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1961 527
Organisch-chemisches Ins~itu~ der Technischen Universit~$ Berlin
Anwendung yon Trifluoressigsiiure bei der Analyse yon Aminos~iuren und Peptiden
Von G. KRESZE und V. SCHMIDT
Mi~ 2 Text~bbildungen
(Eingegangen am 17. November 1960)
Wie W~YG~D u. Mitarb. 7 in einer ganzen Reihe yon Arbeiten gezeigt haben, l~13b sich behn synthetischen Arbei$en in der Peptidchemie die Trifluoressigs~ure (TFA) aus 2 Griinden mit sehr gutem Erfolg einsebzen:
1. Aminos~uren, Peptide und auch Proteine sind in Trittuoressigs~ure im allgemeinen leicht bis sehr leicht 15slich.
2. der CFaCO-Rest ist als Schutz Ftir die Aminogruppen leicht ein- zufiihren und alkalisch wieder leicht abspaltbar.
Es lag daher nahe, die Trifluoressigs~ure und die N-TFA-Aminos~uren auch bei der Analyse in dor Peptidchemie einzusetzen. W~YGA~D 7 zeigte, wie man N-TFA-Derivate bei der Sequenzanalyse einsetzen kann; zu untersuchen blieb, wie welt man mit Hilfe von Trifluoressigs~ure auch speziell Erkennung und - - weaigstens teflweise - - KonstitutionsaufklK- rung von Aminosi~uren und Peptiden durchfiihren kann. Wir haben einige Verfahren hierzu ausprobiert.
Die oben als erster Vorteil herausgestellte leiehte LSsliehkeit der Aminos~uren und Peptide in Trifluoressigs~ure erlaubt dabei eine Be- s t immung des J4"quivalentgewichts der Verbindungen : in dem stark sauren Medium ist die Dissoziation der freien Carboxylgruppen unterbunden, die Aminos~uren verhalten sich basenanalog. Da die LSsungen eine gute, konzentrationsproportionale elektristne Leitf~higkeit zeigen (0,1 molare LSsungen yon Glyein z.B. batten u = 2 ,9 . 10 -4 ~-1 cm-1), ist eine Bestimmung des Animos~uregehalts dureh konduktometrisehe Titration mit Perehlors~ure in CF3COOH m6glich. Wir haben das Verfahren an einer Anzah] yon Aminos~ureJ~ und einigen Peptiden erprob~ ~, allein bei Tyrosin war eine Bestimmung, wahr eheinlieh wegen Oxydation als StSrreaktion, nieht mSglieh. Im allgemeinen konnten 50--200 mg Amino- sgure in 40 ml Trifluoressigsgure mit einem Metrohm-Konduktometer bei einem mittleren Fehler vo " 20/0 bestimmt werden, eine Entwieklung zum MJkroverfahren seheint m*s bei entspreehender Apparatur ohne Sehwierigkei~en m6glieh. Anf dJese Weise kann bequem bei Aminosguren und Peptiden unbekannter Ko ,titntion das Aquivalentgewieht best immt
528 G. K~nsz~ u~d V. SC~D~ Bd. 18t
werden, wir haben dies bei einigen Aminos/~uren angewandt, die sich yon Kohlenhydra~en ab le i t en t - - Zwei~ens haben wir die Gesehwindigkeit der alkalischen Hydrolyse yon Iq-TFA-Aminos/~uren und -peptiden unter- sueht. Dai3 die alkalisehe Hydrolyse rasch erfolg~,ist oben erwghnt worden, zu kl/~ren blieb - - als wichtig z.B. f i i r pr/~paratives Arbe i t en - - , wie die ttydroly.~ngeschwindigkeit yon den Reaktionsbedingungen und yon der Kons~itution abh/~ngt. Wit haben auch diese Reaktion konduktometriseh verfolgt 1 und sie in w/~Briger LSsung, meist bei 20 ~ C, ablaufen lassen.
Allgemein hat sich ergeben: W~Brige LSsungen yon N-TFA-Aminos/~uren oder ihren Na~rinm-
salzen sind bei Zimmer~emperatur fiber lange Zeiten hinweg stabfl, die , ,neutrale" t tydrolyse der Verbindungen is~ zu vernaehl/~ssige n.
Die Hydrolyse in atkallscher LSsung (NaOI-I) ist 2. Ordnung, v = k 2 �9 [Aminos~ure] �9 [OH-]
Die Gesehwindigkei~skonstanten k2 f f i r eine l~eihe yon N-TFA- Aminos/~uren zeigt Tab. 1.
Tabelle 1. k S- Wefts der alkatis~hen Hydrolyse yon N- T~'A-Aminosdiuren
II o
H CH3
CII2X, X----- I:[00C- H00CCI-I~ C~H5
(CH~)2CH- CHaSCH 2-
X /
CR %
* DinaSriumsaJz.
X = CII 3 Y = CH~ CH3 C~H~
Gly Ala
Asp* Glu* Phe
Leu Meth
Val Ileu
k~(Liter/ Mol �9 rain)
8,35 6,35
2,53 2,50 2,2
1,8 1,10
5,0 5,3
Die ttydrolysengesehwindigkeit ist danaoh zwar nieht dramatisch, jedoch deutlieh yon der Konsti~ution des Aminos/~urerestes - - NHCHt~ �9 COOtt abhiingig:
~, fl- und s tark aueh ~-Substitu~ion yon t t i m l~es$ t~ setz$ die tCe- aktivi~/~t herab.
1961 Analyse yon Aminos~uren und Pep$iden 529
Ergebnisse bei verschiedenen Peptiden zeigt Tab. 2.
Tabelle 2. k S- Werte der alkalischen Hydrolyse yon N-T~A-Peptlden k2(Liter/Mol, rain)
N-TFA-Gly-gly - Gly-gly-gly - GIy-phe
2,30 2,18 2,26
Iq-TFA-IIou- Gly -Phe-gly -Val-gly
1,54 1,98 2,52
Wie zu erwarten, besRzt die Hydrolysengeschwindigkeit bei Peptiden eine andere GrSSe als bei den entspreehenden Aminos/~uren; bei den Ver- bindungen, deren endst/~ndige Amluogruppe yon Glycin s~ammt, wird, so- welt bisher feststellbar, in erster N/~herung der k2-Wert dureh den Mole- kiilrest nieh$ beeinflugt.
Die Ergebnisse beim N-TFA-Derivag einer Tab. 3 :
Tabelle 3. k~- Werte yon Prolin
N-TFA-Prolin 4,64; 4,42 bei 40 ~ C zum Vergleieh: 9,96 bei 45 ~ C N-TFA-Glycin
15,70 bei 50 ~ C
sek. Aminosgure zeigt
k~(Liter/Mol, rain) 6,35 bei 15 ~ C 8,35 bei 20 ~ C
12,0 bei 25 ~ C 14,25 bei 30 ~ C
Hier ist die Reaktivit/ i t sehr stark herabgesetzt, aus der Temperatur- abh/~ngigkei~ der Hydrolysengesehwindigkeit bei N-TFA-Glycin und -Prolin kSnnen als AktivierungsgrSf~en abgeseh/~tzt werden:
Glycin Prolin
Aktivierungs- I Stollzahlfaktor energie (b~ in 1/Mol.sec)
(kcal/Mol)
9,2 / 7,8 25,0 18,2
Das dritte analytische Problem, das mit Hilfe yon N-TFA-Derivaten vielleicht behandelt werden kSnnte, ist die Bestimmung der Kettenlgnge yon Peptiden. DasVerfahren, das wir un~ersueht haben, beruht auf folgen- dem Prinzip: I m IR-Spekt rum der Trfltuoressigs/~ure und ihrer Derivate lassen sich unschwer starke Banden bei 1200 em -1 herausfinden, die Valenzsehwingungen der CFa-Gruppe zukommen 3. Diese Banden tre~en auch in den N-TFA-Aminos/~uren und N - T F A - P e p t i d e n auf (vgl. Abb. 1). Ihre Intensit/it, relativ zu der yon den Banden, die fiir die Amidstruktur der Peptide charakterisgsch sind, sinkt mit s~eigender Zahl der Amino- s/~uren im Peptid. ~hnlich wie es zuerst SVHrED~ U. R]~STL]~ 5 bei N-DNP- Pep~iden [Intensit/itsverh/iltnis yon ~s (NO~)/v (Amid I-Bande)] und OT~f~G 4 bei acylierten Aminozuckern [Intensit/~tsverh~ltnis im Amid I- Banden- und ~ (C-O)-Gebiet] gezeigt haben, sollte man aueh hier aus dem
Z. analyt. Chem., Bd. 181 34
530 G. Kg~szE un4 V. Sc~r~Dm Bd. 181
Intensit/~tsverhKltnis der beiden IR-Banden, yon denen die eine fiir die Peptidstruktur, die zweite fiir die CF a- Gruppe eharakteristiseh is~, auf die Kettenl/~nge in Y~-TFA-Peptiden zuriiekschlieBen kSnnen.
Wellenl#o~e [~) - ~ ~,5 s 111Z lS1r IS zo ~ ao ~ ,
O' ' ' Ioo ~
3o~ 700 0
3~00 2800 2000 /300 /s /r 720# 7000 803 800 r ROg lllie lle n z a k l ( o ~ 1)
Aiob, 1, IR-S1oek~rum ~r ~T-TFA-Glycylglycin
b"
Dabei waren folgende Fragen zu kl/~ren: Welche der eharakteristisehen Banden sind am wenigsten durch an-
dere Absorptionen iiberlappt und daher zur Analyse geeignet ~. Ist die Verwendung einer Maximalextinktion (wie bei SCnIEDT 5)
oder einer integralen Absorption (wie bei OmmI~G ~) in diesem speziellen Fall giinstig ?
Die Substanzen miissen in festem Zustand spektroskopiert werden; welche Voraussetzungen sind an die Reproduzierbarkeit gekniipft ?
Schlie~lieh: bestehb, wie zu hoffen, ein einfacher Zusammenhang zwisehen dem Extinktionsverh~ltnis und der Kettenl~nge, und falls ja,
J
/ O 7 2 3 ~ S 8
l(e//enld'zge n
Abb. 2. Q(n) bei Xq-TFA-Polyglyeinen
gilt dieser fiir al le Aminos~uren als Peptidbausteine ?
Wir haben hierzu folgende Er- gebnisse erhalten:
Am besten geeignet fiir den Intensi$~tsvergleieh sind bei Oligo- pep$iden die Amid I-Bande bei 1680 cm -1 (vl) und die Teilbande 1165 em -1 der fiir die CFs-Gruppe eharakteristischen Absorption (v2). Bei anderen Banden (z.B. Amid II , andere CFa-Banden ) lieg~ en~weder das Extinktionsverh~ltnis zu un- giinstig, oder die Absorption ist
bei zu vielen Verbindungen dureh S$Srbanden iiberlappt. Am besten wird -- unter den im Versuehsteil genannten Bedingun-
gen -- die seheinbare Maximalextinktion der beiden Banden (E 1 bzw. E~) ausgewertet. Das Verh/~ltnis der integralen Absorptionen (Bereiche 1600--1680cm -1, 1130--1270cm -1) ist starker gegen Konstitutions-
1961 Analyse von Aminosauren und Peptiden 531
einfliisse der Aminosgurereste anfi~llig und daher zur allgemeinen Ketten- 1/ingenbestimmung weniger geeignet.
Die Spektren wurden yon KBr-PreBlingen der N-TFA-Peptide auf- genommen. Dabei bat ten die PreBdauer der Tabletten (3--30 rain bei 30 t Gesamtdruek), der PreBdruck (20--40 t Gesamtdruck bei 3 rain PrelMauer), die Schichtdieke (Tablet~en mig 400--600 mg KBr bei 0,7 mg Subs~anz), die Konzentration an Peptid (0,2--1,4 mg bei 500 rag) im gtinstigen Extinktionsbereieh, sowie eine nach~rggliehe 15stiindige Trocknung bei 80~ keinen EinfluB auf die Gr6Be der Ex- tinktionsverh/~l~nisse, bei denen die maximale Abweichung bei versehiede- nen Tabletten ~= 50/0 betrug.
Bei den N-TFA-Polyglycinen (n = 2, 3, 4, 6) liegen die Quotienten Q ~ E1/E~, gegen n aufgetragen, auf einer Geraden (Abb. 2), der Anstieg AQ/An betr//gt 0,75.
Bei einer ganzen Zahl anderer Dipeptide wurde der Q-Wer~ bestimmt, der Mittelwert war 1,36 (Tab. 4).
Tabelle 4. Q-Werte von Dipelgtiden und Dipeptidderivaten
N-TFA-GIy-gly N-TrA Al~-~la N-TFA-Ala-phe-OCH 3 N-TFA-Val-ala-OC~H~ N-TFA-V~I-~la-OCH 8 N-TFA-Asp-gly-OC2H 5 N-TFA-Asp-al~-OCH 3 N-TFA-Asp-Leu-OCtt 3 N-TFA-Asp-val-OC2H 5 N-TFA-Asp-phe-OC~H 5 N-TFA-Asp-asp-(OC2H~)2 N-TFA-Asp-glu~-(OC~Hs), N-TFA-Asp-tyr-OC2tt 5 N-TFA-Ser-gly-OC2It 5 N-TFA-Threo-gly-OC~H 5 N-TFA-Ser-ala-OCH 8 N-TFA-Threo-ser-OCH 3 N-TFA-Ser-meth-OCH 3 N-TFA-Phe-ser-OCH 3 N-TFA-Ala-ser-OCH 3 N-TFA-Ser-tyr-OCH,CoH ~
1,37 1,66 1,59 1,80 1,41 1,13 1,11 1,29 1,55 1,36 1,39 1,10 1,20 1,25 1,14 1,15 0,68 1,35 1,40 1,37 1,57
Die Q-Werte zeigen etwas variable Werte, StSrungen k6nnen vor allem bei hydroxylhaltigen Aminosiiuren auftreten.
Freie N-TFA-Aminos~uren und deren Methyl- oder J~hylester zeigen gleiche Q-Werte (siehe Tab.4). Auch N-TFA-AminosKurehydrazide ver- halten sieh normal, die , ,Kettenl~nge" n wird hier um eine Einheit zu hoeh gefunden. Bei Tritylhydraziden ist eine Auswertung wegen StSrung dureh die Aromatenbanden nieht mSglich.
34*
532 K ~ s z ~ u. SC~VIIDT: Analyse yon Aminos~uren und Peptiden Bd. 181
Die Ergebnisse bei Tr ipep t iden sind die folgenden:
N-TFA- Oly-gly-gly N-TFA- Gly-gly-gly-OC2H 5 N-TFA-Threo-ser-fleu-OCtIa N-TF A-Threo-val-ala-OCtta N-TFA-Tyr-ser-meth-OCH 3
2,13 1,96 1,87 1,70 1,29
Wieder fallen OH-halt ige Verb indungen heraus ; i m al lgemeinen sollte jedoch wegen des h o h e n g l Q / d n - W e r t e s e ine , ,Ket ten l /~ngen"-Bes t immung den r icht igen Wer t fiir n ergeben.
Ferner wurden un te r sueh t :
Tetrapeptid: N-TFA-(Gly)4 2,90 Hexapeptid: N-TFA-(Gly)6-OC2H 5 4,42
Zusammenfassend karm m a n sagen, dag bei Pep t iden mi t einer Ket- tenl/ inge bis zu 9, die aus einfachen Aminos/ /uren aufgebaut sind, eine Ke t t en l / ingenbes t immung mi t I t i lfe yon I g - S p e k t r e n der N-TFA-Der i - r a t e im Pr inz ip m6glich sein sollte.
Beschreibung der Yersuche 1. Bestimmung der Hydrolysengeschwindiglceit yon N~TFA-AminosSure~ und
-Peptiden. 0,05--0,2 in Mol der N-TFA-Aminos~ure wurden in einem Poly~thylen- WagerShrchen in die thermostatierte Leitf~higkeits-Megzelle gegeben und so viel Leiff~higkeitswasser zugegeben, dab das Gesamtvolumen -- einschlieglich NaOg- L6sung -- genau 40 ml betrug. Dann wurde unter Riihren zun~chst ein ~quivalent 0,1 n NaOH-L5sung und nach einigem Stehen ein weiteres J~quivalen~ NaOH- LSsung hinzugefiigt. Die Temperatur wurde konstant auf 20 ~= 0,1 ~ C gehalten, als Nullpunkt der Zeitmessung wurde die Zeit der Zugabe yon 1,5 Aquivalent ge- nommen. Dann wurde die Zeit-Widerstandskurve aufgenommen, Messungen er- folggen in Abst~nden yon etwa 30 sec, gemessen wurde 35--40 min lang. Der Endwert des Widerstands hatte sich nach 3--Tti~gigem S~ehenlassen der LSsung eingestell~.
Die Auswertung erfolgte nach dem Gesetz 2. Ordnung:
a / (a - - ~c) = (Roo -- Ro)R/(R~ -- R)Ro 1
(Roo = Endwert; R 0 = Anfangswert, extrapoliert; R = MeBwert).
Die Punkte lagen auf einer Geraden, die -- apparativ bedingte -- Streuung konn~e dutch Aufnahme vieler N[el3punkte gut graphisch ausgeglichen werden.
2. Bestimmung der Kettenlgnge yon N-TFA-Peptiden. 0,7--1,4mg N-TFA- Peptid wurden im Achatm6rser mit 500 mg KBr verrieben und bei 30 t Gesamt- druck gepregt, es ergaben sich Mare PreBlinge. Dana wurde das IR-Spektrum mit einem Leitz-Ger~t mit NaC1-Prisma (Spaltprogramm 3,0, Registriergeschwlndig- keit 1,2) aufgenommen, wobei zun~chst bei 2000 cm -1 mit tIilfe eines Gitters im Vergleichsstrahl eine Durchl~ssigkeit yon 90~ eingestellt wurde. Diese 90~ Durchliissigkei~slinie wurde als Nullinie fiir die Extinktionsmessungen gew~hlt, bestimmt wurde die Maximalextinktion der Amid-I-Bande (1680 cm -1, El) und der niedrigstfrequenten Teilbande der CF~-Absorption (li65 cm -1, E~). Das Extink-
1961 t I ~ T ~ A ~ et al. : Untersuchung der Spaltung yon Di- und Tripeptiden 533
tionsverhgltnis E1/E 2 : Q ist mit der Kettenlgnge n dutch die Ngherungsgleichung Q - - 1,36
n -- 2 ~- 0,75 verkniipft.
Wit danken Herrn Prof. W~u fiir seine stere Hflfe und seinen Rat, dem Hcrrn Bundesminister fiir wirtschaftlichen Besitz des Bundes fiir die wesentliche Unterstfitzung dieser Arbeit.
Literatur F~osT, A. A., u. R. G. P~msoN: Kinetics and Mechanism, Wiley & Sons,
New York, Chapman & Hall Ltd. London, 1956, S. 35. -- 2 FvsoN u. Mitarb. : J. chem. Physics 20, 1627 (1952). -- RoBson, D. H., u. J. R~r~)mD~: J. Amer. chem. Soe. 77, 498 (1955). -- KAoA~Is~, R. E. : J. chem. Physics 27, 519 (1957). -- 3 K~v, sz]L G., u. V. SC]tMIDT: Chem. Ber. 90, 1678 (1957). -- ~ OTTn~G, W.: Liebigs Ann. Chem. 612, 68 (1958). -- 5 SeBX~)T, U., u. H. R~STLV,: Z. Naturforsch. 9b, 182 (1954); vgl. diese Z. 145, 197 (1955). -- e W~x~G.twD, F., u. I-I. RI~NO: Hoppe- Seylers Z. physiol. Chem. 806, 173 (1957); vgl. diese Z. 163, 316 (1958). -- 7 WEv- G~tN1), F., u. W. Swol)n~K: Chem. Ber. 98, 1693 u. ffiiher (1960). -- W~:CtA~D, F., u. E. L]~sn~o: Chem. Ber. 87, 248 (1954). -- W v . u F., n.~R. G~%o]~: Chem. Bet. 89, 647 (1956). --WEu F., R. G~%r u. U. G~6CKL]~R: Chem. Ber. 89, 1543 (1956). -- W~Yo~D, F,, 1~. G~v.R u. W. SWOD~Y:: Angew. Chem. 68, 307 (1956). -- W~u F., B. KoLB u. P. K~Cm~E~: diese Z. 181, 396 (1961).
Organisch-Chemisehes Institut der Teehnischen Universit~r Berlin-Charlottenburg, Stral~e des 17. Juni
Institut fiir physikalische Chemie der Universit~t Frankfurt a. M.
Analytisehe 2robleme bei kinetisehen Untersuehungen fiber die Spaltung yon Di- und Tripeptiden
Von H. HARTMANN~ J. HEIDBERG~ J. :HEINTGES und H. JUNG
M_it 1 Textabbildung
(Eingegangen am 1ft. November 1960)
Einfiihrung und Problemstellung
Uber die K ine t ik der Spa l tung yon einfaehen Pep t iden f inden sich in der L i t e ra tu r dank des Interesses, das diese Verb indungen als Modell- subs tanzen fiir die Prote ine besitzen, eine Reihe yon Arbe i ten e. Die analy t i sehen l~ethoden, welehe bei diesen Un te r suehungen durehweg angewendet wurden, die Forrnol t r i t ra t ion naeh S S R ~ s ~ x , die mano- metrisehe Kohlens/~uro- oder St ickstoffbesthnmung, die Dini t rophenyl - methode oder das eolorimetrische Verfahren naeh ~oo~v,, ermSghchen die quan t i t a t ive Erfassung bes t immter funkt ionel ler Gruppen u n d dami t der Summe aber n icht die Erfassung des individuel len Antei ls ihrer