14.11.2007 AC – BPBS HS07 1

Analytische Chemiefür Biologie Pharmazie Bewegungs-

wissenschaften und Sport

Teil Chromatographische undElektrophoretische Trennverfahren

LC / HPLC

14.11.2007 AC – BPBS HS07 2

LC / HPLCHigh-Pressure-Liquid-Chromatography

High-Performance-Liquid-Chromatography

High-Price-Liquid-Chromatography

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie

Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie

HPLC vs GC

Apparatur

Theorie

Mobile Phase

Säule und Stationäre Phase

Unterarten HPLC

Detektoren

Dünnschichtchromatographie

Walh einer Methode

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Warum HPLC ?• GC: nur Trennung von Substanzen, die sich bis ca. 300°C

unzersetzt verdampfen lassen

• Sehr polare und thermisch labile Substanzen

• Ionische Verbindungen, Biopolymere und Polymere

• Selektivität hängt ...... ab

! von der stationären Phase

! von der mobilen Phase (Polarität, Gradientselution)

• Stofftransport in flüssiger Phase ist deutlich langsamer

(kleinere Diffusionskoeffizienten), Hochdruck ist nötig

• Analytische, Präparative und Produktive

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Scheme HPLC

300 – 400 bar

LM 10 ml/min

Trennsäule

LM Aufteilungsvalve

He/Ar

LM Behälter

Detektor

Injektorvalve

Vorsäule

Pumpe

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Apparatur

6-port-Valve Injektor

Eluentvorrat (Entgaser, Aufteilungsvalve)

Pumpe (reproduzierbar und konstant Druck)

Injektor (bestimmte Menge zur Säule)

Filter/Vorsäule (fein Partikel in LM und Probe)

Säule

Detektor

Vor- und Nach-derivatisierungsteile

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Klassische Theorie

!

K =A[ ]

S

A[ ]M

!

v =L

tR

!

u =L

tM

!

k = KVs

VM

!

k =tR" t

M

tM

=tR

'

tM

!

" =K

B

KA

!

" =kB

kA

!

" =(tR

')B

(tR

')A

!

N = Neff "k +1

k

#

$ %

&

' (

2

=tR'

)

#

$ %

&

' (

2

"k +1

k

#

$ %

&

' (

2!

N =L

H=tR

2

" 2=16

tR

w

#

$ %

&

' (

2

!

tR

'= t

R" t

M

Trennfaktor / Selektivätsfaktor

Retentionsfaktor / Kapazitätsfaktor

Retentionszeit / Geschwindigkeit

Verteilungskoeffizient

Auflösung!

H =L

16

w

tR

"

# $

%

& '

2

Bodenzahl und Bodenhöhe

!

R =tB" t

A

wB

+ wA

2

=2(t

B" t

A)

wB

+ wA

!

R =" #1

"

$

% &

'

( ) *

kB

1+ kB

*N

4

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Van Deemter Gleichung

Minimaler H-Wert

Theore

tische B

odenhöhe H

!

H = 2" # dp +2kD #DM

u+ u #

f (dp2,dc

2)

DM

+q # k # d f

2

(1+ k)2DS

oder2td # k

(1+ k)2

$

% &

'

( )

optimale u

Minimum H

A B C

14.11.2007 AC – BPBS HS07 8

Mobile PhaseReinheit, Siedepunkt, Preis

Inert, Korrosionsbeständigkeit, Toxizität

UV–Durchlässigkeit, Brechungsindex

Mischbarkeit

Puffer

Haltbarkeit

! Viskosität

! Elutionsstärke

! Selektivität

Isokratische Trennung: Eluent bleibt

während des Laufs unverändert.

Gradiententrennung: Eluent wird

während des Laufs verändert.

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Stationäre Phasen

Unpolare Analyten erst eluiert Polare Analyten erst eluiert

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Stationäre Phase

Si

O

OH

O Si

Si

O

OH

O Si

O

OH

OH

SiSi O OO Si

OH

OH

OH

single silanol group

two silanol group

three silanol group

SiO2: ideale SP, aber ...

Polymere: Copolymer von Styrene

und Divinylbenzene

! Partikelgrösse, Form und Grössenverteilung

! Porosität, Porengrösse, Oberfläche und Volumen

! Poröse und Nichtporöse

! Stärke (mechanische) gegen Druck und LM (Bruch und Deformation))

Physikalische Eigenschaften:

14.11.2007 AC – BPBS HS07 11

Modifikation der SP

Si

OH

Si

R2

ClR

R1Modifikation:

Si

R1

R2

R

Si

O

SiOH HN[Si(CH3)3]2

Entcapping:

Si(CH3)3SiO

14.11.2007 AC – BPBS HS07 12

Normale (Polare) Phase

Original SiO2, Al2O3: Polare OH-Gruppe

Modifizierte polare NP:

O Si

R1

R2

CN O Si

R1

R2

NH2

O Si

R1

R2

O OH

OH

Cyano (C3–CN)

Amino (C3–NH2)

Diol (C3–OCH2CH(OH)CH2(OH)

14.11.2007 AC – BPBS HS07 13

Modifizierte NP-Säule

Nonpolare Mobile Phase

z.B., Kohlenwasserstoff

Hydrophile Eigenschaft

14.11.2007 AC – BPBS HS07 14

Umkehrphase (RP)

O Si

R1

R2

R

R = C1 – C18

Straight-chain hydrocarbons (C18, C12, C8 C6, C4, C3, C2, C1))

Cyclohexyl, phenyl, alkylphenyl

O Si

R1

R2

O Si

R1

R2

O Si

R1

R2

Unpolare Modifikation durch Kohlenwasserstoffketten

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Umkehrphase (Reversed Phase, RP)

Si

CH3

CH3

(CH2)17R = CH3

Hydrophobe Eigenschaft

14.11.2007 AC – BPBS HS07 16

Unterarten der HPLC

" Adsorptions-Chromatographie

" Verteilungs-Chromatographie

" Umkehrphasen-Chromatographie (RP)

! Ionenaustausch-Chromatographie (IEC)

! Ionenpaaren-Chromatographie

! Grössenausschluss-Chromatographie (GPC)

# Affinitäts-Chromatographie

# Komplexierungschromatographie

# Chirale Chromatographie

14.11.2007 AC – BPBS HS07 17

Adsorptionschromatographie

Elutrope Reihe:

Hexan < Cyclohexan < Toluol <Dichlormethan< Tetrahydrofuran < Acetonitril < Ethanol <Methanol < Wasser

Probenmoleküle Reihenfolge:

Fluorierte, gesättigte Kohlenwasserstoffe

< gesättigte Kohlenwasserstoffe

< Aromaten < halogenierte Verbindungen

< Äther < Nitrile < Nitroverbindung < Ester

< Ketone < Aldehyde < primäre Amine

< Amide < Phenole < Carbonsäuren

Präparative Trennung im Labor

Feste stationäre Phase

14.11.2007 AC – BPBS HS07 18

Verteilungschromatographie

Flüssige

stationäre

Phase

Nur chemisch-verbundene flüssige Filme

14.11.2007 AC – BPBS HS07 19

Wechselwirkungsmechanismus

schwach

stark

schwach

stark

Hydrophob

Hydrophil

Dipol-Dipol

14.11.2007 AC – BPBS HS07 20

Ionenchromatographie (IC)

$ Ionenaustauschchromatographie (Ion Exchange Chromatography)

$ Ionenpaarchromatographie (Ion Pair Chromatography)

$ Ionenausschlusschromatographie (Ion Exclusion Chromatography)

Schnelligkeit, Empfindigkeit, Selektiivität, und Simultanität

Organische Polymere als Trägermaterial, hohen pH-Stabilität; frei vom

ionische Verunreinigungen aus Edelstahl und korrosive Elutionsmittel

zu vermeiden

Detektor – Leitfähigkeitsdetektor häufig, aber alle andere Detektoren

auch einsetzen können

Suppressor: Reduktion der Grundleitfähigkeit auf minimalen Wert und

Erhöhung des Signal/Untergrund Verhältnisse

Mobile Phase: Wasser oder Puffer (mit pH)

14.11.2007 AC – BPBS HS07 21

Ionenaustauschchromatographie (IC)

Stationäre Phase mit funktionellen Gruppen

• SO3–H+ (Sulfonsäure): stark saurer Kationenaustauscher, pH 2 – 14

• COO–H+ (Carbonsäure): schwach saurer Kationenaustauscher, pH 8 – 14

• NR3+OH– (quaternäres Amin): stark basischer Anionenaustauscher, pH 0 – 10

• NR2 (tertiäres Amin): schwach basischer Anionenaustauscher, nur bei

niedrigem, pH 0 – 6.

14.11.2007 AC – BPBS HS07 22

Ionenaustauschschromatographie

Beispiel stark saurer Kation-

enaustauscher:

Harz-SO3H + M+(aq) ! Harz-

SO3M + H+(aq)

Der Selektivitätskoeffizient S

für den Austausch zweier

verschiedener Metallionen ist

gegeben durch den

Quotienten der entsprechend-

en Gleichgewichtskonstanten

K:

S(M1/M2) = K(M1)/K(M2)

More highly charged

molecules are more

tightly bound to the

resin, and so travel

slowly and are eluted

later.

Moderately charged

molecules equilibrating

between the resin and

the moving buffer more

readily.

Less charged molecules

bind less strongly to the

resin, equilibrate with

the moving buffer more

readily, and so travel

rapidly and are eluted

faster.

14.11.2007 AC – BPBS HS07 23

Elutionsreihenfolge

Elutionsreihenfolge für Kationen:

Ba2+ < Ca2+ < Zn2+ < Mg2+ < Cs+ < Rb+ < K+ < NH4+ < Na+ < H+ < Li+

Elutionsreihenfolge für Anionen:

Citrat (COO–)3 < Sulfat < Oxalat (COO–)2 < Iodid < Nitrat (NO3–) <

Phosphat < Bromid < Nitrit (NO2–) < Chlorid <Acetat < Hydroxid

MP: Wasser, Puffer (gewisser pH-Werte einstellen)

Leitfähigkeitsdetektor mit Supressionsäulen

14.11.2007 AC – BPBS HS07 24

Ionenpaar-Chromatographie

Um die organische grösse Ionen zu Trennen:

ein Ionenpaarbildner (sogenanntes Gegenion) als Hilfskomponente

wird der mobilen Phase zugesetzt, um neutral Ionenpaar zu bilden,

dann kann man die Umkehrphasen-Säule benutzen.

$ das Anion der Heptansulfonsäure für kationische Proben

$ das Tetrabutylammoniumion (Phosphat) für anionische Proben

14.11.2007 AC – BPBS HS07 25

Trennung – Nucleotidegemisch

Mixture of nucleotides

resolved by IPC

Mixture of biogenic amines:

1. Adrenaline

2. Dopamine

3. Tyramine

4. Tryptamine

Buffer: 0.005 M heptanesulfonic acid

sodium/0.01 M phosphoric acid pH 2.4

Weigh-in: ~ 2 mg in 10 ml

acetonitrile/phosphoric acid (0.01 M) 1:9;

Injection volume: 20 µl

Detection: 220 nm; Temperature: ambient

DiscoveryTM C18 (RP): 250/4.0 mm, ID 5 µm

Eluent: acetonitrile, Flow: 1.5 ml/min, gradient:

t=0 min : 6%, t=5 min : 6%, t=18 min : 25%

Heptanesulfonic acid

14.11.2007 AC – BPBS HS07 26

Ionenausschluss

14.11.2007 AC – BPBS HS07 27

Vorteile der Ionenchromatographie$ Schnelligkeit

für Analyse der wichtigsten 7 anorganischen Anionen benötigt man heute nur noch

3 Minuten – Bruchteil der Zeit, die für traditionelle nasschemische Methoden

aufgewendet werden muss

$ EmpfindlichkeitNachweis von Konzentrationen im mittleren und unteren ppb-Bereich ohne

Voranreicherung routinemäßig (Absolutmengen im untersten ng-Bereich), bei

Aufkonzentrierung können NWG bis auf 10 ppt gesenkt werden

$ Selektivitäterreichbar durch Auswahl geeigneter Trenn-und Detektionssysteme.

Probenvorbereitung besteht oft nur aus Verdünnung und Membranfiltration der

Proben

$ Simultane Bestimmungenwerden durch Vorliegen extremer Konzentrationsverhältnisse begrenzt

$ Stabilität der Trennsäulenhohe pH-Stabilität der verwendeten Polymere, vertragen auch verdünnte Säuren

und Basen, sind aber gegenüber organischen Lösungsmitteln empfindlich; hohe

Unempfindlichkeit gegenüber komplexen Matrices

14.11.2007 AC – BPBS HS07 28

GelpermeationschromatographieGrössenausschluss-Chromatographie/Size Exclusion Chromatography

Mechanismus: Grösse / Molekularer Radius

SP:

5 – 100,000 nm

Ausschluss-Limit

Eindringen-Limit

Geeignet für

10% Unterschied in MW

Kein Wechselwirkung

Biopolymer, Polymer

Organische Moleküle

14.11.2007 AC – BPBS HS07 29

14.11.2007 AC – BPBS HS07 30

Größenausschlusschromatographie

!

tR"

1

log10 MW

CH3(CH2)nCOOH

14.11.2007 AC – BPBS HS07 31

Dünnschichtchromatographie (HPTLC)

DC-laufmitteltest

Wahl der DC Platte

Probeauftragen

Laufmitteltest

Entwicklung

Detektion

Normal Silica / Alumina TLC, HPTLC plates C 18-50 (50% silanization)

and C 18-100 (100% silanization) with fluorescent indicator

14.11.2007 AC – BPBS HS07 32

Entwicklung der DC

Laufmittel

Wahl des Laufmittels

(Rein oder Gemisch)

Entwicklung

14.11.2007 AC – BPBS HS07 33

Selektivität und Trennleistung

!

Rf =Sx

S f

Auswertung

14.11.2007 AC – BPBS HS07 34

Detektoren für HPLC

• Brechungsindex-Detektor (RID)

• UV/Vis-Absorption-Detektor (UVD)

• Lichtstreudetektor (ELSD)

• Fluoreszenzdetektor

• Elektrische Leitfähigkeitsdetektor (für Ionen)

• Massenspektrometrie (MS): molekulare Information

• IR, NMR

$ Nachweisgrenze

$ Linearer Messbereich

$ Kompatibilität mit der mobilen Phase

$ Selektivität

$ Flexibilität, Robustheit, Preis

14.11.2007 AC – BPBS HS07 35

Brechungsindex-Detektorrefractive index detectors, RID

Universell, aber geringe Empfindlichkeit

wegen kleiner RID-Unterschied von LM

und Analytenmolekülen

14.11.2007 AC – BPBS HS07 36

Verdampfungs-Lichtstreudetektor ELSD

EBULIZE ELUENT AND

SELECT SMALL

DROPLETS TO MINIMIZE

BACKGROUND NOISE

EVAPORATE AT LOW

TEMPERATURE

DETECT LIGHT

SCATTERING

Universell einsetzbarer Detektor, wenn

• Analytmolekül keine UV-Absorbtion

• Mit einem Brechungsindex-Detektor

nicht detektierbar

• Eine Gradientenelution anstatt

isokratischen Laufmittel Partikelgrösse

und -anzahl

Partikelgrösse und -anzahl

14.11.2007 AC – BPBS HS07 37

Beispiel mit ELSD als Detektor

RP–Säule:a hydrophobic chain andan acidic functional groupas a cation exchanger

14.11.2007 AC – BPBS HS07 38

UV/vis-Detektor

Variiert ! oder PDA

(Photodiodenarray)

um ein ganzes UV-

Spektrum aufzu-

nehmen

Br, I, S

Carbonyl

Konjugierte

Aromatische

14.11.2007 AC – BPBS HS07 39

Fluoreszenzdetekor

Nachweisgrenze +++

Linearbereich +++

Nur einsetzbar für:

• Nativ

fluoreszierenden

Substanzen

• Nach derivati-

sierung nicht-

fluoreszierender

Analyten mit einem

Fluoreszenz-

marker

14.11.2007 AC – BPBS HS07 40

Massenspektrometrische Detektor

Interface – LC und MS

Senkrecht

Off-linearräumlich

zeitlich

14.11.2007 AC – BPBS HS07 41

Leitfähigkeitsdetektor

• Universell für Ionenchromatographie

• Grundleitfähigkeit des Eluenten wird durch Suppressortechnik

erniederigt, um die Nachweisgrenzen zu senken.!

" = "0# $ % C

Harz-NR3OH + H+ + Cl– ––> Harz-Cl + H2O

Harz-SO3H + Na+ + HCO3

– ––> Harz-Na + H2CO3

Für Kationenanalytik, Suppressorsäule mit OH– beladen :

Für Aionenanalytik, Suppressorsäule mit Protonen beladen:

Harz-SO3H + Na+ + Cl– ––> Harz-Na + H+

+ Cl–

Harz-SO3H + Na+ + Br– ––> Harz-Na + H+

+ Br–

14.11.2007 AC – BPBS HS07 42

Suppressor

Suppressor

Harz-SO3H + Na+ + HCO3

– ––> Harz-Na + H2CO3

Harz-SO3H + Na+ + Cl– ––> Harz-Na + H+ + Cl

–

Harz-SO3H + Na+ + Br– ––> Harz-Na + H+ + Br

–

Grundleitigkeit zu erniedrigen

Analyt-signal zu verstärken

" (H+) = 350

" (Na+) = 50

Beispiel von Cl– and Br

–

14.11.2007 AC – BPBS HS07 43

Charakteristika der Detektoren

Detektor Nachweisgrenze Linearer Bereich

Spezielle Eigenschaften des Analytmoleküls oder Bulk-Eigenschaften

von Analytmolekül und Lösungsmittel: Nachweisgrenze, Linearer

Messbereich, Kompatibität mit MP, Selektivität, Flexibilität und

Robustheit, Preis.

10510–12 – 10–15 gICP-MS

10310–9 – 10–12 gAAS

10510–7 – 10–9 gMS

10510–8 g.mL–1Leitfähigkeit

10510–14 gFluoreszenz

10410–11 gUV/Vis

14.11.2007 AC – BPBS HS07 44

Trennstrategie (1)

$ Polarität

$ Löslichkeit

$ Ionenisch

$ Molekulare Masse

Auswahl: Flüssig-chromatographie

NP RP

Ausschluss

14.11.2007 AC – BPBS HS07 45

Trennstrategie (2)• Auswahl: Gradient-Elution

• Derivatisierung:

Online: Vor- (für höhe Trennleistung) und Nach- (mit UV/Fl Marker fürselektive und empfindliche Detektion )

Offline: bei der GC für flüchtig und zu schwer

• Schnell, sauber, Reagenzien mischbar mit MP, Produkte löslich in MP

14.11.2007 AC – BPBS HS07 46

Derivatisierungsreagenzien

Häufig verwendete Derivatisierungsreagenzien in der HPLC:

Funktionelle Gruppe Derivatisierungsreagenz

-NH2 (Amine, Aminosäuren) 5-(N,N-Dimethylamino)-

naphthalin-1-sulphonylchlorid

2,4-dinitrofluorbenzol

-OH (Alkohole) 3,5-Dinitrobenzochlorid

Silylierungsreagenzien

-CHO (Aldehyde) 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH)

-C(O)R (Ketone) 4-Hydroazino-7-nitrobenzofurazan

-COOH (Säuren) 4-Brommethyl-7-methoxycoumarin

-SH (Thiole) Dansylaziridin

14.11.2007 AC – BPBS HS07 47

Einfluss der Eluentenpolarität

14.11.2007 AC – BPBS HS07 48

Complex Mixture of Acids, Bases,

Amino Acids, and Neutral Compounds

RP/IC Säule