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Analisi genetico-molecolare

della distrofia miotonica

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Società Italianadi Genetica Medica

Revisione del gruppo di lavoro: dicembre 2004

Data di aggiornamento: 24 ottobre 2005

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RedazioneLaura Perrotta, Zadig, Milano

ImpaginazioneGiovanna Smiriglia

AUTORI

Massimo Gennarelli, Università di Brescia e Ospedale Fatebenfratelli IRCCS, Brescia

Giuseppe Novelli, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata

Annalisa Botta, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata

Leila Baghernajad Salehi, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata

Emanuela Bonifazi, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata

Laura Vallo, Università di Roma Tor Vergata, Policlinico di Tor Vergata

Cecilia Garré, Università di Genova

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3Indice

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

IndiceRiassunto Pag. 5Test postnatale per DM1 e DM2 » 5

Analisi molecolare » 5Indicazione all’indagine » 5

Test prenatale per DM1 » 5Analisi molecolare » 5Indicazione all’indagine » 5

La malattia: mutazioni e fenotipo » 6Diagnosi » 6Genetica » 6

Analisi genetico-molecolare della malattia di Steinert, Dystrophia myotonica 1 (DM1) » 8

Analisi genetico-molecolare della miopatia miotonica prossimale o Promm, sindrome di Ricker (DM2) » 9

Indicazioni per i test » 10Indicazioni per l’analisi molecolare della DM1 » 10

Test di conferma nei pazienti sintomatici » 10Test presintomatico in soggetti asintomatici » 10Test sui minori » 10Test prenatale » 11

Indicazioni per l’analisi molecolare della DM2 » 11Test di conferma nei pazienti sintomatici DM1 negativi » 11Test preclinico in soggetti asintomatici » 12

Diagnosi differenziale » 12Riservatezza » 13Informazioni al paziente » 13

Bibliografia essenziale » 14

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5Riassunto

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

Riassunto Test postnatale per DM1 e DM2

Analisi molecolare� E’ consigliato il protocollo diagnostico basato sulla long PCR (reazione polimerasica

a catena lunga) che permette di quantificare l’entità dell’espansione al locus DM1 intutti i casi (anche nelle forme congenite) e dell’espansione al locus DM2 in circa il70% dei casi. La metodica permette di rilevare sempre la presenza di espansioni CTGe CCTG con un’accuratezza del 100%.

Indicazione all’indagine� Test di conferma della diagnosi clinica nei pazienti con quadro clinico compatibile

con DM1 o DM2, DM1 negativi: la predizione prognostica in base alla grandezzadell’espansione è sconsigliata per l’assenza di una correlazione tra genotipo e fenoti-po, in particolare nella DM2.

� Test presintomatico in soggetti asintomatici e consanguinei di pazienti DM, a scopoclinico e predittivo per identificare la provenienza della mutazione nella famiglia eper modificare il rischio a priori di avere ereditato la mutazione DM: si raccomandala consulenza genetica a conclusione dell’indagine molecolare poiché quest’ultima nonpuò dare informazioni sull’età di insorgenza, né sul tipo di sintomi e sulla loro pro-gressione.

Test prenatale per DM1

Analisi molecolare� E’ consigliato il protocollo diagnostico per l’analisi postnatale integrato con lo stu-

dio di segregazione del polimorfismo intragenico Alu. In termini predittivi, è possi-bile escludere le forme cliniche più gravi solo per espansioni inferiori a 150 CTG.

Indicazione all’indagine� Qualora uno dei genitori abbia un rischio del 50% di essere portatore della malattia

va sottoposto al test genetico e solo in seguito si procede all’analisi prenatale, se siritiene necessaria.

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La malattia: mutazioni e fenotipo La distrofia miotonica (DM) è la malattia muscolare più comune dell’adulto (circa1/8.000 individui) è caratterizzata da espressività variabile e si presenta in forme conge-nite, forme con esordio in età infantile o, più spesso, forme con esordio in età adulta.La sintomatologia clinica comprende, in diversa associazione, miotonia, distrofia, arit-mie cardiache, cataratta, calvizie, ipogonadismo, alterazioni della tiroide e intolleranzaal glucosio.

DiagnosiLa diagnosi è prioritariamente clinica e strumentale. L’elettromiografia rileva scarichemiotoniche caratteristiche e l’analisi dell’occhio mediante lampada a fessura rileva lepeculiari opacità nel cristallino. Alla biopsia muscolare non ci sono alterazioni istolo-giche peculiari, anche se a volte si osserva la centralizzazione dei nuclei nelle fibrocel-lule muscolari.

GeneticaAl momento sono conosciuti due geni-malattia che mutati sono responsabili del fenoti-po: il gene DMPK e il gene ZNF9, rispettivamente associati alla DM1 e alla DM2. Lamutazione DM1 (OMIM n. 160900) coinvolge la tripletta nucleotidica CTG normal-mente presente nella regione non tradotta all’estremità 3’ del gene DMPK (DM protei-na chinasi) localizzato sul braccio lungo del cromosoma 19 (19q13.3) ed è presente nel98% circa dei pazienti. La DM2 (OMIM n. 602668) coinvolge la sequenza ripetutaCCTG contenuta nell’introne 1 del gene ZNF9 (zinc finger protein 9). Un terzo locus èstato identificato sul cromosoma 16 in alcune famiglie negative alle mutazioni DM1 eDM2, mentre un altro locus, originariamente mappato sul cromosoma 15 da uno studiodi una sola famiglia nella quale i soggetti affetti manifestano oltre alla sintomatologia tipi-ca anche una demenza frontotemporale, si è rivelato infondato e pertanto non esiste.1,2

Il numero di ripetizioni CTG nel locus DM1 è molto variabile nella popolazione. Gliindividui sani hanno alleli contenenti da 5 a 35 ripetizioni e in questo intervallo gli alle-li sono stabili e non vanno incontro ad amplificazione. Gli alleli con un numero di ripetizioni compreso fra 36 e 49 devono essere consideraticome alleli premutati potenzialmente instabili.Quando la tripletta supera le 50 ripetizioni gli alleli diventano instabili e si ha l’espres-sione della patologia: i pazienti con fenotipo lieve hanno alleli con 50-150 duplicazio-ni di CTG, i pazienti con la forma classica della malattia hanno alleli con 150-1.000copie e nei pazienti con la forma grave (congenita) la tripletta può essere ripetuta più di2.000 volte.

La malattia: mutazioni e fenotipo6

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

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In generale, più è grave la malattia e maggiore è l’espansione CTG; inoltre c’è una cor-relazione significativa fra l’età d’insorgenza della malattia e l’aumento delle ripetizioni.Questa evidenza spiega le basi molecolari della cosiddetta anticipazione della DM nellegenerazioni successive, cioè l’aumento della gravità clinica associato alla più precoce etàdi insorgenza. Il livello d’instabilità intergenerazionale dovuto al numero delle triplettedipende anche dal sesso del genitore affetto: l’incremento è maggiore quando la tra-smissione è materna piuttosto che paterna. Questo spiega la predominante trasmissio-ne materna delle forme congenite, che sono le più gravi dal punto di vista clinico. Per quanto riguarda la DM23 è stato osservato che l’ampiezza dell’espansione CCTGnel gene ZNF9 nei figli affetti è generalmente inferiore a quella presente nei genito-ri, tuttavia il notevole mosaicismo somatico (presenza di espansioni diverse nei diver-si tessuti) rende difficile la conferma di questo risultato. Non è stata invece osservataalcuna correlazione significativa fra l’età di esordio della DM2 e l’ampiezza dell’e-spansione CCTG. La proteina ZNF9, che contiene 7 domini zinc finger, si ritiene leghi l’RNA. Vieneespressa in molti tessuti e i livelli di espressione più alti si trovano nel cuore e nelmuscolo scheletrico, che sono i tessuti prevalentemente coinvolti nella DM2. Il tra-scritto mutante del gene ZNF9 si accumula in foci nucleari in maniera del tutto simi-le a quello che si osserva per il trascritto mutato del gene DMPK nella DM1. Questaosservazione avvalora l’ipotesi corrente di un ruolo patogenetico dell’RNA espanso chesequestrerebbe le proteine che legano la ripetizione CUG/CCUG, necessarie per il pro-cessamento nucleare dell’RNA, sottraendole ad altri trascritti e inibendo così impor-tanti funzioni cellulari.

7La malattia: mutazioni e fenotipo

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

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Analisi genetico-molecolare della malattia di Steinert, Dystrophia myotonica 1 (DM1)

L’analisi diretta dell’espansione della ripetizione CTG mediante la combinazione delletecniche della PCR e del Southern blot permette un’accurata caratterizzazione di tuttele mutazioni DM1.Il Southern blot condotto su DNA genomico trattato con un enzima di restrizione (comeEcoRI, BamHI, NcoI, o BgII) è la procedura di base per l’analisi dei frammenti conte-nenti da 100 a oltre 2.000 duplicazioni di CTG. Fra le numerose sonde per l’ibridazio-ne disponibili presso i laboratori di ricerca ci sono cDNA25, pGB2.6, p5B1.4 e pMDY1.Ma il Southern blot non permette di distinguere gli alleli con piccole espansioni: in que-sto caso l’approccio migliore è l’analisi mediante PCR. Alleli con un numero di ripeti-zioni compreso fra 5 e 200 possono essere facilmente identificati con la PCR, che pre-vede l’utilizzo come primer di oligonucleotidi sintetici complementari alle regioni vici-ne alla sequenza ripetuta. Un ulteriore approccio diagnostico molecolare è rappresentato dalla long PCR che con-sente di amplificare frammenti contenenti da 5 a 3.700 copie di CTG, che includonoquindi tutti gli alleli normali e mutati.4 Questa tecnica prevede una reazione polimera-sica a catena seguita da due fasi, una per la caratterizzazione degli alleli normali o di quel-li con piccole espansioni e un’altra per l’identificazione delle espansioni più grandi. Nel-la prima fase il prodotto di PCR viene sottoposto a elettroforesi capillare per mezzo diun sequenziatore automatico. Qualora vengano individuati due alleli distinti di dimen-sioni normali, il soggetto analizzato è da considerare sano. Se è visibile invece un solosegnale, il campione può essere un omozigote sano oppure un portatore di un allele espan-so e uno normale. In questo caso il prodotto della PCR passa alla seconda fase di ana-lisi in cui viene caricato su un gel di agarosio, trasferito su filtro di nylon e ibridato conuna oligo-sonda [CTG]5. Le tecniche di PCR e di Southern blot per l’analisi diretta delle mutazioni/espansioniDM richiedono una competenza specifica e devono essere condotte in laboratori cherispondano a rigorosi criteri di accuratezza.

Analisi genetico-molecolare della malattia di Steinert, Dystrophia myotonica 1 (DM1)8

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

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Analisi genetico-molecolare della miopatia miotonica prossimale o Promm, sindrome di Ricker (DM2)

L’espansione della sequenza CCTG del locus DM2 viene analizzata mediante long PCRalla quale è necessario affiancare il Southern blot secondo il protocollo descritto in Liquo-ri et al.2 La procedura consente l’analisi di frammenti contenenti un numero di ripeti-zioni CCTG compreso tra 75 e 1.100 ma, a causa della elevatissima instabilità ed ete-rogeneità somatica, la tecnica fallisce nell’evidenziare la mutazione nel 20% dei pazien-ti DM2.3 Per questa ragione sono stati sviluppati metodi diagnostici alternativi che, puressendo incapaci di caratterizzare le espansioni più grandi, riescono però a individuarnesempre la presenza. La metodica della long PCR descritta nel paragrafo precedente hauna sensibilità del 100% per le espansioni comprese tra 5 e 3.700 ripetizioni.La recente caratterizzazione5 di un polimorfismo localizzato nel primo introne del geneZNF9 fornisce uno strumento in più nell’analisi genetico-molecolare della DM2. Que-sto polimorfismo consiste in una sostituzione nucleotidica C/A che crea o distrugge unsito di restrizione ApaI. Tale polimorfismo è risultato essere in linkage disequilibrium conla mutazione DM2.Le tecniche di PCR e/o Southern blot per l’analisi diretta delle mutazioni/espansioni DMrichiedono una competenza specifica e devono essere quindi condotte in laboratori cherispondono a rigorosi criteri di accuratezza.Recentemente alcuni autori6 hanno proposto l’impiego dell’ibridazione in situ pervisualizzare i trascritti abnormi del gene DM2 in sezioni istologiche di biopsie musco-lari. A nostro parere, il test può essere utilizzato in alcuni casi come integrazione deglialtri metodi.

9Analisi genetico-molecolare della miopatia miotonica prossimale o Promm, sindrome di Ricker (DM2)

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

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Indicazioni per i testIndicazioni per l’analisi molecolare della DM1

Test di conferma nei pazienti sintomatici� Conferma della diagnosi clinica: il test è la conferma definitiva per il medico che sta

conducendo la diagnosi in un paziente con sintomi clinici tipici.� Definizione di diagnosi clinica incerta: il test genetico è utile nei casi in cui il pazien-

te abbia un quadro clinico compatibile sia con DM sia con altre patologie.CommentiDal momento che la correlazione fra l’ampiezza dell’espansione e la gravità della malat-tia non è assoluta, non è appropriato fare una predizione della prognosi della malattiasulla base del numero di triplette risultate dall’analisi molecolare. Poiché i risultati deltest genetico hanno conseguenze dirette anche su altri membri della famiglia del pro-bando, la consulenza genetica deve essere disponibile sia per il probando sia per qual-siasi altro membro della famiglia. Recentemente sono stati descritti casi di pazienti conmutazione DM1 con un fenotipo associato alla malattia facio-scapolo-omerale (FSH),in alcuni di questi erano presenti entrambe le mutazioni DM1 e FSH (B. Eymard, comu-nicazione personale).

Test presintomatico in soggetti asintomaticiViene condotto per identificare pazienti asintomatici e consanguinei dei pazienti a sco-po clinico e predittivo, oppure per conoscere il rischio a priori di avere ereditato la muta-zione DM, che viene ridotto a zero in caso di esito negativo.CommentiAl momento attuale non è possibile dare informazioni certe sull’età d’insorgenza dellamalattia o sul tipo di sintomi e sulla loro progressione. Per questo motivo il test su pazien-ti asintomatici deve sempre comprendere la consulenza genetica condotta da personalequalificato ed esperto.

Test sui minoriA meno che non sussistano ragioni mediche pressanti, i minori non dovrebbero esseresottoposti a test genetico. Questa decisione è volta alla tutela dell’individuo che si sot-topone al test, che deve essere in grado di comprendere pienamente le conseguenze delrisultato di tale analisi.Un’eccezione appropriata viene fatta nel caso in cui il minore presenti i sintomi clinicidella malattia: il test genetico in questo caso viene infatti condotto per avere la confer-ma diagnostica della presenza della malattia oppure per monitorare adeguatamete even-tuali gravidanze successive della coppia.

Indicazioni per i test10

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

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Test prenataleIn caso di diagnosi certa di distrofia miotonica in uno dei genitori, il test prenatale puòessere usato per stabilire il rischio del feto di aver ereditato l’allele mutato.Nel caso in cui uno dei genitori abbia un rischio del 50% di essere portatore della malat-tia si procede in due fasi: prima viene sottoposto al test il genitore a rischio e poi si ese-gue l’analisi prenatale solo se è ancora necessaria.Si raccomanda l’esecuzione durante il monitoraggio prenatale anche del test di segre-gazione del polimorfismo Alu di inserzione/delezione del gene DMPK. Questo poli-morfismo è in disequilibrio con la mutazione DM e quindi di grande aiuto diagno-stico, specie durante l’accertamento di espansioni di grandi dimensioni non facilmenteanalizzabili.A causa degli intervalli di sovrapposizione delle dimensioni dell’espansione nellediverse forme della malattia, dell’incertezza riguardo al mosaicismo somatico e all’in-stabilità dell’amplificazione delle triplette nella vita fetale non è possibile predire se ilfeto svilupperà la forma congenita di DM o quella a esordio più tardivo. E’ possibileescludere con una buona attendibilità statistica le forme più gravi in presenza di espan-sioni al di sotto delle 150 CTG. Benché la diagnosi prenatale sia basata sull’analisidiretta della mutazione, è consigliabile effettuare contestualmente l’analisi molecola-re in entrambi i genitori.

11Indicazioni per i test

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

Tipo di test Mutazione Accuratezza Disponibilità analizzata del test di un kit commerciale

DM1 - Analisi diretta Espansione della mutazione trinucleotidica [CTG]n 100% No

DM2 - Analisi diretta Espansione della mutazione tetranucleotidica [CCTG]n 80-100% No

Tabella 1. Test genetico per la distrofia miotonica

Indicazioni per l’analisi molecolare della DM2

Test di conferma nei pazienti sintomatici DM1 negativi Il test è la conferma definitiva della diagnosi clinica in un paziente con sintomi clinicitipici. Il test genetico è utile anche in tutti i casi in cui la diagnosi clinica è incerta ecioè ogni qual volta il paziente mostri un quadro clinico compatibile sia con DM siacon altre patologie.

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CommentiAmpiezza dell’espansione, gravità della malattia ed età di esordio della malattia non sonocorrelate in modo assoluto e pertanto non è possibile fare una predizione della progno-si della malattia sulla base del numero delle ripetizioni risultate all’analisi molecolare.I risultati del test genetico hanno senza dubbio ripercussioni su altri membri della fami-glia del probando, per questo motivo deve essere sempre disponibile la consulenza gene-tica sia per il probando sia per qualsiasi altro familiare.Alcuni autori7 raccomandano di prendere in considerazione il test DM2 in pazienti asin-tomatici che presentano un incremento della creatin chinasi sierica come sola manife-stazione clinica presente.Recentemente sono stati riportati casi di pazienti con mutazione DM2 e un fenotipo carat-teristico della camptocormia. Anche in questi casi si ritiene utile analizzare il gene DM2.

Test preclinico in soggetti asintomaticiViene condotto per determinare quale dei due genitori abbia l’allele mutato in modo daidentificare altri possibili portatori nel ramo familiare di provenienza del genitore. Il test preclinico nei soggetti asintomatici viene eseguito allo scopo di conoscere il rischioa priori di avere ereditato la mutazione DM2.CommentiDal momento che, come detto in precedenza, il dato molecolare non può dare infor-mazioni sull’età di insorgenza o sul tipo di sintomi e sulla loro progressione, il test suipazienti asintomatici deve sempre comprendere la consulenza genetica condotta da per-sonale qualificato ed esperto.

Diagnosi differenzialeTalvolta la distrofia miotonica non è clinicamente diagnosticabile soprattutto alla nasci-ta e spesso richiede la necessità di procedere a una diagnosi differenziale per distinguer-la da altre patologie come la miosite da corpi inclusi (inclusion body myositis, IBM), lamiopatia ereditaria miofibrillare (hereditary myofibrillar myopathy, MFM), la distrofiamuscolare distale e alcune distrofie dei cingoli. Inoltre, è opportuno in alcuni casi procedere alla diagnosi differenziale nei confronti dialtre miotonie dovute a difetti dei canali ionici come la miotonia o miotonia congenitadi Thomsen o di Becker, data da mutazioni nel gene CLCN1, la paramiotonia conge-nita e le sue varianti, data da mutazioni nel gene SCN4A, e la paralisi periodica iperca-liemica data da mutazioni del gene SCN4A. Occasionalmente sono stati riportati in letteratura casi di diagnosi errate, soprattutto perla forma congenita di DM1, confusa con l’atrofia muscolare spinale di tipo I (SMA). Intutte queste situazioni la diagnosi molecolare genetica è non solo opportuna ma anchenecessaria.

Indicazioni per i test12

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

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RiservatezzaMantenere la riservatezza riguardo ai risultati delle analisi molecolari dei soggetti che sisottopongono al test è una responsabilità etica e legale del laboratorio di analisi e di chiesegue il test. La riservatezza è molto importante per prevenire la discriminazione neiriguardi dei soggetti sottoposti alla valutazione.

Informazioni al pazienteIl paziente deve essere informato riguardo al test genetico e deve essere messo a cono-scenza di tutte le caratteristiche della malattia e della sua variabilità fenotipica, soprat-tutto nel caso del test presintomatico. Deve conoscere le modalità di esecuzione dell’a-nalisi e deve essere consapevole delle conseguenze che il risultato del test può avere sul-la sua persona e sui suoi familiari. Deve, inoltre, essere messo a conoscenza di tutti i sup-porti di natura medica, genetica, psicologica ed etica messi a sua disposizione dalla strut-tura di riferimento durante e dopo la fase diagnostica. Prima di iniziare qualsiasi gene-re di indagine, il paziente deve fornire il consenso informato che va sempre formalizza-to in forma scritta.Dal momento che i campioni di DNA utilizzati a scopo di ricerca e per la diagnosi appar-tengono all’individuo da cui sono stati ottenuti, si raccomanda che ogni laboratorio ela-bori un modulo per il consenso informato in cui si richiedano anche le indicazioni perla conservazione del campione di DNA dopo l’esecuzione del test. Le indicazioni richie-ste riguardano:� il permesso di conservare il DNA dopo l’esecuzione del test; � il permesso di utilizzare il DNA per futuri test a scopo diagnostico senza bisogno di

ulteriore consenso;� la possibilità di utilizzare il campione di DNA per scopi di ricerca.

13Indicazioni per i test

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

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1. Le Ber I, Martinez M, Campion D,Laquerriere A, Betard C, Bassez G,Girard C, Saugier-Veber P, Raux G,Sergeant N, Magnier P, Maisonobe T,Eymard B, Duyckaerts C, DelacourteA, Frebourg T, Hannequin D. A non-DM1, non-DM2 multisystem myotonicdisorder with frontotemporal demen-tia: phenotype and suggestive map-ping of the DM3 locus to chromoso-me 15q21-24. Brain 2004; 127:1979-92.

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6. Sallinen R, Vihola A, Bachinski LL,Huoponen K, Haapasalo H, Hack-man P, Zhang S, Sirito M, Kalimo H,Meola G, Horelli-Kuitunen N, Wes-sman M, Krahe R, Udd B. Newmethods for molecular diagnosis anddemonstration of the (CCTG)n muta-tion in myotonic dystrophy type 2(DM2). Neuromuscul Disord 2004;14: 274-83.

7. Merlini L, Sabatelli P, Columbaro M,Bonifazi E, Pisani V, Massa R, Novel-li G. Hyper-CK-emia as the solemanifestation of myotonic dystrophytype 2. Muscle Nerve 2005; 31:764-7.

Bibliografia essenziale14

Analisi genetico-molecolare della distrofia miotonica

Bibliografia essenziale

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Finito di stampare nel mese di novembre 2005 presso Geca - Cesano Boscone, Milano