Uji Mikroba Dalam Bahan Pangan

Mikroba pada bahan makanan

• Terdiri dari berbagai spesies yang berasal dari berbagai lingkungan

• Populasinya tergantung dari penerapan proses sanitasi, proses pengolahan dan kontrol yang digunakan untuk membunuh mikrobia (metoda preservasi)

Tujuan melakukan analisa mikrobiologi

• Menentukan jenis dan sumber kontaminan• Evaluasi proses sanitasi, penanganan bahan dasar

dan proses pengolahan• Menentukan kualitas mikrobiologis makanan atau

untuk mengetahui mutu bahan pangan • Menentukan umur simpan makanan

Metoda Kuantitaif

• Enumerasi atau estimasi langsung atau tidak langsung

• Aerobic Plate Counts (standard plate counts untuk dairy products), anaerobic counts, psychrotrophic counts, thermoduric counts, coliform counts, S. aureus counts, yeast and mold counts.

Metoda Kualitatif

• Bakteri patogen (positif atau negatif)• Salmonella, E. coli O157:H7, Clostridium

botulinum, Listeria dll

Metoda Cepat

• ELISA • Nucleic Acid Probe

METODE KUANTITAFCara yang dapat digunakan untuk menghitungJumlah mikroba dalam bahan pangan adalah :1. Perhitungan massa sel secara langsung a. volumetrik b. gravimetrik c. kekeruhan (turbidimetri)2. Perhitungan massa sel secara tidak langsung a. analisis komponen sel b. analisis produk metebolisme c. analisis konsumsi nutrien

3. Perhitungan jumlah sel a. hitungan (enumerasi) atau estimasi langsung dan tidak langsungb. Aerobic Plate Counts (standard plate counts

untuk dairy products), anaerobic counts, psychrotrophic counts, thermoduric counts, coliform counts, S. aureus counts, yeast and mold counts.

• Hitungan massa sel secara langsung dan tidak langsung jarang digunakan dalam uji mikrobiologi bahan pangan, tetapi sering digunakan untuk mengukur pertumbuhan sel selama proses fermentasi.

• Dalam hitungan massa sel secara langsung, jumlah sel mikroba dapat dihitung jika medium pertumbuhannya tidak mengganggu pengukuran .

• Perhitungan massa sel secara tidak langsung sering digunakan dalam mengamati pertumbuhan sel selama proses fermentasi, dimana komposisi substrat atau bahan yang difermentasi dapat diamati dan diukur dengan teliti.

Enumerasi langsung

• Hitungan mikroskopik (Microscopic Counts)• Hitungan Cawan (CFU – Colony Forming Unit)– Non selective agar media (PCA)– Nonselective differential agar media– -selective agar media– Selective differential agar media

Enumerasi tidak langsung

• MPN • Dye reduction test• Pengenceran - nonselective media cair –

jarang digunakan

Hitungan mikroskopik1. Metode breed• Sering digunakan untuk menganalisis susu yang

mengandung bakteri dalam jumlah tinggi• Merupakan cara cepat, yaitu menghitung bakteri

secara langsung menggunakan mikroskop• Cara ini mempunyai kelemahan yaitu tidak dapat

dilakukan terhadap susu yang telah dipasteurisasi karena secara mikroskopik tidak dapat dibedakan antara sel-sel bakteri yang masih hidup atau yang telah mati, karena perlakuan pasteurisasi.

2. Metode Petroff-Hausser• Hitungan mikroskopik dengan metode ini

dilakukan dengan pertolongan kotak-kotak skala• dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2

terdapat 25 kotak besar dengan luas 0,04 mm2 dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil• Tinggi contoh yang terletak diantara gelas

obyek dengan gelas penutup adalan 0,02 mm• Jumlah sel dalam beberapa kotak besar

dihitung, kemudian dihitung jumlah sel rata-rata dalam satu kotak besar.

Petroff-Hausser Chamber Slide

Kelemahan metode ini :• Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari

sel yang hidup• Sel-sel yang berukuran sangat kecil sukar dilihat

dibawah mikroskop, sehingga kadang-kadang tidak dihitung.

• Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel didalam suspensi harus tinggi, misalnya untuk bakteri minimal 106 sel/ml. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung.

• Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan pangan yang hanya mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal ini akan mengganggu dalam perhitungan.

Hitungan cawan•Prinsip metode ini adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.

• Metode ini merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan mikroba, karena :a. hanya sel yang masih hidup yang dapat dihitungb. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligusc. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba

karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu mikroba yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik.

Kelemahan metode ini :• Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel

yang sebenarnya, karena beberapa sel berdekatan mungkin membentuk satu koloni

• Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.

• Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.

• Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.

Hal yang perlu diperhatikan dalam metode hitungan cawan :• Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel

mikroba per ml atau per gram atau per cm (jika pengambilan contoh dilakukan pada permukaan)

• Memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri

• Setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah diantara 30 sampai 300 koloni.

• Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000, dan seterusnya.

• Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer fosfat 0,85%, NaCl atau larutan ringer.

Dilution and Plate Count (1)

Cara pemupukan dalam metode hitungan cawan yaitu :1. Metode tuang (pour plate)2. Metode permukaan (spread plate)

Dilution and Plate Count (2)

Metode MPN (Most Probable Number)• Dalam metode ini menggunakan medium cair didalam

tabung reaksi.• Perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah tabung

yang positif yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.

• Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil(durham) yang diletakkan pada posisis terbalik.

• Setiap pengenceran umumnya digunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi.

Hal yang perlu diperhatikan dalam metode MPN:• Pengenceran harus dilakukan lebih tinggi dari

pengenceran dalam hitungan cawan.• Beberapa tabung yang berisi medium cair yang

diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung satu sel mikroba, beberap mungkin mengandung lebih dari satu sel sedangkan tabung lainnya tidak mengandung sel.

• Setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, dan dinyatakan sebagai tabung positif, sedangkan tabung lainnya negatif.

Uji mikrobiologi pada bahan makanan

7 Total mikrobia (bakteri, jamur, yeast)6 Plate Count5432 Bakteri indikator : Coliform/E.coli1 MPN0-1 Bakteri patogen -2 Media resusitasi-3 Media diperkaya-4 Media selektif-5 Isolasi dan identifikasi-6Log jumlah sel

Deteksi mikrobia pada makanan

• Total mikrobia (bakteri, yeast, jamur/mold)• Bakteri indikator

• Coliform, fecal coliform, E. coli, Grup Enterobacteriacea Enterococci

• Bakteri pathogen• Classical pathogen (Salmonella, Shigella, EPEC E. coli• Emerging pathogen (Vibrio, Listeria monocytogenes, Yersinia,

Campylobacter jejuni, dll)

Kriteria bakteri indikator dan pathogenBerkaitan dengan feses dan pathogen enterikLevel/rasio eksistensinya pada feses, bakteri indikator dan enterikResistensinya terhadap lingkungan (habitat) alami (feses dan makanan)Resistensinya terhadap berbagai kondisi (proses dan penyimpanan makanan)Waktu yang dibutuhkan untuk deteksi

Prosedur Sampling• Gunakan wadah yang steril• Jaga tangan selalu bersih dan kering • Jangan membalik atau menjatuhkan tutup botol• Jangan memasukkan plastik sampel yang belum steril kedalam saku baju • Jangan mengkontaminasi bagian atas ataupun bagian dalam plastik

sampel.• Cuci peralatan sampling sebelum digunakan• Isi didalam wadah tidak lebih dari 2/3 atau 3/4 –nya• Jangan memegang wadah (belum tertutup) melewati permukaan sampel

ketika sampel tersebut dipindahkan• Dinginkan sampel pada suhu 0-4,4oC• Pindahkan sampel dalam wadah untuk pengiriman ke laboratorium• Setelah digunakan, kembalikan wadah sampel ke laboratorium untuk

disterilkan kembali

Standard Plate Count (SPC)

Standard di dalam equipment, material dan inkubasi

Equipment – tempat kerja, kabinet, refrigerator, termometer, transfer pipet, botol untuk pengenceran, cawan Petri, timbangan, waterbath, autoclave, inkubator, dll

Penyimpanan sampel suhu 4,4 C, waktu pengujian < 36 jam

Media – Standard method agar (Plate count Agar)Pancreatic digest of casein (tripton) 5,0 gYeast extract 2,5 gGlucose 1,0 gAgar 15,0 gDW s/d 1 literpH (setelah sterilisasi) 7.0 + 0,2

Inkubasi 32 + 1C, 48 + 3 jam untuk mesofilik

Untuk termofilik : 55 + 1 C selama 48 jam, sebagai TBC/ml atau g

Untuk psikrofilik : 7 + 1 C selama 10 hari, sebagai PBC/ml atau g