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Applications de marqueurs immunotoxicologiques en écotoxicologie
PLAN
• Survol historique• Considérations toxicologiques• Approches en immunotoxicologie• Conckusions
SURVOL HISTORIQUE
1884 La phagocytose
1890 Les anticorps
1901 Les groupes sanguins
1950-60 Les bases cellulaires de l’immunité
1970-80 Les bases moléculaires de l’immunité
1975 L’immunopharmacologie
1980 L’immunotoxicologie
· cibles (1983)
· résistance (1985)
Réponse immunitaire non-spécifique
Réponse immunitaire spécifique
Prolifération lymphoblastique
Présentationde l’Ag
Réactions inflammatoires
Phagocytose
Activité cytotoxique
Y YSécrétion d’anticorps
Y
Réponse immunitaire cellulaire
Réponse immunitaire humorale
Tc
Tc Tc
Tc Tc Tc Tc
Tc BB
B
BB
BBBB
Th
Th Th
NK
Réponse immunitaire non-spécifique
Réponse immunitaire spécifique
Prolifération lymphoblastique
Présentationde l’Ag
Réactions inflammatoires
Phagocytose
Activité cytotoxique
Y YSécrétion d’anticorps
Y
Réponse immunitaire cellulaire
Réponse immunitaire humorale
Tc
Tc Tc
Tc Tc Tc Tc
Tc BB
B
BB
BBBB
Th
Th Th
NK
Phénotypage
CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES
Santé humaine ?
Santé des écosystèmes ?
ASPECTS RÉGLEMENTAIRES
CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES
1. Fiabilité et reproductibilité des méthodes
2. Sensibilité des paramètres sélectionnés
3. Allure de la courbe dose-réponse
1. FIABILITÉ ET REPRODUCTIBILITÉ DES MÉTHODES
PROGRAMME INTERNATIONAL D ’HARMONISATION
PROTOCOLE• 10 laboratoires d ’Europe et des États-Unis• Rat• Réponse humorale par la technique des plages de
lyse (PFC)• Azathioprine composé modèle• Résultats exprimés en pourcentage de la réponse
du laboratoire de référence
Réponse immunitaire non-spécifique
Réponse immunitaire spécifique
Prolifération lymphoblastique
Présentationde l’Ag
Réactions inflammatoires
Phagocytose
Activité cytotoxique
Y YSécrétion d’anticorps
Y
Réponse immunitaire cellulaire
Réponse immunitaire humorale
Tc
Tc Tc
Tc Tc Tc Tc
Tc BB
B
BB
BBBB
Th
Th Th
NK
GRM
Complément
Splénocytes
Chambre deCunningham
PRINCIPE DES PFC
PROGRAMME INTERNATIONAL D’HARMONISATION(Réponse humorale)
Lab1
Lab2
Lab3
Lab4
Lab5
Lab6
Lab7
Lab8
Lab9
Lab10
050
100150200250300350400450500
Lab1
Lab2
Lab3
Lab4
Lab5
Lab6
Lab7
Lab8
Lab9
Lab10
Dose 1Dose 2Dose 3
% L
AB
. R
ÉF
ÉR
EN
CE
2. SENSIBILITÉ DES PARAMÈTRES SÉLECTIONNÉS
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
1x10-9 1x10-8 1x10-7 1x10-6 1x10-5 1x10-4
Concentrations (M)
Ind
ex d
e p
hag
ocy
tose
HgCl2
ZnCl2CH3HgCl
CdCl2
EFFET DES MÉTAUX LOURDS SUR LA PHAGOCYTOSE DES COELOMOCYTES
CHEZ LE VER DE TERRE
CdCl2
CI 50 DOSE
ANALYSE DES RÉSULTATSCI 50
0
50
100
150
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
%
rép
on
se n
orm
ale
IMMUNOTOXICITÉ COMPARATIVE DES MÉTAUX CHEZ LE VER DE TERRE (CI 50)
• ZnCl2
• CdCl2
• HgCl2
• CH3HgCl
• > 10 x 10-5 M
• 3.0 x 10-5 M
• 1.8 x 10-5 M
• 0.03 x 10-5 M
3. ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE
Dose1: NOEL; 2: dose de référence; 3:dose 50 %
ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE
Eff
et
Adulte
2 1 3
Dose
Eff
et
AdulteEmbryon
1 2 3 4
1: NOEL embryon; 2: dose de référence; 3: NOEL adulte; 4: dose 50%
ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE
APPROCHES
1. MODÈLES CLASSIQUES
2. IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE
4. TERRAIN
5. COMBINAISON
APPROCHES
1. MODÈLES CLASSIQUES
2. IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE
4. TERRAIN
5. COMBINAISON
PROTOCOLE
NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRIN
1, 4, 7, 10, 14, 28, 42 DAYS
TESTS IMMUNOLOGIQUES
MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES
EFFETS DE LA DIELDRINESUR LES CELLULES PRODUCTRICES
D ’ANTICORPS%
Rép
on
se n
orm
ale
Dose (LD50)
0
20
40
60
80
100
120
1/32 1/16 1/8 1/4 1/2
IMMUNOTOXICITÉ DE LA DIELDRINE
MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES
PHAGOCYTOSE
FLAMBÉE OXIDATIVE
PROCESSING DE L ’ANTIGÈNE
PFC
LPS
Ab
CON A
PHA
MLR
GVH
NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRINE
PROTOCOLEMODÈLE DE RESISTANCE
• MURINE HEPATITIS VIRUS 3
• Salmonella typhimurium
RESISTANCE AUX INFECTIONS
ANTI BACTERIENNE ANTI VIRALE
S. typhymurium MHV 3
MORTALITÉ
BACTÉRICIDIE
PHAGOCYTOSE
ANTICORPS
MORTALITÉ
ANTICORPS
EFFETS CYTOPATIQUES
RÉPLICATION
TOXIQUES
Chlorure de mercureChlorure de méthyl mercureChloride de cadmiumChlorure de zinc
DDT, DDE
BPC congenères 138, 153, 168, 180Benzo-a-pyrene
TCDD
Mélanges (synthétiues, effluents, sédiments)insecticides
herbicides
RELATIONS TOXIQUE ET SYSTÈME IMMUNITAIRE
X
AUTOIMMUNITÉ
SOI MODIFIÉ
SOI
SUSCEPTIBILITÉAUGMENTÉE* INFECTIONS* CANCERS
IMMUNOSUPPRESSION
SYSTÈME IMMUNITAIRE
ALLERGIES ELIMINATION
RÉPONSE IMMUNITAIREANTI-X
NON-SOI
IMMUNO COMPÉTENCE?
CANCERSINFECTIONS
CONTAMINANTS
APPROCHES
1. MODÈLES CLASSIQUES
2. IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE
4. TERRAIN
LISTE DES ESPÈCES
•Mye•Moule•Mactre
•Choquemort•Plie•Truite •Chien
•Chat•Poulet•Aigle•Caille
•Écureuil•Rat•Souris
•Ver de terre
•Phoque•Béluga•Ours polaire
•Cochon•Bœuf•Bœuf musqué•Lama•Élan•Cheval
•Chèvre•Mouton
•Alligator•Grenouille
SENSIBILITÉ DES ESPÈCES HgCl2 CI50 (x 10-5)
• Choquemort 0.08• Truite 0.13• Mye 0.48• Bœuf musqué 1.09• Bœuf 1.24• Lama 1.29• Aigle 1.40
• Élan 1.43• Mouton 1.70• Ver de terre 1.80• Poulet 1.90• Cochon 10.08• Rat 10.20• Humain
100.03
Mercury concentrations (M)
% N
orm
al r
espo
nse
(SI
x 10
0)
0
20
40
60
80
100
120
140
10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4
CH3HgCl
HgCl2
Mercury concentrations (M)
% N
orm
al r
espo
nse
(SI
x 10
0)
0
20
40
60
80
100
120
140
10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4
CH3HgCl
HgCl2
0
20
40
60
80
100
120
140
10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4
CH3HgCl
HgCl2
% p
roli
fera
tion
concentration (ppm)
PCB 138
PCB 180PCB 156
PCB 153
IC =89ppmIC =89ppm5050
IC =44ppmIC =44ppm 5050 IC =67ppmIC =67ppm50 50
IC =73ppmIC =73ppm5050
*
*
* **
* **
***
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
10 100 10 100
APPROCHES
1. MODÈLES CLASSIQUES
2. IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE
4. TERRAIN
5. COMBINAISON
PROCÉDURE EXPÉRIMENTALE
ZnCl210 ug/l50 ug/l
CdCl21 ug/l5 ug/l
Hg/Zn0,3/30 ug/l0,5/50 ug/l
Cd/Zn3/30 ug/l5/50 ug/l
CH3HgCl0,1 ug/l0,5 ug/l
UN METAL
Cd/Hg3/0,3 ug/l5/0,5 ug/l
DEUX METAUX
Cd/Hg/Zn3/0,3/30 ug/l5/0,5/50 ug/l
TROIS METAUX
Truite arc-en-ciel30 jours d ’exposition
PARAMÈTRES
oxidative burst cytométrie
phagocytose cytométrie
macrophage
PHA LPS
ConA
prolifération
H3-thymidine
lymphocyte
lysozymeactivité
colorimétrie
IgMELISA
serum
Rein
CHLORURE DE CADMIUM
-80
0
80
-100
-60
-40
-20
20
40
60
100
120
Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM
% r
épon
se d
u té
moi
n
1ug/l
5 ug/l
* * * * * * * *
* *
* **
*
CHLORURE DE MERCURE
-100-80-60-40-20
020
406080
100120140
Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM
% r
épon
se d
u té
moi
n 0.1 ug/l
0.5 ug/l
* * * * * * * * * * * *
*
CHLORURE DE ZINC
-100-80-60-40-20
020406080
100120140
Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM
% r
épon
se d
u té
moi
n
10 ug/l
50 ug/l
* ** * * *
* *
*
CADMIUM / MERCURE%
rép
onse
du
tém
oin
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM
3/ 0.3 ug/l5/ 0.5 ug/l
* * * * * * * * * *
* *
* *
CADMIUM / ZINC100
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM
% r
épon
se d
u té
moi
nl
3/30 ug/l5/50 ug/l
* * * * * * * *
MERCURE / ZINC%
rép
onse
du
tém
oin
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM
0.3/30 ug/l0.5/50 ug/l
* * * **
CADMIUM / MERCURE / ZINC
-100
-80-60
-40-20
020
40
6080
100120
140
% r
épon
se d
u té
moi
n
Phago. Oxid. ConA PHA LPS Lyso. IgM
3/0.3/ 30 ug/l5/0.5 /50 ug/l* * *
*
* *nd* * *
*
APPROCHES
1. MODÈLES CLASSIQUES
2. IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE
4. TERRAIN
5. COMBINAISON
Facteurs confondants
• Nombre d’individus
• Âges
• Sexe
• Sites
Nombre
Nombre d’individus
% V
aria
tion
25
50
75
3 9 126 2518
SITE
% p
hag
ocyt
es/r
ein
5
10
15
Ma Me Hu
Lac
Variations mensuelles%
Ph
agoc
ytes
/rei
n
5
10
15
Juil Sept Oct
Mois
Variations liées au sexe
% P
hag
ocyt
es/r
ein
5
10
15
MM M
Ma Me Hu
Lac
F F F
0
40
60
80
100
20
-9,0 -8,0 -7,0 -6,0 -5,0 -4,0 -3,0
Concentration (M)
% R
épo
nse
No
rma
le
SENSIBILITÉ AU MERCURE
0 5 10 200
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
Apopka
Woodruff
Con A ug
cpm
x 1
000
Transformation blastique
0
1
2
3
4
5
6
Venise en Qc St-Amable Boucherville Chibouet Fairbanks
Site d'échantillonnage
Nom
bre
de
ph
agoc
ytes
act
ifs
( x
106 ) A
B
B BC
C
Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en juillet
Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en septembre
0
1
2
3
4
5
6
Venise en Qc St-Amable Boucherville Chibouet Fairbanks
Site d'échantillonnage
Nom
bre
de
ph
agoc
ytes
act
ifs
( x
106 ) A
B
B BC
C
APPROCHES
1. MODÈLES CLASSIQUES
2. IN VITRO
3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE
4. TERRAIN
5. COMBINAISON
BA IE D E S
AN G LAIS
12 3
BAIE-C OM EAU
Q U É BE C
M O N T-JO LI
M ATAN E
B AIE -C O M E A U
* : μg/g sédiment sec
BPC*
1
2
3
3,3’,4,4’- T4CB 5700 740 86
2,3,4,3’4’- P5CB 29000 3030 280
2,4,5,3’,4’- P5CB 53000 4460 411
3,3’,4,4’,5- P5CB 230 20 2,3
3,3’,4,4’,5- H6CB 3,2 0,5 0,1
BPC dans les sédiments de la Baie-des-Anglais
Métaux*
1
2
3
Pb 23,65 18,63 16,75
Cd 0,20 0,09 0,06
Ag 0,07 0,04 -
Cu 18,90 18,03 9,12
Hg 0,08 0,03 0,01
* : μg/g sédiment sec
Métaux dans les sédiments de la Baie-des-AnglaisSites
Pro
du
its
de
com
bu
stio
n
(μg/
g sé
dim
ent
sec)
Sites
0
50
25
1 2 3
HAP dans les sédiments de la Baie-des-Anglais
Site 1, 2, 3 Site 1
13 semaines
Protocole expérimental
Protocole expérimental
Effets de l ’exposition in situ
05
10
15202530
3540
Cells MO 1+ MO 3+
No
mb
re d
e ce
llu
les
(107
)
Site 3
Site 2
Site 1
Protocole expérimental
Site 1 sédiment
Sable
1, 2, 3 mois et recouvrementimmunologie, analyse chimique
Nombre de macrophages actifs
0
1
2
3
4
5
6
7
1 mois 2 mois 3 mois Récupération
No
mb
re d
e ce
llu
les
(10
7)
Témoin
Exposé
Pathologies
• Neoplasies 15 17.6%• Pneumonies (vers) 15
17.6%• Infections bactériennes 13
15.3%• Malformations 5 5.9%• Parasitisme 4
4.7%• Infections (virus, autres) 6
7.1%• Non déterminées 18
21.1%• Autres causes 9
10.5%
85 nécropsies de 235 carcasses (1982-97)
Tumeurs décrites
• Adenocarcinomes: intestin, estomac, utérus, glandes salivaires, glandes mammaires
• Carcinome de la vessie
• Lymphosarcome thymique
• Tumeurs de l’ovaire (granulosa, dysgerminoma)
• Hépatocarcinome
• Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir d’échantillons de sang de bélugas en captivité
• Validation des méthodes et établissement d’une banque de données à partir des animaux de l’arctique
• Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro
• Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète)• Caractérisation des animaux du Saint-Laurent
Programme de recherche
Lymphocytes de bélugas et DDE
Lymphocytes de bélugas et DDT
Expositions in vitro
• Métaux : Pb, Cd, Hg, Ag, Zn, Cu
• TCDD, DDT, DDE
• Congénères de BPC
• Insecticides, herbicides
• Mélanges
Programme de recherche
• Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir d’échantillons de sang de bélugas en captivité
• Validation des méthodes et établissement d’une banque de données à partir des animaux de l’arctique
• Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro
• Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète) Caractérisation des animaux du Saint-Laurent
Diète pour 90 jours
- Gras de bœuf
- Huile de maïs
- 100 % béluga Saint-Laurent ou Arviat
- mélange 75:25, 50:50, 25:75
Compétence immunitaire
Phagocytose, transformation blastique, phénotypage, NK, PFC
Protocole expérimental
0
2040
6080
100
120140
160
Boeuf 75/25 25/75 100 St
% N.R.
**
**
PFC
*
Maïs 50/50100
Sexe et maturation
Hémolymphe
Estradiol
Testostérone
Progestérone
Sérotonine
PgE2, PgF2
Phagocytose
Time (h)
0 5 10 15 20 25
Flu
ore
scen
ce F
L1
(% c
ells
)
0
10
20
30
40
50
60
70
Mya truncata Siliqua costataMesodesma arctatumSerripes groenlandicusCyrtodaria siliquaElliptio ComplanataMya truncata (Azide)Siliqua costata (Azide)
0
50
100
150
200
250
3001x
10-9
1x10
-8
1x10
-7
1x10
-6
1x10
-5
1x10
-4
1x10
-3
CONCENTRATIONS ( M )
EFFETS SUR LA PHAGOCYTOSE SUITE À DES EXPOSITIONS IN-VITRO
CH3HgCl
HgCl2
CdCl2
ZnCl2
AgNO3
Brousseau et et al., 2000. Toxicology 142 : 145-156.
CMFDACMFDA
CMF
Conjugaison des thiols
Non conjugué
EsteraseEsterase
DA
CMF-SH
PRINCIPE DE LA MESURE DES THIOLS
Effet de la NEM sur la fluorescence induite par la CMFDA
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 40 80 100
Dose de NEM (ug/ml)
Flu
ores
cenc
e m
oyen
ne
EFFET DU MERCURE SUR LE NIVEAU INTRACELLULAIRE DE THIOLS CHEZ LA MYE
Concentrations (M)Inte
nsi
té d
e fl
uo
resc
ence
(F
L1)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 10-8 10-4
Estradiol
Testostérone
Progestérone
Sérotonine
PgE2, PgF2
Sexe et maturation
Phagocytose
Phagocytose
0 5
TémoinN = 15
0.1 XN = 15
[TBT] = 5 µg.L-1
[Atrazine] = 8 µg.L-1
[Diuron] = 0.07 µg.L-1
[E2] = 10-10 M
XN = 15
[TBT] = 50 µg.L-1
[Atrazine] = 80 µg.L-1
[Diuron] = 0.7 µg.L-1
10 XN = 15
[TBT] = 500 µg.L-1
[Atrazine] = 800 µg.L-1
[Diuron] = 7 µg.L-1
[E2] = 10-8 M
Protocole expérimental
débimètre
Contaminants0.2 ml/min.
Eau de mer 200 ml/min.
Mytilus edulis
FiltreMya arenaria
Expositions In vivo
PROTOCOLE - PROTOCOLE - In VivoIn Vivo
HgCl2 CH3HgCl
10-9M 10-8M 10-7M
10-6M 10-5M 0
FILTRE
0 -9 -6
0
200
100
Ch
arge
tis
sula
ire
ug/
g
Corrélation entre l’exposition et la charge tissulaire (14j.)
300
-7-8Dose Molaire
CH3HgCL
HgCl2
0 100 200
0
100
50
Charge tissulaire ug/g
Corrélation entre la charge tissulaire et l ’inhibition de la
phagocytoseP
hag
ocyt
ose
%
Blanc
-
Sablon
Havre-St- Pierre
Carleton
Gaspé
Grande -Rivière
Havre- aux- Maisons
% de phagocytose moules Grande-Rivière transplantées en fonction du temps (2002)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Juin Juillet Août Sept. Octo. Nov. Mois
% d
e p
hag
ocy
tose
1 bille3 billes et +
CONCLUSIONS
Xénobiotiques
Espèces labo.
SI
Espèces fauniques
Espèces fauniques
In vitro
In vivo
In vitro
In vivo
In vivo
Expositions contrôlées(résistance)
Expositions contrôlées
Terrain
1.
CONCLUSIONS
Mécanismes d ’immunotoxicité
Laboratoire Terrain
2.
CONCLUSIONS
3. Biomarqueurs immunologiques en
écotoxicologie
Validation• Espèces laboratoire• Espèces fauniques
Utilisation• Suivi environnemental d ’espèces fauniques
CONCLUSIONS
4. Biomarqueurs immunologiques en
santé humaine
Validation• Etude clinique
Utilisation• Suivi environnemental
Exposition
Fonctions cellulaires
Altérations physiologiques
Santé de l’individu
CommunautéPopulation
Écosystème
Impa
ct é
clog
ique
cro
issa
nt É
chelle de temp
s
Réponses moléculaires et cellulaires
% d
e p
opu
lati
on
Résistance au pathogène
Malades mais vont survivreNe
survivront pas
Pathologie légèrePrésence d’Ab