Analytische Chemie fأ¼r Biologie, Pharmazie und ... Analytische Chemie fأ¼r Biologie, Pharmazie, Teil

  • View
    2

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Analytische Chemie fأ¼r Biologie, Pharmazie und ... Analytische Chemie fأ¼r Biologie, Pharmazie,...

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie und Bewegungswissenschaften und Sport Teil Chromatographische und Elektrophoretische Trennverfahren Markus Kalberer HCI, E330 Tel. 632 29 29 kalberer@org.chem.ethz.ch

  • Inhalt

    Kapitel 1: Theoretische Grundlagen Effizienz einer Trennmethode

    Selektivität einer Trennmethode Quantitative Methoden

    Kapitel 2: Gas-Chromatographie (GC) Trennung von eher flüchtigen Substanzen Überblick über die für GC üblichen Trennsysteme Aufbau und Funktion eines Gaschromatographen und der

    gebräuchlichsten Detektoren Kapitel 3: Flüssig-Chromatographie (LC) Trennung von eher polaren, weniger flüchtigen Substanzen Aufbau und Funktion einer Flüssigchromatographie-Apparatur und

    der gebräuchlichen Detektoren Überblick über verschiedene Varianten der LC Kapitel 4: Elektrophoretische Trennverfahren Kurzer theoretischer Überblick – Unterschiede zur Chromatographie Aufbau und Funktion einer Messapparatur Kapitel 5: Probenaufarbeitung Extraktions-, Aufkonzentrations-, Reinigungsmethoden

    Bücher

    D.A. Skoog, J.J. Leary, Instrumentelle Analytik, Grundlagen, Geräte, Anwendungen, Springer, Berlin, 1996 K. Cammann, Instrumentelle Analytische Chemie, Verfahren, Anwendungen, Qualitätssicherung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 2001 R. Kellner, J.-M. Mermet, M. Otto, H.M. Widmer, Analytical Chemistry, Wiley-VCH Verlag, Weinheim, 1998 K. Robards, P.R.Haddad, P.E. Jackson, Principles and practice of modern chromatographic methods, Academic Press, London, 1994 ... und viele mehr, siehe u.a. Chemie Bibliothek !

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

    1

    1. Theoretische Grundlagen 1.1 Typen von Trennmethoden Trennung verschiedener Komponenten in der chemischen Analytik beruht im allgemeinen auf Unterschieden in der Verteilung zwischen zwei Phasen und/oder in der Beweglichkeit innerhalb einer Phase der zu trennenden Substanzen. Es werden bevorzugt eindimensionale Trennverfahren eingesetzt, bei denen eine Bewegung aller Komponenten in der gleichen Richtung erfolgt. Die folgenden Bewegungstypen sind relevant: Typ 1 Typ 2 Typ 3

    1 2

    1

    2 1

    2

    Elektrophorese (Kap. 4) Gas Chromatographie Membrantrenn- Isoelektrische Fokussierung GC (Kap. 2) verfahren Isotachophorese Flüssig Chromatographie Dialyse Kapillarzonenelektrophorese HPLC (Kap. 3) Elektrodialyse (CZE)

    Mischformen: Gelpermeationschromatographie Elektrokinetische Micellarchromatographie SDS-PAGE (Trägerelektrophorese) Zweidimensionale Trennmethoden sind meist zwei zeitlich hintereinander geschaltete eindimensionale Trennungen. In der Polypeptidanalytik kommen z.B. häufig 2D- Elektrophoresemethoden zur Anwendung (Trennung nach Molmasse und isoelektrischem Punkt).

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

    2

    Trennkriterien: a) Kinetische Eigenschaften b) Gleichgewichtseigenschaften (Phasengleichgewichte, Verteilungsgleichgewichte) Oft liegt eine Kombination von a) und b) vor. a) Trennmethoden unter Ausnutzung von kinetischen Eigenschaften: Massenspektrometrie Elektrophorese Ultrazentrifuge Enzymatischer Abbau Trennverfahren mit porösen Membranen (Dialyse, Elektrodialyse, Gasdiffusion) b) Trennmethoden unter Ausnutzung von Gleichgewichtseigenschaften

    - Phasengleichgewichte: Phasen gebildet durch zu trennende Komponenten (z.B. Destillation)

    - Verteilungsgleichgewichte: Phasen enthalten zum grossen Teil Spezies, die nicht zum zu trennenden Gemisch gehören (z.B. GC, HPLC)

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

    3

    Übersicht über verschiedene Trennmethoden

    zweite Phase

    gasförmig

    fluid

    flüssig

    fest

    gasförmig

    thermische Diffusion

    Gas-Flüssigkeits- Chromatographie

    Gas-Adsorptions- Chromatographie

    fluid

    Fluid-Flüssigkeits- Chromatographie

    Fluid-Adsorptions- Chromatographie

    flüssig

    Destillation Flotation

    Flüssigkeits- Flüssigkeits- Chromatographie Dialyse Flüssig-Flüssig- Extraktion Ultrafiltration

    Flüssigkeits- Adsorptions- Chromatographie Ionenaustausch Ausfällen Kristallisieren Abscheiden (Zonenelektrophorese)

    Erste Phase

    fest

    Sublimation

    Fluid- Fest- Extraktion

    Flüssig-Fest- Extraktion

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

    4

    Übersicht über Chromatographische Methoden

    mobile Phase

    flüssig

    fluid

    gasförmig

    fest

    Flüssigkeits-Adsorptions- Chromatographie Tswett, 1906 Kuhn, Winterstein, Lederer, 1931

    Superkritische Fluid- Adsorptions- Chromatographie Klesper, 1962 Rijnders, 1966 Novotny, 1981

    Gas- Adsorptions- Chromatographie Ramsay, 1905 Cremer, 1951 Janak, 1953

    stationäre Phase

    flüssig

    Flüssigkeits-Flüssigkeits- Chromatographie Martin, Synge, 1941

    Superkritische Fluid- Flüssigkeits - Chromatographie Klesper, 1962

    Gas- Flüssigkeits - Chromatographie James, Martin, 1952

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

    5

    1.2 Anschauliches Konzept für das Funktionsprinzips der Chromatographie: Gedanklich kann man sich eine chromatographische Trennung als eine Reihe von diskreten Extraktionen vorstellen, bei denen sich die Analyten entsprechend ihrem Verteilungsgleichgewicht (Stoffkonstante) zwischen zwei Phasen verteilen. Vorraussetzung ist, dass sich die zwei Phasen nicht ineinander mischen. Phase 1 (z.B. Wasser) Phase 2 (z.B. organisches Lösungsmittel)

    Analyt zuerst 100% in dieser Phase

    weniger Analyt

    mehr Analyt

    Zeit

    Sind zwei Analyten A und B (mit unterschiedlichem Verteilungsgleichgewicht) in unserem System, haben wir eine Trennung der beiden Analyten erreicht. Phase 1 Phase 2

    A nd B zuerst 100% in dieser Phase

    weniger A,

    mehr B

    mehr A, weniger B

    Zeit

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

    6

    Eine vollständige Trennung von A und B kann mit einer einmaligen Extraktion nicht erreicht werden. Um eine bessere Trennung zu erreichen, können mehrere Extraktionen hintereinander durchgeführt werden.

    beliebige Wiederholungen

    neue Phase 2

    neue Phase 1

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

    7

    Dieses Konzept kann man sich nun kontinuierlich vorstellen: Phase 1 Phase 2

    Die Phasen müssen gegen einander fliessen, sonst wird das System zu einer einzigen grossen Extraktionsstufestufe. Sie dürfen aber nicht zu schnell fliessen, sodass lokal jeweils Gleichgewichte etabliert werden können. Diese Methode heisst Gegenfluss-Extraktion (Countercurrent Extraction). Da experimentell sehr aufwändig, wird die Gegenfluss-Extraktion jedoch nur selten angewendet. Viel praktikabler ist es, wenn Phase 2 fest statt flüssig ist. In einer solchen Anordnung fliesst eine Flüssigkeit (Phase 1) über die feste Phase 2, was technisch sehr leicht zu machen ist. Definition der Chromatographie:

    • Physikalische Trennmethode, bei der die zu trennenden Komponenten zwischen einer feststehenden (stationären) und einer beweglichen (mobilen) Phase verteilt werden.

    • Im Idealfall verteilen sich alle zu trennenden Substanzen unterschiedlich zwischen den zwei Phasen.

    Hauptanwendungen für chromatographische Methoden:

    • Analytische Anwendungen • Präparative Anwendungen

    Grundarten der Chromatographie:

    • Säulenchromatographie • Planare Chromatographie

    Fluss- richtung

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

    8

    Trennung eines Gemisches von A und B in einer Säulenchromatographie und das zeitabhängige Detektorsignal.

    mobile Phase

    A+B

    A

    B

    A

    B

    Zeit

    Zeit tA tB

  • Analytische Chemie für Biologie, Pharmazie, Teil Chromatographische und Bewegungswissenschaften und Sport Elektrophoretische Trennverfahren

    9

    1.3 Einflussfaktoren der Wandergesc