ANALYTICKÁ CHEMIE VE FORENZNÍ ANALÝZE A …

ANALYTICKÁ CHEMIE VE FORENZNÍ ANALÝZE A KRIMINALISTICE

Ing. Veronika Škeříková, Ph.D.

Ing. Oldřich Vyhnálek, Ph.D.

DRUHY ZKOUMÁNÍ dle 100. závazného pokynu policejného prezidenta ke kriminalistickotechnické činnosti Policie České

republiky, Hlava XII, čl. 183

• Omamné a psychotropní látky, jejich prekurzory, léčiva a výrobky farmaceutického průmyslu

• Nátěrové hmoty, ředidla, ostatní výrobky průmyslu nátěrových hmot

• Pohonné hmoty a maziva

• Výrobky chemického průmyslu a drogistické zboží

• Cizorodé toxické látky v potravinách a nápojích a ve vodě v souvislosti s objasňováním trestné činnosti (Státní zemědělská a potravinářská inspekce)

• Alkohol v krvi a moči (výjimečné případy, jinak Soudní lékařství, toxikologická pracoviště, revizní posudky)

• Druhy a kvalita lihovin s omezením na trestné činy nedovolené výroby lihu (Celní technické laboratoře, Státní zemědělská a potravinářská inspekce),

• Toxické látky používané v zemědělství a průmyslu (Státní rostlino-lékařská zpráva)

• Slzotvorné a dráždivé látky

• Organické hořlaviny, včetně zjištění těkavých látek

• Neznámé a málo běžné látky organického původu včetně stopových množství

• Organické složky povýbuchových zplodina výbušnin, střelivo, výbušniny, nástražné výbušné systémy (Pyrotechnický odbor policejního prezidia + Krajské expozitury)

NAKLÁDÁNÍ SE VZORKEM

• Nejproblematičtější je odběr vzorku

• Vyšetřovatel si může na místo činu vzít experta a ten přejímá odpovědnost za odběr vzorku

ale „Expert má zkoumat vzorek bez ohledu na místo činu“

• Od příjmu vzorku na expertízní pracoviště – ČSN ISO 17025, bez dalších omezení

„Co se zanedbá na místě činu se nedá už nikdy napravit“

MIKROSKOPIE

OPTICKÁ MIKROSKOPIE

Konidiofory Aspergillus clavatus, 200x zvětšeno


• optická mikroskopie umožňuje pozorovat vzorky v přirozeném stavu včetně vlhkosti a s malými úpravami též při nižších nebo vyšších teplotách

• umožňuje pozorovat mikroskopické objekty a struktury do 1000-i násobného zvětšení bez speciálních úprav mikroskopu a při běžné přípravě vzorků broušením a leštěním nebo rozložených na skleněné podložce

• pozorování neleštěných povrchů v odraženém světle je u běžných mikroskopů možné jen u malých zvětšení pokud je nerovnost povrchu menší než hloubka ostrosti použitého objektivu

• pozorování neleštěných povrchů při větším zvětšení umožňuje konfokální mikroskop, dosahující zvýšenou hloubku ostrosti speciální konstrukcí optické soustavy nebo speciální software, který dosahuje zaostření snímku objektu digitální rekonstrukcí série snímků pořízených při rozdílném zaostření


Obrazová analýza 1. Optický mikroskop s mikrofotografickým zařízením • umožňuje pozorování mikroskopických preparátů v procházejícím i v

odraženém světle při zvětšení 1000x a při použití zoomu pak ještě větším • k dalšímu příslušenství patří vybavení pro epifluorescenci, temné pole,

polarizované světlo a Nomarského DIC v odraženém i procházejícím světle 2. Makro soustava • je tvořena repro stativem s osvětlovací soustavou • na stativ je možno připevnit barevnou CCD video kameru s makro video

zoom objektivy, které umožňují vytváření dokumentačních snímků nebo obrazů s různým zvětšením a nahrazují tak částečně stereomikroskop

3. PC s obrazovou analýzou • obrazy z mikroskopu nebo z makrooptiky snímané barevnou TV 3 CCD

kamerou nebo černobílou CCD kamerou mohou být archivovány, softwarově upravovány, proměřovány a dále matematicky zpracovávány.


Využití v celních laboratořích • Optický mikroskop ve spojení s obrazovou analýzou • analýza papíru pro zjištění přítomnosti anorganického nátěru a

stanovení vlákninového složení • Posouzení glazování keramických dlaždic • Rozlišení dřevin podle jejich buněčné stavby • rozlišování druhů vláken, škrobů, měří se tloušťka tenkých vrstev

apod. • Makro soustava se používá k dokumentaci vzorků, při posuzování

heterogenních směsí, měření velikosti částic u sypkých materiálů, při rozlišení dřevovláknitých desek apod.

• Rozsah aplikací celého systému je velký a dále se rozšiřuje podle problémů, které vyvstávají u nově analyzovaných vzorků


Mechanoskopie

- komparační mikroskop

ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP

• jedná o optický přístroj, ve kterém jsou fotony nahrazeny elektrony a skleněné čočky elektromagnetickými čočkami

• Elektromagnetická čočka je cívka, která vytváří vhodně tvarované magnetické pole

• jedním ze základních parametrů je jejich mezní rozlišovací schopnost

• mezní rozlišovací schopnost je úměrná vlnové délce použitého záření a elektrony mají podstatně kratší vlnovou délku než má viditelné světlo → elektronový mikroskop má mnohem vyšší rozlišovací schopnost a může tak dosáhnout mnohem vyššího efektivního zvětšení (až 1 000 000×) než světelný mikroskop

ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE • Umožňující studium mikrostruktury zkoumaných objektů ve vakuu pomocí

elektronového svazku

• Svazek vzniká emisí elektronů z katody jež jsou dále urychlovány k anodě

• Svazek je fokusován vhodně upraveným elektrickým, magnetickým nebo elektromagnetickým polem, aby bylo dosaženo požadovaného zvětšení

• Elektronový svazek vytváří obraz interakcemi s pozorovaným preparátem

• Elektrony pronikají pozorovaným preparátem a interakcemi s ním jsou odchylovány od původního směru, jímž se pohyboval hlavní svazek

• Obraz je tvořen dopadem převážně neodchýlených elektronů na zobrazovací systém (např. stínítko z luminiscenčního materiálu) na kterém se vytvoří kruhový obraz

Diamantová zrna, cca 1 µm Povrch syntetizovaného diamantu Tkanina

ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE

• TEM transmisní elektronový mikroskop – nepohyblivý svazek elektronů, detekce elektronů prošlých vzorkem (TE) na fluorescenčním stínítku nebo detektorem (spíše pro molekulární biologii)

• SEM rastrovací elektronový mikroskop – pohyblivý svazek, zobrazení povrchu vzorku pomocí odražených sekundárních elektronů

ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE SPM mikroskopie skenující (rastrující) sondou (Scanning Probe Microscopy) - ke zjišťování struktury povrchu s rozlišením na úrovni velikosti atomu

AFM mikroskopie atomárních sil

- mapování rozložení atomárních sil na povrchu vzorku, síly mapovány přiblížením hrotu k povrchu → vzniká přitažlivá nebo odpudivá síla → způsobí ohnutí nosníku, na němž je upevněn hrot → ohnutí je snímáno laserovým snímačem

- výhodou metody AFM je možnost studovat jak nevodivé, tak i vodivé vzorky

STM skenující tunelovací mikroskopie

- princip je založen na kvantové fyzice

- mezi hrotem elektrody a zkoumaným vzorkem teče proud díky tunelovém jevu i když se hrot vzorku přímo nedotýká → při pohybu nad vzorkem se mění vzdálenost hrotu tak, aby tunelový proud zůstával stejný

- je schopna poskytnout až atomární rozlišení, nevyžaduje náročnou přípravu vzorku, poskytuje informace jen o povrchu

SNOM rastrovací optický mikroskop blízkého pole (scanning near-field optical microscope)

- detektor velmi blízko k povrchu vzorku (méně než je vlnová délka světla)

ELEKTRONOVÁ MIKROSONDA

• Spojení elektronového mikroskopu a lokální elektronové analýzy

• Elektrony jsou v mikroskopu urychleny a fokusovány na vzorek

Děje při interakci elektronů se vzorkem:

- Vznik charakteristického RTG záření

- Pružné elektronové srážky

- Vznik sekundárních elektronů při nepružných srážkách

- Absorpce elektronů

- Vznik viditelného záření (katodoluminiscence)

- Difrakce RTG záření

• Prostor vzorku je evakuován

• Lze připojit různé typy XRF spektrometrů

Využití:

- Kvalitativní a kvantitativní informace o povrchu

MIKROSPEKTROFOTOMETRIE (MSF) • srovnávací mikroskopy nedokáží rozlišit složení dvou červených barev,

které vypadají stejně, ale ve skutečnosti se mohou lišit ve složení, a naopak spektrální metody mají tu vadu, že se jimi změří spektrum, ale jen celého vzorku

• spojuje mikroskopické i spektroskopické metody

• čočky - elektromagnetické cívky, naleštěná ocelová zrcadla

• zdroje záření - lasery

• hlavní výhodou je možnost zkoumat vzorky do většího detailu

• lze pozorovat jen jedno vlákno a současně ho prověřit i spektrálně

• kombinace mikroskopu a jedno-paprskového absorpčního spektrofotometru

• proměřuje se kvantitativně absorpce světla o různých λ (vymezena optickými filtry nebo monochromátorem) v různých místech preparátu

MIKROSPEKTROFOTOMETRIE (MSF)

Software na základě spektra přesně určí barvu vzorku a její odstín → porovnání s databází barev a laků.

RENTGENOVÁ FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIE (XRF)

• Využití rentgenové fluorescenční spektrometrie je velmi široké

• PRO PRVKOVOU ANALÝZU !

• Tato metoda je schopna identifikovat prvky v rozsahu Al - U na vzduchu a při použití vakua je možno identifikovat až Be.


• počátky sahají až do prvních let 20. století, první komerční prototyp vyroben v 50. letech 20. století

Princip

- interakce rentgenového záření, emitovaného rentgenkou, se vzorkem → dochází k vyražení elektronu z vnitřních slupek → dojde k přesunu elektronu do vyšších energetických hladin → vyzáření sekundárního rentgenového záření, které je charakteristické pro všechny prvky → detekováno na detektoru

Typy přístrojů

- vlnově dispersní - dochází k separaci rtg. záření na krystalu na základě různých vlnových délek

- energiově disperzní - dochází k detekci na základě různých energií fotonů sekundárního rtg. záření


Energy dispersive x-ray fluorescence spectra from fossil penguin bones

Tučňák brýlový

INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE (IR)

• analytická technika určená především pro identifikaci a strukturní charakterizaci organických sloučenin a pro stanovení anorganických látek

• infračerveným zářením je elektromagnetické záření v rozsahu vlnových délek 0.78 – 1000 µm, což odpovídá rozsahu vlnočtů 12800 – 10 cm-1

• oblast rozdělena na blízkou (13000 - 4000 cm-1), střední (4000 - 200 cm-1) a vzdálenou infračervenou oblast (200 - 10 cm-1)

INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE (IR)

• průchod infračerveného záření vzorkem → absorpce záření → změny rotačně vibračních energetických stavů molekuly v závislosti na změnách dipólového momentu molekuly

• analytickým výstupem je infračervené spektrum - grafické zobrazení funkční závislosti energie, vyjádřené v procentech transmitance (T) nebo jednotkách absorbance (A), na vlnové délce dopadajícího záření

• absorpční pásy mající vrcholy v intervalu 4000 – 1500 cm-1 jsou vhodné pro identifikaci funkčních skupin (např. –OH, C=O, N-H, CH3 aj.)

• pásy v oblasti 1500 – 900 cm-1 jsou nazývané oblastí „otisku prstu“ (fingerprint region)

Oblast otisku prstu

INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE (IR) MĚŘENÍ SPEKTER (transmisní techniky)

Plynné vzorky:

- skleněná kyveta s délkou nejméně 10 cm a okénky z alkalického halogenidu

Kapalné vzorky:

- kyvety s tloušťkou asi 0,1 mm z NaCl

- rozpouštědla: CS2, CCl4, CHCl3

- voda nevhodná (absorbuje IR záření, vyžaduje kyvety z nerozpustného směsného jodidu a bromidu thalného)

Pevné vzorky:

- NUJOLová technika (vzorek se rozetře s parafinovým olejem v achátové misce na hustou suspenzi a měří se v tenké vrstvě)

- KBr tablety (vzorek ve směsi s KBr (asi 1:50-100) se pod vysokým tlakem lisuje do tablet)

INFRAČERVENÁ MIKROSKOPIE

• Pracuje v oblasti λ ≈ 750 – 1100 nm (blízká IR)

• Požadavky na infračervenou mikroskopii:

• Zdroj: běžné žárovky, halogenové žárovky

• Optika: běžná skleněná nebo zrcadla

• Detekce: fotografický materiál (fotomateriál senzibilovaný pro IR – např. kryptocyanin)

• Preparáty: může být i silnější (IR penetruje snadněji než viditelné světlo), lze ho kontrastně barvit (kryptocyanin)

FT-IR mikroskop IR mikroskop

INFRAČERVENÁ MIKROSKOPIE

Pozměněné texty, padělky

- rozlišení psacích pomůcek, resp. inkoustů, ochranné prvky

INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE S FURIEROVOU TRANSFORMACÍ (FT-IR)

• v místě polopropustného zrcadla se setkávají odražené paprsky a interferencí se zesilují ty, které jsou ve fázi (pohyb zrcadla 0,1 – 50 cm/s, mění λ zesíleného záření)

• vzdálenost mezi děličem paprsků a

nepohyblivým zrcadlem JE stejná jako

vzdálenost mezi děličem a pohyblivým zrcadlem

→ dochází mezi paprsky ke konstruktivní

interferenci → svazek paprsků dopadající na

detektor má maximální intenzitu

• vzdálenost mezi děličem paprsků a

nepohyblivým zrcadlem NENÍ stejná jako

vzdálenost mezi děličem a pohyblivým zrcadlem

→ svazky paprsků od obou zrcadel nejsou ve fázi

a interferují destruktivně → redukce intenzity

INFRAČERVENÁ SPEKTROSKOPIE S FURIEROVOU TRANSFORMACÍ (FT-IR)

ATR (Attenuated Total Reflection)

• Založeno na principu úplného odrazu záření na fázovém rozhraní měřeného vzorku a měřícího krystalu z materiálu o vysokém indexu lomu

• Měřený vzorek je v dokonalém kontaktu s ATR krystalem a záření proniká částečně do analyzovaného materiálu

• Pokud měřený vzorek absorbuje záření o určité frekvenci, pak tato složka bude v totálně odraženém světle zeslabena

• Výhody: minimální příprava vzorků, snadné čištění, pevné i kapalné vzorky

ATR (Attenuated Total Reflection)

• Interakce IR záření se vzorkem sériemi tzv. evanescentních vln

• Evanescentní vlna: záření vstupuje do vzorku (do hloubky 1-4 μm) a změněné pak vystupuje zpět do IR paprsku → je vedeno do interferometru ke zpracování

• Evanescentní vlna obsahuje informace o absorbovaném záření

ODRAZNÉ TECHNIKY

• pro rutinní analýzy práškových vzorků vyvinuta difúzní reflektace

• při této technice se infračervené záření přivádí na práškový vzorek, část je absorbována, část je odražena ve formě spekulární složky a část je rozptýlena

DRIFT

• Difúzní reflektance: spočívá ve fokusaci infračerveného paprsku na pevný vzorek → difúzně rozptýlené záření je převedeno vhodným optickým zařízením na detektor spektroskopu

• Difúzně reflektanční spektra jsou vyjádřena v lineárních jednotkách Kubelka - Munk (odpovídají jednotkám absorbance ve spektru měřeného KBr technikou)

• Spekulární a reflektanční složka záření je závislá na velikosti částic a distribuci velikosti částic (pro reprodukovatelnost měření je důležité mlít vzorek na velikost částic mezi 10 a 20 µm a reprodukovatelně plnit vzorkovací kelímek

DRIFT

• vzorky měřeny v práškovém stavu ve směsi se substráty (stejné pro IR -KBr, KCl apod.) nebo jsou měřeny v čisté formě

• Vzhled spekter bez přítomnosti substrátu není ovlivněn přítomností vody v substrátu a nedochází k reakcím mezi substrátem a vzorkem (např. iontová výměna)

• spektrum má velmi intenzivní pásy, relativní rozdíly v jejich intenzitách jsou poměrně malé při dodržení konstantní velikosti částic (rozdíl ve vzhledu DRIFT spektra může být odstraněn ředěním vzorku ve vhodné matrici např. KBr, KCl, CsI)

• pro analýzu se uplatňují dotykové sondy, které jsou propojeny s FTIR spektrometrem optickými vlákny

• měření probíhají převážně v blízké infračervené oblasti

RAMANOVA SPEKTROSKOPIE

• perspektivní, nedestruktivní metodou umožňující analýzu in-situ • využívána pro identifikaci zakázaných drog, analýzu vláken,

inkoustů, výbušnin, padělaných výrobků a peněz • Ramanova spektroskopie sleduje vibrační pohyby molekuly • Měří se rozptyl světla • Ramanovo spektrum je závislostí intenzity rozptýleného záření na

Ramanově posunu Δν (cm-1), což je rozdíl energie mezi laserovým paprskem a rozptyleným zářením

• intenzita Ramanovych čar je dána změnami polarizovatelnosti molekuly během vibračního pohybu

• absorpční pásy mající vrcholy v intervalu 4000–1500 cm-1, jsou vhodné pro identifikaci funkčních skupin (např. –OH, C=O, N–H, CH3 aj.)

• pásy v oblasti 1500–400 cm-1 se nazývají oblastmi „otisku palce“

IR x RAMAN

ODOROLOGIE

• kriminalistický obor, který se zabývá identifikací osob nebo věcí na základě jejich pachu

Hlavní cíl: zjištění původce určitého pachu a jeho detailní identifikace

- tělesný pach člověka - zdrojem je např. dech, pot či jiné výměšky

- látky, které jsou součástí tělesného pachu, jsou vylučovány nepřetržitě a jejich složení je individuální

- na konkrétní charakteristiku tělesného pachu mají vliv nemoci a léky, užívání alkoholu, kouření, jídlo, používání kosmetiky apod.

ODOROLOGIE

Subjektivní, tzv. olfaktorika:

- Provádí se biologickými prostředky (speciálně vycvičení služební psi)

- V pachové konzervě je umístěna tkanina s určitým pachem → srovnání s konkrétním vzorkem určité osoby

- Pachová identifikace se provádí až po 24 hodinách od uložení tkaniny nebo předmětu do konzervy (aby pach měl čas uzrát)

- Trvanlivost konzervy je minimálně 1 rok

- Africké šelmy mají čich lepší než psi → např. pokusy se lvy

Objektivní, tzv. olfaktronika:

- Provádí se technickými prostředky (nejčastěji GC)

Ze soudního hlediska je důkaz pachovou zkouškou pouze důkazem nepřímým, resp. výsledky nemají povahu trestně-procesního důkazu.

ANALÝZA PACHU

Odběr pachu na skleněné kuličky

HS-GC/TQ-MS

Tepelná desorpce těkavých látek z nosiče → zachycení látek na chlazenou trapovací patronu (Tenax) → zakoncentrování látek → nástřik na kolonu → separace látek → hmotnostní detekce (trojitý kvadrupol)

ANALÝZA PACHU

13/4/15

17/7/15

4/6/15

tR (min)

Inte

nzi

ta

ANALÝZA DNA

• lze provést prakticky z každého typu lidské tkáně, i ze zdrojů, které jsou na DNA poměrně chudé - z kostí, nehtů, vlasů, šupinek kůže atd.

• z čerstvých tkání i ze zaschlých tělních tkání (krev, jiné tělní tekutiny, …)

Mitochondriální DNA - vlasy

Jaderná DNA - mumifikované ostatky

Postup analýzy:

Vzorek → izolace DNA → sekvenace DNA → PCR → elektroforéza → vyhodnocení elektroforegramů

IZOLACE DNA

• Nutnost uvolnit DNA z buněk a oddělit ji z nadmolekulárních struktur

Lyze buněk – rozpuštěni biomembrán a denaturace proteinů

- detergenty (rozrušení membrán)

- Lysozomy (buněčné stěny)

- Mechanická degradace

• Přečištění extraktů DNA

- nutné se zbavit bílkovin

- proteázy

- fenol a chloroform (vysrážení proteinů)

- ethanol (vysrážení nukleových kyselin)

SEKVENOVÁNÍ DNA

• souhrnný termín pro biochemické metody, jimiž se zjišťuje pořadí nukleových bází v sekvencích DNA

• přibližně 1500 restrikčních endonukleáz, které dokáží rozeznat krátké sekvence nukleotidů (4, 6, 8) → podle rozeznané sekvence dokáží DNA v konkrétním místě rozštěpit

• použití endonukleáz vede k fragmentaci DNA na díly, které jsou specifické pro každého člověka

• výsledkem štěpení je směs různě velikých úseků DNA

PCR

• Polymerase Chain Reaction - Polymerázová řetězová reakce

• Zacyklované tři teplotní kroky v programovatelném termostatu – termocykléru

• Replikace (amplifikace) chtěného DNA fragmentu

ELEKTROFORÉZA FRAGMENTŮ DNA

• elektroforéza založena na rozdílné pohyblivosti částic látky v elektrickém poli, která závisí na velikosti náboje, velikosti molekul, jakož i na vlastnostech prostředí

• sacharidofosfátová „páteř“ nukleových kyselin je příčinou rovnoměrného rozloženi negativních nábojů v molekulách DNA a RNA

• fragmenty DNA se děli podle své relativní molekulové hmotnosti a velikosti náboje


PAGE (polyakrylamidová gelová elektroforéza)

• vertikální elektroforéza

• elektroforetické médium - poly-akrylamidový gel

- denaturačni - s ureou

- nedenaturační

Barviva

- Ethidium Bromid

- fluorescenční barva (interkalační činidlo)

Barvení

- do gelu

- do pufru

- barvení po elfu


• Sekvenátor DNA – kapilární elektroforéza s fluorescenční detekcí

• V reálném čase probíhá najednou elektroforéza v 96-ti kapilárách

• Dávkování z mikrodestiček

Kapilára • délka 25 – 100 cm • vnitřní průměr 25 – 100 mm • vnitřní povrch lze modifikovat

SPOJENÍ MS A SEPARČNÍCH TECHNIK

On-line

• umožňuje v jedné analýze zároveň separovat i identifikovat složitou směs látek

Off-line

• izolace látek po jejich chromatografické separaci a následné změření hmotnostních spekter pro jednotlivé látky

• pracné, časově náročné, pro složité směsi látek nebo látky ve stopové koncentraci ve směsi nemusí být vůbec proveditelný

SPOJENÍ MS A SEPARČNÍCH TECHNIK

Problémy spojení

• rozdíl tlaků mezi hmotnostním analyzátorem (např. kvadrupól či iontová past 10-3 Pa) a analyzovanými látkami vstupujícími do iontového zdroje z kolony

- atmosférický tlak 105 Pa

- rozdíl tlaků nejméně 8 řádů

• průtok mobilní fáze

- Kapilární GC – průtok plynu cca 1ml/min

- Mikrokolonová HPLC – průtok kapaliny v µl/min

- HPLC na povrchově porézních částicích – průtok v ml/min

Mobilní fáze v obrovském nadbytku → musí být odstraněn před vstupem do vakuové části přístroje!

SPOJENÍ GC/MS

• rutinní metoda, téměř výhradně ve spojení s kapilárními kolonami (průtok ca. 1 ml/min)

• nosný plyn s analytem se zavádí přímo do iontového zdroje ve vakuu, kde vakuový systém odstraní přebytečný nosný plyn

• kapilára je před vstupem do iontového zdroje vyhřívána, aby nedocházelo ke kondenzaci analytů při přechodu do vakua

• iontové zdroje: EI nebo CI

• použití EI umožňuje přímé softwarové porovnání naměřených spekter s knihovnami spekter v počítači (stovky tisíc spekter)

• hmotnostní analyzátory: Q, IT, TOF, QqQ

SPOJENÍ LC/MS • technicky mnohem náročnější ve srovnání s GC/MS (18 ml vody (1 mol) = 22.4 l

plynu, tzn. 1 ml vody je po odpaření 1.2 l plynu

• u ionizačních technik pracujících za atmosférického tlaku (ESI, APCI, APPI) se

mobilní fáze přímo účastní ionizačního procesu

• spektra není možné porovnávat s knihovnou, protože knihovny pro HPLC/MS

spektra většinou neexistují

• spektra se výrazně liší podle použité ionizační techniky, pracovních podmínek i

typu přístroje (platí kromě EI) - spektra je nutné interpretovat manuálně

(zkušenosti operátora, porovnání s analogickými typy látek či literaturou)

• proteomické knihovny - laboratorní knihovny pro omezený rozsah látek (např.

skupiny zakázaných drog, pesticidů či podobně definovaná skupina známých

cílových analytů), většinou se jedná o knihovny MS/MS spekter (na rozdíl od MS

spekter u GC/EI-MS), převoditelnost knihoven mezi různými typy hmotnostních

analyzátorů může přinést problémy kvůli významným rozdílům

DERIVATIZACE

Cíl

• Zlepšení separačních vlastností (GC – zvýšení těkavosti, LC – změna retence)

• Zvýšení hmotnost (MS)

• Detekovatelnost

• Změna sloučeniny vhodnou reakcí (např. označením nebo změnou funkční skupiny)

• Pre-/post-kolonová derivatizace

GC

- esterifikace, acetylace, methylace, silylace

- karboxylové kyseliny, alkoholy, aminokyseliny, aminy

LC, CE

- adice chromoforu nebo fluoroforu)

ANALÝZA PSACÍCH PROSTŘEDKŮ

• inkoust je směs látek (filmotvorné látky, aditiva, rozpouštědla, konzervační prostředky, barviva)

• hlavními složkami jsou pojivo, konzervační a barvonosné látky

• typické složení inkoustu v kuličkovém peru je: 50 % rozpouštědla, 25 % barviva, 25 % jiné látky

• ale konkrétní chemické a množstevní složení inkoustů je výrobním tajemstvím

OMAMNÉ A PSYCHOTROPNÍ LÁTKY

Ředidla:

- glukosa

- mannitol

- Kofein

- škrob

- MgSO4.7H2O

Různé otázky:

• přítomna ano/ne

• obsah drogy

• vzájemné porovnání vzorků

• profilování


Identifikace

- GC/MS

- FT-IR spektroskopie

- Ramanova spektroskopie

Screening drog

- TLC

- GC-NPD

- HPLC

DUSÍKOVÝ-FOSFOROVÝ DETEKTOR (NPD)

• kroužek z alkalických chloridů rubidia nebo cesia vyhřívaný cívkou

• přes kroužek prochází nosný plyn smíchaný s vodíkem

• horký kroužek emituje elektrony termionickou emisí

• elektrony sbírány na anodě a představují proud pozadí

• V přítomnosti dusíku nebo fosforu jsou částečně spálené dusíkové a fosforové materiály adsorbovány na povrchu kroužku → zvýšení emise elektronů a proudu, který se měří


• v UK 80% bankovek v oběhu (ale 99% v Londýně) je kontaminováno drogami

(zvláště kokainem), nové bankovky jsou kontaminovány během týdnů

• v UK vzrostl počet smrtelných dopravních nehod pod vlivem drog mezi lety

1985-2000 ze 3% na 18% → součást silniční kontroly immunoassy (1 ml slin)

• v USA kontaminováno 75-92% bankovek, až 2,86 μg kokainu/bankovku

• v Japonsku nebo Číně se kokain vyskytuje "pouze" na 12 až 20 % bankovek

• množství kokainu se většinou pohybuje mezi 0,006 a 1,240 µg/bankovku

Jourdan T. H., Veitenheimer A. M., Murray C. K., Wagner J. R., Forensic Sci. 58 (2013) No. 3, 616.

OMAMNÉ A PSYCHOTROPNÍ LÁTKY Rapid comparison of diacetylmorphine on banknotes by tandem mass spectrometry Karl A. Ebejer, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19: 2137–2143

Banknote thermal desorption unit coupled to an atmospheric pressure chemical ionisation source

KANABINOIDY Tělní tekutiny

- 2D-GC/MS s kryofokusací

- SPE-LC/MS/MS

- PMME-GC/MS (polymer monolith microextraction GC/MS)

- MEKC

Vlasy

- LC/MS/MS

- HF-LPME-GC/MS/MS (hollow fiber-liquid phase microextraction GC/MS/MS)

Nové kanabionidy

- po derivatizaci (N-methyl-N-terc-butyldimethylsilyl-

trifluoroacetamid, pentafluoropropionyl anhydrid)

- GC/NCI/MS/MS

Rostlinný materiál

- HPLC/DAD, GC/MS

Kanabinové indoly

- LC/MS/MS, GC/MS, NMR

MORFINOVÉ ALKALOIDY Heroin

- CE-MS (ESI), UHPLC-MS/MS (profilování)

Morfin, Thebain (v makovicích)

- FT-IR-ATR

Opiové alkaloidy

- Cyclodextrin modified CE po extrakci v ultrazvuku

- LC/ESI-MS/MS, SPE-LC/2D-IT-MS, SPE-UPLC/MS/MS

- (l)-(l) extrakce - GC/MS, CE/FluD, SPE-HILIC/MS/MS

- (l)-(l) extrakce - CSEI-sweep-MEKC (cation-selektive exhaustive injection and sweeping micellar electrokinetic chromatography)

- LC/MS/MS (také v mozku post-mortem)

- ve vlasech - mikrovlnná extrakce - HPLC/DAD

Morfin a jeho metabolity ve vlasech

- SPE-GC/MS, SPME-GC/MS

KOKAIN

Analýza metabolitů kokainu

- potvrzení užívání orální, intravenozní, intranasální nebo inhalační cestou

Na oblečení

- Ramanova spektroskopie, rentgenová krystalografie

- IMIS (ion mobility increment spectrometry)

- API-MS

V biologických vzorcích

- LC/Fluorimetric Det. (zaschlé krevní stopy)

- MEPS/DART/TOF-MS (microextraction oby packed sorbent/direct analysis in real-time/TOF-MS)

- SPE-IMS, CE/ESI-MS, SPE-LC/MS/MS

- GC/MS (V krvi a novorozeneckém mekonimu)

- MALDI, LC/MS/MS, ELISA, LC/MS/MS (ve vlasech)

AMFETAMIN A JEHO METABOLITY Tělní tekutiny

- GC/IR, GC/MS, GC/SAL-DI-MS, GC/IT-MS, chirální GC/MS, SPE-GC/MS

- SPE-LC/MS/MS, LC/MS/MS

- SPME/IMS, 1H NMR, microELISA (na čipu)

- Mikrovlná derivatizace + GC/MS, LC/MS/MS

Lak na nehty

- GC/MS

BENZODIAZEPINY Diazepam

- SPE v kombinaci s GC/MS, LC/MS/MS, LC/APPI-MS, HPLC/DAD

- (l)-(l) extrakce/UPLC/MS/MS, Imunoassay/LC/MS/MS

Lorazepam

- LC/MS/MS

Ketamin v nápojích

- kapilární GC/MS

γ-HYDROXYMÁSELNÁ KYSELINA • Lék na narkolepsii

Tělní tekutiny

- DART/TOF-MS

- GC/MS (s/bez derivatizace), GC/PCI-MS

- LC/APCI-MS/MS

Butyrolacton

- GC/C/IR-MS (GC/combustion/isotope ratio mass spectrometry)

ALKOHOL Krev

• Plynová chromatografie

• Widmarkova metoda

Moč, sliny

• Reagenční proužky

Dech

• Detekční trubičky

• Analyzátory s polovodičovými, infračervenými, elektrochemickými senzory

Widmarkova metoda

- oddestilování etanolu obsaženého v krvi → oxidaci známým nadbytkem dichromanu draselného v kyselině sírové → jodometrická titrace nadbytku dichromanu

- Nevýhodou její nespecifičnost (stejně se chová např. aceton, acetaldehyd, éter, benzin, …)

ETHYLEN GLUKURONID (EtG)

• Metabolit ethanolu

• přetrvává v moči po stavu opilosti až po dobu pěti dnů

• Testování moči na alkohol je vlastně velmi jednoduché

• Výsledky se těžko falšují (nadměrné množství vody vede k podezření z falšování)

• Pozitivní výsledek znamená to, že osoba požila alkohol v posledních 4 až 5 dnech

• Koncentrace EtG v moči neodpovídá přímo koncentraci alkoholu v krvi

Metody analýzy

• Tělní tekutiny – LC/MS, LC/MS/MS, UHPLC/MS

• Vlasy – GC/MS, HS-SPME/GC/MS/MS, GC/NCI-MS/MS, HILIC/MS/MS

TĚKAVÉ LÁTKY

„Čichači“

• Toluen v krvi – SPME-GC/MS, GC/FID

• Acetylen v krvi a moči – HS-GC/MS

• Azidy v krvi a plazmě – GC/NPD

HOŘLAVINY A VÝBUŠNINY Předvýbuchová analýza

• detekci a identifikaci explozivních látek a jejich složek

Povýbuchová analýzá

• detekci a identifikaci povýbuchového odpadu nebo zbytků samotných výbušnin po detonaci

Pyrotechnická slož (druh výbušniny)

- Základní složky - hořlaviny (cukr, plast, pryskyřice,…), oxidovadla (chlorečnany, chloristany,…) , pojidla

- při explozi dochází k rychlému hoření doprovázeného různými světelnými a zvukovými efekty.

Metody stanovení

- IMS

- SPME – GC - na akcelerátory hoření

- kapilární elektroforéza

HOŘLAVINY A VÝBUŠNINY

Akceleranty hoření

- Extrakce z popela

- Plynová chromatografie

SPE

SPME

IONTOVÁ MOBILNÍ SPEKTROMETRIE (IMS)

Princip

- rozdílná mobilita jednotlivých molekulových fragmentů vzniklých ionizací

- základní konstrukční schéma: ionizátor, analyzátor a detektor

- vzorky analyzovány v plynném stadiu

IONTOVÁ MOBILNÍ SPEKTROMETRIE (IMS)

Ionizátor:

- Ionizace nasávaného vzduchu radioaktivním β-zářičem (63Ni)

Analyzátor:

- separaci iontů podle jejich pohyblivosti při průletu analyzátorem

- ionty ovlivňovány elektrickým polem (gradientové, konstantní) a proudem inertního plynu (proti směru letu iontů)

- letící nabité částice o menší hmotnosti a zakřivenější dráhou letu dopadají na detektor dříve než těžší částice, zpomalené především odporem inertního plynu

Detektor:

- při dopadu iontů dochází k jejich neutralizaci → vznik elektrického impulzu → zobrazí se jako pík ve specifickém průletovém čase → celkové spektrum látky

Nevýhodou IMS je, že lze detekovat pouze jeden typ iontů (+/-).

ANALÝZA AUTOMOBILOVÝCH LAKŮ

• trestný čin typu „hit and run“

Automobilové laky

- syntetické akrylátové barvy (makromolekulární látky), jejichž stavební jednotkou je ester kyseliny akrylové

- součástí laku je barva (barevný pigment), ředidlo, tužidlo

Metody stanovení

- identifikaci chemického složení - pyrolytická GC-MS (pyrolytické rozložení vzorku, 750 °C, 10 min → GC/MS)

- určení odstínu a identifikace barvy z databáze (mikrospektrofotometrie)

KONTAKTY

Ing. Veronika Škeříková, Ph.D.

č. d. 223, budova A

e-mail: [email protected]

Ing. Oldřich Vyhnálek, Ph.D.

č. d. 146, budova A

e-mail: [email protected]

Documents

ANALYTICKÁ CHEMIE VE FORENZNÍ ANALÝZE A …