5/27/2018 An Another Carr and Prince

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CXXXVI. THE DETERMINATION OF V ITAMIN AWITH THE PHOTOELECTRIC COLORIMETER

BY WILLIAM JOHN DANND e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y a n d P h a r m a c o l o g y , D u k e U n i v e r s i t y S c h o o l o fM e d i c i n e , D u r h a m , N o r t h C a r o l i n a

AND KENNETH AUSTIN EVELYNM c G i l l U n i v e r s i t y C l i n i c , R o y a l V i c t o r i a H o s p i t a l , M o n t r e a l , C a n a d a

R e c e i v e d 2 1 M a r c h 1 9 3 8 )T H I s c o m m u n i c a t i o n d e s c r i b e s t h e a p p l i c a t i o n o f t h e E v e l y n p h o t o e l e c t r i cc o l o r i m e t e r [ E v e l y n , 1 9 3 6 ] t o t h e q u a n t i t a t i v e e s t i m a t i o n o f v i t a m i n A b y t h ea n t i m o n y t r i c h l o r i d e r e a c t i o n o f C a r r & P r i c e [ 1 9 2 6 ] . I t w a s t h o u g h t t h a t t h eC a r r - P r i c e t e s t w i t h i t s a t t e n d a n t d i f f i c u l t i e s d u e c h i e f l y t o t h e i n s t a b i l i t y o f t h ec o l o u r t o b e m e a s u r e d f o r d a t a on t h i s p o i n t , s e e b e l o w ) m i g h t b e p e r f o r m e dm o r e a c c u r a t e l y w i t h t h e p h o t o e l e c t r i c c o l o r i m e t e r o n a c c o u n t o f t h e r a p i d i t yw i t h w h i c h r e a d i n g s c a n b e t a k e n on t h i s i n s t r u m e n t . T h e r e s u l t s d e s c r i b e db e l o w s h o w t h a t t h e C a r r - P r i c e t e s t c a n b e p e r f o r m e d w i t h g r e a t p r e c i s i o n b yt h i s m e t h o d .A p a r t f r o m t h e b i o l o g i c a l a s s a y t h e r e a r e two m e t h o d s , o n e p h y s i c a l a n d t h eo t h e r c h e m i c a l , w h i c h h a v e b e e n w i d e l y u s e d f o r t h e e s t i m a t i o n o f v i t a m i n A .T h e p h y s i c a l m e t h o d i s b a s e d o n t h e d i s c o v e r y o f T a k a h a s h i e t a l . [ 1 9 2 5 ] t h a tv i t a m i n A c o n c e n t r a t e s s h o w s e l e c t i v e a b s o r p t i o n i n t h e u l t r a v i o l e t s p e c t r a lr e g i o n w i t h a maximum a t 3 2 8 m , . T h i s m e t h o d was i n t r o d u c e d b y Drummond& M o r t o n [ 1 9 2 9 ] , a n d i t s s t a t u s a s a f a i r l y s a t i s f a c t o r y m e t h o d i s b a s e d o nc r i t i c a l e x a m i n a t i o n b y C o w a r d e t a l . [ 1 9 3 1 ] , M o r g a n e t a l . [ 1 9 3 5 ] , t h e M e d i c a lR e s e a r c h C o u n c i l [ 1 9 3 5 ] a n d Hume [ 1 9 3 7 ] .I n t h e c h e m i c a l m e t h o d o f C a r r & P r i c e [ 1 9 2 6 ] , t h e v i t a m i n A i s made t or e a c t w i t h a n t i m o n y t r i c h l o r i d e i n c h l o r o f o r m s o l u t i o n , t h e amount o f t h er e s u l t a n t b l u e p i g m e n t b e i n g d e t e r m i n e d b y e x a m i n a t i o n o f t h e s o l u t i o n i n at i n t o m e t e r o r v i s u a l s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h e u s e o f t h e t i n t o m e t e r i s a t t e n d e db y c o n s i d e r a b l e . e r r o r o w i n g t o t h e u n a v o i d a b l e d i f f i c u l t i e s i n c o l o u r m a t c h i n gb y e y e , a n d a l s o t o t h e p e c u l i a r p h y s i c a l b a s i s o f t i n t o m e t r y w h i c h i s r e s p o n s i b l ef o r t h e n o n l i n e a r r e l a t i o n b e t w e e n t h e t i n t o m e t e r r e a d i n g a n d t h e amount o fv i t a m i n A [ N o t e v a r p & W e e d o n , 1 9 3 6 ] . S p e c t r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n ts h o w s , h o w e v e r , t h a t t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f t h e b l u e s o l u t i o n a t 620mui s a l i n e a r f u n c t i o n o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f v i t a m i n A i n a n y g i v e n m a t e r i a l[ N o t e v a r p & W e e d o n , 1 9 3 6 ] . T h a t t h e c h r o m o g e n w h i c h r e a c t s w i t h a n t i m o n yt r i c h l o r i d e t o p r o d u c e t h e b l u e c o l o u r i s v i t a m i n A i t s e l f i s i n d i c a t e d b y t h eo b s e r v a t i o n s o f H o l m e s & C o r b e t [ 1 9 3 7 ] who f o u n d t h a t a c r y s t a l l i n e p r e p a r a t i o no f v e r y h i g h b i o l o g i c a l p o t e n c y g a v e t h e c h a r a c t e r i s t i c r e a c t i o n . I n s p i t e o f t h ec o n s i d e r a b l e i n a c c u r a c i e s i n h e r e n t i n m e t h o d s a v a i l a b l e f o r m e a s u r i n g t h ei n t e n s i t y o f t h e b l u e c o l o u r up t o t h e p r e s e n t , i t h a s b e e n s h o w n t h a t t h e r e s u l t so f t h i s c h e m i c a l m e t h o d a r e a l m o s t a s c l o s e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e b i o l o g i c a l a s s a ya s a r e t h e r e s u l t s o f t h e p h y s i c a l m e t h o d o f e s t i m a t i o n [ M o r g a n e t a l . 1 9 3 5 ;c f . T a b l e V I , p . 1 6 5 4 ] . T h u s t h e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l m e t h o d s h a v e e q u a l l ys o u n d f o u n d a t i o n s a s s h o w n b y e a r l i e r o b s e r v a t i o n s .

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DETERMINATION OF VITAMIN AI n t h e p a s t t h e i n v e s t i g a t o r h a s t h e r e f o r e h a d t h e c h o i c e o f u s i n g t h e i n -a c c u r a t e t i n t o m e t r i c c h e m i c a l m e t h o d r e q u i r i n g l i t t l e c a p i t a l o u t l a y , o r t h e m o r ea c c u r a t e s p e c t r o p h o t o m e t r i c c h e m i c a l o r p h y s i c a l m e t h o d s r e q u i r i n g e x p e n s i v ea p p a r a t u s ( a n d f o r t h e p h y s i c a l m e t h o d c o n s u m i n g much t i m e i n t h e e x p o s u r e ,

d e v e l o p m e n t a n d r e a d i n g o f t h e p h o t o g r a p h i c p l a t e s ) . R e c e n t l y a s p e c i a lp h o t o e l e c t r i c p h o t o m e t e r u t i l i z i n g t h e p h y s i c al m e t h o d h a s b e e n d e s c r i b e d[ M c F a r l a n e t a l . 1 9 3 7 ] . T h i s i n s t r u m e n t p e r m i t s r a p i d m e a s u r e m e n t o f t h ee x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t a t 3 2 8 m , u , b u t h a s t h e d i s a d v a n t a g e t h a t i t c a n n o t b ea p p l i e d t o u s e s o t h e r t h a n t h e e s t i m a t i o n o f v i t a m i n A .T h e r e i s a t p r e s e n t n o e v i d e n c e t h a t m e a s u r e m e n t o f a b s o r p t i o n a t 3 2 8 m , ui s a n y m o r e c l o s e l y r e l a t e d t o b i o l o g i c a l a c t i v i t y t h a n i s t h e d e p t h o f t h e b l u ec o l o u r p r o d u c e d i n t h e C a r r - P r i c e r e a c t i o n , b u t i t i s g e n e r a l l y a g r e e d t h a t t h ef o r m e r q u a n t i t y i s m o r e s u s c e p t i b l e o f a c c u r a t e m e a s u r e m e n t t h a n t h e l a t t e ra s l o n g a s o n e i s f o r c e d t o u s e t i n t o m e t e r s o r v i s u a l s p e c t r o p h o t o m e t e r s f o re x a m i n a t i o n o f t h e b l u e c o l o u r . T h e a d v a n t a g e s o f t h e p h o t o e l e c t r i c c o l o r i -m e t e r ' [ E v e l y n , 1 9 3 6 ] f o r t h e m e a s u r e m e n t o f t h e v e r y u n s t a b l e b l u e c o l o u r o ft h e C a r r - P r i c e r e a c t i o n may b e r e a d i l y a p p r e c i a t e d b y t h e f o l l o w i n g b r i e fd e s c r i p t i o n o f t h e a p p a r a t u s , w h i c h i s e s s e n t i a l l y a s i n g l e p h o t o c e l l d i r e c t - r e a d i n gp h o t o e l e c t r i c p h o t o m e t e r e q u i p p e d w i t h l i g h t f i l t e r s . A beam o f a p p r o x i m a t e l ym o n o c h r o m a t i c f i l t e r e d ) l i g h t i s d i r e c t e d u p o n a p h o t o e l e c t r i c c e l l c o n n e c t e dt o a g a l v a n o m e t e r w h i c h r e c o r d s t h e i n t e n s i t y o f t h e i n c i d e n t l i g h t d i r e c t l y o na s c a l e o f 1 0 0 d i v i s i o n s . An a b s o r p t i o n c e l l c o n t a i n i n g t h e s o l u t i o n u n d e r t e s tmay b e i n t e r p o s e d b e t w e e n t h e l a m p a n d t h e p h o t o c e l l , a n d t h e r a t i o o f t h e f i n a la n d i n i t i a l g a l v a n o m e t e r r e a d i n g s m e a s u r e s t h e l i g h t t r a n s m i s s i o n o f t h e c o l o u r e dc o m p o u n d . I m p o r t a n t f e a t u r e s o f t h e d e s i g n o f t h e a p p a r a t u s , i n a d d i t i o n t os i m p l i c i t y , r a p i d i t y a n d o b j e c t i v i t y o f o p e r a t i o n , a r e e x t r e m e c o n s t a n c y o f t h el i g h t s o u r c e , t h e u s e o f f i l t e r s o f h i g h s e l e c t i v i t y a n d p e r m a n e n c e o f s p e c t r a lc h a r a c t e r i s t i c s , a n d s t r i c t l y l i n e a r r e l a t i o n b e t w e e n g a l v a n o m e t e r d e f l e x i o n a n dl i g h t i n t e n s i t y . F o r t h e v i t a m i n A d e t e r m i n a t i o n i t i s a l s o i m p o r t a n t t h a t t h ec o l o r i m e t e r e m p l o y s a t e s t t u b e t y p e o f a b s o r p t i o n c e l l t h e o p e n e n d o f w h i c hp r o j e c t s a b o v e t h e t o p o f t h e a p p a r a t u s , t h u s a l l o w i n g r e a g e n t s t o b e a d d e d t ot h e t e s t s o l u t i o n w h i l e t h e t u b e i s a c t u a l l y i n p l a c e i n t h e p a t h o f t h e beam o fl i g h t . T h i s f e a t u r e t o g e t h e r w i t h t h e d i r e c t r e a d i n g n a t u r e o f t h e d e v i c e e n a b l e st h e o p e r a t o r t o r e c o r d a t s h o r t i n t e r v a l s t h e d e v e l o p m e n t a n d f a d i n g o f t h ec o l o u r f o r a n y p e r i o d h e d e s i r e s b e g i n n i n g w i t h i n a s e c o n d o r t w o a f t e r a d d i t i o no f t h e r e a g e n t , a n d m a k e s i t p o s s i b l e t o m e a s u r e t h e i n t e n s i t y o f t h e b l u e c o l o u ra t i t s t r u e maximum w h i c h , a s we s h a l l s h o w b e l o w , o c c u r s i m m e d i a t e l y a f t e ra d d i t i o n o f t h e r e a g e n t .

A n o t h e r i m p o r t a n t c o m p o n e n t o f t h e p h o t o e l e c t r i c c o l o r i m e t e r i s t h e f i l t e rw h i c h i s u s e d t o i s o l a t e a n a r r o w s p e c t r a l r e g i o n i n t h e v i c i n i t y o f t h e r e g i o i n o fmaximum a b s o r p t i o n o f t h e s o l u t i o n u n d e r t e s t . S i n c e a c o m p l e t e s e t o f h i g h l ys e l e c t i v e f i l t e r s h a s b e e n d e v e l o p e d a s a n i n t e g r a l p a r t o f t h e a p p a r a t u s , o n e h a sn o d i f f i c u l t y i n s e l e c t i n g a f i l t e r ( N o . 6 2 0 ) t o f u l f i l t h i s r e q u i r e m e n t f o r t h ev i t a m i n A - a n t i m o n y t r i c h l o r i d e c o m p l e x . F i g . 1 s h o w s s p e c t r o p h o t o m e t r i ct r a n s m i s s i o n c u r v e s o f t h e b l ue c o m p o u n d a n d o f t h e f i l t e r u s e d i n i t s d e t e r -m i n a t i o n .1 T h e a p p l i c a t i o n o f t h e E v e l y n p h o t o e l e c t r i c c o l o r i m e t e r t o t h e m e a s u r e m e n t o f v i t a m i n A

w a s f i r s t s u g g e s t e d b y Dr C h a r l e s May o f t h e C h i l d r e n s H o s p i t a l , B o s t o n , M a s s a c h u s e t t s . DrMay h a s p e r f e c t e d a m i c r o - m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f v i t a m i n A i n s e r u m , w h i c h i s d e s c r i b e di n a p a p e r n o w i n t h e p r e s s .T h e c o l o r i m e t e r i n c l u d i n g a l l t h e n e c e s s a r y f i l t e r s c a n b e o b t a i n e d f r o m t h e R u b i c o n C o m p a n y ,

2 9 N o r t h S i x t h S t r e e t , P h i l a d e l p h i a , P a . , U . S . A .B i o c h e m . 1 9 3 8 x X x I I 6 4

1 0 0 9

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W. J . DANN AND K . A . EVELYNI t s h o u l d b e e m p h a s i z e d a t t h i s p o i n t t h a t t h e p h y s i c a l b a s i s o f p h o t o e l e c t r i cm e a s u r e m e n t s made w i t h s p e c t r a l f i l t e r s r e s t s o n a n a c c u r a t e m a t h e m a t i c a lf o u n d a t i o n n o l e s s s e c u r e t h a n t h a t o f c o n v e n t i o n a l s p e c t r o p h o t o m e t r i c d e t e r -m i n a t i o n s . T h e r e l a t i o n b e t w e e n t h e t r u e s p e c t r o p h o t o m e t r i c t r a n s m i t t a n c e T A

1 0 0

4 0 F 2 0

7 9 2 0 . A 0o5 6 0 5 4 0 5 8 0 6 2 0 6 6 0 7 0 0

W a v e - l e n g t h i n m u &F i g . 1 . S p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e v i t a m i n A a n t i m o n y t r i c h l o r i d e b l u e c o l o u ra n d o f t h e f i l t e r e m p l o y e d i n i t s m e a s u r e m e n t .

a t a n y w a v e - l e n g t h A , a n d t h e a v e r a g e t r a n s m i t t a n c e T A w h i c h i s m e a s u r e dw i t h t h e c o r r e s p o n d i n g f i l t e r i s g i v e n b y t h e e q u a t i o nT A 1 T P F k . S ( 1A ,2 _ A v s

w h e r e A 1 a n d A 2 a r e t h e l i m i t s o f t r a n s m i s s i o n o f t h e f i l t e r , a n d F A i s t h e t r a n s -m i t t a n c e o f t h e i f i t e r a t w a v e - l e n g t h A . T h e s e i n t e g r a l s c a n b e e v a l u a t e d r a p i d l ya n d a c c u r a t e l y f r o m t h e known s p e c t r o p h o t o m e t r i c c u r v e s o f t h e c o l o u r e dc o m p o u n d a n d f i l t e r b y g r a p h i c r e p r e s e n t a t i o n a n d t h e u s e o f t h e p l a n i m e t e r .F i n a l l y i t may b e a d d e d t h a t t h e f i l t e r s a r e a l w a y s m a d e s u f f i c i e n t l y s e l e c t i v et o f u l f i l t h e r e q u i r e m e n t t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e c o l o u r e d c o m p o u n d s h a l lb e p r o p o r t i o n a l w i t h i n t h e l i m i t s o f e r r o r o f t h e d e t e r m i n a t i o n i t s e l f ) t o t h en e g a t i v e l o g a r i t h m o f T ' a s w e l l a s t o t h a t o f T t h u s a l l o w i n g t h e u s e o f s t a n d a r ds p e c t r o p h o t o m e t r i c f o r m u l a e i n c a l c u l a t i o n o f r e s u l t s o b t a i n e d w i t h t h e p h o t o -e l e c t r i c c o l o r i m e t e r . T o p r e v e n t c o n f u s i o n o f t e r m i n o l o g y t h e f o l l o w i n g s y m b o l sa r e u s e d t h r o u g h o u t .E l o g 1 o T s p e c t r o p h o t o m e t e r ) ,L = l o g 1 o T p h o t o e l e c t r i c c o l o r i m e t e r ) - l o g i o - = 2 - l o g G ,

w h e r e G i s t h e g a l v a n o m e t e r r e a d i n g o b t a i n e d o n i n s e r t i n g t h e s a m p l e s o l u t i o n ,t h e i n i t i a l a d j u s t m e n t o f t h e l i g h t i n t e n s i t y h a v i n g b e e n made t o g i v e a r e a d i n go f 1 0 0 t h r o u g h a t u b e c o n t a i n i n g p u r e s o l v e n t o n l y .P r o c e d u r e . T h e m e t h o d i s a p p l i c a b l e t o a n y f a t t y m a t e r i a l c o n t a i n i n g v i t a m i nA . I f t h e v i t a m i n A c o n t e n t o f t h e m a t e r i a l i s s m a l l a s i n c o d l i v e r o i l s t h e n t h ef a t must b e s a p o n i f i e d a n d t h e u n s a p o n i f i a b l e r e s i d u e u s e d f o r t h e t e s t . T h i se l i m i n a t e s i n t e r f e r e n c e o f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d r a d i c a l s w i t h t h e C a r r - P r i c er e a c t i o n [ E m m e r i e , 1 9 3 3 ] . I t i s s u g g e s t e d t h a t s a p o n i f i c a t i o n s h o u l d b e c a r r i e do u t w h e n e v e r t h e v i t a m i n A c o n t e n t o f t h e m a t e r i a l i s b e l i e v e d t o b e l e s s t h a n1 0 , 0 0 0 I . . o f v i t a m i n A p e r g .

1 0 1 0

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DETERMINATION OF VITAMIN AA w e i g h e d a m o u n t o f t h e f a t o r o i l ( a b o u t 2 5 0 m g . f o r a c o d l i v e r o i l ) i s b o i l e di n a s m a l l f l a s k f o r 2 m i n . w i t h 2 m l . o f 6 0 a q u e o u s KOH a n d 1 0 m l . o f 9 5 a l c o h o l . T h e r e s u l t i n g s o l u t i o n i s p o u r e d i n t o 1 0 m l . o f d i s t i l l e d w a t e r i n as e p a r a t i n g f u n n e l , a n d t h e f l a s k w a s h e d w i t h t w o l o t s o f 1 5 m l . o f w a t e r a n d t w o

l o t s o f 2 5 m l . o f e t h e r , a l l b e i n g p o u r e d i n t o t h e s e p a r a t i n g f u n n e l . T h e f u n n e li s s h a k e n v i g o r o u s l y a n d t h e a q u e o u s l a y e r d r a w n o f f a n d d i s c a r d e d . T h e e t h e r e a ls o l u t i o n i s w a s h e d v i g o r o u s l y w i t h 1 0 m l . o f w a t e r a n d t h e n t w i c e g e n t l y w i t h2 5 m l . o f w a t e r e a c h t i m e a n d f i n a l l y i s d r i e d b y f i l t r a t i o n t h r o u g h a n h y d r o u ss o d i u m s u l p h a t e o n a s i n t e r e d g l a s s d i a p h r a g m , a n d t h e s u l p h a t e w a s h e d w i t h2 0 m l . o f e t h e r . T h e e t h e r e a l s o l u t i o n i s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s b y c o n n e c t i n gt h e c o n t a i n i n g f l a s k d i r e c t l y t o a w a t e r pump w i t h o u t u s i n g a c o n d e n s e r , t h e f l a s kb e i n g i m m e r s e d i n warm w a t e r u n j i l t h e e t h e r h a s e v a p o r a t e d , a n d t h e n d i p p e df o r a moment i n b o i l i n g w a t e r t o d r i v e o f f t r a c e s o f w a t e r f r o m t h e u n s a p o n i f i e dr e s i d u e .T h e r e s i d u e i s d i s s o l v e d i n 2 5 m l . o f c h l o r o f o r m , a s u i t a b l e a l i q u o t ( s a y0 - 2 5 m l . f o r f i r s t t r i a l ) i s p i p e t t e d i n t o o n e o f t h e s p e c i a l p h o t o c o l o r i m e t e ra b s o r p t i o n t e s t t u b e s , a n d t h e v o l u m e i s made up t o 1 m l . w i t h c h l o r o f o r m .F o r a r i c h e r o i l when s a p o n i f i c a t i o n i s u n n e c e s s a r y a f e w m g . s h o u l d b e w e i g h e do u t a n d made u p t o a known v o l u m e w i t h c h l o r o f o r m ; a s u i t a b l e a l i q u o t o f t h i ss o l u t i o n i s t h e n t r a n s f e r r e d t o t h e c o l o r i m e t e r t u b e . T h e a p p r o p r i a t e f i l t e r( N o . 6 2 0 ) i s p l a c e d i n t h e c o l o r i m e t e r , t h e a p p a r a t u s i s t u r n e d o n , a n d t h e l i g h ti n t e n s i t y i s a d j u s t e d s o t h a t a g a l v a n o m e t e r d e f l e x i o n o f 1 0 0 d i v i s i o n s i s o b t a i n e dt h r o u g h a t u b e c o n t a i n i n g 1 m l . o f c h l o r o f o r m a n d 9 m l . o f r e a g e n t o r 1 0 m l .o f r e a g e n t i f m o r e c o n v e n i e n t , a s i t g i v e s t h e same r e s u l t ) . T h i s b l a n k t ub e i st h e n r e p l a c e d b y t h e s a m p l e t u b e a n d 9 m l . o f t h e a n t i m o n y t r i c h l o r i d e r e a g e n t 2 5 g . p e r 1 0 0 m l . o f s o l u t i o n ) a r e r u n r a p i d l y down t h e s i d e o f t h e t u b e f r o m a na u t o m a t i c p i p e t t e o f t h e B . D . H . p a t t e r n o r o t h e r s u i t a b l e t y p e o f a u t o m a t i cp i p e t t e o r b u r e t t e .A s t h e r e a g e n t a n d t e s t s o l u t i o n m i x t h e g a l v a n o m e t e r s p o t w i l l move a c r o s st h e s c a l e t o a new p o s i t i o n o f t e m p o r a r y e q u i l i b r i u m w h i c h i s r e c o r d e d b y t h eo p e r a t o r a s G 6 2 0 . I f t h e r e a d i n g i s l e s s t h a n 2 0 o r more t h a n 7 0 , a n o t h e r t ub es h o u l d b e s e t u p w i t h a c o r r e s p o n d i n g l y s m a l l e r o r l a r g e r v o l u m e o f t h e c h l o r o -f o r m s o l u t i o n .T h e L v a l u e o f t h e o i l may t h e n b e c a l c u l a t e d f r o m t h e e q u a t i o n

L v a l u e = 5 2 . 5 x L 6 2 , L . . . . . . 2 ). M 6 2 0w h e r e L 6 2 = ( 2 - l o g 0 6 2 0 , a n d M 6 2 0 m g . i s t h e w e i g h t o f o r i g i n a l m a t e r i a l y i e l d i n gt h e a l i q u o t o f u n s a p o n i f i a b l e r e s i d u e p l a c e d i n t h e c o l o r i m e t e r t u b e .D e r i v a t i o n o f t h e n e w u n i t . T h e u n i t a d o p t e d f o r e x p r e s s i o n o f r e s u l t s b y t h enew m e t h o d h a s b e e n c h o s e n t o b e a s c l o s e l y a s p o s s i b l e a n a l o g o u s t o t h e f a m i l i a rE ( 1 , 1 c m . 6 2 0 m , u ) a n d i s w r i t t e n L ( 1 , 1 c m . 6 2 0 m , u ) . I t i s u s u a l l yr e f e r r e d t o a s t h e L v a l u e . I f M m g . i s t h e amount o f o r i g i n a l m a t e r i a lc o r r e s p o n d i n g t o t h e v o l u m e o f t h e c h l o r o f o r m s o l u t i o n u s e d i n t h e t e s t , t h e n t h ec o n c e n t r a t i o n o f o r i g i n a l m a t e r i a l i n t h e f i n a l b l u e s o l u t i o n i s M/10 m g . p e r m l .o r M / 1 0 0 g . p e r 1 0 0 m l . B e a r i n g i n m i n d t h a t t h e e f f e c t i v e t h i c k n es s o f t h e l a y e r

1 T h e e s s e n t i a l c h a r a c t e r i s t i c o f w h a t e v e r d e v i c e i s u s e d f o r t h e d e l i v e r y o f t h e r e a g e n t s o l u t i o ni s t h a t i t s d e l i v e r y t i m e s h a l l b e n o l o n g e r t h a n 2 s e c . T h e r e a d i n g o b t a i n e d i s t h e same w h e t h e r a ) t h e r e a g e n t i s r u n i n t o t h e t u b e a l r e a d y i n p o s i t i o n i n t h e c o l o r i m e t e r , o r b t h e r e a g e n t i s r u ni n t o a t u b e h e l d i n t h e h a n d , t h e t u b e r a p i d l y s h a k e n a n d i n s e r t e d i n t o t h e c o l o r i m e t e r . T h i s s h o w st h a t c o m p l et e m i x i n g o c c u r s r a p i d l y when t h e r e a g e n t i s r u n i n t o t h e t u b e a l r e a d y i n t h e c o l o r i -m e t e r .

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W . J . DANN AND K . A . EVELYNo f s o l u t i o n t h r o u g h w h i c h t h e l i g h t p a s s e s i n t h e t u b u l a r p h o t o c o l o r i m e t e r c e l li s 1 - 9 c m . i t i s c l e a r t h a t t h e q u a n t i t y w h i c h we h a v e r e f e r r e d t o a b o v e a s L 6 2 0i s m o r e e x a c t l y L ( M / 1 0 0 , 1 . 9 c m . , 6 2 0 m , ) a n d t h e r e f o r e

L v a l u e = L (1 , 1 c m . , 6 2 0 m , ) =- x - x L IM X 2 1 .9 6 26 2 5 L 6 . . . . . . . 2By c a l c u l a t i o n f r o m e q u a t i o n 1 ) i t h a s b e e n f o u n d t h a t t h e r a t i o o f E 1 ,1 c m . , 6 2 0 m u ) t o L 1 , 1 c m . , 6 2 0 m , u ) i s 1 3 0 + 0 0 3 .C o r r e c t i o n f o r t h e p r e s e n c e o f c a r o t e n e . S i n c e i n t h e p r e s e n c e o f a n t i m o n yt r i c h l o r i d e c a r o t e n e d e v e l o p s a c o l o u r s i m i l a r t o t h a t g i v e n b y v i t a m i n A , ac o r r e c t i o n f o r c a r o t e n e p r e s e n t s h o u l d b e a p p l i e d t o t h e L v a l u e when t h ec h l o r o f o r m s o l u t i o n i s s e e n t o b e y e l l o w . T o d o t h i s , 1 0 m l . o f t h e s o l u t i o n a r ep i p e t t e d i n t o a n o t h e r c o l o r i m e t e r t u b e , f i l t e r 6 2 0 i s r e p l a c e d b y f i l t e r 4 4 0 , a n da f t e r a d j u s t i n g t h e g a l v a n o m e t e r r e a d i n g t o 1 0 0 w i t h a b l a n k t u b e c o n t a i n i n g1 0 m l . o f c h l o r o f o r m t h e g a l v a n o m e t e r r e a d i n g w i t h t h e t u b e o f s o l u t i o n i np l a c e i s r e c o r d e d a s 4 O . . I f t h e r e a d i n g i s l e s s t h a n 2 0 , a s u i t a b l e d i l u t i o n o f t h es o l u t i o n i s made t o o b t a i n a r e a d i n g b e t w e e n 2 0 a n d 7 0 .T h e c o r r e c t e d L v a l u e o f t h e o i l may t h e n b e c a l c u l a t e d f r o m t h e e q u a t i o n

L v a l u e c o r r e c t e d ) 5 2 . 5 - 6 2 0_ 0 - 1 4 . M 4 4 0 . . . . . . 3w h e r e L 4 4 0 = ( 2 - l o g G 4 4 ) , a n d M u o m g . i s t h e w e i g h t o f o r i g i n a l m a t e r i a l y i e l d i n gt h e a l i q u o t o f u n s a p o n i f i a b l e r e s i d u e c o n t a i n e d i n t h e t u b e u s e d f o r r e c o r d i n g0 4 4 0 .T h e o b s e r v a t i o n s w h i c h e s t a b l i s h t h e c o n s t a n t 0 - 1 4 u s e d i n t h i s e q u a t i o na r e d e s c r i b e d b e l o w . E x p e r i m e n t a l

A p p l i c a t i o n o f l a w s o f L a m b e r t a n d B e e r t o t h e b l u e s o l u t i o n , a n d p r e c i s i o n o ft h e m e t h o d . I t i s c l e a r t h a t t h e d e f i n i t i o n o f t h e new u n i t i n v o l v e s t h e a s s u m p t i o nt h a t L t h e n e g a t i v e l o g a r i t h m o f t h e t r a n s m i t t a n c e ) i s a l i n e a r f un c t i o n o f MT a b l e I . D a t a o n t h e p r e c i s i o n o f e s t i m a t i o n o f v i t a m i n A w i t h t h e p h o t o e l e c t r i cc o l o r i m e t e r . R e a d i n g s o f L f o r d i f f e r e n t v o l u m e s o f t h e s a m e s o l u t i o n c o n t a i n i n gv i t a m i n A . V o l u m e o fs o l u t i o n m l . ) L L v o l u m e

1 . 0 0 * 6 0 1 0 . 6 0 10 9 5 0 - 5 7 2 0 - 6 0 20 9 0 0 - 5 4 2 0 . 6 0 20 * 8 5 0 * 5 2 0 0 - 6 1 10 8 0 0 - 4 8 5 0 - 6 0 60 7 5 0 - 4 5 7 0 - 6 0 90 7 0 0 4 2 4 0 - 6 0 60 - 6 5 0 3 9 5 5 0 - 6 0 80 * 6 0 0 . 3 6 5 0 - 6 0 80 * 5 5 0 3 3 5 5 0 - 6 1 00 5 0 0 - 3 0 2 0 . 6 0 40 4 5 0 - 2 7 4 0 - 6 0 90 * 4 0 0 - 2 4 6 0 - 6 1 50 3 5 0 - 2 1 4 0 - 6 1 20 3 0 0 - 1 8 4 5 0 - 6 1 50 . 2 5 0 - 1 5 2 0 - 6 0 80 - 2 0 0 * 1 1 9 0 . 5 9 5Mean v a l u e o f L v o l u m e = 0 6 0 7 .S t a n d a r d d e v i a t i o n o f L v o l u m e = 0 - 0 0 5 1 5 = + 0 . 8 5 .

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DETERMINATION OF VITAMIN A t h e c o n c e n t r a t i o n o f v i t a m i n A ) . I n o t h e r w o r d s i t i s a s s u m e d t h a t B e e r s l a wg o v e r n s t h e r e l a t i o n o f d e p t h o f b l ue c o l o ur p r o d u c e d t o amount o f v i t a m i n Ap r e s e n t . N o t e v a r p & Weedon [ 1 9 3 6 ] h a v e s h o w n t h i s a s s u m p t i o n t o b e v a l i df o r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s m e a s u r e d o n t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r , a n d t h e r e s u l t sg i v e n i n T a b l e I p r o v e t h a t t h e p h o t o c o l o r i m e t e r r e a d i n g s a l s o s a t i s f y t h i sr e l a t i o n t o a h i g h p r e c i s i o n . T h e p r o c e d u r e w a s a s f o l l o w s .A s o l u t i o n w a s made o f a n u n s a p o n i f i a b l e r e s i d u e f r o m c o d l i v e r o i l a n d t h es o l u t i o n w a s m e a s u r e d i n t o s p e c i a l l y c a l i b r a t e d c o l o r i m e t e r t u b e s f r o m a m i c r o -b u r e t t e g r a d u a t e d i n i n t e r v a l s o f 0 0 1 m l . C a r e w a s t a k e n t o w i p e t h e b u r e t t et i p b e f o r e e a c h d e l i v e r y i n o r d e r t o r e m o v e u n s a p o n i f i a b l e r e s i d u e d e p o s i t e dt h e r e b y s e e p a g e o f t h e s o l u t i o n p a s t t h e c l o s e d t a p a n d e v a p o r a t i o n a t t h e t i p .T h e s o l u t i o n i n e a c h t u b e w a s made u p t o 1 m l . b y a d d i t i o n o f p u r e c h l o r o f o r mf r o m a s i m i l a r m i c r o b u r e t t e .T h e s o l v e n t u s e d w a s d r y a l c o h o l - f r e e c h l o r o f o r m w h i c h h a d b e e n d i s t i l l e d5 d a y s p r e v i o u s l y , a n d t h e r e a g e n t w a s a 2 0 s o l u t i o n o f a n t i m o n y t r i c h l o r i d e( t h r o u g h o u t t h i s p a p e r t h e c o n c e n t r a t i o n o f a n t i m o n y t r i c h l o r i d e s o l u t i o n s a r eg i v e n a s p e r c e n t a g e s w h i c h s i g n i f y g . s o l u t e i n e a c h 1 0 0 m l . o f s o l u t i o n ) madeu p 2 d a y s p r e v i o u s l y i n s o m e o f t h e s a m e b a t c h o f c h l o r o f o r m . A l l r e a d i n g s w e r et a k e n a t 2 0 0 . E a c h r e a d i n g w a s t a k e n o n c e o n l y ; n o d u p l i c a t e s w e r e r e a d .From t h e f i g u r e g i v e n f o r t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n i t a p p e a r s t h a t when w o r k i n gw i t h t h i s d e g r e e o f c a r e o n l y 1 o b s e r v a t i o n i n 2 2 w i l l e r r b y m o r e t h a n + 1 - 7 f r o m t h e t r u e v a l ue o f L .T h e s e f i g u r e s s h o w ho w s m a l l i s t h e e r r o r o f t h e m e t h o d , w h i c h i n c l u d e sb o t h t h e e r r o r o f t r a n s f e r r i n g a m e a s u r e d a l i q u o t o f t e s t s o l u t i o n t o t h e c o l o r i -m e t e r t u b e a n d t h e p e r s o n a l a n d i n s t r u m e n t a l e r r o r s i n t h e g a l v a n o m e t e rr e a d i n g . U n l e s s t h e c l o s e s t a t t e n t i o n i s p a i d t o t h e m e a s u r e m e n t o f t h e v o l u m eo f t e s t s o l u t i o n , t h i s d e g r e e o f a c c u r a c y c a n n o t b e o b t a i n e d , a s a much l a r g e re r r o r w i l l b e made i n t h i s o p e r a t i o n . I n a n y r e a d i n g t h i s e r r o r i s l i k e l y t oc o n t r o l t h e s i z e o f t h e e r r o r o f t h e c o m p l e t e p r o c e s s o f t a k i n g t h e r e a d i n g .C o n c e n t r a t i o n a n d p u r i t y o f t h e r e a g e n t . F i g . 2 s h o w s t h e e f f e c t o f v a r y i n g t h ec o n c e n t r a t i o n o f t h e s o l u t i o n o f a n t i m o n y t r i c h l o r i d e . C a r r & P r i c e [ 1 9 2 6 ]o r i g i n a l l y s u g g e s t e d u s i n g a 3 0 s o l u t i o n i n c h l o r o f o r m . I n o u r e x p e r i e n c e a

0 X 4 1 09 50 . 4 - 9 0

. 8 5 I D o0 - 3 5 - 8 0 o

7 50 ' 3 C . _ . _ . __ _ . _ ._ ._ ._ ._ ._ - 7 00 1 0 1 2 0 2 5 3 0C o n c e nt r a t i o n o f C a r r - P r i c e r e a g e n t g . S b C l s p e r 1 0 0 m l . s o l u t i o n )F i g . 2 . D e p e n d e n c e o f i n t e n s i t y o f b l ue c o l o u r u p o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e C a r r - P r i c e r e a g e n t .E a c h r e a d i n g w a s made b y t r e a t i n g 1 m l . o f a s t a n d a r d s o l u t i o n o f v i t a m i n A w i t h 9 m l . o fC a r r - P r i c e r e a g e n t o f t h e c o n c e n t r a t i o n s h o w n b y t h e i n d i v i d u a l p o i n t .

s o l u t i o n o f t h i s c o n c e n t r a t i o n c a n b e p r e p a r e d f r o m r e a g e n t q u a l i t y a n t i m o n yt r i c h l o r i d e a n d r e a g e n t q u a l i t y c h l o r o f o r m b y w a r m i n g , a n d t h e s o l u t i o n w i l lg e n e r a l l y r e m a i n s t a b l e down t o 2 0 0 a t l e a s t ; b u t i f t h e d r i e s t c o m m e r c i a ls p e c i m e n s o f a n t i m o n y c h l o r i d e a r e c h o s e n a n d d i s s o l v e d i n p u r e d r y a l c o h o l - f r e e

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W. J . DANN AND K . A . EVELYNc h l o r o f o r m a t t h i s c o n c e n t r a t i o n , t h e n much o f t h e s a l t w i l l c r y s t a l l i z e o u t a t 2 0 0 .A f t e r t h e s o l u t i o n a n d s o l i d h a v e b e e n s t a n d i n g f o r s o m e w e e k s , h o w e v e r t i g h t l ys t o p p e r e d i n d a r k o r l i g h t ) , t h e s a l t c a n b e r e d i s s o l v e d b y w a r m i n g a n d w i l l n o ta g a i n c r y s t a l l i z e o u t o n k e e p i n g a t 2 0 0 . T h e d a t a c h a r t e d i n F i g . 2 w e r e t h e r e f o r eo b t a i n e d w i t h a s t a l e r e a g e n t .F i g . 2 s h o w s t h a t t h e r e i s n o n e e d t o i n c r e a s e t h e r e a g e n t c o n c e n t r a t i o na b o v e 2 0 , a n d t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n n e e d n o t b e v e r y a c c u r a t e l y c o n t r o l l e d .T h i s i s a g r e a t a d v a n t a g e i n t h e u s e o f s uc b a h y g r o s c o p i c r e a g e n t .C a r r & P r i c e [ 1 9 2 6 ] s t a t e d t h a t t r a c e s o f w a t e r a n d a l c o h o l d o n o t a f f e c t i td e l e t e r i o u s l y . T h i s s t a t e m e n t w a s d e n i e d b y N o t e v a r p & Weedon [ 1 9 3 6 ] whof o u n d t h a t w a t e r , a l c o h o l o r d e g r a da t i o n p r o d u c t s p r o d u c e d b y t h e a c t i o n o fl i g h t o n t h e c h l o r o f o r m a l l a f f e c t e d t h e d e p t h o f b l u e c o l o u r p r o d u c e d . I n o u re x p e r i e n c e t h e f o r m e r a u t h o r s a r e c o r r e c t , a s s h o w n b y t h e f o l l o w i n g o b s e r -v a t i o n s . A f r e s h 2 0 s o l u t i o n s o l u t i o n A ) o f a n t i m o n y t r i c h l o r i d e i n p u r e d r ya l c o h o l - f r e e c h l o r o f o r m w a s p r e p a r e d . From t h i s s o l u t i o n w e r e p r e p a r e d as o l u t i o n B c o n s i s t i n g o f 9 9 m l . s o l u t i o n A+ 1 m l . a l c o h o l ; s o l u t i o n C , 9 5 m l . o fs o l u t i o n A+ 5 m l . a l c o h o l ; a n d s o l u t i o n D , 9 9 m l . o f s o l u t i o n A 1 m l . w a t e r .S o l u t i o n D b e c a m e c l o u d y , b u t o n s t a n d i n g i t s e p a r a t e d i n t o t w o c l e a r l a y e r s ,t h e l o w e r v e r y s m a l l i n v o l u m e . O n l y t h e u p p e r l a y e r w a s u s e d f o r t h i s t e s t .S o l u t i o n E was a 2 0 r e a g e n t s o l u t i o n w h i c h h a d b e e n s t a n d i n g i n a c o r k e df l a s k i n a b r i g h t room f o r 6 m o n t h s a n d h a d s e p a r a t e d i n t o l a r g e u p p e r a n ds m a l l l o w e r i m m i s c i b l e l a y e r s . T h e u p p e r l a y e r was t e s t e d . When e a c h o f t h e s es o l u t i o n s w a s u s e d a s r e a g e n t w i t h 1 m l . o f t h e same s o l u t i o n o f v i t a m i n A ,t r i p l i c a t e r e a d i n g s w e r e o b t a i n e d w h i c h w e r e i d e n t i c a l w i t h i n t h e l i m i t s o f e r r o ro f t h e m e t h o d . T h u s f o r t h e v i t a m i n c o n c e n t r a t i o n s p e r m i s s i b l e i n t h i s m e t h o ds t a l e r e a g e n t s o r r e a g e n t s c o n t a i n i n g t r a c e s o f w a t e r , a l c o h o l o r d e g r a d a t i o np r o d u c t s d o n o t a f f e c t t h e i n i t i a l d e p t h o f t h e c o l o u r p r o d u c e d . T h i s a g a i n i sv e r y c o n v e n i e n t s i n c e t h e r e a g e n t s o l u t i o n i s h y g r o s c o p i c a n d u n s t a b l e .F a d i n g o f t h e b l u e c o l o u r . T h e g r e a t e s t d i f f i c u l t y i n s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e a s u r e m e n t o f t h e b l u e c o l o u r i s d u e t o t h e r a p i d i t y w i t h w h i c h t h e c o l o u r

o o lB

7 0

0 4 6 0 -5 0i m e i n m i n u t e s a f t e r a d d i t i o n o f r e a g e n tt o s o l u t i o n o f v i t a m i n A

F i g . 3 . O b s e r v a t i o n s on t h e r a t e o f f a d i n g o f t h e b l u e c o l o u r . C u r v e A was o b t a i n e d b y u s i n ga f r e s h l y p r e p a r e d r e a g e n t s o l u t i o n ; c u r v e B w i t h a s t a l e r e a g e n t s o l u t i o n . T h e i n i t i a lr e a d i n g s w i t h e a c h r e a g e n t w e r e i d e n t i c a l .f a d e s . T h i s d i f f i c u l t y i s c o m p l e t e l y o v e r c o m e b y t h e p h o t o e l e c t r i c c o l o r i m e t e r ,a s t h e r e a d i n g o n a n y t e s t s o l u t i o n c a n b e t a k e n w i t h i n 2 - 3 s e c . o f a d d i n g t h e

1 0 1 4

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DETERMINATION OF VITAMIN Ar e a g e n t ; t h i s a l l o w s t i m e f o r t h e m i x i n g o f t h e t e s t a n d r e a g e n t s o l u t i o n s a n d t h es w i n g o f t h e g a l v a n o m e t e r s p o t .C a r r & P r i c e [ 1 9 2 6 ] c l a i m e d t h a t t h e b l u e c o l o u r i s s t a b l e f o r 3 m i n . a f t e ri t s a p p e a r a n c e , b u t o u r e x p e r i e n c e s h o w s o n t h e c o n t r a r y t h a t t h e c o l o u r b e g i n st o f a d e a t o n c e i f a s t a l e r e a g e n t s o l u t i o n i s u s e d , a n d a f t e r 1 0 - 1 5 s e c . i f a f r e s hs o l u t i o n i s u s e d . When a s t a l e r e a g e n t s o l u t i o n i s a d d e d t o a t e s t s o l u t i o n i n at u b e a l r e a d y i n p o s i t i o n , t h e g a l v a n o m e t e r s p o t m o v e s r a p i d l y t o a n i n i t i a lr e a d i n g a n d t h e n i m m e d i a t e l y b e g i n s t o d r i f t s l o w l y t o t h e r i g h t , i n d i c a t i n g ad e c r e a s i n g i n t e n s i t y o f c o l o u r . B u t w i t h f r e s h p ur e r e a g e n t s o l u t i o n t h e s p o tm o v e s e q u a l l y r a p i d l y t o t h e s a m e i n i t i a l p o s i t i o n a n d t h e n r e m a i n s m o t i o n l e s sf o r 1 0 - 1 5 s e c . b e f o r e i t b e g i n s t o . d r i f t a w a y . T h u s t h e r e i s a r e a l a d v a n t a g e i nu s i n g t h e f r e s h p u r e r e a g e n t s o l u t i o n a s t h e r e a d i n g c a n b e n o t e d i n m o r e l e i s u r e l yf a s h i o n . M o r e o v e r , i t a l l o w s a t e s t t o b e made o f t h e t h o r o u g h n e s s w i t h w h i c hm i x i n g o c c u r s i n t h e t u b e when t h e r e a g e n t i s a d d e d , a s t h e r e i s t i m e t o a d d t h er e a g e n t a n d s h a k e t h e t u b e w e l l b e f o r e p l a c i n g i t i n p o s i t i o n . T h i s t e s t s h o w s t h a tc o m p l e t e m i x i n g o c c u r s v e r y r a p i d l y when t h e r e a g e n t i s a d d e d t o t h e t u b ea l r e a d y i n p o s i t i o n .T h e r a t e o f f a d i n g o f b l u e c o l o u r p r o d u c e d f r o m o n e a n d t h e s a m e t e s ts o l u t i o n w i t h f r e s h a n d w i t h s t a l e r e a g e n t s o l u t i o n s i s s h o w n i n F i g . 3 . T h e r a t eo f f a d i n g a p p e a r s t o v a r y s o m e w h a t w i t h t h e p a r t i c u l a r t e s t m a t e r i a l , b u t i no u r e x p e r i e n c e t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e f r e s h a n d s t a l e r e a g e n t s i s a l w a y s a ss h o w n i n F i g . 3 . S i m i l a r f a d i n g o c c ur s w h e t h e r t h e t e s t s o l u t i o n c o n t a i n s a no i l o r a n u n s a p o n i f i a b l e r e s i d u e .E f f e c t o f t e m p e r a t u r e . We h a v e c o n f i r m e d e a r l i e r o b s e r v a t i o n s t h a t t e m -p e r a t u r e e x e r t s a n e f f e c t o n t h e d e p t h o f c o l o u r p r o d u c e d , b u t n o a c c u r a t em e a s u r e m e n t s h a v e b e e n p o s s i b l e . R e a d i n g s w e r e t a k e n i n a warm r o o m , a n dt h e i n s t r u m e n t a n d s o l u t i o n s t r a n s f e r r e d t o a r e f r i g e r a t o r w h e r e f u r t h e r r e a d i n g sw e r e t a k e n a f t e r s o m e h o u r s . M e a s u r e m e n t s w e r e f i r s t made a t 2 1 0 a n d 1 1 0r e s p e c t i v e l y , a n d t h e L v a l u e w a s f o u n d t o b e 4 - 8 g r e at e r a t t h e l o w e r t e m -p e r a t u r e . L a t e r a n o t h e r t e s t w a s made a t 2 9 a n d 5 0 a n d L w a s o b s e r v e d t o b e1 0 - 6 g r e a t e r a t t h e l o w e r t e m p e r a t u r e . From t h e s e f i g u r e s i t s e e m s t h a t t h eo b s e r v e d v a l u e o f L i s i n c r e a s e d b y a b o u t 4 - 5 f o r a t e m p e r a t u r e d e c r e a s e o f1 0 0 w i t h i n t h e r a n g e 0 - 3 0 : t h i s i s much l e s s t h a n w a s c l a i m e d b y Wokes &W i l l i m o t t [ 1 9 2 7 ] , b u t a c a r e f u l r e a d i n g o f t h e i r p a p e r s h o w s t h a t t h e r e w a s s o m ec o n f u s i o n b e t w e e n d e p t h o f c o l o u r p r o d u c e d a n d t h e r a t e a t w h i c h i t d e v e l o p e d .T h e c h r o m o g e n i c p o w e r o f c a r o t e n e r e l a t i v e t o i t s y e l l o w c o l o u r . T h e f o l l o w i n go b s e r v a t i o n s w e r e made i n o r d e r t o c a l c u l a t e t h e n u m e r i c a l f a c t o r e m p l o y e dw i t h i n t h e b r a c k e t o f e q u a t i o n 3 ) a b o v e . 2 3 - 3 m g . o f c o m m e r c i a l f l - c a r o t e n ew e r e w e i g h e d f r o m a f r e s h l y o p e n e d a m p o u l e a n d d i s s o l v e d i n 1 0 m l . o f c h l o r o -f o r m . F u r t h e r d i l u t i o n s w e r e made a n d L . f o r e a c h o f t h e r e s u l t a n t s o l u t i o n sw a s m e a s u r e d . I t w a s f o u n d t h a t t h e s o l u t i o n s o b e y e d B e e r ' s l a w w i t h p r e c i s i o na n d t h e L 4 9 v a l u e o f t h e : - c a r o t e n e w a s 1 4 4 0 . A s e r i e s o f l e s s e r d i l u t i o n s w a sa l s o p r e p a r e d a n d t o 1 m l . o f e a c h s o l u t i o n 9 m l . o f t h e 2 0 a n t i m o n y t r i c h l o r i d ew e r e a d d e d a n d L 6 2 0 m e a s u r e d f o r e a c h . I t w a s f o u n d t h a t t h e b l u e s o l u t i o no b e y e d B e e r s l a w , a n d t h e L 6 2 0 v a l ue o f t h e c a r o t e n e w a s 2 2 0 .

T h e r a t i o o f L 2 o w a s 2 2 0 o r 0 - 1 5 3 .L 4 0 1440or053S i m i l a r l y w i t h a c o m m e r c i a l s p e c i m e n o f c a r o t e n e s t a t e d t o c o n t a i n 2 5 o fa - c a r o t e n e t h e v a l u e s o b s e r v e d w e r e L 4 4 , = 1 6 4 1 , L 6 , = 2 2 0 a n d L 6 2 0 = 0 - 1 3 0 . T h ea b s o l ut e v a l ue s o f L r e c o r d e d h e r e a r e u n d o u b t e d l y t o o l o w o n a c c o u n t o f t h ed i f f i c u l t y o f o b t a i n i n g p u r e s p e c i m e n s o f c a r o t e n e ; we h o p e t o b e a bl e t o p r e p a r ep u r e s p e c i m e n s a n d r e d e t e r m i n e t h e f i g u r e s i n t h e f u t u r e . T h e r a t i o s a r e l i k e l y

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W. J . DANN AND K . A . EVELYNt o b e m o r e a c c u r a t e , a n d f o r t h e p r e s e n t t h e mean v a l u e o f t h e t w o d e t e r -m i n a t i o n s i s s u g g e s t e d f o r u s e i n e q u a t i o n 3 .R e l a t i o n o f L v a l u e t o t h e o t h e r u n i t s . S i n c e i t w a s f e l t t h a t t h e p r e s e n t m e t h o dh a s m a t e r i a l l y i n c r e a s e d t h e p r e c i s i o n a n d a c c u r a c y o f t h e m e a s u r e m e n t o f t h eb l u e v i t a m i n A - a n t i m o n y t r i c h l o r i d e c o m p l e x , i t a p p e a r e d d e s i r a b l e t o d e t e r m i n ee x p e r i m e n t a l l y t h e d e g r e e o f c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e new L v a l u e , t h e E v a l u ea t 3 2 8 m , u a n d t h e b l u e v a l u e . F o r t h i s p u r p o s e a s e r i e s o f m e a s u r e m e n t s w a sm a d e o n u n s a p o n i f i a b l e r e s i d u e s ( e x c e p t i n t h e c a s e o f c o n c e n t r a t e d s o u r c e s )t o e l i m i n a t e f a c t o r s o f i n h i b i t i o n w h i c h c o n s t i t u t e a n i m p o r t a n t ( t h o u g h e n t i r e l yu n n e c e s s a r y ) s o u r c e o f d i s c r e p a n c y b e t w e e n t h e c h e m i c a l a n d p h y s i c a l v a l u e s .T h e c o n v e r s i o n f a c t o r s f o r t h e a b o v e u n i t s w e r e d e t e r m i n e d o n t h e b a s i s o fm e a s u r e m e n t s o n 2 1 o i l s a n d 1 8 c o n c e n t r a t e s a s f o l l o w s :E 1 , 1 c m . , 3 2 8 m , - t ) =L v a l u e x 0 - 4 1 + 0 0 5 ) .B l u e v a l u e =L v a l u e x 2 0 + 3 . 0 ) .T h e r a t i o o f L v a l u e t o E v a l u e a t 6 2 0 m , u w a s c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n 1 )a n d w a s n o t m e a s u r e d o n t h e s e o i l s a n d c o n c e n t r a t e s . T h e c a l c u l a t i o n s h o w e dt h a t E ( 1 , 1 c m . , 6 2 0 m t u ) = L v a l u e x ( l 3 0 + 0 { 0 3 ) . B e a r i n g i n m i n d t h en a t u r e a n d m a g n i t u d e o f t h e v a r i o u s s o u r c e s o f d i s c r e p a n c y s o a b l y d i s c u s s e d b yM o r g a n e t a l . [ 1 9 3 5 ] , we f e e l t h a t t h e a b o v e c o n v e r s i o n f a c t o r s w i l l y i e l d a c c u r a t er e s u l t s ( w i t h i n t h e l i m i t s i n d i c a t e d a b o v e ) f o r t h o s e w ho w i s h t o c h a n g e f r o mo n e u n i t t o a n o t h e r . T h e q u e s t i o n o f t h e c o r r e l a t i o n o f t h e L v a l u e w i t h t h eb i o l o g i c a l a s s a y w i l l b e d e a l t w i t h s e p a r a t e l y .

SUMEMARY1 . T h e E v e l y n p h o t o e l e c t r i c c o l o r i m e t e r h a s b e e n a p p l i e d t o t h e m e a s u r e -ment o f t h e i n t e n s i t y o f t h e b l u e c o l o u r p r o d u c e d b y t h e r e a c t i o n b e t w e e n

v i t a m i n A a n d a n t i m o n y t r i c h l o r i d e ; t h e s i m p l e p r o c e d u r e f o r t h e e s t i m a t i o no f v i t a m i n A i n o i l s a n d o t h e r m a t e r i a l s i s d e s c r i b e d . T h e m e t h o d c o m b i n e sa c c u r a c y , c o n v e n i e n c e a n d e c o n o m y p e r h a p s t o a g r e a t e r e x t e n t t h a n a n y o t h e r .2 . T h e m o s t i m p o r t a n t a d v a n t a g e o f t h i s n ew m e t h o d i s i t s o b j e c t i v i t y w h i c he n s u r e s t h a t t h e r e s u l t s o b t a i n e d a r e a s f a r a s p o s s i b l e i n d e p e n d e n t o f t h eo p e r a t o r , t h e r e b y e l i m i n a t i n g a s o u r c e o f s e r i o u s e r r o r . O t h e r a d v a n t a g e s a r er a p i d i t y a n d c o n v e n i e n c e .3 . D a t a a r e p r e s e n t e d t o i l l u s t r a t e t h e p r e c i s i o n o f t h e m e t h o d , w h i c h i sc o n s i d e r a b l y g r e a t e r t h a n t h a t o b t a i n e d w i t h t h e t i n t o m e t e r o r t h e v i s u a ls p e c t r o p h o t o m e t e r .4 . A n ew u n i t i s d e f i n e d f o r t h e e x p r e s s i o n o f r e s u l t s o b t a i n e d b y t h e m e t h o d ,a n d e x p e r i m e n t a l d a t a a r e g i v e n on t h e r e l a t i o n b e t w e e n t h e n ew u n i t a n d o t h e ru n i t s n o w i n u s e .

O n e o f u s K . A . E . ) i s i n d e b t e d t o t h e B a n t i n g R e s e a r c h F o u n d a t i o n ,T o r o n t o , C a n a d a , f o r s e v e r a l g r a n t s d u r i n g t h e p e r i o d o f d e v e l o p m e n t o f t h ec o l o r i m e t e r a s w e l l a s i n s u p p o r t o f t h e p r e s e n t w o r k .

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DETERMINATION OF VITAMIN A 1 0 1 7

REFERENCESC a r r & P r i c e 1 9 2 6 ) . B i o c h e m . J . 2 0 , 4 9 7 .C o w a r d , D y e r , M o r t o n & Gaddum 1 9 3 1 ) . B i o c h e m . J . 2 5 , 1 1 0 2 .Drummond & M o r t o n 1 9 2 9 ) . B i o c h e m . J . 2 3 , 7 8 5 .E m m e r i e 1 9 3 3 ) . N a tu re , L o n d . , 1 3 1 , 3 6 4 .E v e l y n 1 9 3 6 ) . J . b i o l . C h e m . 1 1 5 , 6 3 .H o l m e s & C o r b e t 1 9 3 7 ) . J . A m e r . c h e m . S o c . 5 9 , 2 0 4 2 .Hume 1 9 3 7 ) . N a t u r e , L o n d . , 1 3 9 , 4 6 7 .M c F a r l a n , R e d d i e & M e r r i l l 1 9 3 7 ) . I n l . E n g . C h e m . A n a l y t i c a l E d . 9 , 3 2 4 .M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l 1 9 3 5 ) . Th e S t a n d a r d i s a t i o n a n d E s t i m a t i o n o f V i t a m i n A .

( H . M . S t a t i o n e r y O f f i c e , L o n d o n . )M o r g a n , E d i s b u r y & M o r t o n 1 9 3 5 ) . B i o c h e m . J . 2 9 , 1 6 4 5 .N o t e v a r p & Weedon 1 9 3 6 ) . B i o c h e m . J . 3 0 , 1 7 0 5 .T a k a h a s h i , N a k a m i y a , Kawakami & K i t a s a t o 1 9 2 5 ) . P r o c . T o k y o I n 8 t . P h y 8 . a n d C h e m . R e s .

3 , 8 1 .W o k e s & W i l l i m o t t 1 9 2 7 ) . A n a l y 8 t , 5 2 , 5 1 5 .