor proteine pentru o anumit faz staionar sau pentru o anumit faz mobil.

Asocierea dintre fiecare protein i faza staionar este slab i tranzitorie. Proteinele care

interacioneaz mai puternic cu faza staionar sunt reinute pe coloan mai mult i sunt eluate mai

trziu. Durata asocierii unei proteine cu faza staionar depinde att de natura fazei staionare ct i

mobile. Separarea optim a unei proteine dintr-un amestec depinde de compoziia acestor dou faze.

Cromatografia de excluziune sau gel filtrarea separ proteinele n funcie de raza Stokes,

adic diametrul sferei pe care molecula e protein o ocup n soluie. Raza Stokes depinde de masa

molecular a proteinei i de forma sa (o protein alungit ocup un volum mai mare dect o protein

sferic cu aceeai mas). Cromatografia de excluziune folosete ca faz staionar granule poroase.

Proteinele cu raz Stokes prea mare pentru a putea ptrunde prin porii granulelor (proteinele excluse)

ramn n faza mobil i sunt eluate primele, naintea proteinelor care pot penetra prin pori (proteinele

incluse). Astfel, proteinele pot fi separate n ordinea razelor lor Stokes.

Figura 2. Componentele unui aparat cromatografic.

R: rezervorul fazei lichide (furnizat gravitaional sau cu ajutorul unei pompe). C: coloana care

conine faza staionar. F: colectorul de fracii care culege porii de eluat n eprubete separate.

R

C

F

24

Cromatografia de absorbie. n cromatografia de absorbie, amestecul proteic este aplicat pe

coloan n condiiile n care proteina de interes se asociaz strns cu faza staionar. Moleculele

neaderente sunt eluate primele i se arunc, dup care proteinele sunt eliberate succesiv prin ruperea

legturilor care stabilizeaz complexul protein-faz staionar, de cele mai multe ori folosind un eluent

cu gradient cresctor de concentraii de anumite sruri. Compoziia fazei mobile este schimbat gradat

astfel nct moleculele s fie eliberate n ordinea afinitii lor pentru faza staionar.

Cromatografia cu schimbtori de ioni. n cromatografia cu schimbtori de ioni, proteinele

interacioneaz cu faza staionar n funcie de ncrcarea lor electric. Proteinele care au o incrctur

pozitiv la un anumit pH vor adera la faza staionar ncrcat negativ cu grupri funcionale de tip

carboxilat sau sulfat (schimbtori cationici). Invers, proteinele care au o incrctur negativ la un

anumit pH vor adera la faza staionar ncrcat poztiv cu grupri funcionale de tip amine teriare sau

cuaternare (schimbtori anionici). Proteinele, care sunt poli-ioni, concureaz impotriva ionilor mono-

sau divaleni n legarea de suportul staionar schimbtor de ioni. De exemplu, proteinele se leag de

DEAE (dietilaminoetil)-celuloz prin nlocuirea contraionilor (de obicei Cl- sau AcO-) care

neutralizeaz amina protonat. Proteinele legate sunt apoi ndeprtate selectiv ridicnd gradat

concentraia de ioni din faza mobil. Proteinele sunt eluate n ordine invers forei de interacie cu faza

staionar. Deoarece sarcina net a unei proteine depinde de pH, eluarea secvenial a proteinelor se

poate face i prin modificarea pH-ului n faza mobil. Pentru a fi purificat, o protein poate suferi mai

multe runde de ion-cromatografie la pH-uri diferite, astfel nct proteine care de exemplu sunt co-eluate

la un anumit pH, pot fi separate folosind ulterior alt pH.

Cromatografia prin interacii hidrofobe. Acest tip de cromatografie separ proteine pe baza

tendinei lor de a se asocia cu o faz staionar acoperit cu grupri hidrofobe (fenil-Sepharose, octil-

Sepharose). Proteinele cu fragmente hidrofobe expuse la suprafa ader la faza staionar prin

interacii hidrofobe, care sunt mrite prin folosirea unei faze mobile cu trie ionic mare. Proteinele

neaderente sunt eluate primele, dup care polaritatea fazei mobile este sczut gradat prin scderea

B A

Figura 3. Cromatografia de excluziune. A.Un amestec de

molecule mari (ptarte) i mici (cercuri) se aplic pe o coloan de gel filtrare. B. Dup intrarea n coloan, moleculele mici ptrund n porii fazei staionare, n timp ce moleculele mai mari sunt excluse. C. Pe msur ce faza mobil nainteaz prin coloan moleculele mari curg mpreun cu ea, n timp ce moleculele mici rmn din ce

n ce mai n urm.

C

25

concentraiei ionice. Dac interaciile dintre protein i faza staionar sunt prea puternice, se pot

aduga n faza mobil etanol sau glicerol pentru a micora polaritatea fazei mobile i slbi interaciile

hidrofobe.

Cromatografia de afinitate. Cromatografia de afinitate se folosete de selectivitatea pe care

majoritatea proteinelor o manifest fa de anumii liganzi. De exemplu, enzimele pot fi purificate

utiliznd o faz staionar de care sunt legate substratele, produii de reacie, coenzimele sau inhibitorii

enzimelor respective. Teoretic, numai proteinele care interacioneaz cu ligandul imobilizat vor adera

la faza staionar. Proteinele aderente sunt ulterior eluate fie cu o soluie de ligand sau, mai puin

selectiv, prin ruperea legturilor protein-ligand cu uree, clorhidrat de guanidin, soluii tampon cu pH

slab acid sau soluii concentrate de ioni. Printre cele mai performante faze staionare sunt cele utilizate

pentru purificarea proteinelor recombinante (modificate genetic), cum ar fi faze staionare cu ioni de

Ni2+

ce leag proteinele cu coad polihistidinic, sau faze staionare cu glutation care leag proteinele

recombinante legate de un fragment de glutation-S-transferaz.

Peptidele pot fi purificate prin HPLC. Fazele staionare utilizate n coloanele cromatografice

clasice sunt materiale poroase a cror compresibilitate mare limiteaz scurgerea fazei mobile.

Cromatografia n faz lichid la presiune ridicat (High-Pressure Liquid Chromatography, HPLC)

utilizeaz granule necompresibile de silicagel sau alumin ca faz staionar i presiune de pn la

cteva mii de psi. Umplutura necompresibil a coloanei permite att viteze mari de eluie ct i

rezoluie crescut. HPLC poate separa amestecuri complexe de lipide i peptide a cror proprieti

difer doar puin. Pentru separarea peptidelor, se utilizeaz HPLC cu faz inversat (reversed-phase

HPLC) n care faza staionar este hidrofob (oligomeri alifatici cu 3-18 atomi de carbon). Amestecul

peptidic este eluat cu un gradient apos al unui solvent organic miscibil cu apa (acetonitril, metanol).

Puritatea unei proteine se determin prin electroforez. Electroforeza separ molecule

ncrcate electric n funcie de viteza cu care acestea migreaz ntr-un cmp electric aplicat. Cea mai

utilizat metod pentru determinarea puritii unei proteine este SDS-PAGE, sau cromatografia n gel

de poliacril amid n prezena dodecilsulfatului de sodiu (SDS). (PAGE = PolyAcrylamide Gel

Electrophoresis). Pentru SDS-PAGE, acrilamida este nti co-polimerizat cu o cantitate mic de N,N'-

metilen bis-acrilamid, formnd o reea poroas prin care vor migra moleculele supuse electroforezi.

SDS denatureaz proteina i se leag de ea ntr-un raport de o molecul SDS la dou legturi peptidice.

Numrul mare de molecule SDS ataate face ca molecula proteic s capete o ncrctur negativ,

astfel nct proteinele vor migra prin gelul electroforetic n funcie numai de masa lor molecular.

Proteinele individuale migate n gel pot fi vizualizate cu anumii colorani, cum ar fi Coomasie blue.

26

3.2. Determinarea structurii primare a proteinelor

Dup purificarea unei proteine, urmtorul pas este reducerea legturilor disulfidice eventual

prezente, de obicei cu 2-mercaptoetanol, urmat de o reacie cu acid iodacetic, care impiedic

reformarea punilor disulfidice.

NHCH

O

CH2

S

S

CH2

NHCH

O

NHCH

O

CH2

SH

NHCH

O

SH

CH2

SCH2CH

2OH

SCH2CH

2OH

NHCH

O

CH2

SCH2COOH

NHCH

O

SCH2COOH

CH2

C

C

C

C

+

ICH2COOH

C

C

+ 2 HI

2 HSCH2CH2OH

Urmtorul pas const n determinarea felului i numrului de aminoacizi componeni. Pentru aceasta, o

prob de protein se hidrolizeaz:

proteina aminoacizi6 N HCl

100oC

24 hr

Acest tratament distruge toate legturile amidice, inclusiv cele din Asn i Gln. Numrul de Asn i Gln

se determin prin alte metode. Hidroliza acid distruge nucleul indolil din Trp, aa c pentru

determinarea Trp se folosete separat hidroliza n mediu bazic. Amestecul de aminoacizi obinut prin

hidroliz este trecut printr-un analizor de aminoacizi care determin numrul i tipul de aminoacizi.

Identificarea aminoacidului N-terminal

Exist cteva metode de determinare a aminoacidului N-terminal. Metoda Sanger utilizeaz

proprietatea gruprii NH2 de a reaciona cu 2,4-dinitrofluorbenzen dnd derivai 2,4-dinitrofenil

galbeni.

27

+ H2NR..

NO2

FO2N

NO2

O2N

F

NH2R

.. +-

NO2

NHRO2N

- HF

Reactantul Sanger reacioneaz uor cu aminoacidul N-terminal al unei proteine, transformnd

gruparea amino n grupare arilamino. Dup hidroliz, aminoacidul N-terminal rmne legat de gruparea

2,4-dinitrofenil putnd fi uor separat de ceilali aminoacizi i identificat. Principalul dezavantaj al

acestei metode este ca nu poate fi aplicat secvenial ca metoda Edman.

NO2

FO2N

R

proteina

O

NO2

O2N

R

proteina

O NO2

O2N

R

O

+ H2NCHC

HNCHCH3O

+

HNCHCOH + aminoacizi

Metoda Edman. Fenilizotiocianatul (PITC) sau reactivul Edman reacioneaz selectiv cu

aminoacidul N-terminal, iar derivatul tiazolinonic rezultat poate fi clivat n condiii acide blnde.

Derivatul tiazolinonic este extras cu un solvent organic i n prezena acidului trece intr-un derivat de

feniltiohidantoin (PTH) mai stabil, genernd un nou capt N-terminal. Se pot face astfel mai multe

serii succesive de degradri Edman pe aceei prob de protein. Din pcate nu se poate realiza

secvenializarea complet a unei proteine, deoarece se acumuleaz produi secundari care denatureaz

rezultatele. Secvenializarea Edman a fost automatizat, utilizndu-se o matrice solid pentru

imobilizarea peptidei i HPLC pentru a identifica derivaii PTH. Secveniatoarele moderne pot efectua

pna la 50 degradrii succesive, pe o prob de civa picomoli.

28

N C S

f enil izotiocianat

(PITC)

(reactiv Edman)

H2NCHC NHCHC NHCHC

O O O

R R' R"

..

N C

S

HNCHC NHCHC NHCHC

O O O

R R' R"

..

HF

N

S

N

O

R+

NHCHC NHCHC

O O

R' R"

H F

.. ....

HN

HN S

R O

+

H3NCHC NHCHC

O O

R' R"

++

deriv at tiazolinonic

peptida f ara acidul N-terminal original

NH N

S

R O

PTH-aminoacid

Determinarea aminoacidului C-terminal. Aminoacidul C-terminal se identific pin hidroliza

cu o enzim numit carboxipeptidaz, care catalizeaz specific hidroliza aminoacidului C-terminal.

Carboxipeptidazele sunt exopeptidaze (enzime care catalizeaz hidroliza unei legturi peptidice aflate

la marginea lanului peptidic).

29

NH

NH

NH

COO

R"

R'

R

O

O

-carboxipeptidaza N

H

NH

COO

R"

R'O

H3N COO

R

--

+

+

Pe msur ce primul aminoacid este ndeprtat, enzima atac urmtorul aminoacid, pn cnd ntreaga

protein este hidrolizat. Prin determinarea vitezei de apariie a diverilor aminoacizi n hidrolizat se

pot identifica astfel primii 3-4 aminoacizi de la captul C-terminal.

Fragmentarea lanurilor proteice. Metoda Edman poate fi utilizat fr probleme pentru

secvenializarea primelor 20-30 resturi de aminoacizi, numai c moleculele proteice au minim 50

aminoacizi (foarte multe de ordinul sutelor). n consecin, majoritatea proteinelor necesit clivare

nainte de a putea fi secvenializate. Acest lucru se face prin hidroliz parial n mediu slab acid,

cnd numai anumite legturi peptidice sunt atacate. Fragmentele rezultate se separ, se purific (prin

reversed-phase HPLC) i se secvenializeaz. Secvena proteinei originale se poate deduce aliniind

secvenele fragmentelor i cautnd poriunile care coincid.

Proteinele pot fi fragmentate i cu endopetidaze (enzime care catalizeaz hidroliza unei legturi

peptidice aflate n interiorul lanului peptidic). Tripsina, chimotripsina, elastaza sunt endopeptidaze

care hidrolizeaz specific anumite legturi peptidice. De exemplu, tripsina catalizeaz scindarea

legturilor peptidice n care sunt implicate lizina sau arginina.

Peptida X

Peptida Z

Peptida Y

Poriunea C-terminal a peptidei X

Poriunea N-terminal a peptidei Y

Figura 3.4. Secvena de aminoacizi a peptidei Z, care coincide parial cu cea a peptidelor X i Y,

demonstreaz c peptidele X i Y se regsesc n proteina original n ordinea XY i nu YX.

30

+

+C NH

2

NH2

O

OO

O

NH

NH

NH

NH

NH

NH

R

R'O

O CH2

CH2

CH2

CH2

NH3

R"

CH2

CH2

CH2

NH

R"'

C- Ly s C-Arg

Principalii ageni de clivare specific a proteinelor sunt prezentai n Tabelul 3.4.

Tabelul 4. Specificitatea agenilor de clivare a proteinelor

Reactiv Specificitate

Reactivi chimici

Reactiv Sanger

Reactiv Edman

CNBr (bromcian)

Hidroxilamin Acid slab

Exopeptidaze*

Carboxipeptidaza A

Carboxipeptidaza B

Endopeptidaze

Tripsin* Chimotripsin* Elastas* Endopeptidaz Lys-C Endopeptidaz Arg-C Endopeptidaz Asn-N

nltur aminoacidul N-terminal nltur aminoacidul N-terminal Met-X

Asn-Glz

Asp-Pro

nltur aminoacidul C-terminal (nu i Arg sau Lys) nltur aminoacidul C-terminal (doar Arg i Lys)

Arg-X, Lys-X

aminoacid hidrofob (Phe, Tyr, Trp)-X

Gly-X, Ala-X

Lys-X

Arg-X

X-Asn

Glu-X, mai ales cnd X este hidrofob

*Clivarea nu are loc cnd prolina e implicat n legtur.

Mecanismul clivrii cu bromcian (BrCN) este prezentat mai jos:

31

NHCHCNHCH C NHCHC

O

R

O O

R'

CH2

CH2

S

CH3

.. ..

Br NC

NHCHCNHCH C NHCHC

O

R

O O

R'

CH2

CH2

S

CH3

NC + Br

+

+

..

.. -

NHCHCNHCH C NHCHC

O

R

O

R'

N+ CH3SC

O

+NHCHCNHCH C O

O

R

O

R'

O

NHCHC

H3O+

H3O+

NHCHCNHCH COH

O

R

OCH2

CH2

OH

Detectarea modificrilor covalente prin spectrometria de mas. Spectrometria de mas, care

face distincie ntre specii moleculare exclusiv pe baza masei lor, poate fi utilizat pentru a depista

modificrile posttranslaionale (care survin dup ce proteina a fost biosintetizat la nivel ribozomal) ale

aminoacizilor dintr-o protein. Astfel, pot fi detectate grupri hidroxi, fosfat, etc. fiecare grupare

contribuind cu un increment specific la masa aminoacidului modificat (Tabelul 3.5).

Tabelul 5. Creterea de mas produs de modificrile posttranslaionale

Modificare Creterea de mas (Da)

Fosforilare

Hidroxilare

Metilare

Acetilare

Miristilare

Palmitilare

Glicozilare

80

16

14

42

210

238

162

Spectrometrele de mas convenionale sunt utilizate pentru determinarea moleculelor cu mas

molecular pn la 1000 Da, dar exist i spectrometre speciale pentru analiza compuilor cu mase

32

moleculare mari. Iniial, analizarea polipeptidelor i proteinelor prin spectrometrie de mas a fost mult

ngreunat de dificultatea cu care aceti compui pot fi volatilizai. ntre timp, tehnici de felul MALDI

(Matrix Assisted Laser Desorption) i dispersie prin electropulverizare (electrospray dispersion) permit

ca pna i polipeptide mari (> 100 000 Da) s fie detectate cu o acuratee extraorinar ( 1 Da).

Utiliznd dispersia prin electropulverizare, peptidele scoase dintr-un cromatograf HPLC sunt imediat

introduse n spectrometrul de mas pentru analiz. Aici, peptidele sunt fragmentate prin bombardare cu

atomi de heliu, iar masele diverselor fragmente sunt nregistrate. Deoarece legrura peptidic este mult

mai labil dect legturile C-C, cele mai abundente fragmente vor diferi ntre ele cu uniti echivalente

de 1-2 aminoacizi. Deoarece cu excepia leucinei i izoleucinei masele individuale ale

aminoacizilor sunt unice, secvena unei polipeptide poate fi dedus din masele fragmentelor

componente.

Amestecurile complexe de peptide pot fi acum analizate fr o purificare anterioar utiliznd

echivalentul a dou spectrometre de mas legate n serie (spectrometria de mas n tandem).

Biologia molecular a revoluionat metodele de determinare a structurii primare a

proteinelor. Cunoaterea secvenei de ADN care codific o protein permite deducerea structurii

primare a proteinei respective. Pn n prezent, genomurile multor specii, inclusiv genomul uman, au

fost secvenializate complet, bazele de date fiind accesibile liber pe Internet. Algoritmuri computerizate

de cutare permit identificarea fragmentelor de ADN (ORF, open reading frame) care codific proteine

prezumptive. Invers, secvene scurte de aminoacizi pot fi utilizate pentru a identifica secvena de ADN

codificator.

n timp ce genomul uman a fost complet descifrat, proteomul (totalitatea seturilor de proteine

caracteristice unei specii, sintetizate de celule n diferite condiii) este departe de a fi neles, iar

bioinformatica este metoda care va avea un rol de baz n descifrarea sa.

33

3.3. Nivele Superioare de Organizare a Structurii Proteinelor

Proteinele catalizeaz reaciile metabolice, induc mobilitatea celular, alctuiesc frnghiile i cablurile ce confer integritate structural prului, oaselor, tendoanelor, dinilor. n natur, forma urmeaz funciei. Varietatea structural a proteinelor umane reflect deci diversitatea i sofisticarea funciilor lor biologice. Maturarea unei polipeptide nou-sintetizate ntr-o protein funcional presupune plierea lanului polipeptidic ntr-un aranjament spaial specific numit conformaie. n timpul maturrii, modificri postranslaionale pot avea loc cu adugarea unor grupri chimice noi sau cu ndeprtarea unui fragment peptidic cu rol tranzitoriu. Deficienele genetice sau nutriionale care afecteaz maturarea proteinelor pot avea efecte majore asupra strii de sntate. Exemple din prima categorie includ maladia Creutzfeldt-Jakob, maladia Alzheimer i encefalopatia spongiform bovin (boala vacii nebune). Scorbutul este o deficien nutriional

provocat de lipsa vitaminei C, care perturb maturarea anumitor proteine structurale (colagenul).

3.3.1. Clasificarea proteinelor. Oamenii de tiin au clasificat iniial proteinele pe baza unor

proprieti cum ar fi solubilitatea, forma sau prezena n structura lor a unor componente neproteice. De

exemplu, proteinele care pot fi extrase din celule utiliznd soluii cu pH-uri i trii ionice fiziologice

sunt proteine solubile, celelalte fiind considerate proteine insolubile.

n funcie de forma lor, pot fi proteine globulare i proteine fibrilare. Proteinele globulare au

o form aproximativ sferic sau ovoidal avnd raportul axial (raportul dintre cea mai mare

dimensiune i cea mai mic dimensiune) mai mic dect 3. Majoritatea enzimelor sunt globulare, cu un

volum intern mare care furnizeaz un spaiu amplu pentru a se putea forma caviti cu geometrii,

ncrcri electrice, hidrofilicitate sau hidrofobicitate specifice, necesare pentru a lega substratele

enzimatice i pentru a promova cataliza. Prin contrast, majoritatea proteinelor structurale adopt

conformaii alungite. Acestea sunt proteine fibrilare i au raportul axial 10 sau mai mare.

n funcie de produii rezultai la hidroliz, proteinele pot fi proteine simple sau

heteroproteine (holoproteine). La hidroliz acid, bazic sau enzimatic proteinele simple pun n

libertate numai -aminoacizi. Heteroproteinele au o compoziie complex fiind formate dintr-o parte

proteic (apoproteina) i o parte neproteic (componenta prostetic). Componenta prostetic poate fi

de natur chimic diferit (glucide, lipide, acizi nucleici, porfirine, metale). n cazul heteroproteinelor,

legarea gruprii prostetice de apoprotein se face prin legturi chimice covalente sau necovalente care

le confer stabilitate.

Lipoproteinele i glicoproteinele conin lipide i respectiv carbohidrai legai covalent.

Mioglobina, hemoglobina, citocromii conin ioni metalici strns asociai, fiind denumite

metaloproteine, etc. Odat cu dezvoltarea i aplicarea tehnicilor de determinare a structurii primare a

proteinelor au aprut scheme de clasificare mai precise, bazate pe similariti sau pe gradul de

34

omologie privind secvena sau structura. Cu toate acestea ns, muli termeni din vechea clasificare

rmn n continuare n uz.

Natura modular a sintezei i organizrii spaiale a proteinelor este materializat n conceptul de

nivele de structur: structura primar, care este determinat de succesiunea aminoacizilor n lanul

polipeptidic; structura secundar, care este dat de plierea unor fragmente polipeptidice scurte (3-30

resturi de aminoacizi) n uniti ordonate geometric; structura teriar, sau asamblarea

tridimensional a unitilor structurale secundare pentru a forma uniti funcionale mai mari cum ar fi

polipeptida matur i domeniile sale; structura cuaternar, dat de numrul i tipul de lanuri proteice

i aranjamentul lor spaial.

PROTEINE

HETEROPROTEINE

PROTEINE FIBRILARE

PROTEINE GLOBULARE

GREU

SOLUBILE

INSOLUBILE Actin Miozin

Fibrinogen

Albumine

Globuline

Histone

Protamine

Figura 4. Clasificarea proteinelor

Lipoproteine

Glicoproteine

Fosfoproteine

Nucloproteine

Metaloproteine

Cromoproteine

Colagen

Elastine

Keratine

Scleroproteine PROTEINE SIMPLE

35

3.3.2. Structura secundar a proteinelor

Datorit rigiditii legturii peptidice rotaia liber este permis numai n jurul a dou din cele

trei tipuri de legturi din scheletul polipeptidic: C-Ccarbonil i C-N.

C

N

C

C

N

C

C

N

O

H

R' H

O

H

H R"

O

H

Unghiul de rotaie n jurul legturii C-N este denumit phi (), iar unghiul de rotaie n jurul legturii

C-Ccarbonil este denumit psi (). Pentru orice aminoacid diferit de glicin, majoritatea combinaiilor -

sunt interzise din cauza mpiedicrilor sterice. Conformaiile care implic prolina sunt chiar mai

restricionate, din cauza absenei rotaiei libere n jurul legturii C-N.

Regiuni cu structur secundar ordonat apar atunci cnd o serie succesiv de aminoacizi

adopt unghiuri i similare. Exist dou categorii de structuri secundare, -helix i -pleated

sheet (planuri pliate). Segmente extinse de aminoacizi (de exemplu buclele) posed o gam variat

din aceste unghiuri.

3.3.2.1. Structura -helix

Scheletul polipeptidic dintr-un -helix este rsucit n mod egal n jurul fiecrui C cu un unghi

de aproximativ -57 i un unghi de aproximativ -47. O spir complet a helixului conine n

medie 3,6 resturi de aminoacizi, iar nalimea spirei este de 0,54 nm.

36

Gruprile R din fiecare rest de aminoacid inclus ntrpun -helix sunt ndreptate spre exterior.

Proteinele naturale conin numai -aminoacizi, motiv pentru care -helixul spre dreapta este

mai stabil dect cel spre stnga, i numai -helixuri orientate spre dreapta exist n natur. Diagramele

schematice convenionale ale proteinelor reprezint -helixurile prin cilindri sau panglici spiralate

(Fig. 5B). Stabilitatea -helixurilor deriv din legturile de hidrogen care se formeaz ntre atomii de

Figura 5. Structura -helix. A. Aranjarea catenei polipeptidice n jurul axei unui -

helix. B. Reprezentarea convenional a unui -helix

B

0,54

nm

0,15

nm

A

Figura 6. Vedere de sus i de-a lungul axei unui -helix. Gruprile R sunt orientate n afara helixului.

37

oxigen din carbonilul peptidic i atomul de hidrogen de la azotul peptidic care aparine aminoacidului

din poziia a patra. Capacitatea de a forma un numr maxim de legturi de hidrogen precum i

interaciile van der Waals din miezul acestei structuri compacte face ca -helixul s fie foarte stabil.

Deaorece resturile de prolin nu au hidrogen la atomul de azot peptidic i prin urmare nu pot forma

legturi de hidrogen, prolina nu poate fi inclus ntr-un -helix dect n prima spir. Cnd este

prezent n alt parte, prolina perturb -helixul. i glicina, din cauza dimensiunilor sale reduse

produce rupturi n -helix.

Multe -helixuri au grupri R predominant hidrofobe pe o parte a axei helixului i grupri R

predominant hidrofile pe cealalt parte. Aceste helixuri amfipatice sunt bine adapate pentru a forma

interfee ntre regiuni polare i regiuni nepolare, cum ar fi miezul intern al proteinei i nveliul su

apos. Grupuri de helixuri amfipatice pot forma canale cu pori care permit anumitor molecule polare s

treac prin interiorul hidrofob al membranelor celulare.

3.3.2.2. Structura -pleated sheet (planuri pliate). Al doilea tip de structur secundar

regulat ntlnit n structura proteinelor este structura -sheet. Resturile aminoacil dintr-o structur -

sheet sunt dispuse n zig-zag formnd un aranjament de tip foaie pliat, n care gruprile R ale

aminoacizilor adiaceni sunt orientate n direcii opuse. n contrast cu aranjamentul compact din -

helix, scheletul peptidic din -sheet este foarte extins. Ca i n cazul -helixului, structura -sheet i

Figura 7. Legturile de hidrogen dintre O i H stabilizeaz

structura polipeptidic ntr-o conformaie -helix.

38

datoreaz marea stabilitate legturilor de hidrogen care se formeaz ntre atomii de oxigen carbonilici i

atomii de hidrogen din legturile peptidice, doar c aceste legturi se formeaz ntre atomi aparinnd la

dou catene diferite.

Structurile -sheet care se afl n interacie pot fi aranjate paralel (segmentele polipeptidice

adiacente merg n aceeai direcie NC) sau antiparalel (segmentele polipeptidice adiacente merg n

direcii opuse, una NC, cealalt NC).

Figura 9. Reprezentarea unei catene polipeptidic cu structuri -sheet n orientarea antiparalel (A i B) i paralel (B i C).Gruprile R sunt omise pentru claritate.

N

C

B A

Figura 8. A. Aranjarea catenei polipeptidice ntr-o structur de tip

-pleated sheet. B. Reprezentarea convenional a unei structuri

-pleated sheet.

39

Ambele structuri permit un numr maxim de legturi de hidrogen ntre fragmentele catenare. Structura

-sheet nu este perfect plan, ci are o uoar rsucire spre dreapta. Mnunchiuri de segmente cu

structuri -sheet formeaz miezul multor proteine globulare. Schematic, structura -sheet este

reprezentat ca o sgeat orientat de la captul N-terminal spre captul C-terminal.

3.3.2.3. Bucle i cotituri. Aproximativ jumtate din resturile de aminoacizi care intr n

constituia unei proteine globulare se gsesc n structuri -helix i -sheet, restul aflndu-se n bucle

(loops), cotituri(turns) ndoituri (bends) i alte conformaii mai laxe. Cotiturile se refer la

segmente peptidice scurte care unesc dou uniti de structur secundar, de exemplu dou catene

adiacente cu structur -sheet. Cotiturile (-turns) implic patru aminoacizi, din care primul este

legat de al patrulea rest prin legturi de hidrogen, rezultnd o cotitur de 180. Prolina i glicina sunt

deseori prezente n cotiturile .

Buclele sunt segmente care conin mai muli aminoacizi dect numrul minim necesar pentru a

conecta dou uniti adiacente de structur secundar. Dei au conformaii neregulate, buclele au roluri

biologice importante. De exemplu, pentru multe enzime, buclele care unesc domeniile responsabile de

legarea substraturilor i a produilor de reacie conin aminoacizi care particip la cataliz. Laitmotivele

helix-bucl-helix (helix-loop-helix) reprezint locul de legare de ADN a unor proteine (factori care

activeaz sau inhib transcripia ADN n ARN). Motivele structurale de tipul helix-bucl-helix sunt

C

C

N

C

C

N

C

C

N

C

O H

OC O

H

H

H

H

CH3

H

H2C

H

CH2OH

H

COOH

Figura 10. O cotitur care leag dou segmente antiparalele cu structur -sheet. Linia punctat indic legtura de hidrogen dintre primul i al patrulea aminoacid din segmentul Ala-Gly-Asp-Ser.

40

intermediare ntre structura secundar i cea teriar, fiind uneori denumite structuri supersecundare.

Deoarece multe din bucle sunt orientate spre exteriorul moleculei proteice, ele alctuiesc situsuri uor

accesibile (epitopi) pentru a fi recunoscute i legate de ctre anticorpi.

Buclele nu au regularitate structural; ele totui exist preponderent n anumite conformaii

stabilizate prin legturi de hidrogen, puni electrostatice sau interacii hidrofobe cu alte regiuni ale

proteinei. Nu toate regiunile unei proteine sunt ns organizate n structuri ordonate.

Proteinele conin i zone dezorganizate, de cele mai multe ori aflate spre captul C-terminal,

caracterizat printr-o flexibilitate conformaional mare. De multe ori, aceste regiuni dezorganizate pot

adopta o conformaie organizat atunci cnd se leag de exemplu de un ligand. Aceast flexibilitate

conformaional confer acestor regiuni capacitatea de a aciona ca regiune reglatoare, care atunci cnd

leag un ligand duce la modificrea structurii i funciei proteinei.

3.3.3. Structura teriar i cuaternar a proteinelor

Structura primar i secundar nu pot explica n totalitate proprietile fizico-chimice i

biologice ale unei proteine. Termenul de structur teriar se refer la ntreaga conformaie

tridimensional a unei proteine. Ea indic n spaiul tridimensional modul n care fragmentele cu

structur secundar - -helixurile, -sheet, cotiturile, ndoiturile i buclele - se asambleaz pentru a

forma regiuni distincte, i cum aceste regiuni se raporteaz spaial una la alta. O regiune distinct este

un fragment din structura proteinei suficient pentru a executa o anumit funcie fizic sau chimic, cum

ar fi legarea unui substrat ori a unui ligand. Alte regiuni pot avea rolul de a lega o protein de o

membran sau de a interaciona cu o molecul care i moduleaz funcia. Unele proteine (triozofosfat

Figura 11. n catena unei proteine putem ntlni fragmente cu structuri secundare diferite.

-helix

-sheet

cotitur

bucl

41

izomeraza sau mioglobina) au o singur regiune funcional. Altele, cum ar fi protein kinazele au dou

regiuni distincte. Protein kinazele catalizeaz transferul unei grupri fosfat de pe molecula de ATP la

gruparea OH a unui rest de aminoacid hidroxilat dintr-o protein sau peptid. Fragmentul N-terminal,

care este bogat n structuri -sheet leag ATP-ul, n timp ce regiunea C-terminal care este bogat n

zone de -helix, se leag de substratul proteic. Gruprile care catalizeaz transferul gruprii fosfat se

afl localizate n bucla care face legtura dintre cele dou regiuni.

n unele cazuri, proteinele sunt ansambluri de mai multe lanuri polipeptidice, numite

protomeri. Structura cuaternar definete numrul i felul protomerilor, precum i relaia spaial

dintre ei. Interaciunile prin care se realizeaz agregatul molecular i care stabilizeaz structura

cuaternar se realizeaz de regul prin fore necovalente: legturi electrostatice, de hidrogen, hidrofobe

si van der Waals.

Proteinele monomere sunt alctuite dintr-un singur lan polipeptidic i nu au structur cuaternar.

Proteinele dimere sunt alctuite din dou lanuri polipeptidice.

Figura 12. Structura teriar este modul n care structurile secundare se organizeaz pentru a forma o protein sau un protomer al unei proteine complexe (oligomere).

-sheet

-helix

Figura 13. Numai proteinele cu dou sau mai multe lanuri polipepdidice au structur cuaternar

42

Homodimerii conin dou copii ale aceluiai lan polipeptidic, n timp ce heterodimerii conin

dou lanuri polipeptidice diferite. Literele greceti , , sunt folosite pentru a face distincie ntre

protomeri, iar indicii arat numrul din fiecare. De exemplu 4 desemneaz o protein

homotetrameric, iar 22o protein pentameric cu trei tipuri de protomeri, doi , doi i unul

Datorit faptului c proteinele, chiar cele mici, conin mii de atomi, reprezentarea unei proteine

cu indicarea fiecrui atom este deosebit de dificil. De regul se utilizeaz diagrame simplificate care

s prezinte caracteristicile principale ale proteinei.

3.3.3.1. Factorii care stabilizeaz structura teriar i cuaternar

Structura teriar i cuaternar a proteinelor este stabilizat prin interacii necovalente. Dintre

acestea, interaciile hidrofobe orienteaz majoritatea catenelor laterale ale aminoacizilor nepolari spre

interiorul moleculei de protein, punndu-i la adpost de contactul cu apa. Alte interacii importante

sunt legturile de hidrogen sau punile electrostatice dintre ionii carboxilat ai resturilor glutamil i

aspartil i gruprile ncrcate pozitiv ale resturilor lizil, arginil i histidil. Dei mai slabe dect

legturile covalente, numrul mare al acestor interacii confer un grad mare de stabilitate

conformaiilor funcionale ale proteinelor.

HIV-proteaz

insulin

Figura 14. Reprezentarea structurii cuaternare a ununi homodimer (HIV-proteaz ) i a unui heterodimer (insulin).

43

Unele proteine conin legturi disulfurice (-S-S-) care leag gruprile tio- a dou resturi

cisteinil. Formarea legturilor disulfurice presupune oxidarea gruprilor tiolice i necesit oxigen.

Legturile disulfurice intracatenare confer un plus de stabilitate conformaiei proteinei, pe cnd

legturile disulfurice intercatenare stabilizeaz structura cuaternar a anumitor proteine oligomere.

3.3.3.2. Denaturarea proteinelor

Denaturarea reprezint distrugerea organizrii structurii teriare i cuaternare a unei proteine.

Acest lucru poate fi realizat de orice factor care rupe legturile implicate n meninerea structurii

tridimensionale a unei proteine. Legturile care determin structura teriar sau cuaternar a unei

proteine sunt n general legturi slabe, i din acest motiv proteinele pot fi uor denaturate. Conformaia

total dezorganizat a unei proteine complet denaturate se numete conformaie ntmpltoare

(random coil).

Denaturarea proteinelor poate fi reversibil sau ireversibil. Agenii care provoac denaturarea

proteinelor sunt de natur fizic (temperaturi de peste 60C, agitare, raze X, radiaii ultraviolete,

ultrasunete) i chimic (acizi, baze, sruri ale metalelor grele, solveni organici, ageni tensioactivi).

HN

OHCH

2

O C

S S CH2

CH2

(CH2)4NH

3

+OCCH

2

O

-

S

CH2

S

H2C

CH2CNH

O

HOCH

2

H

CHCH2CH

3

CH3

CH

CH3

CH3

OC

Legturi disulfidice

Interacii hidrofobe

Atracii electrostatice

Legturi de hidrogen ntre grupri peptidice

Legturi de hidrogen ntre grupri funcionale

Figura 15. Tipuri de interacii care stabilizeaz structura teriar a proteinelor

H3N+

-Helix

Legturi de hidrogen

Legturi de hidrogen

Legturi de hidrogen ntre o grupri funcionale i legturi peptidice

Structur- sheet COO-

44

Consecinele denaturrii sunt: pierderea activitii biologice, diminuarea solubilitii, creterea

numrului de grupri SH libere, pierderea capacitii de a se combina cu apa, modificarea vscozitii

i a presiunii osmotice, creterea susceptibilitii la hidroliza enzimatic.

3.3.3.3. Determinarea experimental a structurii tridimensionale a proteinelor

Cristalografia cu raze X. De la determinarea structurii mioglobinei n 1960, structura a mii de

proteine a fost ntre timp determinat prin cristalografie cu raze X. Etapa cheie n acest proces l

constituie precipitarea proteinei n condiiile n care ea formeaz cristale regulate care difract razele X.

Acest lucru se poate realiza prin tratarea unor picturi fine de soluie proteic cu diverse combinaii de

pH-uri i ageni de precipitare (sruri, polietilenglicol). O structur tridimensional detaliat poate fi

dedus combinnd datele structurii primare cu modul de difracie a unui mnunchi monocromatic de

raze X. Apariia unor algoritmuri i programe computerizate au fcut ca interpretarea spectrelor de

difracie s fie din ce n ce mai simpl; inconvenientul major rmne greutatea de a obine proteina n

stare cristalin. Exist o serie de dovezi, printre care pstrarea proprietilor catalitice ale enzimelor,

care sugereaz ca structurile determinate prin cristalografie reflect structura proteinelor din soluii. O

metod complementar cristalografiei cu raze X este spectroscopia de rezonana magnetic nuclear

(RMN).

Modelarea molecular. Un instrument ajuttor la determinrile empirice de structur

tridimensional a proteinelor este reprezentat de utilizarea tehnologiilor de calcul n modelarea

molecular. n prezent exist dou tipuri de tehnici de modelare. n prima, structura tridimensional a

unei proteine este folosit ca punct de pornire n construirea unui model de structur tridimensional

posibil pentru o protein omoloag. n a doua, sunt utilizate programele soft pentru a manipula un

model static furnizat de cristalografie. n astfel de programe se simuleaz schimbrile conformaionale

ce ar avea loc n diferite condiii (schimbri de pH, temperatur, trie ionic, ligand). n paralel,

oamenii de tiin studiaz i bazele de date ce conin structuri cunoscute, n ncercarea de a concepe un

program soft care s prevad conformaia tridimensionl a unei proteine direct din structura sa primar.

3.3.3.4. Boli neurologice cauzate de modificri n conformaia proteinelor Prionii. Encefalopatiile spongiforme transmisibile sau bolile prionilor sunt maladii neurodegenerative fatale

caracterizate prin modificri spongiforme i pierderi ale funciilor neuronilor cauzate de depunerea unor agregate proteice insolubile (prioni) n celulele nervoase. Acest tip de maladii include boala Creutzfeldt-Jakob la oameni, cpierea la oi i encefalopatia spongiform bovin la vaci (boala vacii nebune). Sursa i mecanismul transmiterii prionilor au fost mult vreme necunoscute, mai ales c nu s-a putut identifica nici o gen viral sau bacterian care sa i codifice. n momentul de fa se crede c maladiile prionice sunt de fapt maladii ale conformaiilor proteice transmise pe calea alterrii conformaiei, de unde i proprietile fizice neobinuite ale proteinelor endogene ale organismului bolnav. Proteina PrP, protein uman nrudit cu prionii, este o glicoprotein codificat de o gen aflat pe cromozomul 20. n mod normal, este monomeric i

bogat n zone -helix. PrPc este un tip de proteine prionice patologice ce pot servi ca inductori pentru modificrile

45

conformaionale ale PrP normale n PrPsc. PrPsc este bogat n structuri -sheet cu multe catene hidrofobe provenite de la aminoacizii nepolari ndreptate spre faza apoas, condiii n care mai multe moclecule de PrPsc se asociaz puternic, formnd agregate rezistente la aciunea proteazelor. Deoare un prion patologic sau o molecu nrudit poate induce modificri conformaionale n lan, bolile prionice se pot transmite prin intermediul strict al proteinei, fr implicarea moleculelor de ADN sau ARN.

Maladia Alzheimer. Caracteristica principal a maladiei Alzheimer o constituie replierea sau plierea incorect a

unei proteine cerebrale, numit -amiloid. n timp ce cauzele maladiei ramn necunoscute, este clar c plcile senile

caracteristice i fasciculele neurofibrilare conin agregate de -amiloid, o polipeptid de 4,3 kDa rezultat din clivarea de ctre o proteaz a unei proteine mai mari (proteina precursoare de amiloid). La pacienii cu maladie Alzheimer se observ o

cretere semnificativ a nivelului de -amiloid, aceast protein suferind i modificri conformaionale de la forma bogat

n -helixuri la cea bogat n structuri -sheet, devenind astfel capabile de autoagregare. Se pare ca mediatorul acestei transformri conformaionale este apolipoproteina E.

3.3.3.5. Structura colagenului

Maturare proteinelor de multe ori implic ruperea i/sau formarea de legturi covalente, un

proces numit modificare posttranslaional. Multe proteine sunt biosintetizate iniial ca precursori

mai mari numii proproteine. De multe ori segmentele proteice care dispar ulterior servesc iniial

pentru orientarea proteinelor ctre anumite compartimente celulare sau faciliteaz transportul prin

membranele celulare. n alte cazuri acestea au rolul de a inhiba activitatea potenial duntoare a unei

proteine; astfel, proteaze de tipul tripsinei si chimotripsinei rmn inactive pn cnd aceste proteine

ajung la destinaia final, moment n care fragmentele protectoare sunt ndeprtate prin proteoliz

selectiv. Alte modificri chimice pot avea loc adugnd noi funcionaliti proteinei. Maturarea

colagenului se face prin ambele aceste procese.

Colagenul este o protein fibroas. Colagenul este cea mai abundent protein fibroas,

reprezentnd mai mult de 25% din masa proteic uman. Alte proteine fibroase sunt keratina i

miozina. Aceste proteine reprezint baza structural a celulelor (citoscheletul) i a esuturilor.

Rezistena i elasticitatea pielii este dat de o reea de fibre de colagen i keratin, n timp ce oasele i

dinii au la baz o reea de colagen asemntoare armturilor de oel din betonul armat. Colagenul intr

i n alctuirea esuturilor conjunctive (tendoane, cartilagii, ligamente). Marele grad de rezisten

elastic a colagenului necesar pentru a duce la ndeplinire aceste roluri structurale deriv din

secvenele repetate de aminoacizi i din structura secundar foarte regulat.

Moleculele de colagen formeaz un triplu helix. Tropocolagenul este alctuit din trei fibre,

fiecare avnd cca 1000 resturi de aminoacizi, mpletite ntr-o conformaie unic, numit triplu helix. O

fibr matur de colagen are aspectul unui baston lung, cu un raport axial de aproximativ 200. Este

alctuit dintr-o mpletitur de trei catene polipeptidice rsucite spre stnga. Aceast mpletitur se

rsucete spre dreapta pentru a forma triplul helix al colagenului. Sensurile opuse de rsucire al acestui

super helix i al componentelor sale fac ca fibra de colagen s fie deosebit de rezistent (acelai

principiu se aplic la cablurile de susinere a podurilor suspendate).

46

Triplul helix al colagenului are 3,3 resturi de aminoacizi pe spir. Gruprile R din fiecare caten sunt

aranjate att de compact, nct pentru a putea ncpea, fiecare al treilea aminoacid trebuie s fie o

glicin. Colagenul este de asemenea bogat n prolin i hidroxiprolin, existnd secvena repetitiv

Gly-X-Y, n care Y este de obicei prolin sau hidroxiprolin. Triplul helix este stabilizat prin legturi

de hidrogen care se formeaz intercatenar. Gruprile OH ale hidroxiprolinei de asemenea particip la

formarea legturilor de hidrogen intercatenare. Un plus de stabilitate este conferit de legturi covalente

ncruciate (att intra ct i intercatenare) ntre resturi de lizin modificate chimic posttranslaional.

Colagenul este sintetizat sub forma unui precursor mare. Colagenul este sintetizar iniial

sub forma unei polipeptide numit procolagen, n care numeroase resturi prolil si lizil sunt hidroxilate

de prolilhidrolaz i lizilhidrolaz, enzime care necesit acid ascorbic (vitamina C) pentru o bun

funcionare. Resturile hidroxiprolil i hidroxilizil nou formate confer un plus de stabilitate prin

formarea unor noi legturi de hidrogen. n plus, glucozil- i galactozil transferaze ataeaz resturi de

glucoz sau galactoz la gruprile hidroxi de la anumite resturi de hidroxilizin. Ulterior acestor

transformri, partea central a procolagenului se asociaz cu alte molecule formnd triplul helix. Acest

proces este nsoit de ndeprtarea prin proteoliz selectiv a prii globulare amino-terminale precum i

a extensiilor carboxi-terminale. Anumite resuri lizil sunt modificate de lizil oxidaz, o cupru-protein

care transform gruparea amino n grupare aldehidic. Aceste grupri aldehidice se condenseaz cu

gruprile amino ale lizinelor nemodificate, formnd baze Schiff (en-imine) care sunt ulterior reduse,

cu formare de legturi simple C-N. Aceste legturi covalente leag ncruciat catenele polipeptidice,

conferind fibrei de colagen o extraordinare rezisten i rigiditate.

3.3.3.6. Anumite insuficiene genetice i nutriionale perturb maturarea colagenului. Cel mai bine cunoscut defect n biosinteza colagenului este scorbutul, care este provocat de lipsa vitaminei C din

alimentaie. Aceast caren perturb buna funcionare a prolil- i lizil- hidrolazelor. Rezult un deficit n numrul resturilor de hidroxiprolin i hidroilizin care submineaz stabilitatea conformaional a fibrelor de colagen, ducnd la sngerarea

Triplu helix de colagen -Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-Gly-X-Y-

Structura primar

Figura 16. Structura colagenului.

47

gingiilor, umflarea ncheieturilor, nevindecarea rnilor, i n cele din urm la moarte. Sindromul Menkes, caracterizat prin ntrzierea creterii, reflect o deficien de cupru n alimentaie, care duce la o proast funcionare a liziloxidazei, enzim care catalizeaz o reacie cheie n procesul de formare a legturilor ncruciate ce contribuie la rezistena fibrei de colagen.

Deficiene genetice n biosinteza colagenului includ cteva forme de osteogenez imperfect caracterizate prin fragilitatea oaselor. n sindromul Ehlers-Dahlos, un grup de boli ale esutului conjunctiv, apar defecte n genele care codific procolagen-N-peptidaza sau lizilhidrolaza, defecte care provoac anormaliti ale pielii i fragilizri ale ncheieturilor.