Analyse von Arzneipflanzen-assoziierten Mikroorganismen

Martina KOEBERL, Bakk. rer. nat.

Analyse von Arzneipflanzen-assoziierten

Mikroorganismen:

Biodiversität und antagonistisches Potenzial

gegen bodenbürtige Phytopathogene

MASTERARBEIT

zur Erlangung des akademischen Grades

Master of Science

der Studienrichtung Molekulare Mikrobiologie

an der Naturwissenschaftlichen Fakultät der

Karl-Franzens-Universität Graz

unter der Betreuung von

Univ.-Prof. Dipl.-Biol. Dr. rer. nat. Gabriele Berg

Institut für Umweltbiotechnologie

Technische Universität Graz

veröffentlicht im März 2010

Abstract

SEKEM ist eine ägyptische Kulturinitiative und ein Fair Trade-Unternehmen, wo seit mehr

als 30 Jahren biologisch-dynamische Landwirtschaft betrieben wird. Medikamente, welche

aus ökologisch gezogenen Arzneipflanzen gewonnen werden, werden international

vermarktet. Deren Anbau ist allerdings immer mehr von bodenbürtigen Phytopathogenen wie

Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum betroffen, wodurch es zu

erheblichen Ertragseinbußen kommt. Eine mögliche, umweltfreundliche und nachhaltige

Lösung des Problems wäre die Einführung von biologischen Kontrollstämmen (Biological

Control Agents, BCA). Durch die Einbringung von BCAs kann die Vitalität und die

natürliche Biodiversität des Bodens wieder hergestellt werden.

In dieser Arbeit wurden Mikroorganismen aus der Rhizo- und Endorhizosphäre von

ägyptischen Arzneipflanzen (Matricaria chamomilla, Calendula officinalis und Solanum

distichum) sowie aus ägyptischen Böden isoliert und auf ihr antagonistisches Potenzial gegen

die in SEKEM auftretenden bodenbürtigen Phytopathogene gescreent. Potenzielle

Kontrollstämme wurden morphologisch, physiologisch und genotypisch charakterisiert und

identifiziert. Zusätzlich wurde die bakterielle und pilzliche Biodiversität in der Rhizo- und

Endorhizosphäre der Arzneipflanzen und im Boden durch kultivierungsunabhängige

Methoden untersucht. Dabei wurde die Single Strand Conformation Polymorphism

(SSCP)-Analyse von PCR-amplifizierten 16S rDNA- bzw. ITS-Fragmenten verwendet.

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG ........................................................................................... 1

1.1 SEKEM – Das Wunder der Wüste ...........................................................................1

1.2 Arzneipflanzen ..........................................................................................................2

1.2.1 Matricaria chamomilla ...........................................................................................2

1.2.2 Calendula officinalis ...............................................................................................4

1.2.3 Solanum distichum ..................................................................................................5

1.3 Phytopathogene .........................................................................................................6

1.3.1 Verticillium dahliae .................................................................................................6

1.3.2 Rhizoctonia solani ...................................................................................................6

1.3.3 Fusarium culmorum ................................................................................................7

1.4 Antagonismen: Amensalismus und Parasitismus ....................................................7

1.5 Aufgabenstellung ......................................................................................................8

2. MATERIAL UND METHODEN ........................................................... 10

2.1 Herstellernachweis .................................................................................................. 10

2.2 Nährmedien ............................................................................................................. 10

2.3 Probennahme .......................................................................................................... 13

2.4 Isolation von Mikroorganismen aus dem Probenmaterial .................................... 14

2.4.1 Bestimmung der Lebendzellzahl ........................................................................... 15

2.4.2 Herstellung von Einzelisolaten .............................................................................. 16

2.4.3 Stammhaltung ....................................................................................................... 17

2.5 Analyse des antagonistischen Potenzials der isolierten Mikroorganismen ........... 17

Inhaltsverzeichnis

2.6 Genotypische Charakterisierung der bakteriellen Isolate mit

antagonistischem Potenzial ..................................................................................... 19

2.6.1 Puffer und Lösungen ............................................................................................. 19

2.6.2 Standard DNA Ladders ......................................................................................... 20

2.6.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................................................................ 21

2.6.4 Agarosegelelektrophorese ..................................................................................... 22

2.6.5 ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis) .................................................. 23

2.6.6 BOX-PCR ............................................................................................................. 26

2.6.7 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung ..................................... 28

2.7 Untersuchung der bakteriellen Antagonisten auf das Bildungsvermögen

des Phytohormons Indol-3-essigsäure .................................................................... 29

2.8 Isolation der Gesamt-DNA aus dem Probenmaterial ............................................ 30

2.9 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen Biodiversität

mittels SSCP-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism

Analysis) .................................................................................................................. 32

2.9.1 DNA-Isolation aus Gelbanden zur Identifizierung von Mikroorganismen .............. 43

3. ERGEBNISSE ......................................................................................... 45

3.1 Mikrobielle Abundanzen in Rhizosphäre, Endorhizosphäre und Boden ............. 45

3.2 Analyse des antagonistischen Potenzials der isolierten Mikroorganismen ........... 46

3.2.1 Morphologische Gruppierung der stärksten Antagonisten ...................................... 50


antagonistischem Potenzial ..................................................................................... 51

3.3.1 ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis) .................................................. 51

3.3.2 BOX-PCR ............................................................................................................. 55

3.3.3 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung ..................................... 58

3.4 Untersuchung der bakteriellen Antagonisten auf das Bildungsvermögen

des Phytohormons Indol-3-essigsäure .................................................................... 59

Inhaltsverzeichnis

3.5 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen Biodiversität

mittels SSCP-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism

Analysis) .................................................................................................................. 60

3.5.1 Analyse der bakteriellen Community..................................................................... 60

3.5.2 Analyse der Pilz-Community ................................................................................ 71

4. DISKUSSION .......................................................................................... 75

4.1 Kultivierungsabhängige Analyse des antagonistischen Potenzials gegen

bodenbürtige Phytopathogene ................................................................................ 75

4.2 Kultivierungsunabhängige Analyse der mikrobiellen Biodiversität ..................... 78

5. ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................... 82

6. LITERATURVERZEICHNIS ................................................................ 84

7. DANKSAGUNG ...................................................................................... 92

Abkürzungsverzeichnis


Abb. Abbildung

APS Ammoniumpersulfat

A Amper

ARDRA Amplified rDNA Restriction Analysis

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bzw. beziehungsweise

BCA Biological Control Agent (Biologischer Kontrollstamm)

BSA Bovine Serum Albumine (Rinderserumalbumin)

Co Calendula officinalis

C Celsius

ca. circa

cfu Colony Forming Units (Kolonie-bildende Einheiten)

CDB Czapek Dox Broth

deion. deionisiert

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Desoxyribonukleosid-5‟-triphosphate

dest. destilliert

DMSO Dimethylsulfoxid

DES DNase/Pyrogen-Free Water

ds double-stranded

Re Endorhizosphäre

Eppi Eppendorf Reaktionsgefäß

g Erdbeschleunigung

et al. et alteri (und andere)

etc. et cetera (und so weiter)

EDTA Ethylendiamintetraacetat

f forward

fw Fresh Weight (Frischgewicht)

° Grad

g Gramm

ha Hektar

h Hour (Stunde)


HP Hyperparasitismus

IAA Indol-3-acetic acid (Indol-3-essigsäure)

ITS Internal Transcribed Spacer

k kilo

konz. konzentriert

l Liter

Mc Matricaria chamomilla

m Meter

µ mikro

m milli

min Minute

M Molar; mol/Liter

NA Nähragar

NB Nährbouillon

n nano

NCBI National Center for Biotechnology Information

Nr. Nummer

ONC Over Night Culture (Übernachtkultur)

pH pH-Wert; negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration

PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria

PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion)

PDA Potato Dextrose Agar

PPS Protein Precipitation Solution

% Prozent

RT Raumtemperatur

r reverse

RNA Ribonukleinsäure

r ribosomale

rpm Rounds per Minute (Umdrehungen pro Minute)

Sb SEKEM-Boden

s Sekunde

SSCP Single Strand Conformation Polymorphism

ss single-stranded

Sd Solanum distichum


Std. Standard

SD Standard Deviation (Standardabweichung)

SNA Synthetic Nutrient Agar

Tab. Tabelle

TEMED N, N, N, N-Tetramethylethylendiamin

TSM Trichoderma Selective Medium

TAE Tris-Acetat-EDTA

TBE Tris-Borat-EDTA

Tris Tris-Hydroxymethyl-Amminomethan

UV ultraviolett

U Unit

V Volt

v volume (Volumen)

WA Waksman Agar

w weight (Gewicht)

Wb Wüstenboden

ZMF Zentrum für medizinische Grundlagenforschung

z. B. zum Beispiel

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1 SEKEM – Das Wunder der Wüste

SEKEM liegt etwa 60 km nordöstlich von Kairo und ist eine ägyptische Kulturinitiative und

ein Fair Trade-Unternehmen. Im Jahr 1977 erschloss der Gründer Dr. Ibrahim Abouleish

70 ha trockenen, heißen Wüstenboden, auf welchem biologisch-dynamische Landwirtschaft

betrieben werden soll. Aus einst reinem Sandboden ist ein ökologisches Paradies gewachsen.

SEKEM umfasst heute nicht nur die Mutterfarm mit 138 zertifizierten Demeter-Höfen und

Kooperationen mit 850 Kleinbauern, die überall in Ägypten auf mehr als 4.100 ha

biologisch-dynamische Landwirtschaft betreiben und die Produkte gemeinsam vermarkten.

SEKEM ist ebenso eine Unternehmens-Holding aus neun erfolgreichen Firmen, die

Lebensmittel, Gewürze und Tees herstellen, verarbeiten und exportieren. Ökologisch

angebaute Baumwolle wird zu gesunder Kinderkleidung verarbeitet und Medikamente,

welche aus den biologisch angebauten Arzneipflanzen gewonnen werden, werden

international vermarktet.

Zur SEKEM-Gemeinschaft, die rund 2.000 Menschen Arbeit gibt, gehören Kindergärten, eine

Polyklinik, Schulen, Behinderteneinrichtungen, Einrichtungen zur Erwachsenenbildung,

Forschungseinrichtungen und eine Universität. Weiters initiiert die SEKEM Development

Foundation Tanz-, Kunst- und Theaterprojekte und Straßenkinderinitiativen. Rund 30.000

Menschen sind in Ägypten an das Netzwerk angeschlossen, die SEKEM-Klinik versorgt

40.000 Ägypter medizinisch.

SEKEM ist ein Entwicklungsimpuls, der zunehmend an regionaler, nationaler und

internationaler Bedeutung gewinnt. Dr. Ibrahim Abouleish wurde 2003 für sein Lebenswerk

mit dem Alternativen Nobelpreis (Right-Livelihood-Award) ausgezeichnet (Abouleish, 2005).

Einleitung

2

1.2 Arzneipflanzen

In SEKEM werden unter anderem Arzneipflanzen angebaut. Deren Anbau ist in letzter Zeit

allerdings vermehrt durch bodenbürtige Phytopathogene betroffen. Für die Probennahme

wurden die 3 Arzneipflanzen Matricaria chamomilla, Calendula officinalis und Solanum

distichum ausgewählt.

1.2.1 Matricaria chamomilla L.

Die Kamille ist aufgrund der phytochemischen, pharmakologischen und klinischen

Forschungsergebnisse sowie ihrer medizinischen Bedeutung seit dem Altertum eine

bemerkenswerte Arzneipflanze. Es gibt nur ganz wenige pflanzliche Drogen, über die eine

ähnlich große Anzahl qualitativ hochwertiger Publikationen existiert (Schilcher, 1987).

Nach der systematischen Nachuntersuchung von Rauschert (Rauschert, 1974) wird die

Gattung Matricaria aufgeteilt in Tripleurospermum Schultz Bip. und Matricaria sensu stricto.

Die Matricaria chamomilla zählt dabei zur Gruppe der Matricaria sensu stricto. Linné scheint

diese Gattungen nicht getrennt zu haben, wobei von ihm der Name Matricaria chamomilla

eher für Matricaria maritima – eine Art der Gattung Tripleurospermum Schultz Bip. – als für

Matricaria chamomilla im modernen Sinne verwendet wurde. Für unsere

medizinisch-pharmazeutisch genutzte Kamille hat Linné den Namen Matricaria recutita

verwendet. Rauschert weist darauf hin, dass bei einer Aufspaltung der von Linné

bezeichneten Gattung Matricaria der abgespaltene Teil mit unserer arzneilich verwendeten

Kamille den Namen Chamomilla A. Gray tragen muss und dass ferner für die Gattung

Tripleurospermum Schultz Bip. die Bezeichnung Matricaria L. sensu stricto richtig wäre. Aus

diesem Grund erscheinen in der Literatur für die medizinisch genutzte Kamille

unterschiedliche Namen: Chamomilla recutita (L.) Rauschert oder Matricaria chamomilla L.

(syn. Matricaria recutita L.) (Tutin et al., 1976).

Es ist noch nicht eindeutig geklärt, ob innerhalb der Art Matricaria chamomilla chemische

Rassen existieren. Untersuchungen verschiedener Arbeitskreise deuten darauf hin, dass es

genetisch bedingte chemische Variationen in lokalen Populationen gibt

(Salamon, 2004; Schilcher, 1985; Honcariv & Repcak, 1979; Franz et al., 1978).

Einleitung

3

Die Kamilleninhaltsstoffe kann man in zwei Gruppen unterteilen:

Lipophile Inhaltsstoffe: dazu gehören die Einzelkomponenten des ätherischen Öles,

Cumarine, methoxylierte Flavonaglyka, Phytosterole sowie lipidische und wachsartige

Substanzen.

Hydrophile Inhaltsstoffe: hierzu zählen Flavonoide, Schleim, Phenylcarbonsäuren,

Aminosäuren und Cholin (Streibel, 1980; Franke & Schilcher, 2005).

Die Kamille ist seit Jahrhunderten bekannt und in der Therapie eingeführt. In der

volksmedizinischen Überlieferung finden wir sie in Form des Kamillentees, der innerlich bei

schmerzhaften, mit Krämpfen verbundenen Magen- und Darmstörungen wie Durchfall und

Blähungen, aber auch bei entzündlichen Magen- und Darmerkrankungen wie Gastritis und

Enteritis getrunken wird. Äußerlich findet die Kamille in Form heißer Kompressen bei

schlecht heilenden Wunden, als Sitzbad bei Abszessen, Furunkeln, Hämorrhoiden und

Frauenkrankheiten, als Mundspülung bei Entzündungen der Mund- und Rachenhöhle, als

Kamillendampfbad zur Behandlung der Akne vulgaris, zur Inhalation bei Schnupfen und

Bronchitis sowie als Zusatz zu Säuglingsbädern Verwendung (Schilcher, 1987).

Die Richtigkeit der empirischen Kamillenanwendung ist in den letzten Jahren durch

eingehende Untersuchungen bestätigt worden. Allerdings hat sich gezeigt, dass ein

haushaltsüblich durch Übergießen von Kamillenblüten hergestellter Kamillentee nur einen

kleinen Bruchteil (10 – 15 %) des in der Droge vorhandenen ätherischen Öles enthält. Der

größte Teil der wichtigen, antiphlogistisch wirkenden Bestandteile des ätherischen Öles wird

mit den überbrühten Pflanzenteilen fortgeschüttet und bleibt ungenutzt. Wohl aber enthält die

Teezubereitung eine Reihe wasserlöslicher Flavonoide mit deutlich krampflösender und, wie

sich in Untersuchungen herausgestellt hat, bei lokaler Anwendung auch

entzündungshemmender Wirkung (Della Loggia, 1985).

Da der therapeutische Wert der Kamille nicht auf einem einzelnen Hauptwirkstoff sondern

auf dem Zusammenwirken vieler Einzelstoffe beruht, deren tierexperimentell und klinisch

nachgewiesene Effekte sich zu der für ein breites Indikationsgebiet geeigneten

Gesamtwirkung vereinigen, ist natürlich ein Kamillenextrakt, das alle Komponenten in

optimaler Konzentration enthält, dem haushaltsüblichen Aufguss vorzuziehen.

Einleitung

4

Die wichtigsten Komponenten sind Chamazulen mit unbestrittener antiphlogistischer

Wirkung (Isaac & Schimpke, 1965) sowie (-)-α-Bisabolol, ein Sesquiterpenalkohol mit

antiphlogistischen, antibakteriellen, antimykotischen sowie ulkusprotektiven und

muskulotrop-spasmolytischen Eigenschaften. Beide sind Hauptbestandteile des ätherischen

Öles. Die Kamillenflavone sind sowohl muskulotrop spasmolytisch als auch bei lokaler

Anwendung antiphlogistisch wirksam. Weitere wichtige Innhaltsstoffe sind die Bisaboloxide,

cis- und trans-Spiroether, Cumarine und Schleim (Schilcher, 1987).

1.2.2 Calendula officinalis L.

Die Ringelblume ist eine alte Kulturpflanze, deren Ursprung in den Höhen des Atlas-Gebirges

im nordwestlichen Afrika vermutet wird. Mit ihren leuchtend gelben oder orangeroten

Blütenköpfchen wird sie in vielen Teilen der Welt als Gartenpflanze kultiviert. Die

Ringelblume stellt geringe Ansprüche an Boden und Düngung. Sie ist wärmeliebend, aber

dennoch wenig kälteempfindlich (Heeger, 1956; Dachler & Pelzmann, 1989).

Seit alters her wird der Ringelblume besonders ein positiver Einfluss auf die Funktionen der

Haut zugeschrieben. Im Vordergrund steht dabei die Anwendung bei schlecht heilenden oder

eiternden Wunden, Verbrennungen, Krampfadern und Venenentzündungen. Aber auch in der

Schönheitspflege als Hauttonikum und zum Schutz empfindlicher Haut spielen

Ringelblumenzubereitungen eine nicht unbedeutende Rolle. So ist es nicht verwunderlich,

dass neben der Selbstmedikation auch die Kosmetik sich der Ringelblume in den letzten

Jahren in erstaunlichem Maße angenommen hat. Die innerliche Anwendung beschränkt sich

auf Magen-Darm-Beschwerden und Frauenkrankheiten (Isaac, 1992).

Mit der Verwendung in der Heilkunde und in der Kosmetik nimmt auch das wissenschaftliche

Interesse an der Ringelblume ständig zu. Die Wirkprinzipien der Calendula sind noch nicht

eindeutig geklärt. Das Augenmerk richtet sich vor allem auf die in den Blüten reichlich

vorhandenen Triterpenalkohole (Adler & Kasprzyk, 1976). Den Triterpendiolen, besonders

den Faradiol-3-monoestern, kommt bei topischer Applikation eine dosisabhängige

antiinflammatorische Aktivität zu. Unter den Calendula-Flavonoiden sind vor allem die

Isorhamnetinglykoside charakteristisch (Vidal-Ollivier et al., 1989). Das ätherische Öl,

welches für den charakteristischen Geruch der Ringelblumen verantwortlich ist, besteht aus

Monoterpenen und Sesquiterpenen (Janssen, 1989; Marczal et al., 1987). Hervorzuheben sind

Einleitung

5

weiters die für Asteraceen ungewöhnliche Abwesenheit von Sesquiterpenlactonen, welche

häufig Kontaktallergien verursachen und das fette Öl der Samen, das zu 50 – 60 % aus

Calendulasäure – einer ungesättigten Fettsäure mit einer ungewöhnlichen Struktur – besteht

(Takagi & Itabashi, 1981).

Die Extrakte der Ringelblume sind antimikrobiell wirksam (Spaich, 1977;

Wolters 1966; Bogdanova et al., 1977), sie hemmen das Wachstum von Bakterien, Pilzen und

Viren. Ein Teil dieser Aktivität ist auf Bestandteile des ätherischen Öles zurückzuführen

(Janssen, 1989). In Tierversuchen sind Calendula-Extrakte gegen mehrere Typen von

Krebszellen wirksam (Boucaud-Maitre et al., 1988). Neben der antiinflammatorischen,

immunstimulierenden und wundheilenden Wirkung wurden weiters ulkusprotektive und

vasoprotektive Effekte nachgewiesen (Isaac, 1992).

1.2.3 Solanum distichum Schumach. & Thonn.

Solanum distichum gehört wie z. B. auch die Kartoffel (Solanum tuberosum) zur Familie der

Solanaceae (Nachtschattengewächse). Bei Solanum distichum handelt es sich um eine

semi-domestizierte Art, er ist deshalb als Kultivar-Gruppe des wilden Solanum anguivi

einzuordnen. Solanum distichum besitzt im Gegensatz zu seinem Vorfahren keine Stacheln

mehr und ist wahrscheinlich selbst der Vorfahre der afrikanischen Aubergine Solanum

aethiopicum L. Der Solanum distichum ist in Afrika heimisch und weit über den gesamten

Kontinent verbreitet. Er bevorzugt humide Böden und ist nur sehr selten in trockenen

Gebieten anzufinden. Der Anbau wird bis jetzt selten praktiziert. Solanum distichum ist

widerstandsfähig gegen Krankheiten und Schädlinge, die viele andere Solanum-Arten

befallen.

Bei der Frucht handelt es sich um Beeren mit 7 – 18 mm Durchmesser. Sie sind glatt, wenn

sie reif sind rot und in Gruppen von bis zu 20 Früchten angeordnet. Diese eignen sich nicht

nur zum Verzehr, daraus wird auch ein Medikament gegen hohen Blutdruck hergestellt. Der

Nährwert der Früchte ist noch nicht genau bekannt, aber er ist wohl vergleichbar mit Früchten

der verwandten Art Solanum aethiopicum L. (Grubben & Denton, 2004; Bukenya, 1993). Die

Wurzel beinhaltet Solamargine und Steroid-Alkaloid-Glykoside (Anguivin und Isoanguivin).

Aus den Früchten wurden bereits drei steroidale Glykoside isoliert (Anguivioside A – C)

(Abouzid et al., 2008).

Einleitung

6

Im Gegensatz zu Solanum nigrum und Solanum dulcamara findet Solanum distichum noch

kaum als Arzneimittel Verwendung. Seine blutdrucksenkende Wirkung wurde allerdings

bereits erwiesen (Bahgat et al., 2008).

1.3 Phytopathogene

Die größten Probleme im Arzneipflanzen-Anbau werden durch die bodenbürtigen

Phytopathogene Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum verursacht.

1.3.1 Verticillium dahliae Kleb.

Verticillium dahliae ist ein bodenbürtiges Phytopathogen und gehört zur Klasse der

Ascomyceten. Der Pilz verursacht bei seinen Wirtspflanzen Tracheomykosen, indem er die

Wasserleitungsbahnen der Pflanze verstopft. Dabei kommt es zum Welken und Abfallen von

Blättern und Trieben bis hin zu ganzen Zweigen und Ästen, aus diesem Grund wird die

Krankheit auch als Verticillium-Welke bezeichnet. Bei kritischen Umweltbedingungen ist der

Erreger in der Lage in Form von Mikrosklerotien – seiner Dauerform – über Jahre im Boden

zu persistieren. Das Wirtsspektrum des Pilzes ist relativ breit, darunter befinden sich

z. B. Kulturpflanzen wie Baumwolle, Kartoffel, Raps, Olive und Erdbeere

(Tjamos et al., 2000; Rowe et al., 1987; Svennson & Lerennius, 1987; Talboys, 1970).

1.3.2 Rhizoctonia solani Kühn

Rhizoctonia solani bezeichnet die anamorphe Form von Thanatephorus cucumeris

(A.B. Frank) Donk, welcher zu den Basidiomyceten zählt. Rhizoctonia solani ist ebenfalls ein

bodenbürtiges Phytopathogen, das weltweit verbreitet ist. Der Pilz befällt ein breites

Spektrum an Wirtspflanzen, darunter befinden sich auch einige wichtige Kulturpflanzen wie

z. B. die Kartoffel (Weißhosigkeit) und die Zuckerrübe (Späte Rübenfäule), wodurch es zu

erheblichen Ertragsausfällen kommt (Börner, 2009; Adams, 1988; Davis et al., 1997).

Rhizoctonia solani kann in Form von Sklerotien – der kälte- und austrocknungsresistenten

Dauerform des Pilzes – über viele Jahre überdauern und wächst bei günstigen Bedingungen

wieder aus (Faltin et al., 2004). Der Pilzbefall tritt vor allem in moderat nassen Böden auf.

Einleitung

7

Die Infektionstemperatur liegt meist zwischen 15 und 18 °C, es gibt aber einzelne Stämme,

die Pflanzen bei bis zu 35 °C infizieren können.

Rhizoctonia solani kann in Anastomose-Gruppen (AGs) unterteilt werden. Bisher wurden 13

verschiedene AGs beschrieben (Anderson, 1982; Carling et al., 2003), für die eine gewisse

Wirtsspezifität gezeigt werden konnte. Die unterschiedlichen AGs bevorzugen teilweise auch

unterschiedliche Infektionstemperaturen. Die Anastomose-Gruppen können weiter in

Pathotypen unterteilt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde Rhizoctonia solani AG4

verwendet, dieser ist für die Umfallkrankheiten an Radies und Zuckerrübe verantwortlich

(Scherwinski, 2007).

1.3.3 Fusarium culmorum (Wm.G. Sm.) Sacc.

Fusarium culmorum gehört zu den Schimmelpilzen – also zur großen Gruppe der

Ascomyceten und ist ein weiteres bodenbürtiges Phytopathogen. Die von diesem Erreger

verursachten Pflanzenkrankheiten z. B. an Lebensmitteln oder Getreide werden als Fusariosen

bezeichnet, dabei werden unterirdische Pflanzenteile befallen und es kann bis zum Absterben

der Wirtspflanze kommen (Crüger, 1991). Fusarium culmorum ist in der Lage Mykotoxine

(Schimmelpilzgifte) zu produzieren (Roth et al., 1990), darunter befinden sich mehrere

Trichothecene, Zearalenon, Zearalenol, Moniliformin, Beauvericin, Enniatine und

Fumonisine. Über befallene Lebens- und Futtermittel können bei Mensch und Tier schwere

Vergiftungen verursacht werden, deshalb wurden in der EU Höchstgrenzwerte für diese

Toxine festgelegt (Suchowilska et al., 2010).

1.4 Antagonismen: Amensalismus und Parasitismus

Unter Amensalismus versteht man die Hemmung einer Mikrobenart durch ausgeschiedene

Hemmstoffe einer anderen Art. Antagonistisch wirksame Mikroorganismen können das

Wachstum von Phytopathogenen hemmen indem sie Antibiotika und/oder extrazelluläre

abbauende Enzyme (z. B. Chitinase, Glucanase, Protease) produzieren. Die biologische

Bekämpfung von phytopathogenen Mikroorganismen basiert auf der Grundlage dieser

Hemmstoffe. Die hierfür eingesetzten Kontrollstämme besitzen meist die Fähigkeit sich in der

Rhizosphäre von Pflanzen zu etablieren (Compant et al., 2009). Auch die Eigenschaften

Einleitung

8

bestimmter Böden, Krankheiten zu unterdrücken (disease suppresive soils), begründen sich

vermutlich durch antagonistische Aktivität (Haas & Defago, 2005).

Trichoderma-Pilze leben als Hyperparasiten auf anderen Pilzen. Auch hier handelt es sich um

eine Form von Antagonismus, welcher als Mycoparasitismus bezeichnet wird

(Fritsche, 2002).

1.5 Aufgabenstellung

Die biologisch-dynamische Landwirtschaft, welche in SEKEM in Ägypten betrieben wird, ist

immer mehr von bodenbürtigen Phytopathogenen betroffen. Darunter befinden sich die Pilze

Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum, welche zu erheblichen

Ernteausfällen führen. Eine Ursache hierfür ist ein intensiver Anbau von einer begrenzten

Anzahl an Kulturpflanzen in kurzen Rotationen. Die biologisch-dynamische Landwirtschaft

schließt die Anwendung von synthetischem Kunstdünger und Pestiziden aus. Eine mögliche,

umweltfreundliche und nachhaltige Lösung des Problems ist die Einführung von biologischen

Kontrollstämmen (Biological Control Agents, BCA). BCAs sind natürlich vorkommende

Mikroorganismen, die in der Lage sind, effizient Pflanzen zu besiedeln und durch

verschiedene Mechanismen das Wachstum von gesunden Pflanzen zu fördern, sowie das von

Pathogenen zu hemmen.

Das allgemeine Ziel des Projekts „Commercial Production of Enhanced Bio-Control Agents

for Combating Soil Borne Pathogens in Egypt”, in dessen Rahmen diese Arbeit verfasst

wurde, ist es, ein biologisches Präparat herzustellen, womit die Anwendung von chemischen

Pflanzenschutzmitteln und deren Auswirkungen auf Umwelt und Gesundheit verhindert

werden können. Durch die Einbringung von BCAs soll die Vitalität und die natürliche

Biodiversität des Bodens unterstützt werden. Das Präparat soll bezüglich Boden, Wetter,

Pathogen-Spezies, etc. für ägyptische Bedingungen optimiert werden, aus diesem Grund

sollen die BCAs aus ägyptischem Proben-Material isoliert werden.


ägyptischen Arzneipflanzen sowie aus ägyptischen Böden isoliert und auf ihr antagonistisches

Potenzial gegen die in SEKEM auftretenden bodenbürtigen Phytopathogene gescreent. Isolate

aus der Rhizo- oder Endorhizosphäre der Pflanzen bringen die optimalen Voraussetzungen für

Einleitung

9

eine Kolonisation der Wirtspflanze des Pathogens mit. Potenzielle Kontrollstämme wurden

morphologisch, physiologisch und genotypisch charakterisiert und identifiziert.

Zusätzlich wurde die bakterielle und pilzliche Biodiversität in der Rhizo- und


Methoden untersucht. Dabei wurde die Single Strand Conformation Polymorphism

(SSCP)-Analyse von PCR-amplifizierten 16S rDNA- bzw. ITS-Fragmenten verwendet.

Material und Methoden

10

2. Material und Methoden

2.1 Herstellernachweis

Alle verwendeten Chemikalien und Nährmedien wurden – wenn nicht anders angegeben

– von folgenden Firmen bezogen: Applied Biosystems (Foster City, USA), Fermentas

(St. Leon-Rot, Deutschland), Fluka (Buchs, Schweiz), Invitrogen (Lofer, Österreich), Lactan

(Graz, Österreich), Merck (Darmstadt, Deutschland), MP Biomedicals (Eschwege,

Deutschland), Sifin (Berlin, Deutschland), Peqlab (Erlangen, Deutschland), Promega

(Mannheim, Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland), Qiagen (Wien, Österreich),

Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).

2.2 Nährmedien

Alle verwendeten Medien wurden – wenn nicht anders angegeben – mit deionisiertem Wasser

zubereitet und bei 121 °C für 20 min autoklaviert.

R2A-Agar (Roth)

Hefeextrakt 0,5 g/l

Proteosepepton 0,5 g/l

Caseinhydrolysat 0,5 g/l

Glucose 0,5 g/l

Stärke 0,5 g/l

di-Kaliumhydrogenphosphat 0,3 g/l

Magnesiumsulfat 0,024 g/l

Natriumpyruvat 0,3 g /l

Agar 15,0 g/l

pH 7,2 ± 0,2


11

Trichoderma Selective Medium (TSM)

Calciumnitrat 1,0 g/l

Kaliumnitrat 0,26 g/l

Magnesiumsulfat-Heptahydrat 0,26 g/l

di-Kaliumhydrogenphosphat 0,12 g/l

Calciumchlorid-Dihydrat 1,0 g/l

Zitronensäure 0,05 g/l

Sucrose 2,0 g/l

Agar 20,0 g/l

Igepal 630 1,0 ml/l

Tetracyclin 0,05 g/l

Captan 0,04 g/l

Vinclozolin 0,0025 g/l

→ Die Antibiotika und Fungizide wurden dem autoklavierten Medium nach dem

Abkühlen auf etwa 50 °C zugesetzt, um das Wachstum von Bakterien und Pilzen

außer Trichodermen zu verhindern.

Nähragar II (NA) (Sifin)

Pepton aus Casein 3,5 g/l

Pepton aus Fleisch 2,5 g/l

Pepton aus Gelatine 2,5 g/l

Hefeextrakt 1,5 g/l

Natriumchlorid 5,0 g/l

pH 7,0 ± 0,2

Agar 15,0 g/l

Potato Dextrose Agar (PDA) (Roth)

Kartoffel-Infus 6,5 g/l

Glucose 20,0 g/l

pH 5,6 ± 0,2

Agar 15,0 g/l


12

Waksman Agar (WA)


Glucose 10,0 g/l

Fleischextrakt 3,0 g/l


Agar 15,0 g/l

Nährbouillon II (NB) (Sifin)

Pepton aus Casein 3,5 g/l


Pepton aus Gelatine 2,5 g/l

Hefeextrakt 1,5 g/l


pH 7,0 ± 0,2

Pilzkonservierungs-Medium

Glycerol [99 %] 600 ml/l

Glucose [50 %] 200 ml/l

Pepton [20 %] 100 ml/l

Hefeextrakt [10 %] 100 ml/l

→ Die Komponenten werden getrennt autoklaviert und nach dem Erkalten unter sterilen

Bedingungen miteinander vermischt.

Czapek Dox Broth (CDB) (Duchefa Biochemie)

Natrium-Eisen-EDTA 0,01 g/l

Magnesium Glycerophosphat 0,5 g/l

Kaliumchlorid 0,5 g/l

Kaliumsulfat 0,35 g/l

Natriumnitrat 2,0 g/l

Sucrose 30,0 g/l


13

Wachstumsmedium für IAA-Test

Glucose 5,0 g/l

Hefeextrakt 0,025 g/l

L-Tryptophan 0,2 g/l

2.3 Probennahme

Die Proben wurden am 8. Oktober 2009 in SEKEM in Ägypten genommen. Auf der

Adleya-Farm in SEKEM wurden die Wurzeln von 3 verschiedene Arzneipflanzen beprobt:

Matricaria chamomilla (Kamille), Calendula officinalis (Ringelblume) und Solanum

distichum. Bei der Probennahme befanden sich Matricaria chamomilla und Calendula

officinalis erst im Sämlings-Stadium (siehe Abb. 1), bei Solanum distichum handelt es sich

um einen ausdauernden verholzten Strauch (siehe Abb. 2). Zusätzlich wurden Proben vom

Boden auf der Adleya-Farm und in der Wüste genommen. Von jeder Pflanzenprobe und vom

Boden der Farm wurden 4 unabhängige Replikate genommen, vom Wüstenboden wurde an

3 unterschiedlichen Standorten eine Probe genommen.

Abb. 1: Beprobte Sämlinge der Abb. 2: Beprobte Pflanzen von

Calendula officinalis. Solanum distichum.

Die Probennahme erfolgte unter semisterilen Bedingungen, vor jeder Probe wurden Hände

und Schaufel mit Ethanol oberflächensterilisiert. Für den Transport wurde das Probenmaterial

in einer Kühltasche verpackt und bis zur Aufarbeitung im Labor bei 4 °C im Kühlschrank

gelagert.


14

2.4 Isolation von Mikroorganismen aus dem Probenmaterial

Bei der Probenaufarbeitung im Labor wurden Bakterien und Trichodermen, welche mit

Arzneipflanzen assoziiert sind, getrennt aus der Rhizosphäre und der Endorhizosphäre der

Pflanzen isoliert. Aus den Bodenproben wurden ebenfalls Bakterien und Trichodermen

isoliert.

Pflanzenproben

Rhizosphäre:

Um Mikroorganismen aus der Rhizosphäre zu isolieren, wurden unter semisterilen

Bedingungen je Probe 5 g Wurzelmaterial mit anhaftender Erde in Falcon-Tubes eingewogen.

Es wurden 45 ml steriles NaCl [0,85 %] hinzugegeben und für 5 min am Vortex gemixt. Nach

kurzem Absitzen wurde der Überstand zum Verdünnen und Ausplattieren auf R2A (für

Bakterien) und TSM (für Trichodermen) verwendet.

Endorhizosphäre:

Für die Isolation von Mikroorganismen aus der Endorhizosphäre wurden die 5 g

Wurzelmaterial aus der Rhizosphären-Isolation für 5 min mit NaOCl [4 %] in sterilen Tubes

oberflächensterilisiert. Danach wurden die Wurzeln 3-mal mit sterilem Aqua dest. gewaschen

und zur Kontrolle der Oberflächensterilisation wurde ein Abdruck eines Wurzelstückchens

jeder Probe auf NA gemacht. Nachdem die oberflächensterilen Wurzelstücke in einen

Whirl-Pak® Probenbeutel überführt wurden und 10 ml steriles NaCl [0,85 %] zugegeben

wurden, konnten die Wurzeln mittels Mörser und Pistill zerkleinert werden. Der Mörserbrei

wurde zum Verdünnen und zum Ausplattieren auf R2A und TSM verwendet.

Bodenproben

Bei den Bodenproben wurden unter semisterilen Bedingungen je 5 g Erde bzw. Sand in sterile

Röhrchen eingewogen, mit 45 ml NaCl [0,85 %] aufgeschlämmt und wie bei der Isolation aus

der Rhizosphäre für 5 min gevortext. Nach kurzem Absitzen wurde der Überstand wieder

verdünnt und auf R2A und TSM ausplattiert.


15

2.4.1 Bestimmung der Lebendzellzahl

Die nötigen Verdünnungsreihen wurden mit NaCl [0,85 %] hergestellt. Für die

Lebendkeimzahlbestimmung mit Spatelplatten-Verfahren wurden jeweils 100 µl der

entsprechenden Verdünnungen ausplattiert:

Rhizosphäre:

– auf R2A-Medium: 10-4

, 10-5

, 10-6

je Verdünnung 2 Platten

– auf TSM-Medium: 100, 10

-1, 10

-2 je Verdünnung 2 Platten

Endorhizosphäre:

– auf R2A-Medium: 100, 10

-1, 10



-1, 10


Boden von der Adleya-Farm in SEKEM:

– auf R2A-Medium: 10-4

, 10-5

, 10-6

je Verdünnung 2 Platten


-1, 10


Wüstenboden:

– auf R2A-Medium: 100, 10

-1, 10

-2, 10



-1, 10


Bei R2A handelt es sich um ein Minimal-Medium, welches spezifisch für Bakterien ist. Auf

diesem nährstoffarmen Medium soll eine optimale Artenvielfalt erreicht werden. Die

TSM-Platten dienen speziell zur Anreicherung von Trichodermen, diese Pilze sind für ihr

gutes antagonistisches Potenzial bekannt.

Die Platten wurden bei RT inkubiert und anschließend wurden die gewachsenen Kolonien

ausgezählt. Die R2A-Platten für Bakterien wurden nach 4 Tagen ausgezählt und die

TSM-Platten wurden nach 7 Tagen ausgewertet. Exemplarisch ist hier eine R2A-Platte, auf

welcher Bakterien isoliert wurden, abgebildet (siehe Abb. 3).


16

Abb. 3: Isolation auf R2A-Agar. Auf dieser Platte wurden Bakterien aus der Rhizosphäre der

Matricaria chamomilla isoliert, gezeigt ist die Verdünnungsstufe 10-4.

Die Berechnung der Lebendzellzahl (cfu/g Frischgewicht bzw. Boden) erfolgte anhand

folgender Formel:

(gezählte Kolonien × Verdünnungsfaktor × ml hinzugefügte NaCl)

(g eingewogenes Material × ml ausplattiertes Volumen)

Für die beiden untersuchten Mikrohabitate jeder Pflanze bzw. für jeden Bodentyp wurden

Mittelwert und Standardabweichung aus den verschiedenen Replikaten und Verdünnungen

bestimmt.

2.4.2 Herstellung von Einzelisolaten

Von den Agarplatten wurden nach der Auszählung einzelne morphologisch möglichst

unterschiedliche Bakterien-Kolonien bzw. Pilze abgenommen und vereinzelt. Wenn möglich

wurden pro Replikat 24 Bakterien-Isolate von den R2A-Platten auf NA und 24 Pilz- bzw.

Hefe-Isolate von den TSM-Platten auf PDA übertragen. Die Isolate wurden bei RT

angezüchtet. Einige der über 1.000 erhaltenen Isolate sind hier gezeigt (siehe Abb. 4 und

Abb. 5)


17

Abb. 4: Einzelisolate von Bakterien. Abb. 5: Einzelisolate von Pilzen. Die gezeigten Pilze Die abgebildeten Isolate wurden aus der Rhizosphäre der Matricaria

stammen aus dem Wüstenboden. chamomilla isoliert.

2.4.3 Stammhaltung

Die Bakterien-Isolate wurden auf NA und die Pilz-Isolate auf PDA im Kühlraum bei 4 °C

aufbewahrt. Von allen isolierten Pilzen wurden Gefrier-Konserven angelegt. Hierfür wurden

Agarstückchen mit Myzel-Bewuchs in 1 ml Pilzkonservierungs-Medium eingebracht und bei

-70 °C gelagert. Von den Bakterien wurden aufgrund der großen Anzahl nur jene mit

antagonistischen Fähigkeiten konserviert. Die bakteriellen Isolate wurden hierfür in 700 µl

NB-Medium angeimpft und über Nacht bei 30 °C und 220 rpm im Schüttelinkubator

angezogen. Die so erhaltenen ONCs wurden am nächsten Tag mit 300 µl sterilem

Glycerol [50 %] versetzt und ebenfalls bei -70 °C gelagert. Für die verschiedenen Versuche

wurden üblicherweise die Bakterien- und Pilz-Isolate von den Platten im Kühlraum

verwendet. Nur in Ausnahmefällen wurde die Kultur neu aus der Konserve entnommen.

2.5 Analyse des antagonistischen Potenzials der isolierten

Mikroorganismen

Von den Proben, welche in SEKEM genommen wurden, wurden insgesamt 680 Bakterien-

und 327 Pilz-Stämme isoliert. Alle dieser Isolate wurden in Dualkultur in vitro Assays

(Berg & Ballin, 1994) auf ihre antagonistische Aktivität gegen Verticillium dahliae

(Ascomycet), Rhizoctonia solani (Basidiomycet) und Fusarium culmorum (Ascomycet)

getestet. Jedes Isolat wurde 2-mal unabhängig voneinander getestet. Die Antagonisten-Tests

mit Bakterien-Isolaten wurden auf WA und die Tests mit Pilz-Isolaten auf PDA unter sterilen

Bedingungen durchgeführt und bei RT inkubiert. Es wurden die Pathoge Verticillium dahliae


18

V25, Rhizoctonia solani AG4 und Fusarium culmorum E1 verwendet. Der Fusarium-Stamm

ist in SEKEM von befallenen Pflanzen isoliert worden.

Zusätzlich wurden alle erhaltenen Isolate auf ihre antagonistische Wirkung gegen 3 weitere

Phytopathogene getestet: Botrytis cinerea, Alternaria alternata and Sclerotinia sclerotiorum

(alles Ascomyceten).

Test gegen R. solani, F. culmorum, B. cinerea, A. alternata and S. sclerotiorum:

Für die Dualkultur-Tests wurden Agarstückchen mit Pilzmyzel direkt von einer Platte mit

dem Pathogen ausgestochen und zwischen 4 aufgeimpfte bakterielle Isolate (siehe Abb. 6)

oder zwischen 4 Agarstückchen von pilzlichen Isolaten auf der Testplatte platziert. Hierfür

wurden ein Korkbohrer und sterile Zahnstocher verwendet.

Abb. 6: Schema eines Antagonisten-Tests.

zur Testung von 4 Bakterien-Isolaten

Test gegen V. dahliae:

Verticillium dahliae wurde für mindestens 2 Wochen in flüssiger Kultur in Czapek Dox

Medium (CDB) angezüchtet. Für die Dualkultur-Tests wurden je 200 µl dieser Suspension

auf Agar-Platten ausplattiert und nach dem Trocknen wurden die Isolate auf die Platte

transferiert.

Bei beiden Methoden erfolgte die Auswertung nach einigen Tagen Inkubation bei RT– je

nach Wachstumsgeschwindigkeit des Pathogens. Um diese zu Beurteilen, wurde stets eine

Referenzplatte ohne Test-Isolate mitgeführt.

Bakterien-Isolat

Pilz-Pathogen


19

Für eine quantitative Auswertung wurde die Wachstumshemmung der Pilz-Pathogene

ausgehend von den Teststämmen anhand der gebildeten Hemmhöfe beurteilt

(Berg & Bahl, 1996) und folgendermaßen bewertet:

kein Hemmhof –

Hemmhof 1 – 5 mm +

Hemmhof 5 – 10 mm ++

Hemmhof > 10 mm +++

Bei den Pilz-Isolaten wurde zusätzlich noch Hyperparasitismus (HP) bewertet.


antagonistischem Potenzial

Für die molekularbiologische Charakterisierung wurden jene Bakterien-Isolate verwendet,

welche die stärksten antagonistischen Aktivitäten gegen alle getesteten Phytopathogene

zeigten und auf Gele stets nach Morphologie-Gruppen geordnet aufgetragen.

2.6.1 Puffer und Lösungen

Alle verwendeten Lösungen wurden – wenn nicht anders angegeben – mit deionisiertem

Wasser zubereitet.

TAE-Puffer [50 x]

Tris [99,9 %] 242,0 g/l

Essigsäure [100 %] 57,0 ml/l

EDTA [0,5 M] pH 8 100,0 ml/l

TBE-Puffer [5 x]

Tris [99,9 %] 54,0 g/l

Borsäure [99,8 %] 27,5 g/l

EDTA [0,5 M] pH 8 20,0 ml/l


20

Tris-HCl-Stammlösung [1 M]

Tris [99,9 %] 121,0 g/l

konz. HCl pH 8,5

EDTA-Stammlösung [0,5 M]

EDTA 207,2 g/l

NaOH [10 M] 66,7 g/l

NaOH [1 M] 44,4 g/l

pH 8

Taq-&GOTM

[5 x] (Qbiogene)

Magnesiumchlorid 8,5 mM

dNTPs 1,0 mM

Taq DNA-Polymerase 0,15 U/µl

Loading Dye [6 x]

Bromphenolblau 0,25 %

Xylencyanol 0,25 %

Glycerol 30,0 %

EDTA Na2 x 2H2O [0,5 M] 50,0 mM

2.6.2 Standard DNA Ladders

Es wurden die beiden Standards 1kb DNA Ladder (siehe Abb. 7) und 100 bp DNA Ladder

(siehe Abb. 8) von Fermentas Life Sciences mit einer Konzentration von [0,1 µg/µl]

verwendet. In Agarosegelen wurden 0,5 µg/lane eingesetzt und in Polyacrylamidgelen

0,2 µg/lane.


21

1 kb DNA Ladder 100 bp DNA Ladder

Abb. 7: 1 kb DNA Ladder. Abb. 8: 100 bp DNA Ladder.

2.6.3 PCR (Polymerase Chain Reaction)

Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) wird verwendet, um einen

kurzen, genau definierten DNA-Abschnitt zu amplifizieren. Wichtig hierfür ist eine

thermostabile DNA-Polymerase (ausführendes Enzym) und spezifisch bindende Primer

(kurze Oligonukleotide). Die Polymerase kopiert die DNA-Sequenz des Templates

(Original-DNA) ausgehend von einem Primer. Um den zu replizierenden Bereich von beiden

Seiten zu begrenzen, werden 2 Primer (forward und reverse) benötigt, diese bestimmen auf

beiden DNA-Strängen den Startpunkt für die Polymerase (Saiki et al., 1988). Die PCR wird in

einem Thermocycler durchgeführt, welcher die Reaktionsgefäße präzise auf die Temperatur,

welche für den jeweiligen Schritt benötigt wird, erhitzt bzw. kühlt. Am Beginn des

PCR-Prozesses findet ein Denaturierungsschritt von mehreren Minuten statt, dann folgen eine

Anzahl von 12 – 50 Zyklen, wobei jeder Zyklus aus Denaturierung, Primerhybridisierung und

Elongation besteht. Zuletzt folgt noch ein zusätzlicher längerer Elongationsschritt.

Die PCR-Ansätze wurden stets auf Eis hergestellt. Zur Überprüfung der PCR wurden die

Amplifikate auf einem 0,8 %igen Agarosegel in 1 x TAE-Puffer aufgetrennt (Laufzeit je nach

Gelgröße 30 – 40 min bei 100 V).

http://de.wikipedia.org/wiki/Thermocycler

http://de.wikipedia.org/wiki/Denaturierung_%28Biochemie%29

http://de.wikipedia.org/wiki/Primerhybridisierung

http://de.wikipedia.org/wiki/Elongation_%28RNA-Synthese%29


22

In der kultivierungsabhängigen Analyse wurden folgende Primer verwendet (siehe Tab. 1):

Tab. 1: Verwendete Primer. (f ... forward, r ... reverse, * .. IUPAC-Code: Y = T/C; M = A/C)

Bezeichnung Primer-Sequenz * Ziel-Organismus Referenz

Eub1f 5‟ AGA TTT GAT CMT GGC TCA G „3 Eubakterien Liesack et al., 1991

1492r 5‟ TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T „3 Eubakterien

BOX-A1 5' CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G 3' Martin et al., 1992

2.6.4 Agarosegelelektrophorese

Bei der Agarosegelelektrophorese werden Nukleinsäure-Stränge entsprechend ihrer Länge in

einem Agarosegel, welches in ionischer Pufferlösung liegt, aufgetrennt. Dafür wird ein

elektrisches Feld angelegt, wodurch die negativ geladene dsDNA im Gel von Katode

Richtung Anode transportiert wird. Je kleiner ein Fragment ist, desto schneller kann es sich

im Agarosenetzwerk vorwärts bewegen. Anhand von Vergleichen mit Standards definierter

Fragment-Größe kann die Länge der aufgetrennten Fragmente bestimmt werden

(Adkins & Burmeister, 1996).

Verwendet wurden die beiden Standards 1kb DNA Ladder (siehe Abb. 7) und 100 bp DNA

Ladder (siehe Abb. 8). Die Netzdichte des Agarosegels kann je nach Größe der zu trennenden

DNA-Fragmente variiert werden. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die

eingesetzten Agarose-Konzentrationen und Puffer (siehe Tab. 2).

Tab. 2: Verwendete Agarosegele. Agarose-Konzentration und Elektrophorese-Bedingungen für

verschiedene Anwendungen

Anwendung Agarose-

Konzentration Puffer Spannung Laufzeit

PCR-Produkte,

genomische DNA

0,8 %

1 x TAE

100 V

30 – 40 min

ARDRA 2 % 0,5 x TBE 120 V 3 h 30 min

BOX-PCR 1,5 % 0,5 x TBE 90 V 4 h


23

Zur Auftrennung im Agarosegel wurden Aliquote der Ansätze mit Loading Dye [6 x] versetzt

und auf das Gel aufgetragen. Die Färbung des Gels erfolgte (je nach Gelgröße für

20 – 30 min) in einem Ethidiumbromid-Bad [0,01 %], wonach sie unter UV-Licht fotografiert

wurden.

2.6.5 ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis)

Bei dieser Analyse wird ein eubakterieller Abschnitt der hochkonservierten 16S rDNA mittels

PCR amplifiziert und das erhaltene PCR-Produkt wird anschließend einem Verdau mit einer

Restriktionsendonuklease unterzogen. Je nach Sequenz des amplifizierten DNA-Fragments

gibt es Unterschiede in Anzahl und Lage der Schnittstellen für das verwendete

Restriktionsenzym und somit wird das PCR-Produkt in unterschiedlich viele und verschieden

lange DNA-Sücke geschnitten. Bei der anschließenden Agarosegelelektrophorese resultieren

daraus verschiedene Bandenmuster, wonach Bakterien auf Gattungsebene unterschieden

werden können.

Isolation der chromosomale DNA aus den stärksten Antagonisten

Die DNA-Isolation erfolgte mit der schnellen und kosteneffizienten Aufkochmethode. Dafür

wurde mit sterilen Zahnstochern Zellmaterial der Bakterien-Isolate in je 30 µl H2O

eingebracht. Die Bakterien-Suspensionen wurden für 15 min bei -70 °C eingefroren und

danach für 5 min im Thermocycler auf 100 °C aufgekocht. Anschließend erfolgte eine

Zentrifugation für 5 min bei 13.000 rpm und 4 °C. Der Überstand, welcher nun die

chromosomale DNA der Bakterien enthält, wurde unmittelbar als Template in die PCR

eingesetzt.

Amplifikation der 16S rDNA

Zur Amplifikation der 16S rDNA wurden die eubakteriellen Primer Eub1f und 1492r

verwendet (siehe Tab. 1). Das Eubac-Fragment hat eine Größe von 1492 bp und liegt auf der

16S rDNA. Das erhaltene PCR-Produkt wurde später mit dem Restriktionsenzym HhaI

geschnitten.


24

Reaktionsansatz für Eubac-PCR:

Taq-&GOTM

[5 x] 4,0 µl

MgCl2 [25 mM] 1,2 µl

Primer Eub1f [5 µM] 1,0 µl

Primer 1492r [5 µM] 1,0 µl

H2O 11,8 µl

DNA-Template 3,0 µl

Gesamtvolumen 60,0 µl

Temperaturprogramm:

95 °C ................ 5 min

95 °C .................. 30 s

55 °C .................. 30 s

72 °C ......... 1 min 40 s 9 x

95 °C .................. 30 s

52 °C .................. 30 s

72 °C ......... 1 min 30 s 19 x

72 °C .............. 10 min

15 °C ................... end

Als Negativkontrolle wurde anstelle des DNA-Templates Wasser eingesetzt.

Die Kontrolle der PCR erfolgte durch eine Elektrophorese in einem 0,8 %igen Agarosegel in

1 x TAE-Puffer. Es wurden 3 µl des PCR-Produkts mit Loading Dye [6 x] versetzt und auf

das Kontrollgel aufgetragen.

Restriktion der 16S rDNA mit HhaI

Je nach Stärke der Bande am Kontrollgel wurde die Menge des in den Verdau eingesetzten

PCR-Produkts variiert (6 µl, 10 µl oder 15 µl PCR-Produkt). Der Restriktionsverdau erfolgte

für 3 h bei 37 °C im PCR-Cycler.

Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease HhaI: GC*G↓C

↓ .. Stelle des Enzymangriffs; * ... Stelle der Methylierung


25

Restriktionsansatz mit HhaI:

HhaI [10 U/µl] 0,25 µl

NEB4 Puffer [10 x] 2,0 µl

BSA [10 mg/ml] 0,2 µl

H2O 11,5 µl 7,5 µl 2,5 µl

PCR-Produkt 6,0 µl 10,0 µl 15,0 µl

Agarosegelelektrophorese

Nach dem Verdau wurden 10 µl des Ansatzes mit Loading Dye [6 x] versetzt und auf ein

2 %iges Agarosegel in 0,5 x TBE-Puffer aufgetragen. Die Laufzeit der Elektrophorese betrug

3 h 30 min bei 120 V.

Die Restriktionsansätze wurden auf zwei 2 %ige Agarosegele genau nach demselben

Auftragsschema aufgetragen. Ein Gel wurde wie sonst auch üblich nach der Elektrophorese in

einem Ethidiumbromid-Bad [0,01 %] gefärbt, dem zweiten Gel wurde vor dem Gießen

Midori Green DNA Stain (genXpress) beigemischt (10 µl auf 200 ml Gel-Solution). Beide

Gele wurden anschließend unter UV-Licht fotografiert. So war ein direkter Vergleich der

beiden Methoden möglich.

Midori Green DNA Stain kann wie Ethidiumbromid zur Detektion von Nukleinsäuren in

Agarosegelen eingesetzt werden. Ethidiumbromid ist erwiesen stark carcinogen,

Midori Green DNA Stain verspricht hingegen eine wesentlich geringere Mutagenitätsrate.

Midori Green DNA Stain würde also eine weniger gefährliche Alternative zum

Ethidiumbromid darstellen.


26

Auswertung des ARDRA-Gels mittels GelCompar II

Die Auswertung des ARDRA-Gels erfolgte mit der Software GelCompar II

(Applied Maths). Bei der Erstellung der Dendrogramme wurden folgende Einstellungen

verwendet:

Dendrogram type: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean (UPGMA)

Similarity coefficient: Band based: Dice

Position tolerances: Optimization: 4 %

Position tolerance: 1 %

2.6.6 BOX-PCR

BOX-Elemente sind repetitive hochpolymorphe Sequenzelemente in Genomen, sie

unterscheiden sich in ihrer Länge und ihrer Sequenz. Bei der BOX-PCR wird nur ein Primer

verwendet, der an einen solchen Repeat bindet. Bei Auftrennung der PCR-Produkte im

Agarosegel ergeben sich bei dieser Fingerprint-Methode charakteristische artspezifische

Muster. Somit können die auf Gattungsebene gebildeten ARDRA-Gruppen weiter unterteilt

werden.

Isolation der chromosomale DNA aus den stärksten Antagonisten

Die Isolation der bakteriellen DNA erfolgte erneut mit der Aufkoch-Methode

(siehe 2.6.5 ARDRA).


27

BOX-PCR

Zur Amplifikation der repetitiven BOX-Sequenz wurde der Primer BOX A1 verwendet.

Reaktionsansatz für BOX-PCR:

Taq-&GOTM

[5 x] 5,0 µl


Primer BOX A1 [5 µM] 5,0 µl

H2O 12,5 µl



Temperaturprogramm:

95 °C ................ 5 min

95 °C ................ 1 min

53 °C ................ 1 min

65 °C ................ 8 min 35 x

65 °C .............. 16 min

15 °C ................... end


Agarosegelelektrophorese

Auf das 1,5 %ige Gel in 0,5 x TBE-Puffer wurden 12 µl jedes PCR-Ansatzes versetzt mit

Loading Dye [6 x] aufgetragen. Dabei wurden die Isolate einer ARDRA-Gruppen

nebeneinander gelegt. Die Laufzeit des BOX-Gels betrug 4 Stunden bei 90 V.


28

Auswertung des BOX-Gels mittels GelCompar II

Das BOX-Gel wurde ebenfalls mit GelCompar II ausgewertet. Wobei wieder dieselben

Einstellungen verwendet wurden:





2.6.7 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung

Anhand des ARDRA- und des BOX-Gels wurden einige der stärksten Antagonisten zur

Identifizierung ausgewählt. Zur Sequenzierung wurde das 1492 bp lange Eubac-Fragment

verwendet, welches auf der hoch konservierten 16S rDNA liegt. Dieses Fragment wurde mit

den Primern Eub1f und 1492r in einer PCR amplifiziert (siehe 2.6.5 ARDRA). Die

Sequenzierung wurde ausgehend vom Forward-Primer durchgeführt. Zuvor wurden die

PCR-Produkte mit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) laut

Hersteller-Protokoll gereinigt:

1. Das PCR-Produkt wurde mit dem gleichen Volumen an Membrane Binding Solution

versetzt und auf die Minicolumns, welche in Collection-Tubes platziert wurden,

überführt.

2. Inkubation für 1 min bei RT

3. Zentrifugation für 1 min bei 16.000 g und RT, Collection-Tubes leeren

4. Zugabe von 700 µl Membrane Wash Solution


6. Zugabe von 500 µl Membrane Wash Solution


8. Zentrifugation für 1 min bei 16.000 g und RT ohne vorherige Zugabe von Flüssigkeit

9. Minicolumns in frischen Tubes platzieren

10. 30 µl Nuclease-Free Water auf die Minicolumns geben

11. Inkubation für 1 min bei RT

12. Elution der gereinigten DNA durch Zentrifugation für 1 min bei 16.000 g und RT


29

Die genaue DNA-Konzentration, welche für die Sequenzierung benötigt wird, wurde mittels

Photometer bestimmt. Im Photometer kann doppelsträngige DNA bei einer Wellenlänge von

260 nm gemessen werden. Hierfür werden 45 µl H2O und 5 µl gereinigtes PCR-Produkt in

eine spezielle Küvette gefüllt und gegen H2O als Leerwert vermessen. Die Verdünnung muss

mit einberechnet werden.

Sequenzierung

Für die Sequenzierung wurden die Proben mit den amplifizierten, gereinigten Fragmenten an

das ZMF (Zentrum für medizinische Grundlagenforschung) der medizinischen Universität

Graz überstellt. Durch Vergleiche der erhaltenen Sequenzen mit der Datenbank des NCBI

(National Center for Biotechnology Information) konnten die Bakterien identifiziert werden,

hierfür wurde blastn (megablast) gegen Nucleotide collection (nr/nt) verwendet.

2.7 Untersuchung der bakteriellen Antagonisten auf das

Bildungsvermögen des Phytohormons Indol-3-essigsäure

Einige Bakterien sind in der Lage Pflanzenwachstumshormone wie zum Beispiel Auxine,

wozu Indol-3-essigsäure (IAA) zählt, zu produzieren. Diese Bakterien gehören zur Gruppe

der Pflanzen-wachstumsfördernden Bakterien (PGPR, Plant Growth Promoting

Rhizobacteria) (Dube, 2001). PGPR stimulieren durch die Bildung und Exkretion von

Pflanzenhormonen die Mineralstoffaufnahme aus dem Boden und das Wachstum der Pflanze,

insbesondere werden das Wachstum der Wurzel und die Bildung der Wurzelhaare gefördert

(Taiz & Zeiger, 2002). Viele antagonistisch aktive Bakterien verfügen zusätzlich über die

Fähigkeit Phytohormone zu produzieren.

Anhand der ARDRA-Gruppen wurden 8 bakterielle Antagonisten für den Versuch

ausgewählt. Der Test beruht auf einer Farbreaktion zwischen Indol-3-essigsäure und

Eisen(III)-chlorid in halbkonzentrierter Perchlorsäure. 5 ml Wachstumsmedium

(Minimalmedium) wurden mit den entsprechenden Isolaten angeimpft und für 72 h bei 20 °C

und ca. 120 rpm im Dunkeln inkubiert. Ein unbeimpftes Kulturröhrchen wurde als

Negativkontrolle mitgeführt. Zur Bestimmung der gebildeten Indol-3-essigsäure wird von

jeder Kultur 1 ml entnommen und für 10 min bei 13.000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. 90 µl

des zellfreien Überstandes werden in eine Mikrotiterplatte überführt und 60 µl


30

Salkowski Reagenz dazu gegeben. Nach einer Inkubation von 30 min im Dunkeln kam es bei

positiven Isolaten zu einer rotvioletten Färbung des ausgangs gelblichen Mediums. Mittels

Microplate-Reader wurde die Extinktion gegen den Leerwert (90 µl IAA-Medium + 60 µl

Salkowski Reagenz) bei 530 nm gemessen. Beim erstellten Absorptionsspektrum lag das

Maximum bei 460 nm, aus diesem Grund wurde bei 460 nm ebenfalls eine Messung

durchgeführt.

Salkowski Reagenz

Eisen(III)-chlorid [0,5 M] 20 ml/l

Perchlorsäure [35 %] 980 ml/l

2.8 Isolation der Gesamt-DNA aus dem Probenmaterial

Rhizosphäre:

Für die Isolation der Gesamt-DNA aus der Rhizosphäre wurden 5 g Wurzeln mit daran

haftender Erde und 45 ml NaCl [0,85 %] in sterile Falcon-Tubes gegeben und für 5 min am

Vortex gemixt. Nach kurzem Absitzen wurden 4 ml vom Überstand entnommen und für

20 min bei 13.000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Derselbe Überstand wurde auch für die

Isolation von Mikroorganismen verwendet (siehe 2.4 Isolation von Mikroorganismen aus dem

Probenmaterial). Die erhaltenen Pellets wurden für die Isolation der Gesamt-DNA verwendet.

Endorhizosphäre:

Um die Gesamt-DNA aus der Endorhizosphäre zu isolieren, wurden 5 g Wurzelmaterial mit

NaOCl [4 %] für 5 min in einem sterilen Tube oberflächensterilisiert und danach 3 mal mit

sterilem Aqua dest. gewaschen. Nach der Zugabe von 10 ml steriler NaCl [0,85 %] wurden

die Wurzeln mit Mörser und Pistill zerkleinert. Wie bei der Rhizosphäre wurden 4 ml für die

Zentrifugation (20 min, 13.000 rpm, 4 °C) verwendet und aus den erhaltenen Pellets wurde

die Gesamt-DNA isoliert.

Boden von der Adleya-Farm in SEKEM:

5 g Boden wurden unter semisterilen Bedingungen eingewogen und mit 45 ml NaCl [0,85 %]

aufgeschlämmt. Danach wurde für 5 min gevortext und nach kurzem Absitzen wurde

Überstand für die Zentrifugation (20 min, 13.000 rpm, 4 °C) entnommen. Für die

DNA-Isolation wurden die Pellets von 4 ml Überstand benützt.


31

Wüstenboden:

Im Wüstenboden wird eine geringere Konzentration an Mikroorganismen und so auch an

DNA erwartet. Deshalb wurden für die Isolation aus dem Wüstensand die Pellets von 10 ml

Überstand verwendet.

Aus den erhaltenen Pellets aller Proben, welche bei -70 °C gelagert wurden, wurde die

Gesamt-DNA der Mischkultur mit FastDNA® SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) laut

Hersteller-Protokoll extrahiert:

1. Die Pellets wurden in 978 µl Natriumphosphat-Puffer aufgenommen und in die dem Kit

beiliegenden Lysing Matrix E-Tubes überführt.

2. Zugabe von 122 µl MT-Puffer

3. Aufschluss im Ribolyzer für 2 x 30 s bei Stufe 5,0. Dazwischen wurden die Proben auf

Eis gekühlt.

4. Zentrifugation für 15 min bei 14.000 g und RT, Überführen der Überstände in frische

Tubes

5. Zugabe von 650 µl PPS (Protein Precipitation Solution) und 10maliges Schütteln der

Tubes per Hand

6. Zentrifugation für 5 min bei 14.000 g und RT, Überführen der Überstände in frische

Tubes

7. Zugabe von 1 ml resuspendierter Binding Matrix Suspension und 2 minütiges Schütteln

der Tubes per Hand

8. 5 min sedimentieren lassen

9. 700 µl Überstand abheben und verwerfen

10. Binding Matrix im verbleibenden Überstand resuspendieren und 600 µl auf den

SPINTM

Filter im Catch-Tube transferieren

11. Zentrifugation für 1 min bei 14.000 g und RT, Catch-Tubes leeren

12. Überführen der restlichen Suspension auf den SPINTM

Filter


14. 500 µl SEWS-M auf den SPINTM

Filter zugeben und Pellet darin resuspendieren


16. Zentrifugation für 2 min bei 14.000 g und RT ohne vorherige Zugabe von Flüssigkeit

17. SPINTM

Filter in frische Catch-Tubes überführen

18. 5 min bei RT lufttrocknen lassen


32

19. Zugabe von 100 µl DES (DNase/Pyrogen-Free Water) (vorgewärmt auf 55 °C) und

resuspendieren

20. Inkubation für 5 min bei 55 °C im Thermoblock

21. Elution der DNA durch Zentrifugation für 1 min bei 14.000 g und RT.

Die Qualität der extrahierten DNA wurde in einem 0,8 %igen Agarosegel überprüft. Bis zur

weiteren Verwendung wurde die DNA bei -20 °C gelagert.

2.9 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen

Biodiversität mittels SSCP-Analyse (Single Strand Conformation

Polymorphism Analysis)

Die SSCP-Analyse ist eine molekulare Methode zur Diversitätsanalyse mikrobieller

Gemeinschaften, dafür werden DNA-Moleküle gleicher Länge aber unterschiedlicher

Sequenz verwendet, die in einer PCR gewonnen werden (Rochelle, 2001). Bei Bakterien

werden dafür kleine Abschnitte der hoch konservierten rRNA-Gene amplifiziert, bei Pilzen

wird ein Fragment zwischen 5,8S rDNA und 18S rDNA amplifiziert, welches ebenfalls hoch

konserviert ist. Für die SSCP-Analyse muss die DNA einzelsträngig vorliegen, die

Doppelstrangmoleküle werden nach der PCR durch die Behandlung mit Lambda-Exonuklease

in Einzelstrangmoleküle überführt. Angriffspunkt für dieses Enzym ist der Phosphatrest am

5‟-Ende des PCR-Produkts, der durch den Reverse-Primer eingeführt wurde. Die

Einzelstränge werden denaturiert und bilden sequenzspezifische Sekundärstrukturen auf

Grund intramolekularer Basenpaarungen aus. DNA-Fragmente gleicher Länge aber

unterschiedlicher Konformation zeigen im nicht denaturierenden

Polyacrylamidgelelektrophorese-Nachweis unterschiedliche Laufweiten. Durch Silberfärbung

können die aufgetrennten DNA-Fragmente sichtbar gemacht werden. Mit dieser

Fingerprint-Methode ist eine Unterscheidung bis auf Gattungs- oder sogar Artniveau möglich.

Damit ein Mikroorganismus eine erkennbare Bande am Gel erzeugt, muss dessen DNA

mindestens 1,5 % der Gesamt-DNA der Population betragen. Um einzelne bandengebende

Mikroorganismen zu identifizieren, können DNA-Banden aus dem Polyacrylamidgel

ausgeschnitten und sequenziert werden (Tebbe et al., 2001). Es können Primer, die spezifisch

für eine spezielle Organismengruppe sind, gewählt werde. So kann eine Selektion der durch

die SSCP-Analyse erfassten Mikroorganismen erreicht werden.


33

Ursprünglich wurde die SSCP-Analyse entwickelt, um Genpolymorphismen in menschlicher

DNA zu erkennen (Orita et al., 1989) und wurde dazu verwendet, Genmutationen

festzustellen (Hayashi, 1991). Erst später wurde erkannt, dass diese Fingerprint-Methode auch

zur kultivierungsunabhängigen Analyse von Mikroorganismen-Populationen in

Umweltproben herangezogen werden kann (Schwieger & Tebbe, 1998). Ein großer Vorteil

dieser kultivierungsunabhängigen Methode ist, dass man damit auch schwierig oder nicht

kultivierbare Mikroorganismen erfassen kann.

SSCP-PCR

Der theoretische Hintergrund der PCR wurde bereits unter 2.6.3 erläutert. Für die partielle

Amplifikation der rDNA wurden folgende Primer verwendet (siehe Tab. 3):

Tab. 3: Verwendete Primer. (f ... forward, r ... reverse, P ... 5‟-Phosphorylierung,

* .. IUPAC-Code: Y = T/C; M = A/C)

Bezeichnung Primer-Sequenz * Ziel-Organismus Referenz

Unibac-II-515f 5‟GTG CCA GCA GCC GC‟3 Eubakterien Lieber et al., 2002

Unibac-II-927rP 5‟ CCC GTC AAT TYM TTT GAG TT‟3 Eubakterien Lieber et al., 2002

F311Ps 5´ CTG GTC TGA GAG GAT GAT CAG T 3´ Pseudomonas Milling et al., 2004

1459rPsP 5´ AAT CAC TCC GTG GTA ACC GT 3´ Pseudomonas Milling et al., 2004

ITS1f 5´ TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 3´ ITS1 Pilze White et al., 1990

ITS2rP 5´ GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 3´ ITS1 Pilze White et al., 1990

ITS4rP 5´ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3´ ITS1+2 Pilze White et al., 1990

Gesamte Bakterien-Community:

Um einen kurzen hochkonservierten Abschnitt der bakteriellen 16S rDNA zu amplifizieren,

wurden in der PCR die universellen eubakteriellen Primer Unibac-II-515f und

Unibac-II-927rP eingesetzt (siehe Tab. 3). Das Unibac-Fragment ist 413 bp lang und liegt auf

der 16S rDNA.


34

Reaktionsansatz für Unibac-PCR:

Taq-&GOTM

[5 x] 12,0 µl


Primer Unibac-II-515f [5 µM] 2,4 µl

Primer Unibac-II-927rP [5 µM] 2,4 µl

H2O 38,6 µl

Gesamt-DNA-Template 1,0 µl


Temperaturprogramm:

95 °C ................ 5 min

95 °C .................. 20 s

54 °C .................. 15 s

72 °C .................. 30 s 31 x

72 °C .............. 10 min

15 °C ................... end


Zur Überprüfung der PCR-Produkte wurden 5 µl jedes Ansatzes mit Loading Dye [6 x]

versetzt und in einem 0,8 %igen Agarosegel in 1 x TAE-Puffer aufgetrennt.

Pseudomonas-Community:

Um die 16S rDNA der antagonistisch interessanten Pseudomonaden hervorzuheben, wurde

eine nested PCR (verschachtelte PCR) durchgeführt. Dabei wird das Produkt einer PCR als

Template in eine zweite Reaktion eingesetzt, wobei das zweite Amplifikat einen kürzeren

Abschnitt des ersten Produkts darstellt. Mit diesem Verfahren kann die Sensitivität der PCR

erhöht werden, so dass auch kleine Mengen an Template-DNA eine befriedigende Ausbeute

an Produkt ergeben. Außerdem erhöht sich mit der Methode der nested PCR die Spezifität der

Reaktion, indem die 1. PCR Pseudomonas-spezifisch ist. Hierfür wurden die Primer F311Ps

und 1459rPsP verwendet. Um einen Abschnitt des Amplifikats der 1. PCR zu vermehren,

wurden in der 2. PCR die beiden universellen Primer Unibac-II-515f und Unibac-II-927rP

eingesetzt (siehe Tab. 3), welche auch für die gesamte bakterielle Gemeinschaft verwendet

wurden.


35

Reaktionsansatz für Pseudomonas-spezifische PCR (1. PCR):

Taq-&GOTM

[5 x] 4,0 µl


Primer F311Ps [5 µM] 0,8 µl

Primer 1459rPsP [5 µM] 0,8 µl

BSA [10 mg/ml] 1,0 µl

DMSO [100 %] 0,3 µl

H2O 10,3 µl



Temperaturprogramm:

94 °C ................ 7 min

94 °C .................. 45 s

56 °C ................ 2 min

72 °C ................ 2 min 30 x

72 °C .............. 10 min

15 °C ................... end

Für jene Proben, wo nach der 1. PCR nach wiederholten Versuchen kein PCR-Produkt am

Agarosegel zu erkennen war, wurde zusätzlich ein Ansatz mit der Phusion® High-Fidelity

DNA-Polymerase (New England Biolabs) versucht, wodurch weitere PCR-Produkte

gewonnen werden konnten. Diese Polymerase ist effizienter als die Taq-Polymerase und

eignet sich besonders für schwierige Templates. Das Temperaturprogramm wurde nicht

verändert.


36

Reaktionsansatz für Pseudomonas-spezifische PCR (1. PCR):

Phusion® Polymerase [2 U/µl] 0,5 µl


GC-Puffer [5 x] 4,0 µl

dNTPs [2 mM] 2,0 µl

Primer F311Ps [5 µM] 0,8 µl

Primer 1459rPsP [5 µM] 0,8 µl

H2O 5,1 µl



Je nach Stärke der erhaltenen Bande am Kontrollgel der Pseudomonas-spezifischen PCR

wurde das PCR-Produkt unverdünnt oder in einer 1:50-Verdünnung mit H2O als Template in

die 2. PCR eingesetzt.

Reaktionsansatz für Unibac-PCR (2. PCR):

Taq-&GOTM

[5 x] 12,0 µl




H2O 33,6 µl H2O 37,6 µl

DNA-Template (1:50) 6,0 µl DNA-Template (unverd.) 2,0 µl

Gesamtvolumen 60,0 µl Gesamtvolumen 60,0 µl

Temperatur-Programm wurde dasselbe wie bei der Unibac-PCR der gesamten

Bakterien-Community verwendet.

Gesamte Pilz-Community:

Für die SSCP-Analyse von Pilzen wird ein ITS-Fragment amplifiziert. ITS steht für „Internal

Transcribed Spacer“. Bei diesem Fragment handelt es sich um ein pilzliches Fragment

zwischen 5,8S rDNA und 18S rDNA. Hier wurde ebenfalls eine nested PCR durchgeführt,

wobei beide Reaktionen Pilz-spezifisch sind und ein Primer in beiden identisch ist. Das

Produkt der zweiten Reaktion liegt also am Rande des 1. PCR-Produkts. In der 1. PCR


37

wurden die Primer ITS1f und ITS4rP verwendet. Für die 2. PCR wurde derselbe

Forward-Primer verwendet und mit dem phosphorylierten Reverse-Primer ITS2rP kombiniert.

Reaktionsansatz ITS1-PCR (1. PCR):

Taq-&GOTM

[5 x] 4,0 µl


Primer ITS1f [5 µM] 0,8 µl

Primer ITS4rP [5 µM] 0,8 µl

H2O 12,2 µl



Temperaturprogramm:

94 °C ................ 5 min

94 °C .................. 30 s

54 °C .................. 35 s

72 °C .................. 40 s 36 x

72 °C .............. 10 min

15 °C ................... end

Bei Proben, wo nach der 1. PCR am 0,8 %igen Agarosegel kein Produkt zu erkennen war,

wurde das Amplifikat wieder unverdünnt in die nachfolgende PCR eingesetzt. War eine

Bande sichtbar, wurde das PCR-Produkt zuvor 1:50 verdünnt.

Reaktionsansatz ITS2-PCR (2. PCR):

Taq-&GOTM

[5 x] 12,0 µl


Primer ITS1f [5 µM] 2,4 µl

Primer ITS2rP [5 µM] 2,4 µl

H2O 33,6 µl H2O 37,6 µl

DNA-Template (1:50) 6,0 µl DNA-Template (unverd.) 2,0 µl

Gesamtvolumen 60,0 µl Gesamtvolumen 60,0 µl


38

Temperaturprogramm:

95 °C ................ 5 min

95 °C .................. 30 s

58 °C .................. 35 s

72 °C .................. 40 s 37 x

72 °C .............. 10 min

15 °C ................... end

Aufreinigung des PCR-Ansatzes

Alle erhaltenen PCR-Produkte wurden vor dem Einzelstrang-Verdau für die SSCP-Analyse

mit Wizard®

SV Gel and PCR Clean-Up System laut Hersteller-Protokoll gereinigt

(siehe 2.6.7 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung). Dies diente dazu,

störende Salze, Proteine und Nukleotide zu entfernen. Die gereinigten PCR-Produkte wurden

bis zum Weiterarbeiten bei -20°C gelagert.

Verdauung des am 5’-Ende phosphorylierten Einzelstranges

Die PCR-Produkte, welche als Doppelstränge vorliegen, müssen für die SSCP-Analyse einem

Einzelstrang-Verdau unterzogen werden. Die Exonuklease verdaut spezifisch jene Stränge,

deren Enden durch die phosphorylierten Reverse-Primer markiert wurden.

Reaktionsansatz mit Lambda-Exonuklease:

Lambda Exonuklease [5 U/µl] 2,4 µl

Lambda Exon.-Puffer [10 x] 3,6 µl


Für den Einzelstrang-Verdau wurden 30 µl der gereinigten PCR-Produkte mit 6 µl der

Reaktionslösung versetzt. Die Inkubation bei 37 °C wurde im Thermocycler durchgeführt.

Temperaturprogramm:

37 °C .................... 1 h

4 °C ................... end


39

Die einzelsträngigen DNA-Proben konnten so bis zur Denaturierung und Faltung bei -20 °C

gelagert werden.

Denaturierung und Faltung der Einzelstränge

Für die Denaturierung wurde jede ssDNA-Probe mit 30 µl SSCP-Ladepuffer versetzt.

Anschließend erfolgte eine 3 minütige Denaturierung bei 95 °C im Thermocycler, wonach die

Proben sofort für mindestens 5 min auf Eis gestellt wurden. Dadurch falten sich die

DNA-Einzelstränge in ihre charakteristischen Sekundärstrukturen, wobei schon geringste

Sequenzunterschiede zu einer unterschiedlichen Faltung führen können.

SSCP-Ladepuffer

Formamid [95 %] 950 µl

NaOH [2,5 M] 4 µl

Bromphenolblau [0,025 %] 5 µl

Aqua deion. 41 µl

→ Die Lösung muss frisch hergestellt werden (höchstens 2 Wochen bei 4 °C

aufbewahrt).

Temperaturprogramm:

98 °C ................ 3 min

4 °C ................... end

Herstellung des Polyacrylamidgels

Bevor das Polyacrylamidgel hergestellt wurde, wurden Grund- und Abdeckplatte der

Gießvorrichtung gründlich mit Ethanol [70 %] gereinigt. Nach etwa jedem fünften Gel wurde

die Grundplatte nach dem Reinigen mit Acryl-Glide behandelt, um das Anhaften des Gels zu

verhindern. Die Trägerfolie wurde mit einigen Tropfen Aqua dest. auf der Abdeckplatte

adhäriert, dabei wurden Luftblasen sorgfältig ausgestrichen. Zwischen Abdeckplatte mit

Trägerfolie und Grundplatte, worauf die Spacer und Slots angebracht sind, wurde eine

Silikondichtung gelegt und die Platten mit Metall-Klammern aneinander befestigt

(siehe Abb. 9).


40

Abb. 9: Schematischer Ablauf zum Aufbau der Gießvorrichtung. links: Vorbereitung der

Grund- und Abdeckplatte; rechts: fertige Gießvorrichtung

Der Vernetzungsgrad des Gels und die Laufzeit wurden nach der Größe des aufzutrennenden

DNA-Fragments gewählt. Zur Auftrennung der bakteriellen Unibac-Fragmente (413 bp) mit

unterschiedlicher Sekundärstruktur wurden 8 %ige Polyacrylamidgele verwendet. Für die

pilzlichen ITS-Fragmente (250 – 300 bp) wurden 9 %ige Gele eingesetzt. Die Laufzeit der

8 %igen Gele betrugt 26 h, jene der 9 %igen Pilz-Gele 17 h.

SSCP-Gellösungen: 8 % 9 %

Aqua deion. 23,1 ml 20,8 ml

TBE-Puffer [5 ×] 10,4 ml 10,4 ml

MDE-Solution [2 ×] 18,2 ml 20,5 ml

TEMED 24,5 µl 27,5 ml

APS [10 %] 245,0 µl 275,0 ml

Die Polymerisationsstarter TEMED und APS wurden als letztes zugegeben. Anschließend

wurden die Bestandteile der Gellösung gut durchmischt, mit einer motorischen Pumpe

zwischen Abdeckplatte mit anhaftender Trägerfolie und Grundplatte gegossen und für

mindestens 1,5 h bei RT auspolymerisiert. Dafür wurde das gegossene Gel mit Ethanol

überschichtet.


41

Polyacrylamidgelelektrophorese

Für die Elektrophorese wurde das TGGE Maxi System (Biometra) verwendet. Die

Puffer-Kammern der SSCP-Anlage wurden mit je 500 ml TBE-Puffer [1 x] befüllt und die

Trägerfolie mit dem Polyacrylamidgel im Gerät platziert. Um gleichmäßige

Wärmeübertragung zu gewährleisten, wurden zuvor einige Tropfen Aqua dest. auf der

Teflonplatte verteilt. Das Gel wurde mit einer Abdeckfolie bedeckt und 2 mit Puffer

durchtränkte Cellulosemembranen, welche als Buffer-Wicks dienen, wurden auf die Gelenden

gelegt und leicht angedrückt (siehe Abb. 10).

Abb. 10: Schematischer Aufbau der SSCP-Elektrophorese-Apparatur. links: Seitenansicht;

rechts: Aufsicht

Nach einem Vorlauf von 10 min bei 400 V, 50 mA und 20 °C, um das Gel an die

Elektrophorese-Bedingungen anzupassen, wurden die Proben auf das Gel geladen. Von den

Proben wurden jeweils 10 – 12 µl aufgetragen, vom Standard wurden pro Slot nur 2 µl

eingesetzt. Nach dem Gellauf über 17 bzw. 26 h bei 400 V, 50 mA und 26 °C wurde das Gel

wie folgt behandelt:


42

Silberfärbung

Fixierung: 300 ml Essigsäurelösung [10 %] 30 min

Waschen: 3 × 5 min mit je etwa 300 ml Aqua dest. 15 min

Silberfärbung: 300 ml Silbernitratlösung [0,1 %] (frisch angesetzt)

+ 1,5 ml Formaldehyd [37 w/v %] (Schale abgedunkelt) 30 min

Waschen: unter fließendem Aqua dest. abspülen 10 s

Entwickeln: 500 ml NaOH-Lösung [3 %]

+ 2 ml Formaldehyd [37 w/v %] (Schale abgedunkelt)

erst mit 200 ml kurz spülen,

dann mit restlicher Lösung entwickeln bis Banden sichtbar

Stoppen: 300 ml Essigsäurelösung [10 %] 30 min

Konservieren: 300 ml Ethanol [10 %] + Glycerol [13 %] 30 min

All diese Schritte wurden in einer Plastikwanne durchgeführt, in welcher das Gel zur besseren

Umspülung auf einer Plattform geschwenkt wurde. Die Silberfärbung ist nötig, um die

aufgetrennten DNA-Fragmente im Gel sichtbar zu machen (Bassam et al., 1991). Um die

Gele haltbar zu machen, wurden sie nach der Entwicklung in Ethanol [10 %] + Glycerol [13

%] konserviert, mit einer Cellophan-Folie abgedeckt und zum Trocknen zwischen zwei

Kunststoff-Platten eingespannt. Vor der Konservierung wurde mit einem Flachbettscanner mit

Durchlichtfunktion ein Bild des Gels angefertigt, welches später zur graphischen Auswertung

herangezogen wurde.

Auswertung der SSCP-Gele mittels GelCompar II

Die Auswertung der SSCP-Gele erfolgte mit Hilfe der Software GelCompar II

(Applied Maths) – wie bereits für ARDRA- und BOX-Gel. Dabei wurden aus den

Ähnlichkeiten der einzelnen Gelbahnen Dendrogramme erstellt, wobei folgende

Einstellungen verwendet wurden:






43

2.9.1 DNA-Isolation aus Gelbanden zur Identifizierung von

Mikroorganismen

Die ausgewählten Banden wurden mit einem Skalpell aus dem konservierten Gel

ausgeschnitten und jeweils mit 150 µl Crush and Soak-Puffer versetzt. Die Proben wurden

anschließend für 5 Tage bei 4 °C gekühlt. Danach wurden die gekühlten Gel-Ausschnitte für

10 min bei 13.000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand, worin sich nun die DNA

befand, wurde in ein frisches Eppi transferiert und mit dem doppelten Volumen an Ethanol

[70 %] versetzt. Diese Ansätze wurden für mindestens 1 h bei -20 °C eingefroren.

Anschließend erfolgte eine Zentrifugation für 20 min bei 13.000 rpm und 4 °C. Der Überstand

wurde abgehoben und die erhaltenen DNA-Pellets unter der Clean-Bench getrocknet. Die

isolierte DNA wurde in 50 µl TrisHCl [10 mM] pH 8,5 aufgenommen. Die so extrahierte

DNA wurde direkt als Template in die nachfolgende PCR eingesetzt.

Crush and Soak-Puffer

Magnesiumacetat 2,12 g/l

Ammoniumacetat 38,6 g/l

EDTA pH 8 0,37 g/l

SDS [20 %] 5,0 ml/l

Vorbereitung der Unibac-Fragmente für die Sequenzierung

Um die isolierte DNA aus den ausgeschnittenen SSCP-Gelbanden zu vermehren, wurde mit

der extrahierten DNA eine PCR durchgeführt. Das Temperaturprogramm erfolgte analog der

Unibac-PCR, welche vor der SSCP-Analyse durchgeführt wurde

(siehe 2.9 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen Biodiversität mittels

SSCP-Analyse).


44

Reaktionsansatz für Unibac-PCR:

Taq-&GOTM

[5 x] 6,0 µl




H2O 16,8 µl



Zur Kontrolle der PCR wurden erneut 5 µl des PCR-Produkts mit Loading Dye [6 x] versetzt

und auf ein 0,8 %igen Agarosegel in 1 x TAE-Puffer aufgetragen. Bei erfolgreicher PCR

wurde das verbleibende PCR-Produkt mit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System laut

Hersteller-Protokoll gereinigt und die DNA-Konzentration mittels Photometer bestimmt

(siehe 2.6.7 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung).

Sequenzierung

Zur Sequenzierung wurden die Proben wieder an das ZMF (Zentrum für medizinische

Grundlagenforschung) der medizinischen Universität Graz überstellt und mit den erhaltenen

Sequenzen wurden BLAST-Suchen gegen die NCBI-Datenbank durchgeführt. Hierfür wurde

wiederum blastn (megablast) gegen Nucleotide collection (nr/nt) verwendet. Die

Sequenzierung wurde ausgehend vom Forward-Primer Unibac-II-515f durchgeführt.

Ergebnisse

45

3. Ergebnisse

3.1 Mikrobielle Abundanzen in Rhizosphäre, Endorhizosphäre und

Boden

Für Bakterien wurden aus den R2A-Platten die folgenden Colony Forming Units

(cfu, Kolonie-bildende Einheiten) pro Gramm Frischgewicht bzw. Boden ermittelt. Es handelt

sich dabei um die Mittelwerte aller auswertbaren Platten eines Mikrohabitats. Um die

Streuung der einzelnen Auszählungen zu beurteilen, wurde die dazugehörige

Standardabweichung ermittelt. In der folgender Grafik werden die Abundanzen von den

Bakterien als log cfu/g Probenmaterial dargestellt (siehe Abb. 11).

0

1

2

3

45

6

7

8

9

Mat

ricaria

Cale

ndula

Solan

um

Mat

ricaria

Cale

ndula

Solan

um

SEK

EM

-Bod

en

Wüst

enbo

den

log

cfu

/g P

rob

e

Abb. 11: Abundanzen von Bakterien in den einzelnen Mikrohabitaten. Dargestellt sind die

Mittelwerte der Lebendkeimzahlen pro Gramm Probenmaterial als log10.

Erwartungsgemäß konnten sehr hohe Abundanzen an Bakterien in der Rhizosphäre der

Pflanzen ermittelt werden. Auffallend hoch ist der Wert der Bodenproben der Adleya-Farm in

SEKEM, dies könnte sich dadurch begründen, dass ein frisch gepflügt und gedüngter Acker

beprobt wurde. Die ermittelten Abundanzen für die Endorhizosphäre der Arzneipflanzen und

für den Wüstenboden liegen deutlich darunter.

Für Pilze wurde die Lebendzellzahl nicht ermittelt, da eine Pilz-Isolation nur auf TSM-Platten

stattgefunden hat. Es konnten zwar auch zahlreiche Pilze, wobei es sich nicht um

Trichodermen handelte, isoliert werden, aber durch die im Medium enthaltenen Antibiotika

Ergebnisse

46

und Fungizide, hat eine starke Selektion stattgefunden und die tatsächlichen Abundanzen der

Pilze wäre wesentlich höher. Hierfür wäre eine Pilz-Isolation auf SNA-Medium notwendig.

Laut morphologischer Merkmale konnten 5 Trichodermen-Isolate kultiviert werden. Alle

Isolate stammen aus der Rhizosphäre, je 2 von Matricaria chamomilla und Calendula

officinalis und ein Isolat von Solanum distichum.

3.2 Analyse des antagonistischen Potenzials der isolierten

Mikroorganismen

Es wurden 680 Bakterien- und 327 Pilz-Isolate getestet. In der folgenden Tabelle sind die

Prozentzahlen jener Isolate an den gesamt getesteten Bakterien- bzw. Pilz-Isolaten angegeben,

welche eine antagonistische Aktivität gegen das entsprechende Pathogen gezeigt haben

(siehe Tab. 4). Hier wurde nur bewertet, ob eine Hemmwirkung ausgehend vom Isolat

vorhanden war, die Stärke dieser wurde für die Berechnung des Anteils an antagonistisch

wirksamen Isolaten nicht berücksichtigt. Von jedem getesteten Phytopathogen ist

exemplarisch ein Dualkultur-Test mit einem positiven Isolat gezeigt (siehe Abb. 12, Abb. 13

und Abb. 14)

Tab. 4: Zusammenfassung der Ergebnisse aus den Antagonisten-Tests. Angegeben sind die

Prozentwerte aller positiv getesteten Isolate.

Verticillium dahliae Rhizoctonia solani Fusarium culmorum

Bakterien 10,6 % 9,9 % 14,0 %

Pilze 3,1 % 1,5 % 0,6 %

Abb. 12: Antagonistentest gegen Verticillium dahliae V25. Hier wird ein antagonistisch aktives

Isolat aus dem Wüstenboden gezeigt (Wb2n-23).

Ergebnisse

47

Abb. 13: Antagonistentest gegen Rhizoctonia solani AG4. Dieses positiv getestete Isolat wurde aus

der Rhizosphäre von Solanum distichum isoliert (Sd3-12).

Abb. 14: Antagonistentest gegen Fusarium culmorum E1. Das hier gezeigte Isolat mit

antagonistischer Aktivität stammt aus der Rhizosphäre von Matricaria chamomilla (Mc1-3).

In Prozent an den getesteten Isolaten eines Mikrohabitats ergaben sich für Bakterien mit

antagonistischer Aktivität Werte zwischen 0 und 23 % (siehe Abb. 15). Aus der

Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla konnten prozentuell die meisten bakteriellen

Antagonisten isoliert werden, gefolgt vom Boden, der auf der Adleya-Farm in SEKEM

beprobt wurde.

Ergebnisse

48

0

20

40

60

80

100

120

Iso

late

Mat

ricaria

Cale

ndula

Sol

anum

Mat

ricaria

Cale

ndula

Sol

anum

SEK

EM

-Bod

en

Wüst

enbo

den

Verticillium dahliae

Rhizoctonia solani

Fusarium culmorum

insgesamt getestet

Rhizosphäre Endorhizosphäre

Abb. 15: Antagonistisch wirkende Bakterien-Isolate gegen die einzelnen Pathogenen. gezeigt in

Anzahl an Isolaten

Unter den Pilz-Isolaten konnten nur wenige mit antagonistischen Fähigkeiten gefunden

werden (siehe Abb. 16). Es darf aber nicht vergessen werden, dass durch die Isolation auf

TSM bereits eine starke Selektion der Pilze stattgefunden hat. Aus dem Wüstenboden und aus

der Endorhizosphäre der Pflanzen konnten kaum Pilze isoliert werden. Prozentuell an den

getesteten Isolaten eines Mikrohabitats lagen die Werte für antagonistisch aktive Pilze bei

maximal 4 %. Gegen Fusarium culmorum konnten insgesamt nur 2 Pilze mit schwacher

Wirkung gefunden werden, da es bei diesem Pathogen auch zu keinem Hyperparasitismus

durch die isolierten Trichodermen gekommen ist.

0

20

40

60

80

100

Iso

late

Mat

ricaria

Cale

ndula

Sol

anum

Mat

ricaria

Cale

ndula

Sol

anum

SEK

EM

-Bod

en

Wüst

enbo

den

Verticillium dahliae

Rhizoctonia solani

Fusarium culmorum

insgesamt getestet

Rhizosphäre Endorhizosphäre

Abb. 16: Antagonistisch wirkende Pilz-Isolate gegen die einzelnen Pathogenen. gezeigt in Anzahl

an Isolaten

Ergebnisse

49

Es wurde eine Auswahl der stärksten bakteriellen Antagonisten getroffen (siehe Tab. 5),

welche morphologisch, physiologisch und genotypisch genauer charakterisiert wurden.

Ausgewählt wurden Bakterien-Isolate, welche im Dualkultur-Assay gegen Verticillium

dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum eine antagonistische Aktivität zeigten

und mindestens gegen ein Phytopathogen wenigstens mit einem Doppel-Plus bewertet wurden

– also einen Hemmhof von mindestens 5 mm erzeugten. So wurden 37 der insgesamt 680

Bakterien-Isolate für genauere Untersuchungen herausgefiltert.

Tab. 5: Auswahl der stärksten Antagonisten mit Intensität der Hemmwirkung. Vorausgesetzt

wurde eine antagonistische Aktivität gegen alle getesteten Pathogene.

(Mc ... Matricaria chamomilla, Co ... Calendula officinalis, Sd .... Solanum distichum, Re ... Endorhizosphäre, Sb .... SEKEM-Boden, Wb ... Wüstenboden)

Isolat Verticillium dahliae V25 Rhizoctonia solani AG4 Fusarium culmorum E1

Co1-6 ++ ++ ++

Co4-9 ++ ++ ++

Sd2Re-10 ++ ++ ++

Sb3-1 +++ ++ +

Wb2n-11 +++ +++ +

Wb2n-23 ++ +++ +

Mc1-3 + ++ ++

Mc2-9 ++ ++ +

Mc3-4 + ++ ++

Co1-24 + ++ ++

Sd1-14 + ++ ++

Sd4-9 + ++ ++

Mc1Re-3 + ++ ++

Sb1-16 + ++ ++

Sb1-20 + ++ ++

Sb3-10 ++ ++ +

Wb1-12 + ++ ++

Mc3-10 + + ++

Co2-14 + + ++

Co4-15 + + ++

Co4-16 + + ++

Co4-22 + + ++

Sd3-12 + + ++

Sd3-21 + ++ +

Sd4-11 + + ++

Mc2Re-2 + ++ +

Mc2Re-9 + + ++

Mc2Re-10 + + ++

Mc2Re-18 + + ++

Sb3-5 + ++ +

Sb3-13 + ++ +

Sb3-21 + ++ +

Sb3-24 + ++ +

Sb4-5 + ++ +

Wb1n-4 + ++ +

Wb1n-18 ++ + +

Wb2n-1 + ++ +

Ergebnisse

50

3.2.1 Morphologische Gruppierung der stärksten Antagonisten

Anhand einer makroskopischen Beurteilung morphologischer Merkmale konnten die stärksten

Antagonisten (siehe Tab. 5) in 3 Morphogruppen unterteilt werden (siehe Tab. 6). Dabei war

der überwiegende Teil der ausgewählten Antagonisten der Morphogruppe 1 zuzuordnen,

außer aus der Endorhizosphäre von Calendula officinalis waren aus jedem untersuchten

Mikrohabitat Isolate dabei. Morphogruppe 2 besteht ausschließlich aus Isolaten aus dem

Wüstenboden. Morphogruppe 3 beinhaltet nur ein einziges Isolat, welches aus der

Rhizosphäre von Matricaria chamomilla isoliert wurde.

Tab. 6: Die stärksten Antagonisten unterteilt in ihre 3 Morphogruppen.

Morphogruppe 1 Morphogruppe 2 Morphogruppe 3

Co1-6 Wb2n-11 Mc1-3

Co4-9 Wb2n-23

Sd2Re-10 Wb1n-4

Sb3-1 Wb1n-18

Mc2-9

Mc3-4

Co1-24

Sd1-14

Sd4-9

Mc1Re-3

Sb1-16 Sb1-20

Sb3-10

Wb1-12

Mc3-10

Co2-14

Co4-15

Co4-16

Co4-22

Sd3-12

Sd3-21

Sd4-11

Mc2Re-2 Mc2Re-9

Mc2Re-10

Mc2Re-18

Sb3-5

Sb3-13

Sb3-21

Sb3-24

Sb4-5

Wb2n-1

Ergebnisse

51


antagonistischem Potenzial

Die selektierten stärksten Antagonisten der bakteriellen Isolate wiesen 3 unterschiedliche

Morphotypen auf (siehe Tab. 6). Um zu überprüfen, ob es sich bei den Isolaten einer

Morphogruppe um dieselben Bakterien handelt, wurden diese einer ARDRA und einer

BOX-PCR unterzogen. ARDRA dient zur Unterscheidung auf Gattungsebene und mit Hilfe

der BOX-PCR ist eine Unterscheidung bis auf Artebene möglich.

3.3.1 ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis)

Am 0,8 %igen Agarosegel zur Überprüfung der Eubac-PCR war ersichtlich, dass bei allen

ausgewählten Antagonisten das entsprechende Fragment amplifiziert werden konnte. Eine

Voraussetzung dafür war die erfolgreiche Isolation der DNA mittels Aufkoch-Methode.

Das amplifizierte Eubac-Fragment der selektierten stärksten Antagonisten wurde mittels der

Restriktionsendonuklease HhaI verdaut, dabei wird das PCR-Produkt je nach Sequenz in

unterschiedliche DNA-Fragmente geschnitten, welche anschließend durch Elektrophorese in

einem 2 %igen Agarosegel aufgetrennt wurden. Für einen direkten Vergleich zwischen der

Färbung mit Ethidiumbromid und jener mit Midori Green DNA Stain (genXpress) wurden die

Verdauansätze auf beide Gele nach exakt dem gleichen Auftragsschema geladen

(siehe Abb. 17 und Abb. 18). Auch Laufzeit und Volt wurden bei beiden Gelen exakt gleich

gehalten (3 h 30 min bei 120 V).

Ergebnisse

52

Abb. 17: ARDRA-Elektrophoresegel der stärksten Antagonisten gefärbt mit Ethidiumbromid.

2 %iges Agarosegel, Std.: ....1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7) Std.: ....100 bp DNA Ladder (siehe Abb. 8)

Abb. 18: ARDRA-Elektrophoresegel der stärksten Antagonisten gefärbt mit Midori Green.

2 %iges Agarosegel, Std.: ....1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)

Std.: ....100 bp DNA Ladder (siehe Abb. 8)

Ergebnisse

53

Beide Gelbilder zeigen erwartungsgemäß exakt dasselbe Banden-Muster (siehe Abb. 17 und

Abb. 18). Obwohl Kontrast und Helligkeit beider Fotos bestmöglich bearbeitet wurden, zeigt

Midori Green DNA Stain auch bei der eingesetzten Maximalkonzentration eine wesentlich

geringere Intensität der DNA-Färbung. Die Gruppierung der Antagonisten nach Gattungen

kann auf beiden Gelen abgelesen werden. Errechnet man die Summe aller Banden eines

Isolats, muss sich wieder das verdaute Eubac-Fragment mit einer Größe von etwa

1500 bp ergeben. Unvollständig verdaute Fragmente konnten so ausgeschlossen werden.

Die morphologische Gruppierung hat sich größtenteils bestätigt. Allerdings innerhalb der

großen Morphogruppe 1 fallen 3 Isolate heraus, welche ein abweichendes Banden-Muster zu

den restlichen Isolaten dieser Gruppe zeigen. Die 3 Isolate stammen aus unterschiedlichen

Mikrohabitaten (SEKEM-Boden, Matricaria chamomilla Rhizosphäre und Solanum

distichum Rhizosphäre) und gehören also nicht derselben Gattung an wie der Rest der

Morphogruppe 1. In der Morphogruppe 2 weisen alle 4 Isolate dieselben DNA-Fragmente

auf. Morphogruppe 3 beinhaltet ohnehin nur ein Isolat, dessen Bandenmuster unterscheidet

sich deutlich von allen anderen.

Das ARDRA-Gelbild wurde mittels der Software GelCompar II ausgewertet. Dabei wurden

die Ähnlichkeiten der einzelnen Gelbahnen miteinander verglichen und daraus folgendes

Dendrogramm erstellt (siehe Abb. 19).

Ergebnisse

54

Abb.

19:

A

us

dem

AR

DR

A-G

el a

bg

elei

tete

s D

end

rogra

mm

der

stä

rkst

en A

nta

gon

iste

n.

Die

ses

Den

dro

gra

mm

wu

rde

mit

Gel

Com

par

II

erst

ellt

.

Äh

nli

chk

eit

[%]

Ergebnisse

55

Es ergaben sich also 4 ARDRA-Gruppen (siehe Tab. 7), innerhalb der Gruppen ist die

Ähnlichkeit der Banden-Muster zu 100 % identisch (siehe Abb. 19). Die Nummerierung der

ARDRA-Gruppen wurde von den Morphogruppen abgeleitet und so wurde die gebildete

Morphogruppe 1 für die Bildung der ARDRA-Gruppen in 1a und 1b unterteilt. Die Isolate

einer ARDRA-Gruppe gehören vermutlich derselben Gattung an. Um auf Artebene

differenzieren zu können, wurde mit denselben Isolaten eine BOX-PCR angeschlossen.

Tab. 7: Die stärksten Antagonisten unterteilt in ihre ARDRA-Gruppen. Morphogruppe 1 wurde

in ARDRA-Gruppe 1a und 1b unterteilt.

ARDRA-Gruppe 1a ARDRA-Gruppe 1b ARDRA-Gruppe 2 ARDRA-Gruppe 3

Co1-6 Sb3-1 Wb2n-11 Mc1-3

Co4-9 Mc2-9 Wb2n-23

Sd2Re-10 Sd4-11 Wb1n-4

Mc3-4 Wb1n-18

Co1-24

Sd1-14 Sd4-9

Mc1Re-3

Sb1-16

Sb1-20

Sb3-10

Wb1-12

Mc3-10

Co2-14

Co4-15

Co4-16

Co4-22 Sd3-12

Sd3-21

Mc2Re-2

Mc2Re-9

Mc2Re-10

Mc2Re-18

Sb3-5

Sb3-13

Sb3-21

Sb3-24

Sb4-5 Wb2n-1

3.3.2 BOX-PCR

Durch die Auftrennung der BOX-PCR-Produkte in einem 1,5 %igen Agarosegel können die

auf Gattungsebene gebildeten ARDRA-Gruppen auf Artebene unterteilt werden

(siehe Abb. 20).

Ergebnisse

56

Abb. 20: BOX-Elektrophoresegel der stärksten Antagonisten.

1,5 %iges Agarosegel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)

Anhand des BOX-Gels konnte die große ARDRA-Gruppe 1a in mehrere Untergruppen

unterteilt werden, wobei es sich um unterschiedliche Arten derselben Gattung handelt. Die

abgespaltene ARDRA-Gruppe 1b ist im Box-Muster einigen Isolaten der ARDRA-Gruppe 1a

wieder sehr ähnlich. Die Fingerprints der Isolate aus ARDRA-Gruppe 2 zeigen sehr ähnliche

Banden, wobei sich das Isolat Wb2n-11 etwas von den anderen unterscheidet. Das

Banden-Muster des einzigen Isolats der ARDRA-Gruppe 3 weicht stark von allen anderen ab.

Ergebnisse

57

Abb. 21: Aus dem BOX-Gel abgeleitetes Dendrogramm der stärksten Antagonisten. Dieses

Dendrogramm wurde mit GelCompar II erstellt.

Auch im Dendrogramm des BOX-Gels (siehe Abb. 21) clustern sich die vormals gebildeten

ARDRA-Gruppen 3 und 2 deutlich von den Isolaten der Morphogruppe 1 ab. Setzt man die

Ähnlichkeits-Grenze für eine BOX-Gruppe bei 70 %, so ergeben sich innerhalb der großen

Morphogruppe 1 10 Cluster. Auffallend ist, dass Isolate, deren Bandenmuster sowohl im

ARDRA- als auch im BOX-Gel zu 100 % identisch sind, also dadurch als Bakterien derselben

Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

BOX

100

80

60

40

20

G@images@Box@038

G@images@Box@036

G@images@Box@037

G@images@Box@035

G@images@Box@034

G@images@Box@007

G@images@Box@012

G@images@Box@025

G@images@Box@015

G@images@Box@008

G@images@Box@032

G@images@Box@033

G@images@Box@019

G@images@Box@021

G@images@Box@017

G@images@Box@018

G@images@Box@020

G@images@Box@002

G@images@Box@003

G@images@Box@026

G@images@Box@009

G@images@Box@004

G@images@Box@006

G@images@Box@010

G@images@Box@013

G@images@Box@014

G@images@Box@016

G@images@Box@030

G@images@Box@011

G@images@Box@029

G@images@Box@024

G@images@Box@022

G@images@Box@023

G@images@Box@005

G@images@Box@031

G@images@Box@027

G@images@Box@028

Matricaria chamomilla Rhizosphäre

Wüstenboden

Wüstenboden

Wüstenboden

Wüstenboden

Solanum distichum Rhizosphäre

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

Calendula officinalis Rhizosphäre





Matricaria chamomilla Endorhizosphä.






SEKEM-Boden


Solanum distichum Endorhizosphäre


SEKEM-Boden

Wüstenboden



Wüstenboden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden





SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

BOX

100

80604020

G@images@Box@038

G@images@Box@036

G@images@Box@037

G@images@Box@035

G@images@Box@034

G@images@Box@007

G@images@Box@012

G@images@Box@025

G@images@Box@015

G@images@Box@008

G@images@Box@032

G@images@Box@033

G@images@Box@019

G@images@Box@021

G@images@Box@017

G@images@Box@018

G@images@Box@020

G@images@Box@002

G@images@Box@003

G@images@Box@026

G@images@Box@009

G@images@Box@004

G@images@Box@006

G@images@Box@010

G@images@Box@013

G@images@Box@014

G@images@Box@016

G@images@Box@030

G@images@Box@011

G@images@Box@029

G@images@Box@024

G@images@Box@022

G@images@Box@023

G@images@Box@005

G@images@Box@031

G@images@Box@027

G@images@Box@028


Wüstenboden

Wüstenboden

Wüstenboden

Wüstenboden


SEKEM-Boden

SEKEM-Boden












SEKEM-Boden




SEKEM-Boden

Wüstenboden



Wüstenboden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden





SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

Ähnlichkeit [%]

Ergebnisse

58

Art identifiziert werden konnten, sowohl im Boden als auch in der Rhizo- und

Endorhizosphäre der Arzneipflanzen auftraten. Daraus kann geschlossen werden, dass von

den Pflanzen Bakterien aus dem Boden aufgenommen werden. Dies wäre eine optimale

Voraussetzung für den Einsatz von BCAs als biologischen Pflanzenschutz. Innerhalb der

Morphogruppe 2, deren Isolate alle aus dem Wüstenboden stammen, gibt es 2

unterschiedliche Cluster.

3.3.3 Identifizierung ausgewählter Isolate durch Sequenzierung

Anhand von ARDRA- und BOX-Gel wurde eine repräsentative Auswahl der stärksten

Antagonisten getroffen, deren 16S rDNA partiell sequenziert wurden. Mit den erhaltenen

Sequenzen wurden Abgleiche gegen die Datenbank des NCBI durchgeführt. Die meisten

Isolate konnten einer Gattung zugeordnet werden, teilweise war sogar die Bestimmung der

Art möglich (siehe Tab. 8).

Tab. 8: Identifizierung antagonistisch interessanter Isolate. Diese erfolgte anhand der

Sequenzierung der Eubac-Fragmente.

Isolat

Identifizierung

Accession

Number

Maximale

Identität

Taxonomische

Zugehörigkeit

Mc3-4 Bacillus subtilis GU191901.1 94 % Firmicutes

Mc1Re-3 Bacillus subtilis GU191901.1 98 % Firmicutes

Sd3-21 Bacillus subtilis GQ303255.1 97 % Firmicutes

Mc2-9 Paenibacillus polymyxa EF488174.1 98 % Firmicutes

Sd4-11 Sporosarcina psychrophila D16277.1 82 % Firmicutes

Wb1n-4 Streptomyces flavidovirens

Streptomyces albidochromogenes

FJ486395.1

AB249953.1

97 %

97 % Actinobacteria

Mc1-3 Lysobacter sp. EF471226.1 98 % γ-Proteobacteria

Die Übereinstimmung der Query-Sequenz mit dem ähnlichsten gefundenen Isolat der

Datenbank war teilweise sehr niedrig. Dennoch konnte durch die Identifizierung der

ausgewählten Isolate das Ergebnis der ARDRA bestätigt werden. Die Isolate Mc3-4,

Mc1Re-3 und Sd3-21 wurden der Morphogruppe 1 (siehe Tab. 6) und der ARDRA-Gruppe 1a

zugeordnet (siehe Tab. 7). Bei allen 3 Isolaten wurde Bacillus subtilis als das ähnlichste

Bakterium identifiziert. Die Antagonisten Mc2-9 und Sd4-11 wurden bei der

Ergebnisse

59

morphologischen Gruppierung ebenfalls der Morphogruppe 1 zugeordnet, wiesen aber ein

abweichendes Bandenmuster in der ARDRA auf und wurden in ARDRA-Gruppe 1b

abgespalten. Die Isolate unterschiedlicher Gattung waren also morphologisch nicht zu

unterscheiden. Durch die Sequenzierung wurde das Isolat Mc2-9 als Paenibacillus polymyxa

identifiziert. Als ähnlichste 16S rDNA-Sequenz zu jener des Isolats Sd4-11 wurde

Sporosarcina sp. herausgefunden, wobei das Isolat mit einer maximalen Identität von nur

82 % auch einer anderen Gattung der Firmicutes angehören kann. Paenibacillus und

Sporosarcina gehören wie auch Bacillus dem Stamm der Firmicutes und der Ordnung der

Bacillales an. Das Isolat Wb1n-4 aus der ARDRA-Gruppe 2 wurde als Streptomyces sp.

identifiziert, was auch die Morphologie der Kolonien bestätigte. Streptomyceten gehören zum

Stamm der Actinobacteria. Das Isolat der Morphogruppe 3 mit deutlich abweichendem

ARDRA- und BOX-Muster wurde als Lysobacter sp. identifiziert, welche zur Klasse der

Gamma-Proteobacteria gehören.

3.4 Untersuchung der bakteriellen Antagonisten auf das

Bildungsvermögen des Phytohormons Indol-3-essigsäure

In diesem Test wurden einige der stärksten bakteriellen Antagonisten auf die Fähigkeit zur

Produktion des Phytohormons Indol-3-essigsäure untersucht. Dafür wurden im

Mikroplate-Reader die Extinktionen bei 530 nm (siehe Tab. 8) und 460 nm (siehe Tab. 9)

gegen leeres Wachstumsmedium gemessen.

Tab. 8: Extinktionen bei 530 nm. Der Leerwert wurde bereits subtrahiert.

ARDRA-Gr. 1a ARDRA-Gr. 1b ARDRA-Gr. 2 ARDRA-Gr. 3

Co1-6 Co4-9 Sb3-1 Mc2-9 Sd4-11 Wb2n-11 Wb2n-23 Mc1-3

-0,0059 0,0569 -0,0128 -0,0006 -0,0011 0,0985 -0,0004 -0,0020

Tab. 9: Extinktionen bei 460 nm. Der Leerwert wurde bereits abgezogen.

ARDRA-Gr. 1a ARDRA-Gr. 1b ARDRA-Gr. 2 ARDRA-Gr. 3

Co1-6 Co4-9 Sb3-1 Mc2-9 Sd4-11 Wb2n-11 Wb2n-23 Mc1-3

-0,0056 0,1181 -0,0101 -0,0005 -0,0027 0,1989 -0,0017 -0,0037

Durch die Verfärbung des Mediums und die Extinktionsmessung im Mikroplate-Reader

konnten 2 positive Isolate identifiziert werden. Ein Isolat der ARDRA-Gruppe 1a, welches

aus der Rhizosphäre der Calendula officinalis isoliert wurde, zeigte eine positive Reaktion.

Das zweite positive Isolat gehört zur ARDRA-Gruppe 2 und wurde aus dem Wüstenboden

Ergebnisse

60

isoliert. Allerdings wies jeweils das andere Isolat derselben ARDRA-Gruppe keine

IAA-Bildung auf. Laut BOX-Fingerprint (siehe Abb. 20) gehören die beiden getesteten

Isolate der ARDRA-Gruppe 1a bzw. der ARDRA-Gruppe 2 auch nicht derselben Art an.

3.5 Kultivierungsunabhängige Untersuchung der mikrobiellen

Biodiversität mittels SSCP-Analyse (Single Strand Conformation

Polymorphism Analysis)

Für die Analyse der bakteriellen Biodiversität in den beprobten Mikrohabitaten wurde ein

Bereich der hoch konservierten 16S rDNA verwendet. Zur Untersuchung der pilzlichen

Communities wurde ein hoch konservierter ITS-Abschnitt zwischen 5,8S rDNA und

18S rDNA verwendet. Die amplifizierten Fragmente wurden als Einzelstränge mit

sequenzspezifischer Sekundärstruktur über ein Polyacrylamidgel aufgetrennt. Dabei wurden

die unabhängigen Replikate eines Mikrohabitats stets nebeneinander gruppiert. Die erhaltenen

Gelbilder wurden optisch ausgewertet und die Ähnlichkeiten der einzelnen Gelbahnen wurden

zusätzlich mit der Computer-Software GelCompar II verglichen und daraus Dendrogramme

erstellt.

3.5.1 Analyse der bakteriellen Community

Zur Analyse der gesamten bakteriellen Community der beprobten Mikrohabitate wurde das

unspezifische eubakterielle Unibac-Fragment amplifiziert. Die Auftrennung der ssDNA

erfolgte auf einem 8 %igen Polyacrylamidgel für 26 h bei 400 V, 50 mA und 26 °C

(siehe Abb. 22 und Abb. 23).

Ergebnisse

61

Abb. 22: Gesamte bakterielle Community der Rhizosphäre und Endorhizosphäre. Aufgetrennt

wurde die ssDNA der Unibac-Fragmente.

8 %iges Polyacrylamidgel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)

Dieses SSCP-Gel zeigt die Biodiversität von Bakterien, welche an und in den Wurzeln der

beprobten Arzneipflanzen zu finden sind. Die vertikale Position jeder einzelnen Bande

korrespondiert mit einer Bakterienart.

In der Rhizosphäre ist die bakterielle Gemeinschaft hoch divers, als Resultat davon sind am

SSCP-Gel kaum dominante Banden zu erkennen. Es war also nötig, spezifischere PCRs für

bestimmte Bakterien-Gruppen durchzuführen (z. B. für Pseudomonaden). Aber bereits auf

diesem Gel sind manche Banden zu erkennen, welche bei den 4 Replikaten einer

Arzneipflanze identisch auftraten bei den anderen Pflanzen hingegen nicht. Es handelt sich

dabei also um Bakterien, welche spezifisch für die Rhizosphäre der entsprechenden Pflanze

sind.

Ergebnisse

62

Bei der Endorhizosphäre zeigen besonders die 4 unabhängigen Replikate von Solanum

distichum ein identisches Bandenmuster, welches sich deutlich von jenen der beiden anderen

Arzneipflanzen unterscheidet. Matricaria chamomilla und Calendula officinalis weisen

Fingerprints mit teilweise identischen Banden auf. Das Dendrogramm gibt nähere

Informationen über die Ähnlichkeit bzw. Verschiedenheit der bakteriellen

Community-Strukturen in den Endorhizosphären der beprobten Arzneipflanzen

(siehe Abb. 25). Aber bereits vom Gel kann eine Abhängigkeit der Struktur der bakteriellen

Gemeinschaft von der Pflanze abgelesen werden.

Abb. 23: Gesamte bakterielle Community der Böden und der Endorhizosphäre. Aufgetrennt

wurde die ssDNA der Unibac-Fragmente. Die eingekreisten Banden wurden aus dem Gel

ausgeschnitten und sequenziert.


Ergebnisse

63

Auch die Bodenproben, welche auf der Adleya-Farm in SEKEM genommen wurden, zeigen

eine hoch diverse bakterielle Community mit kaum dominanten Banden am Gel. Auch hier

werden PCRs in denen bestimmte Bakterien-Gruppen hervorgehoben werden, bessere

Ergebnisse liefern. Äußerst interessant sind die beiden dominanten Banden in allen Proben

des Würstenbodens (siehe Abb. 23, mit Pfeilen gekennzeichnet), welche sich auch in der

Endorhizosphäre aller 3 Arzneipflanzen wiederfinden. Aus den ausgeschnittenen dominanten

DNA-Banden (siehe Abb. 23, eingekreiste Banden) wurde die DNA extrahiert und mittels

PCR wurde das entsprechende Fragment amplifiziert und schließlich sequenziert

(siehe Tab. 9).

Abb. 24: Dendrogramm der gesamten bakteriellen Community der Rhizosphäre. Dieses

Dendrogramm wurde aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.

Abb. 25: Dendrogramm der gesamten bakteriellen Community der Endorhizosphäre. Dieses


Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

SSCP1

100

80

60

Calendula officinalis Endorhizosphäre












Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

SSCP1

100

80

60













Ähnlichkeit [%]

Ähnlichkeit [%]

Ergebnisse

64

Abb. 26: Dendrogramm der gesamten bakteriellen Community des Bodens. Dieses


Die Dendrogramme bestätigen die optische Auswertung der Gele. Die bakterielle

Gemeinschaft der Rhizosphäre ist ebenso pflanzenspezifisch wie jene der Endorhizosphäre.

Die artenreichen Rhizosphären-Replikate einer Pflanze clustern sich im Dendrogramm

zusammen (siehe Abb. 24). Am Dendrogramm der Endorhizosphäre spiegelt sich auch die

Ähnlichkeit der bakteriellen Community in der Wurzel der Matricaria chamomilla und in

manchen Proben der Calendula officinalis wider (siehe Abb. 25). Bei den Bodenproben

clustert sich der SEKEM-Boden mit hoher bakterieller Biodiversität deutlich vom artenarmen

Wüstenboden ab (siehe Abb. 26).

Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

SSCP2

100

80

60

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

Wüstenboden

Wüstenboden

Wüstenboden

Ähnlichkeit [%]

Ergebnisse

65

Tab. 9: Identifizierung der ausgeschnittenen Gelbanden. Diese erfolgte anhand der

Sequenzierung der amplifizierten Unibac-Fragmente.

Nr.

Identifizierung

Accession

Number

Maximale

Identität

Taxonomische

Zugehörigkeit

1 Ochrobactrum sp. EU165529.1 83% α-Proteobacteria

2 Ochrobactrum sp. NR_028901.1 98% α-Proteobacteria



5 Unkultiviertes Bakterium GQ070391.1 83%

6 Pseudomonas sp. FM881813.1 81% γ-Proteobacteria

7 Pseudomonas sp. EU097134.1 88% γ-Proteobacteria

8 Artemisia annua Chloroplast EZ230745.1 96% Pflanzen-DNA

9 Artemisia annua Chloroplast EZ230745.1 96% Pflanzen-DNA

10 Xanthomonadales EU404026.1 98% γ-Proteobacteria

11 Lactuca sativa Chloroplast AM411199.1 99% Pflanzen-DNA

12 Lactuca sativa Chloroplast AM411199.1 99% Pflanzen-DNA

13 Rhodococcus sp. EU196301.1 99% Actinobacteria

14 Unkultiviertes Bakterium GQ108869.1 95%

15 Solanum tuberosum Chloroplast DQ386163.2 99% Pflanzen-DNA

Die beiden Banden, welche im Wüstenboden und in allen Endorhizosphären-Proben auftraten,

wurden als Ochrobactrum sp. und Rhodococcus sp. identifiziert. Als ähnlichste Sequenz der

Banden 6 und 7 wurde Pseudomonas sp. herausgefunden. Die entsprechende Bande trat bei

der Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla in Replikat 2 und 4 und bei der

Endorhizosphäre von Calendula officinalis in Replikat 2 auf. Bestätigend für das

Vorhandensein von Pseudomonaden in diesen Proben war auch das 0,8 %ige Agarosegel,

welches zur Kontrolle der Pseudomonas-spezifischen PCR (1. PCR zur Analyse der

Pseudomonas-Community) gefahren wurde (siehe Abb. 27). Bei den entsprechenden Proben

konnte auch auf diesem Gel ein Pseudomonas-spezifisches Fragment nachgewiesen werden.

Bande 10 wurde als Bakterium der Ordnung Xanthomonadales identifiziert. Diese Bande ist

nur bei Replikat 1 der Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla aufgetreten. Ein Vertreter

der Xanthomonadales ist z. B. Lysobacter sp., welcher auch aus der Rhizosphäre dieser Probe

isoliert werden konnte. Bei den Banden 8, 9, 11, 12 und 15 handelte es sich um

Plastiden-DNA der Pflanzen. Da sich diese Zellorganellen aus Endosymbionten entwickelt

Ergebnisse

66

haben, wird deren verbleibendes Genom von den eubakteriellen Primern als Template erkannt

und amplifiziert.

Abb. 27: Elektrophoresegel des amplifizierten Pseudomonas-Fragments. Das Fragment wurde aus

der Gesamt-DNA mit den Primern F311Ps und 1459rPsP amplifiziert.

0,8 %iges Agarosegel, Std.: ... 1 kb DNA Ladder (siehe Abb. 7)

3.5.1.1 Analyse der Pseudomonas-Community

Für eine genauere Analyse der biotechnologisch interessanten Pseudomonas-Community

wurde ebenfalls das Unibac-Fragment verwendet, allerdings wurde dieser PCR eine für

Pseudomonaden spezifische PCR vorangestellt. Die Einzelstränge wurden ebenfalls auf

einem 8 %igen Gel aufgetrennt, die Laufzeit betrug 26 h bei 400 V, 50 mA und 26 °C.

Ergebnisse

67

Abb. 28: Pseudomonas-Community der Rhizosphäre und Endorhizosphäre. Aufgetrennt wurde

die ssDNA der Unibac-Fragmente, dieser PCR wurde eine Pseudomonas-spezifische PCR vorangestellt.


Durch die spezifische Amplifikation der 16S rDNA von Pseudomonaden treten in der

Rhizosphäre bereits einige stärkere Banden auf, Matricaria chamomilla und Calendula

officinalis sind sich in den dominanten Banden sehr ähnlich, in den schwachen Banden

unterscheiden sich die beiden analysierten Rhizosphären allerdings. Solanum distichum weist

einige dieser dominanten Banden nicht auf, andere Banden treten wiederum nur bei Solanum

auf. Diese pflanzenspezifische Pseudomonas-Community der Rhizosphäre spiegelt sich auch

im Dendrogramm wieder (siehe Abb. 30).

Bei den Proben der Endorhizosphäre konnte in manchen Fällen nach der

Pseudomonas-spezifischen PCR kein Produkt nachgewiesen werden (siehe Abb. 27), hier

wurde wenn möglich das entsprechende Fragment mit der effizienteren Phusion®-Polymerase

amplifiziert, wenn dies auch zu keinem Produkt führte, wurde das PCR-Produkt aus der

Ergebnisse

68

1. PCR mit der Taq-Polymerase unverdünnt in die universelle Unibac-PCR eingesetzt. Die

Pseudomonas-spezifischen PCR-Produkte wurden bei den Proben der Endorhizosphäre von

Calendula 3 und 4 mit der Phusion®-Polymerase hergestellt. Bei der Endorhizosphäre von

Matricaria 3 und Calendula 1 wurde das PCR-Produkt unverdünnt in die universelle PCR

eingesetzt, wodurch es möglicherweise auch zur Amplifikation der 16S rDNA von

Nicht-Pseudomonaden gekommen sein könnte. Jene Proben von Matricaria chamomilla und

Calendula officinalis, wo problemlos ein Pseudomonas-Fragment amplifiziert werden konnte

(Mc2, Mc4, Co2) weisen ein beinahe identisches Bandemuster auf. Es kann auch für die

Pseudomonaden abgeleitet werden, dass sich die Communities in der Endorhizosphäre der

Kamille und der Ringelblume ähnlich sind und sich von jener in der Wurzel von Solanum

deutlich unterscheiden. Je nachdem ob nach der 1. PCR ein Produkt vorhanden war oder die

DNA unverdünnt in die unspezifische PCR eingesetzt wurde, clustern sich auch die Gruppen

im Dendrogramm (siehe Abb. 31).

Ergebnisse

69

Abb. 29: Pseudomonas-Community des Bodens. Aufgetrennt wurde die ssDNA der

Unibac-Fragmente, dieser PCR wurde eine Pseudomonas-spezifische PCR vorangestellt.


Die Pseudomonas-Gemeinschaft im Boden der Adleya-Farm in SEKEM ist abweichend zu

jener im Wüstenboden. Auffallend ist das Pseudomonas-arme Replikat 3 des Wüstenbodens,

welches von einer Düne nahe SEKEM stammt. Die hohe Anzahl an Pseudomonaden in den

anderen Wüstenproben ist erstaunlich. Möglicherweise handelt es sich bei den Amplifikaten

auch um andere Vertreter der taxonomischen Gruppe der Gamma-Proteobacteria, wozu auch

einige mesophile (10 °C – 45 °C) und thermophile (40 °C – 65 °C) Bakterien gehören

(Alves et al., 2003; Fritsche, 2002). Eine Sequenzierung der DNA-Banden würde hier

genaueren Aufschluss geben. Im Dendrogramm der Pseudomonas-Community im Boden

werden die Ähnlichkeiten der einzelnen Gel-Bahnen miteinander verglichen (siehe Abb. 32).

Ergebnisse

70

Abb. 30: Dendrogramm der Pseudomonas-Community der Rhizosphäre. Dieses Dendrogramm

wurde aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.

Abb. 31: Dendrogramm der Pseudomonas-Community der Endorhizosphäre. Dieses


Abb. 32: Dendrogramm der Pseudomonas-Community des Bodens. Dieses Dendrogramm wurde

aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.

Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

Pseu2

100

80

60

40

Wüstenboden

Wüstenboden

Wüstenboden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

Pseu1

100

80

60













Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

Pseu1

100

90

80

70

60













Ähnlichkeit [%]

Ähnlichkeit [%]

Ähnlichkeit [%]

Ergebnisse

71

3.5.2 Analyse der Pilz-Community

Um die Pilz-Gemeinschaft in den Proben zu untersuchen, wurde ein ITS-Fragment

amplifiziert. Hier wurde ebenfalls eine verschachtelte PCR durchgeführt, wobei allerdings

beide PCRs spezifisch für Pilze waren. Die einzelsträngige DNA wurde auf einem 9 %igen

Polyacrylamidgel für 17 h bei 400 V, 50 mA und 26 °C aufgetrennt.

Abb. 33: Pilz-Community der Rhizosphäre und Endorhizosphäre. Aufgetrennt wurde die ssDNA

der Pilz-spezifischen ITS-Fragmente.


Ergebnisse

72

Sowohl in der Rhizosphäre als auch in der Endorhizosphäre ist eine hohe Diversität an Pilzen

vorhanden (siehe Abb. 33). Bei der Rhizosphäre gibt es einige dominante Banden die bei

allen Proben auftreten. In der Endorhizosphäre treten manche Banden nur bei den Replikaten

einer beprobten Arzneipflanze auf. Allerdings ist bei anderen Banden wiederum eine relativ

hohe Variabilität innerhalb der Replikate einer Pflanze ersichtlich.

Abb. 34: Pilz-Community des Bodens. Aufgetrennt wurde die ssDNA der Pilz-spezifischen

ITS-Fragmente.


Ergebnisse

73

Der SEKEM-Boden zeigt eine hohe Diversität an Pilzen (siehe Abb. 34). Die einzelnen

Replikate ähneln sich untereinander kaum, was bei Bodenproben meist die Regel ist. Auch im

Wüstenboden ist eine erstaunlich hohe Anzahl an Pilzen nachweisbar, wobei sich wiederum

Replikat 3 als das artenärmste erwies. Auch hier würde ein Ausschneiden der DNA-Banden

mit anschließender Sequenzierung nähere Informationen geben. Interessant wäre auch eine

gesonderte Analyse der Ascomyceten.

Auch bei der Pilz-Gemeinschaft werden die Ähnlichkeiten der Bahnen auf den SSCP-Gelen

durch Dendrogramme für Rhizosphäre, Endorhizosphäre und Boden dargestellt

(siehe Abb. 35, Abb. 36 und Abb. 37).

Abb. 35: Dendrogramm der pilzlichen Community der Rhizosphäre. Dieses Dendrogramm wurde

aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.

Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

ITS1

100

90

80

70













Ähnlichkeit [%]

Ergebnisse

74

Abb. 36: Dendrogramm der pilzlichen Community der Endorhizosphäre. Dieses Dendrogramm

wurde aus dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.

Abb. 37: Dendrogramm der pilzlichen Community des Bodens. Dieses Dendrogramm wurde aus

dem SSCP-Gel abgeleitet und mit GelCompar II erstellt.

Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

ITS2

100

80

60

Wüstenboden

Wüstenboden

Wüstenboden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

SEKEM-Boden

Dice (Opt:4.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

ITS1

100

90

80

70

60













Ähnlichkeit [%]

Ähnlichkeit [%]

Diskussion

75

4. Diskussion

4.1 Kultivierungsabhängige Analyse des antagonistischen Potenzials

gegen bodenbürtige Phytopathogene

Zur Ermittlung der bakteriellen Abundanzen wurde das Spatelplatten-Verfahren angewendet.

Die quantitativen Untersuchungen müssen unter dem Aspekt betrachtet werden, dass der

überwiegende Teil an Bakterien in vitro nicht kultivierbar ist. Mit dieser Methode werden nur

etwa 1 – 10 % der vorhandenen Bakterien erfasst (Hemming, 1990). Dadurch, dass das

Bakterienwachstum stark von der Zusammensetzung des Nährmediums, des pH-Werts und

der Temperatur beeinflusst wird, findet eine zusätzliche Selektion statt. Zur Isolation von

Bakterien wurde in dieser Arbeit R2A-Medium verwendet. Dabei handelt es sich um ein

nährstoffarmes Medium, auf dem eine optimale Artenvielfalt erreicht werden soll. Die Anzahl

der real in den einzelnen Mikrohabitaten vorhandenen Mikroorganismen liegt allerdings weit

über den ermittelten Werten und die möglichen Fähigkeiten der nicht kultivierbaren Bakterien

können nicht untersucht werden.

Die ermittelten Abundanzen für Bakterien in der Rhizosphäre der Arzneipflanzen lagen im

Bereich von 108 cfu/g fw. Die Rhizosphäre stellt ein beliebtes Mikrohabitat für Bakterien und

Pilze dar, dies ist auf die gute Nährstoffversorgung durch Wurzelausscheidungen und

abgestorbene Wurzelteile zurückzuführen (Sørenson, 1997). Die Förderung des mikrobiellen

Wachstums im Wurzelbereich wird als Rhizosphären-Effekt bezeichnet. Jene Bakterien, die

das Wachstum der Pflanze fördern, werden Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR)

genannt (Dube, 2001). Ihre fördernde Wirkung ist auf die Bildung von pflanzlichen

Wachstumsregulatoren und Siderophoren zurückzuführen. Die Siderophore binden das

vorhandene Eisen in der Rhizosphäre, dadurch können phytopathogene Mikroorganismen auf

Grund des Eisenmangels nicht wachsen (Fritsche, 2002).

In der Endorhizosphäre der Arzneipflanzen lagen die ermittelten Abundanzen im Bereich von

104 cfu/g fw. Eine auffallend hohe Anzahl an Bakterien konnte aus dem Boden der

Adleya-Farm in SEKEM isoliert werden. Die ermittelten Colony Forming Units lagen wie in

der Rhizosphäre bei 108 cfu/g. Im Wüstenboden lag der ermittelte Wert erwartungsgemäß

deutlich darunter bei 103 cfu/g.

Diskussion

76

Für Pilze wurde die Lebendzellzahl – wie bereits erwähnt – nicht ermittelt. Die

SSCP-Analyse der Pilz-Community zeigte in allen Mikrohabitaten eine sehr hohe Diversität,

möglicherweise hätten auch bessere pilzliche Antagonisten gefunden werden können, wenn

die Selektion durch das verwendete TSM-Medium nicht durchgeführt worden wäre.

Allerdings konnten durch diese Methode laut morphologischer Charakterisierung 5

Trichoderma-Isolate kultiviert werden, welche sich auf SNA-Medium vermutlich gegen die

große Konkurrenz nicht durchsetzten hätten können. Die isolierten Trichodermen zeigten

zwar Hyperparasitismus auf Verticillium dahliae und Rhizoctonia solani, wiesen aber keine

antagonistische Aktivität gegen Fusarium culmorum auf.

Insgesamt wurden 680 Bakterien- und 327 Pilz-Isolate auf ihre antagonistischen Fähigkeiten

getestet. Unter den Bakterien wiesen 10 – 14 % eine antagonistische Fähigkeit gegen die

unterschiedlichen Phytopathogene (Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium

culmorum) auf, wobei die meisten bakteriellen Antagonisten gegen Fusarium culmorum

gefunden werden konnten. Bei den Pilzen konnten außer den Trichoderma-Isolaten nur

wenige Isolate mit antagonistischen Fähigkeiten gefunden werden, dies begründet sich

vermutlich durch die starke Selektion auf dem TSM-Medium. Die Werte für antagonistisch

wirksame Pilze lagen zwischen 0 und 3 %, wobei noch die meisten antagonistischen Pilze

gegen Verticillium dahliae gefunden werden konnten.

Eine Auswahl der stärksten bakteriellen Antagonisten wurde morphologisch, physiologisch

und genotypisch genauer charakterisiert und schließlich durch partielle Sequenzierung der

16S rDNA identifiziert. Durch makroskopische Charakterisierung wurden diese ausgewählten

Isolate in 3 Morphogruppen unterteilt. Diese Einteilung hat sich durch die

Fingerprint-Methode ARDRA größtenteils bestätigt und durch die anschließend

durchgeführte BOX-PCR konnten die Gruppen in mehrere Cluster unterteilt werden. ARDRA

dient zur Unterscheidung auf Gattungsebene und durch die BOX-PCR ist eine

Unterscheidung bis auf Artebene möglich. Bakterien-Isolate, welche derselben Art zugeordnet

wurden, traten sowohl im Boden, als auch in Rhizo- und Endorhizorphäre der Arzneipflanzen

auf.

Diskussion

77

Durch die Untersuchung der selektierten stärksten Antagonisten auf das Bildungsvermögen

von Indol-3-essigsäure konnten einige der Isolate als Plant Growth Promoting Rhizobacteria

(PGPR) identifiziert werden, was bei antagonistisch wirksamen Bakterien keine Seltenheit ist

(Berg, 2009). Indol-3-essigsäure gehört zu den Auxinen, welche zu den

Pflanzenwachstumshormonen gehören.

Durch Sequenzvergleiche der partiell sequenzierten 16S rDNA mit der NCBI-Datenbank

konnte als ähnlichstes Bakterium der großen Gruppe 1a Bacillus subtilis identifiziert werden.

Bacillus subtilis ist ein bekannter BCA, es sind bereits mehrere biologische

Pflanzenschutzmittel mit Bacillus subtilis im Einsatz (Schisler et al., 2004). Jene

Antagonisten, welche morphologisch nicht von denen der Gruppe 1a getrennt werden

konnten, allerdings in der ARDRA ein abweichendes Banden-Muster zeigten, wurden als

Paenibacillus polymyxa und Sporosarcina sp. identifiziert. Diese beiden Gattungen gehören,

wie auch Bacillus, der phylogenetischen Gruppe der Firmicutes und der Ordnung der

Bacillales an. Es handelt sich dabei um gram-positive Bakterien. Bacillus und Paenibacillus

sind begeißelte Stäbchen, wohingegen es sich bei Sporosarcina um Kokken handelt, die sich

zu Tetraden zusammenschließen. Alle 3 Arten sind zur Bildung von hitzeresistenten

Endosporen fähig. Bacillus-Arten sind weit verbreitete Bodenbakterien, einige von ihnen

produzieren Antibiotika und extrazelluläre Enzyme. Bacillus subtilis produziert Amylasen

und Proteasen. Paenibacillus polymyxa gehört ebenfalls zu den Boden besiedelnden Bacillen

und produziert das Antibiotikum Polymyxin. Für Paenibacillus polymyxa wurde auch bereits

eine antagonistische Aktivität gegen ein breites Spektrum an Mykotoxin-produzierenden

Pilzen wie z. B. Fusarium culmorum beschrieben (Tupinamba et al., 2008). Sporosarcina

urea kommt z. B. bevorzugt in alkalischen Böden vor, die mit Urin kontaminiert sind

(Fritsche, 2002).

Die Antagonisten der Gruppe 2, welche alle aus dem Wüstenboden isoliert wurden, konnten

als Streptomyces sp. identifiziert werden, dies wurde durch die charakteristische Morphologie

auch bereits vermutet. Streptomyceten gehören zum Stamm der Actinobacteria, sie sind

gram-positiv und kommen vor allem in Böden vor. Sie sind mehrzellig und bilden ein Myzel.

Die meisten Streptomyceten sind zur Bildung von Sporen fähig und verschiedene Antibiotika

werden von ihnen produziert – unter anderem Streptomycin (Dworkin et al., 2006;

Stackebrandt et al., 1991).

Diskussion

78

Das antagonistisch aktive Isolat der Gruppe 3, welches sich durch seine Morphologie deutlich

von den anderen abhebt, wurde als Lysobacter sp. identifiziert, welche zur Klasse der

Gamma-Proteobacteria gehören. Lysobacter ist ein gram-negatives Stäbchen und zur

Produktion von Antibiotika fähig (Hashizume et al., 2001), z. B. für Lysobacter capsici wurde

bereits eine breite antimikrobielle Aktivität festgestellt (Park et al., 2008).

Die Eignung der isolierten in vitro antagonisischen Bakterien für den Einsatz im biologischen

Pflanzenschutz müsste in Gewächshaus- und anschließend in Freilandversuchen bestätigt

werden.

4.2 Kultivierungsunabhängige Analyse der mikrobiellen Biodiversität

Zur Analyse der mikrobiellen Biodiversität in der Rhizo- und Endorhizosphäre sowie im

Boden wurde die SSCP-Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism Analysis)

verwendet. Für die Analyse der bakteriellen Biodiversität in den beprobten Mikrohabitaten

wurde ein Bereich der hoch konservierten 16S rDNA amplifiziert. Zur Untersuchung der

pilzlichen Communities wurde ein hoch konservierter ITS-Abschnitt zwischen 5,8S rDNA

und 18S rDNA verwendet. Die Polyacrylamidgele wurden optisch und mit der

Computer-Software GelCompar II ausgewertet.

Die bakteriellen Abundanzen sind in der Rhizosphäre durch den bereits erwähnten

Rhizosphären-Effekt sehr hoch. Auf dem SSCP-Gel der gesamten bakteriellen Community

waren kaum dominante Banden ersichtlich, was auf eine hoch diverse Gemeinschaft in der

Rhizosphäre schließen lässt. Es konnte allerdings auch für die Gesamt-Community der

Bakterien eine Abhängigkeit von der Pflanze festgestellt werden, wobei sich die

Community-Strukturen von Matricaria chamomilla und Calendula officinalis ähnlich sind

und sich deutlich von jener von Solanum distichum unterscheiden. Bei den Proben der

Endorhizosphäre waren deutliche Banden erkennbar, welche ausgeschnitten und sequenziert

wurden. Auch in der Endorhizosphäre ähneln sich die bakteriellen Communities von

Matricaria und Calendula und auch die bakterielle Gesamt-Community der Endorhizosphäre

ist pflanzenspezifisch. Diese Pflanzenspezifität der mikrobiellen Communities in der Rhizo-

und Endorhizosphäre ist bereits bekannt (Berg & Smalla, 2009).

Diskussion

79

Der Boden der Adleya-Farm in SEKEM zeigt am SSCP-Gel eine ähnlich hohe Diversität wie

die Rhizosphären-Proben. Besonders interessant war die Analyse des Wüstenbodens, bei allen

Replikaten traten 2 dominante Banden auf, welche auch in allen Proben der Endorhizosphäre

zu finden waren. Dies war eine äußerst interessante Entdeckung, lässt es doch darauf

schließen, dass die Arzneipflanzen Bakterien aus dem Boden aufnehmen, was auch bereits

durch die BOX-PCR der stärksten Antagonisten vermutet wurde. Dies ist eine optimale

Voraussetzung für biologischen Pflanzenschutz durch antagonistische Bakterien. Auch die

beiden bandengebenden Bakterien im Wüstenboden konnten durch Sequenzierung der

ausgeschnittenen DNA-Fragmente identifiziert werden. Die optische Auswertung der Gele

wurde stets durch die erstellten Dendrogramme bestätigt.

In einer interessanten Studie wurden Umweltbedingungen wie Durchschnittstemperatur,

Verdunstung und Breitengrad als untergeordnete Faktoren für das Bakterienreichtum

identifiziert. Stattdessen war der pH-Wert des Bodens entscheidend. Saure Böden mit

geringem pH-Wert – zu finden etwa im Regenwald – bieten den Mikroorganismen offenbar

schlechtere Lebensbedingungen als Böden mit neutralem pH-Wert, wie sie in trockenen

Wüsten vorkommen (Fierer & Jackson, 2006).

Die beiden dominanten Bakterien im Wüstenboden konnten als Ochrobactrum sp. und

Rhodococcus sp. identifiziert werden. Ochrobactrum ist ein gram-negatives Stäbchen,

welches zur Klasse der Alpha-Proteobakterien zählt. Bei Ochrobactrum anthropi wurde

bereits die Produktion von Pflanzenwachstumshormonen und Siderophoren nachgewiesen

und außerdem eine antifungale Aktivität gegen mehrere Phytopathogene beschrieben

(Chakraborty et al., 2009). Rhodococcus gehört zum Stamm der Actinobacteria. Dieses

gram-positive unbewegliche Stäbchen ist ein weltweit verbreiteter Bodenbewohner.

In einigen Proben der Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla und Calendula officinalis

trat eine Bande auf, welche als Pseudomonas sp. identifiziert wurde. Diese Bande trat genau

in jenen Wiederholungen auf, in denen auch nach der Pseudomonas-spezifischen PCR ein

Produkt nachgewiesen werden konnte. Pseudomonaden gehören zur Klasse der

Gamma-Proteobakterien. Vertreter dieser Gruppe wie z. B. Pseudomonas fluorescens sind

bereits erfolgreich im biologischen Pflanzenschutz im Einsatz

(Prieto & Mercado-Blanco, 2008).

Diskussion

80

Eine Bande, welche nur in einem Replikat der Endorhizosphäre der Kamille auftrat, wurde als

Bakterium der Ordnung Xanthomonadales identifiziert. Ein Vertreter der Xanthomonadales

ist z. B. Lysobacter sp., welcher auch aus der Rhizosphäre dieser Probe isoliert werden konnte

und ein sehr gutes antagonistisches Potenzial gezeigt hat.

Einige Banden wurden leider auch als Plastiden-DNA der Pflanze identifiziert. Da sich diese

Zellorganellen aus Endosymbionten entwickelt haben, besitzen sie noch ein eigenes kleines

Genom, worauf unter anderem die rRNAs für die eigenen prokaryontischen Ribosomen

codiert sind. Diese DNA wird von den eubakteriellen Primern als Template erkannt und

amplifiziert (Madigan & Martinko, 2006).

Durch spezifischere PCRs wurden die biotechnologisch interessanten Pseudomonaden

hervorgehoben. Sowohl die Rhizo- als auch die Endorhizosphäre von Matricaria chamomilla

und Calendula officinalis sind sich in den dominanten Banden auch in dieser Analyse wieder

sehr ähnlich und unterscheiden sich deutlich von Solanum distichum. Es kann auch für die

Pseudomonas-Community eine Abhängigkeit von der Arzneipflanze festgestellt werden.

Bei der Analyse der Pseudomonas-Community in den Böden ist die relativ hohe Anzahl an

Pseudomonaden im Wüstenboden erstaunlich. Es wäre möglich, dass die 16S rDNA von

anderen Vertretern der Gamma-Proteobakterien amplifiziert wurde, wozu auch einige

mesophile (10 °C – 45 °C) und thermophile (40 °C – 65 °C) Bakterien gehören

(Alves et al., 2003; Fritsche, 2002). Das Ausschneiden und Sequenzieren der DNA-Banden

würde hier genaueren Aufschluss geben.

Besonders interessant wäre noch eine Analyse der Firmicutes-Community. Die Bacillen,

welche zu dieser taxonomischen Gruppe gehören, sind wie auch die Pseudomonaden für ihre

biotechnologische Relevanz bekannt. Und viele der identifizierten Isolate mit besonders hoher

antagonistischer Aktivität sind dem Stamm der Firmicutes zuzuordnen.

Die Pilz-Community weist sowohl in der Rhizosphäre als auch in der Endorhizosphäre der

Arzneipflanzen eine sehr hohe Diversität auf. Teilweise ist auch eine Variabilität innerhalb

der Replikate zu erkennen, was bei Pilzen nicht erstaunlich ist.

Diskussion

81

Auch in den Böden zeigte sich eine hohe Diversität an Pilzen. Dies ist besonders beim

Wüstenboden erstaunlich. Eine Sequenzierung der bandengebenden Pilze würde interessante

Informationen liefern. Es ist bekannt, dass im Wüstenboden extrem austrocknungstolerante

Pilze auftreten, welche bevorzugt in einer Mykorrhiza-Symbiose leben, z. B. Piriformospora

indica (Varma et al., 1999). Pflanzen, welche mit solchen Pilzen kultiviert werden, sind

vitaler, wachsen schneller und besser und sind toleranter gegen Austrocknung. Zur

Verifizierung der erläuterten Resultate wäre eine weitere Probennahme nötig.

Zusammenfassung

82

5. Zusammenfassung

SEKEM ist eine ägyptische Kulturinitiative und ein Fair Trade-Unternehmen, wo seit mehr

als 30 Jahren biologisch-dynamische Landwirtschaft betrieben wird. Medikamente, welche

aus ökologisch gezogenen Arzneipflanzen gewonnen werden, werden international

vermarktet. Deren Anbau ist allerdings immer mehr von bodenbürtigen Phytopathogenen wie

Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani und Fusarium culmorum betroffen, wodurch es zu

erheblichen Ertragseinbußen kommt. Eine Ursache hierfür ist ein intensiver Anbau von einer

begrenzten Anzahl an Kulturpflanzen in kurzen Rotationen. Die biologisch-dynamische

Landwirtschaft schließt die Anwendung von synthetischem Kunstdünger und Pestiziden aus.

Eine mögliche, umweltfreundliche und nachhaltige Lösung des Problems wäre die Einführung

von biologischen Kontrollstämmen (Biological Control Agents, BCA). BCAs sind natürlich

vorkommende Mikroorganismen, die in der Lage sind, effizient Pflanzen zu besiedeln und

durch verschiedene Mechanismen das Wachstum von gesunden Pflanzen zu fördern.

Das allgemeine Ziel des Projekts „Commercial Production of Enhanced Bio-Control Agents

for Combating Soil Borne Pathogens in Egypt”, in dessen Rahmen diese Arbeit verfasst

wurde, ist es, ein natürliches Präparat herzustellen, womit die Anwendung von chemischen

Pflanzenschutzmitteln und deren Auswirkungen auf Umwelt und Gesundheit verhindert

werden können. Durch die Einbringung von BCAs soll die Vitalität und die natürliche

Biodiversität des Bodens wieder hergestellt werden. Das Präparat soll bezüglich Boden,

Wetter, Pathogen-Spezies, etc. für ägyptische Bedingungen optimiert werden, aus diesem

Grund sollen die BCAs aus ägyptischem Proben-Material isoliert werden.


ägyptischen Arzneipflanzen (Matricaria chamomilla, Calendula officinalis und Solanum

distichum) sowie aus ägyptischen Böden isoliert und auf ihr antagonistisches Potenzial gegen

die in SEKEM auftretenden bodenbürtigen Phytopathogene gescreent. Potenzielle

Kontrollstämme wurden morphologisch, physiologisch und genotypisch charakterisiert und

durch partielle Sequenzierung der 16S rDNA identifiziert. Dabei konnten Isolate der

Gattungen Bacillus, Paenibacillus, Streptomyces sowie Lysobacter als besonders gute

Antagonisten identifiziert werden. Es konnten antagonistisch aktive Isolate nicht nur aus dem

Boden sondern auch aus Rhizo- und Endorhizosphäre der Pflanzen isoliert werden. Isolate aus

Zusammenfassung

83

Mikrohabitaten an der Pflanze eignen sich besonders gut für den Einsatz im biologischen

Pflanzenschutz, da diese eine optimale Voraussetzung für die Kolonisation der Wirtspflanze

des Pathogens mitbringen.

Zusätzlich wurde die bakterielle und pilzliche Biodiversität in der Rhizo- und


Methoden untersucht. Mittels Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)-Analyse

von PCR-amplifizierten 16S rDNA- bzw. ITS-Fragmenten konnte eine Pflanzenspezifität der

mikrobiellen Communities sowohl in der Rhizosphäre als auch in der Endorhizosphäre

festgestellt werden. Durch identische Banden in Bodenproben und Proben der

Endorhizosphäre kann angenommen werden, dass Bakterien von den Pflanzen aus dem Boden

aufgenommen werden, was eine optimale Voraussetzung für den biologischen Pflanzenschutz

durch den Einsatz von BCAs ist. Diese Beobachtung wurde auch durch die BOX-PCR der

stärksten Antagonisten bestätigt, wo identische Isolate sowohl in Boden- als auch in

Pflanzenproben nachgewiesen wurden.

Literaturverzeichnis

84

6. Literaturverzeichnis

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Danksagung

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7. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Masterarbeit

beigetragen haben.

Mein spezieller Dank gilt meiner Betreuerin Frau Univ.-Prof. Dr. Gabriele Berg. Ihr danke

ich für die Möglichkeit, diese Masterarbeit in ihrer Arbeitsgruppe anzufertigen und für die

wissenschaftliche Betreuung. Ein besonderes Erlebnis für mich war die Probennahme in

SEKEM, für diese Ermöglichung ich mich ebenfalls ganz herzlich bedanken möchte.

Weiters möchte ich mich bei Dr. Henry Müller und Dr. Christin Zachow für die tatkräftige

wissenschaftliche Unterstützung im Laufe meiner praktischen Arbeit bedanken. Ein großes

Dankeschön gilt auch Mag. Michael Fürnkranz für die gute Einarbeitung am Institut.

Außerdem bedanke ich mich bei der gesamten Arbeitsgruppe für die angenehme

Zusammenarbeit, wobei ich speziell die optimale Vorbereitung und die Hilfe bei meiner

Probenaufarbeitung hervorheben möchte.

Bei meinem Freund Michael möchte ich mich für seine liebevolle Unterstützung und

Motivation bedanken.

Zu guter Letzt bedanke ich mich ganz herzlich bei meinen Eltern, dass sie mir das Studium

der Molekularbiologie und der Molekularen Mikrobiologie ermöglicht haben und mich dabei

in jeglicher Hinsicht unterstützt haben.

EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG

Ich erkläre an Eides statt, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst, andere als die

angegebenen Quellen/Hilfsmittel nicht benutzt und die den benutzten Quellen wörtlich und

inhaltlich entnommene Stellen als solche kenntlich gemacht habe.

Graz, März 2010 ___________________________

Martina Köberl

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Analyse von Arzneipflanzen-assoziierten Mikroorganismen