SIR MYCOPLASMA 62781 10 TESTŮ ANTIBIOGRAM PRO UROGENITÁLNÍ MYKOPLAZMU

1- KLINICKÉ POUŽITÍ SIR MYCOPLASMA je reagencie pro analýzu antibiogramu urogenitální mykoplazmy: Ureaplasma spp (Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum) a Mycoplasma hominis (Mh). V současnosti je obtížné získat diferenční identifikaci Ureaplasma urealyticum a U. parvum. SIR MYCOPLASMA se skládá z mikrotitrační destičky obsahující 8 antibiotik účinných proti těmto mikroorganismům a běžně používaných k léčbě genitálních infekcí. Vzhledem k výskytu rezistentních kmenů, zejména vůči cyklinům a makrolidům (antibiotika první linie) (10, 11, 18), je analýza antibiogramu absolutně nezbytná pro zamezení terapeutických selhání. Použitím standardizovaného inokula se z této techniky stává metoda vysoce shodná s referenční metodou (9).

2- PRINCIP SIR MYCOPLASMA je antibiogram v kapalném médiu, v němž je každé antibiotikum přítomno buď ve dvou různých koncentracích (doxycyklin, tetracyklin, azitromycin, josamycin, erytromycin, ofloxacin) nebo v jedné koncentraci (klindamycin, pristinamycin). Test je založen na metabolické inhibici. Růst mykoplazmat je objektivně měřen jejich metabolickou aktivitou: hydrolýza urey v bujónu U9 prostřednictvím Ureaplasma spp a hydrolýza argininu v argininovém bujónu prostřednictvím Mh za vzniku amoniaku způsobí, že se médium alkalizuje a pH indikátor fenolové červeně v médiu se změní ze žlutého na červený. Jestliže je mikroorganismus citlivý na testované antibiotikum, jeho metabolismus je inhibován a médium zůstane žluté. Jestliže je mikroorganismus rezistentní, je schopen růstu a médium zčervená.

3- BALENÍ Souprava SIR MYCOPLASMA obsahuje: • 10 mikrotitračních destiček SIR (schéma 16 jamek je znázorněno na štítku a umožňuje tak identifikaci vzorku). • 10 adhezívních krycích fólií. • 1 příbalový leták. Každá destička je samostatně zabalena v hliníkovém obalu s krycí fólií a sáčkem s desikantem.

4- UCHOVÁVÁNÍ Médium SIR MYCOPLASMA uchovávané při +2-8 °C je možné použít až do data exspirace uvedeného na obalu.

5- POTŘEBNÉ VYBAVENÍ (NENÍ SOUČÁST DODÁVKY) • Bujón U9: kód 62762 (balení 10 ampulí s lyofilizovaným bujónem U9 Q.S.P. 2 ml) • Argininový bujón: kód 62763 (balení 10 ampulí s lyofilizovaným argininovým bujónem Q.S.P. 2 ml) • MYCOPLASMA DUO (20 testů – kód 62740) • Sterilní destilovaná voda • Pipety 2–ml, 200–µl, 100–µl, 20–µl • Inkubátor pro inkubaci při 37 °C • Nádoba na likvidaci kontaminovaného odpadu

6- POSTUP A) MIKROTITRAČNÍ DESTIČKA SIR Mikrotitrační destička SIR je mikrostrip obsahující dvě řady po 8 jamkách, ve kterých jsou navázána různá antibiotika. Po přidání inokula do jamek jsou antibiotika rehydratována tak, aby bylo dosaženo koncentrací blížících se kritickým koncentracím, čímž se umožní analýza profilu citlivosti testovaných kmenů a jejich klasifikace na senzitivní, intermediální nebo rezistentní vůči každému antibiotiku.

Růstová kontrola bez antibiotik Doxycyklin (4 mg/l a 8 mg/l)

Tetracyklin (4 mg/l a 8 mg/l)

Azitromycin (2 mg/l a 4 mg/l)

Josamycin (2 mg/l a 8 mg/l)

Erytromycin (1 mg/l a 4 mg/l)

Klindamycin (2 mg/l)

Pristinamycin (2 mg/l)

Ofloxacin (1 mg/l a 4 mg/l)

B) VOLBA ANTIBIOTIK Volba antibiotik pro testování byla provedena na základě terapeutických presckripcí doporučených pro novorozenecké a genitální mykoplazmatické infekce (17). K dnešnímu datu neexistuje žádná kritická koncentrace specifická pro mykoplazmata. V důsledku toho zvolené kritické koncentrace v mikrotitrační destičce SIR MYCOPLASMA vycházejí z koncentrací publikovaných v řadě vědeckých časopisů a/nebo doporučených lékařskými společnostmi, např. CA–SFM (Antibiogram Committee – French Microbiological Society). Volba koncentrací azitromycinu vychází z hodnocení provedeného za použití klinických kmenů (19). Testované cykliny: tetracyklin a doxycyklin (v koncentracích 4 a 8 mg/l). Kmeny Mh a Ureaplasma spp. popsané jako rezistentní vůči tetracyklinům jsou detekovány jednoznačně, protože bylo, publikováno, že jejich minimální inhibiční koncentrace (MIC) byly ≥ 8 mg/l oproti ≤ 2 mg/l pro citlivé kmeny (15, 18). Pro tuto třídu antibiotik existují resistence nižší úrovně, které požadují inkubační dobu 48 hodin (19). Četnost resistence vůči cyklinům mezi různými kmeny se liší podle příslušné země a hladiny expozice antibiotikům (18). Testované makrolidy: erytromycin (v koncentracích 1 a 4 mg/l), azitromycin (v koncentracích 2 a 4 mg/l), josamycin (v koncentracích 2 a 8 mg/l). Kmeny Mh jsou přirozeně rezistentní vůči erytromycinu a azitromycinu. Josamycin zůstává aktivní. V důsledku toho výsledky získané s těmito antibiotiky musí potvrdit identifikaci již dříve získaného kmene. Četnost získané rezistence proti makrolidům mezi kmeny Mh a Ureaplasma spp izolovaných na klinice není známá, pravděpodobně je však velmi nízká (18). Testovaný lincosamid: klindamycin (v koncentraci 2 mg/l). Kmeny Ureaplasma spp jsou přirozeně rezistentní vůči tomuto antibiotiku (18). Testovaný streptogramin: pristinamycin (v koncentraci 2 mg/l). Kmeny mykoplazmy jsou vysoce citlivé na toto antibiotikum. Testovaný fluorochinolon: ofloxacin (v koncentracích 1 a 4 mg/l). Tato molekula je aktivní u Mh a Ureaplasma spp. Četnost rezistence není dobře známá, pro Ureaplasma spp byla však odhadnuta na méně než 1 %. (6, 18). C) VYTVOŘENÍ ANTIBIOGRAMU Antibiogram lze začít provádět z obsahu jamky X testu MYCOPLASMA DUO (kód 62740). Přečtěte si příslušná doporučení ohledně doby a teploty uchovávání biologických vzorků (13). 1) Standardizace inokula Pro inokulaci antibiogramu inokulem 103 až 105 CCU/ml (CCU = jednotky změny barev) je nutné připravit primokulturu média inokulovaného vzorku. Primokultura (provedena dodržením protokolů popsaných níže) vede k růstu mykoplazmat až na maximální titr 106 až 107 CCU/ml. Zředění této primokultury v poměru 1/100 v bujónu U9 nebo argininovém bujónu, v závislosti na izolovaných druzích, vytváří standardní inokulum. • Z TESTU MYCOPLASMA DUO Když se antibiogram provádí z testu MYCOPLASMA DUO, obsah jamky X po 24 nebo 48 hodinové inkubaci pro Mh, a 24 hodin pro Ureaplasma spp, odpovídá primokultivaci. Obsah jamky se proto musí zředit v bujónu U9 nebo argininovém bujónu při dodržení protokolu popsaného níže pro získání standardizovaného inokula.

1. Pro Mycoplasma hominis Nařeďte obsah jamky X (po 24 nebo 48 hodinové inkubaci) v poměru 1/100 v argininovém bujónu (20 µl obsahu jamky X ve 2 ml argininového bujónu). 2. Pro Ureaplasma spp • Po 24 hodinové inkubaci: proveďte zředění v poměru 1/100 obsahu jamky X v bujónu U9 (20 µl obsahu jamky X ve 2 ml bujónu U9). • Po 48 hodinové inkubaci: v tomto případě není možné použít obsah z jamky X, neboť existuje riziko, že by u ureaplazmy mohlo dojít k autolýze. Proveďte tedy zředění transportního suspenzního média uchovávaného při teplotě + 4°C v poměru 1/10 (200 µl ve 2 ml bujónu U9). • Z KULTIVAČNÍHO BUJÓNU OBOHACENÉHO O MYKOPLAZMATA Urogenitální vzorek lze vložit do kultivačního média specifického pro mykoplazmata (15). Jestliže se čeká na identifikaci a výpočet výsledků, antibiogram lze provést později a médium uchovávat při teplotě +4 °C (viz příbalový leták použitého kultivačního média). Poté se doporučuje inkubace kultivačního média při teplotě 37 °C po dobu 16 hodin za účelem získání inokula obohaceného o mykoplazmata. Obvyklý získaný titr dosahuje hodnot 106–107 CCU/ml. Podle zveřejněných doporučení (15), realizace antibiogramu předpokládá použití standardizovaného inokula. 20 µl obohaceného kultivačního média se proto zředí se 2 ml bujónu U9 nebo argininového bujónu (zředění v poměru 1/100), v závislosti na identifikaci mykoplazmatického kmene. 2) Pipetování standardizovaného inokula 100 µl standardizovaného inokula (zředění v poměru 1/100 předkultury v U9 nebo argininovém bujónu) je pipetováno do každé jamky mikrotitrační destičky SIR. Mikrotitrační destičku přikryjte adhezívní fólií a inkubujte 48 hodin při 37 °C.

U9 U9 U9

MYCOPLAZMA DUO Jamka Χ

INOKULUM OBOHACENÉ O MYKOPLAZMATA

TRANSPORTNÉ SUSPENZNÉ MÉDIUM

Skladované pri +4°C

Arginin Arginin Arginin

Napipetujte 100 µl do jamky

Antibiogram Antibiogram Antibiogram Antibiogram Antibiogram Antibiogram

Napipetujte 100 µl do jamky

Napipetujte 100 µl do jamky

D) VZORKY OBSAHUJÍCÍ Ureaplasma spp a Mh V tomto případě inokulujte 2 mikrotitrační destičky SIR: jednu standardizovaným inokulem získaným naředěním v bujónu U9 (antibiogram kmene Ureaplasma spp), a druhou použstandardizovaným inokulem získaným naředěním v argininovém bujónu (antibiogram kmene Mh).

7- INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Antibiogram lze číst, jakmile jamky s růstovými kontrolami změní barvu ze žluté na červenou. Odečet se provede po 24 hodinách a další po 48 hodinách. Odečet po 48 hodinách umožní detekci nízké hladiny rezistence k cyklinům (19) a potvrzení výsledků, u nichž bylo počáteční inokulum nízké (10 3 CCU/ml) nebo pokud je změna barvy po 24 hodinách neurčitá.

Pro klindamycin a pristinamycin (jedna koncentrace) jsou možné pouze 2 výsledky: Citlivý nebo rezistentní. Příklad: žlutá / žlutá: S Citlivý kmen

červená / žlutá: I Intermediální kmen

červená / červená: R Rezistentní kmen

Zvláštní případ: jestliže je pozorována oranžová barva. V jamkách s nízkou koncentrací lze pozorovat začátek změny ze žluté na červenou, z toho plynoucí oranžovou barvu. Jamku je třeba interpretovat jako pozitivní a jasnou barevnou změnu lze získat po 48 hodinách.

8- KONTROLA KVALITY PROVÁDĚNÁ VÝROBCEM Všechny vyráběné a komercionalizované reagencie jsou kontrolovány kompletním systémem kontroly kvality začínajícím od přijetí surovin až po komercionalizaci produktu. Každá šarže je podrobena kontrole kvality a je uvolněna na trh pouze tehdy, jestliže odpovídá stanoveným akceptačním kriteriím. Dokumentace týkající se výroby a kontroly každé jednotlivé šarže je uchovávána u výrobce. 9– INTERNÍ KONTROLA KVALITY Kontrolu kvality lze provést použitím kmene z lyofylizované kolekce (Ureaplasma parvum ATCC 700970). Lyofylizovaný kmen resuspendujte v 1 ml čerstvě rekonstituovaného média U9 (kód. číslo 62762). Proveďte zředění v poměru 1/10 v čerstvě rekonstituovaném médiu U9. V aerobní atmosféře inkubujte naočkované médium U9 při 37 °C po dobu 18 hodin. Proveďte zředění U9 média obohaceného o Ureoplasmata v poměru 1/100 (20 µl média napipetujte ke 2 ml rekonstituovaného bujónu U9). Test SIR MYCOPLASMA se provede dodržením běžného protokolu, to jest napipetováním 100 µl do každé jamky. Mikrotitrační destičku přikryjte adhezívní fólií a inkubujte po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C. Destičku lze číst, jakmile jamky s růstovými kontrolami změní barvu ze žluté na červenou.

2 žluté jamky: Absence růstu Citlivý kmen

2 červené jamky: Růst za přítomnosti antibiotik Rezistentní kmen

Jamka s nízkou koncentrací antibiotika: červená Jamka s vysokou koncentrací antibiotika: žlutá Intermediální kmen

Očekávaný profil je následující:

Růs

tová

ko

ntro

la

Růs

tová

ko

ntro

la

DO 4– 8 mg/l

TE 4– 8 mg/l

JM 2– 8 mg/l

AZM 2– 4 mg/l

E 1– 4 mg/l

CM 2 mg/l

PT 2 mg/l

OFX 1– 4 mg/l

+ + S S S S S/I R S S/I

10– ÚČINNOST Výběr testovaných antibiotik v testu SIR MYCOPLASMA byl odvozen podle terapeutických postupů, antibiogram SIR MYCOPLASMA byl opětovně přehodnocen z hlediska modifikovaných léčebných postupů. V případě dvou vyhodnocení popsaných níže byla použita referenční metoda minimální inhibiční koncentrace (MIC) v tekutém médiu (6, 15). První vyhodnocení (bez azitromycinových jamek) bylo provedeno na 80 kmenech zahrnujících 60 kmenů Ureaplasma spp a 20 kmenů Mycoplasma hominis (9). U kmenů Ureaplasma spp: Procento shody pro tetracykliny se pohybovalo v rozmezí od 90 % [79,5–96,2 %] a do 95 % [86,1–99 %] a v závislosti na daném antibiotiku. Procento shody pro makrolidy se pohybovalo od 92 % [81,6–97,3 %] a do 100 % [95,1–100 %] a v závislosti na daném antibiotiku. Procento shody pro klindamycin bylo 85 % [73,4–92,9 %] a. Procento shody pro pristinamycin bylo 100 % [95,1–100 %] a. Procento shody pro fluorochinolony bylo 93 % [83,8–98,2 %] a. U kmenů Mycoplasma hominis: Procento shody pro tetracyklin je 85 % [62,1–96,8 %] a a 100 % pro všechny ostatní antibiotika [86,1–100 %] a. Celková shoda všech antibiotik zmiňovaných dříve je 94,6 % [92,4–96,4 %] a s 2,6 % závažnějších neshod. Žádný kmen nebyl shledán citlivým u testu SIR MYCOPLASMA, pokud byl rezistentní u referenční metody (žádná velká neshoda). Druhé vyhodnocení se provedlo po záměně minocyklinu za azitromycin v koncentracích 2 a 4 µg/ml. Byla provedena srovnávací studie mezi metodou na stanovení MIC v tekutém médiu a testem SIR MYCOPLASMA pro jamky s azitromycinem. Testované kmeny jsou referenční kmeny a klinické kmeny běžného typu. Každé inokulum bylo standardizováno a bylo potvrzeno, že se pohybuje v rámci akceptovatelných a doporučených limitů, tj. 104 a 10 5 CCU/ml (15). Výsledky těchto dvou metod byly interpretovány jako citlivý (S), intermediální (I) nebo rezistentní (R) pro různé koncentrace testu. Pro 15 referenčních kmenů mykoplazmat (13 kmenů ATCC Ureaplasma spp a 2 kmeny ATCC Mycoplasma hominis) bylo procento shody pro klinickou klasifikaci S nebo R 100 % [81,9–100 %] a. Všechny kmeny Ureaplasma spp měly citlivý profil a dva kmeny Mycoplasma hominis měly rezistentní profil, což koresponduje s přirozenou rezistencí tohoto druhu. U 15 klinických izolovaných materiálů Ureaplasma spp byla shoda 100 % [81,9–100 %] a mezi klinickou klasifikací získanou pomocí mikrotitrační destičky SIR MYCOPLASMA a získanou pomocí referenční metody MIC. a: [CI 95%] = 95 % interval spolehlivosti.

11– LIMITACE TESTU Jestliže médium zčervená a dojde k zákalu, signalizuje to růst baktérií jiných než jsou mykoplazma (růst později jmenovaných nemění čistotu média). Tento jev lze pozorovat u kultivačních bujónů arginin a U9, jestliže byly inkubovány při teplotě 37 °C. Přítomnost jiných baktérií lze potvrdit na čokoládovém agaru. Finální interpretace výsledků, stejně jako interpretace jakéhokoli jiného biologického výsledku, nemůže být provedena na základě jednoho testu, ale na klinických datech a biologických, cytologických a imunologických výsledcích. Jestliže je inokulum použité pro naočkování mikrotitrační destičky SIR MYCOPLASMA slabé (<10 3 CCU/ml), změna barvy v jamkách může být nespolehlivá. Pokud se výsledek jeví jako nesprávný, doporučujeme opakovat standardizaci inokula a opakovat antibiogram SIR MYCOPLASMA. Jestliže je pro dané antibiotikum jamka s nejvyšší koncentraci červená a s nejnižší koncentraci zůstane žlutá, výsledek nelze použít. Doporučuje se provést další antibiogram, počínaje novým standardizovaným inokulem. Makrolidy, zejména erytromycin, jsou známé jako pH citlivé (14). Ve skutečnosti lze pozorovat změnu barvy v jamce o nízké koncentraci, vedoucí k intermediálnímu výsledku spíše v důsledku pH efektu než antibiotické aktivity. Tento jev změny barvy lze pozorovat rovněž u jamek s azitromycinem.

12- LITERATURA 1. BEBEAR C. Activité comparée de la minocycline et doxycycline sur les mycoplasmes pathogènes pour l'homme.

Pathol. Bio., 1985,33, 577–580. 2. CANTET P et BEBEAR C. Activité comparée in vitro de sept quinolones sur Ureaplasma urealyticum. Pathol. Bio.

1983, 31, 501–503. 3. DAVIS J.W. Antimicrobial Susceptiblity of Ureaplasma urealyticum. J. Clin. Microb., 1981, 13, 320–325. 4. EVANS R.T and TAYLOR ROBINSON D. The Incidence of Tetracycline Resistant Strains of Ureaplasma urealyticum.

J. Antimicrob. Chemother, 1978 , 4, 57–63. 5. ROBERT M.C. Dissemination of the Tet–M Tetracycline Resistance Determinant to Ureaplasma urealyticum.

Antimicrob. Agents Chemother, 1986, 29, 350–352. 6. ROBERTSON J.A. Standardized Method for Determining Antimicrobial Susceptibility of Strains of Ureaplasma

urealyticum and their Response to Tetracycline, Erythromycin and Rosaramincin. Antimicrob. Agents Chemother, 1981, 20, 50–58.

7. TAYLOR–ROBINSON D. Clinical Antibiotic Resistances of Ureaplasma urealyticum. Pediatr. Infec. Dis., 1986, 5, 335–

337. 8. SOBETZKO R., HARTMANN A.A., ELSNER P. Susceptibility of Ureaplasma urealyticum to Ten Chemotherapeutic

Agents. Zbl.Bakt. Hyg. 1988, A269, 245–250. 9. RENAUDIN H., BEBEAR C. Evaluation des systèmes Mycoplasma Plus et SIR Mycoplasma pour la détection

quantitative et l'étude de la sensibilité aux antibiotiques des mycoplasmes génitaux. Path.Biol., 1990, 38, n°5, 431–435.

10. CUMMINGS M.C., Mc CORMACK W.M. Increase in Resistance of Mycoplasma hominis to Tetracyclines. Antimicrob.

Agents Chemother. 1990, 34, 2297–2299. 11. BAURIAUD R., SEROR C.,LARENG M.B., LEFEVRE J.C. Sensibilité in vitro aux antibiotiques des mycoplasmes

génitaux isolés à Toulouse. Etude de nouvelles molécules (macrolides et quinolones).Path. Biol. 1992, 40, n°5, 479–482.

12. WAITES K., DUFFY L., HAMRICK W., CROUSE D., CASSEL G. Microbiologic Efficacy of Intravenous erythromycin

against Ureaplasma urealyticum in the Lower Respiratory Tract of Preterm Neonates. 10th International IOM congress – Bordeaux July 19–26th 1994 – Poster n°163.

13. BEBEAR C.M., RENAUDIN H., CHARRON A., CLERC M., PEREYRE S., BEBEAR C. 2003. DNA Gyrase and

Topoisomerase IV Mutations in Clinical Isolates of Ureaplasma spp. and Mycoplasma hominis Resistant to Fluoroquinolones. Antimicrob. Agents Chemother. 47:3323–3325.

14. KENNY G. E, CARTWRIGHT F.D. 1993. Effect of pH, Inoculum size, and Incubation time on the susceptibility of

Ureaplasma urealyticum to Eryhtromycin in vitro. Clin. Infect. Dis.; 17 (Suppl 1).

15. WAITES K.B., BEBEAR C.M., ROBERTSON J.A., TALKINGTON D. F., KENNY G. E. Laboratory Diagnosis of Mycoplasmal Infections. Cumitech 34.

16. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology. Geneva : World Health Organization (WHO), 1991, 1st edition. 17. Sexually transmitted diseases treatment guidelines. MMWR. 2002. May 10, 2002 / 51 / No–RR6. 18. BEBEAR C.M. 2006. L’antibiogramme. Chap. 43.. Paris : Eska Editor, 1 st edition.

19. BEBEAR C.M., RENAUDIN H. 2007. Evaluation de la galerie SIR Mycoplasma incluant l’azithromycine.

55

Bio-Rad3, boulevard Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette FranceTel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 06/2007Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 880095