Applications des marqueurs moléculaires dans l'amélioration du blé

B AS E Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2003 7 (1), 17–35

Applications des marqueurs moléculaires dansl’amélioration du blé tendre pour la résistance auxmaladies et aux insectes

Bouchra Najimi (1, 3), Samir El Jaafari ( 1 ), Mohamed Jlibène ( 2 ), Jean-Marie Jacquemin ( 3 )

(1) Faculté des Sciences. Université Moulay Ismaïl. B.P. 4010. 50000 Meknès (Maroc). E-mail : [email protected](2) Institut national de la Recherche agronomique. B.P. 578. 50000 Meknès (Maroc).(3) Département de Biotechnologie. Centre de Recherches agronomiques. Chaussée de Charleroi, 234. 5030 Gembloux(Belgique).

Reçu le 17 février 2003, accepté le 24 mars 2003.

Le développement des marqueurs moléculaires durant les dernières années offre la possibilité d’établir de nouvellesapproches pour améliorer les stratégies de sélection. Les marqueurs moléculaires deviennent un outil essentiel dans lesprogrammes de sélection du blé tendre (Triticum aestivum L.) pour les résistances aux maladies et insectes en offrant dessolutions alternatives aux problèmes inhérents à l’utilisation des marqueurs phénotypiques traditionnels. Les marqueursmoléculaires liés aux gènes cibles peuvent être utilisés dans les programmes de sélection assistée par marqueurs (MAS) quiest particulièrement avantageuse dans le cas de l’amélioration des résistances aux maladies et aux insectes. En effet, lesélectionneur peut inférer la présence d’un gène par la recherche du marqueur qui lui est étroitement lié et pourra ainsisélectionner les individus résistants avant même que le caractère considéré ne soit exprimé et en absence du pathogène. Enoutre, les marqueurs moléculaires sont d’un grand intérêt lors du pyramidage de deux gènes ou plus dans une même variétépermettant ainsi une résistance plus constante et à large spectre. L’amélioration des résistances aux maladies et aux insecteschez le blé, via les marqueurs moléculaires associés aux gènes cibles, contribuera à l’amélioration du rendement de cetteculture céréalière à grande importance économique. Nous présentons dans cet article, une brève description des différentstypes de marqueurs moléculaires, ensuite une synthèse sur les utilisations courantes et potentielles de ceux-ci dansl’amélioration du blé tendre pour les résistances aux maladies et aux insectes.Mots-clés. Triticum aestivum, marqueur moléculaire, blé tendre, MAS, résistance aux maladies, résistance aux insectes.

Applications of molecular markers in bread wheat breeding for pest and disease resistance. The development in recentyears of DNAmarkers offers the possibility of developing new approaches to improving the efficiency of selection strategies.The molecular markers are becoming essential tools in bread wheat (Triticum aestivum L.) breeding since they offeralternative solutions to many breeding problems resulting from the traditional phenotypic markers that are difficult and/ortime-consuming to select by plant breeders. Availability of tightly linked molecular markers can now be used in marker-assisted selection (MAS) programs, specially for disease and pest resistance gene where it is possible to infer the gene by themarker without depending on the natural pest or pathogen occurrence or waiting for its phenotypic expression. Moreover,these markers have potential importance in facilitating selection procedure, particularly for pyramiding two or more differentgenes aiming at a more durable and broad- spectrum resistance. Breeding for disease and pest resistance gene can contributeto improving quality yield in wheat plants by carrying out indirect selection through molecular markers linked to the traits ofinterest. We first provide a brief description of main molecular markers technologies currently being employed. Next, wereview some of the current and potential uses of molecular markers in breeding for disease and pest resistance genes in breadwheat.Keywords. Triticum aestivum, molecular marker, bread wheat, MAS, disease resistance, pest resistance.

1. INTRODUCTION

Le blé tendre (Triticum aestivum L.) compte parmi lesespèces les plus anciennement cultivées et constitue labase de l’alimentation d’une grande partie del’humanité, d’où son importance économique.Cependant, cette culture est très sensible aux insectesnuisibles dont la mouche de Hesse et le puceron (quipeut en outre, transmettre au blé des maladies virales),et aux maladies causées principalement par leschampignons parasites dont la rouille jaune, la rouillebrune, la rouille noire, le piétin-verse, l’oïdium et lecharbon. L’amélioration de la production du blé passedonc par un meilleur contrôle de ces parasites. Ene ffet, le développement de variétés à grandeproduction avec une qualité adéquate du grain reste leprincipal objectif du sélectionneur. Toutefois, à cesbesoins classiques s’ajoutent aujourd’hui des exigen-ces découlant d’une grande prise de conscience socialeen matière de protection de l’environnement, menant àla limitation des traitements phytosanitaires et de lafertilisation chimique. Les techniques nouvelles, enparticulier les marqueurs moléculaires, apparaissentcomme des outils indispensables d’appui auxprogrammes classiques d’amélioration pour releverces défis.

L’utilisation de variétés résistantes constitue unecomposante essentielle pour la majorité desprogrammes de sélection et un moyen de contrôlee fficace qui prend en considération l’aspectécologique aussi bien qu’économique. Cependant, lapression de sélection exercée par les variétés àrésistance monogénique favorise le développement denouveaux biotypes capables de contourner cesrésistance, ce qui nécessite la recherche continue etrapide de nouvelles sources de résistance. Cetterecherche a été largement facilitée par l’avènementdes techniques de marquage moléculaire durant cesdernières années. En effet, plusieurs gènes derésistance aux insectes et aux maladies ont étérécemment localisés dans le génome du blé tendre parl’établissement de liaisons entre ces derniers et desmarqueurs moléculaires sur les différentes cartesgénétiques (Gupta et al., 1999 ; Yencho et al., 2000 ;Langridge et al., 2001).

Contrairement aux marqueurs traditionnels(morphologiques et biochimiques), les marqueursmoléculaires ne sont pas influencés par lesfluctuations de l’environnement et sont indépendantsde l’organe analysé et du stade de développement de laplante. Ces marqueurs moléculaires deviennentaujourd’hui un outil essentiel d’amélioration desplantes et ouvrent de nouvelles perspectives pour les é l e c t i o n n e u r. La recherche de marqueursmoléculaires étroitement liés aux gènes de résistanceest une étape importante avant leur exploitation

pratique pour accélérer et améliorer l’efficacité desprogrammes de sélection (Hospital, 2001 ; Moreauet al., 2001 ; Eagles et al., 2001 ; Dekkers, Hospital,2002).

La sélection assistée par marqueurs (MAS) estparticulièrement avantageuse dans le cas del’amélioration des résistances aux maladies et auxinsectes (Michelmore RW., 1995 ; Yencho e t a l .,2000 ; Langridge et al., 2001). Elle peut se faire sansavoir recours aux tests d’inoculation, permettant ainsid’éviter les erreurs associées à l’utilisation de cesprocédures et de mener l’amélioration de la résistancemême dans les aires où le pathogène n’existe pas. Demême, les marqueurs moléculaires permettent lecumul rapide de plusieurs gènes dans une seule variétéélite en vue d’une résistance plus efficace, et lamaîtrise de la taille des fragments chromosomiquesintroduits par rétro-croisements, ce qui élimine leseffets défavorables susceptibles d’être transmis avecles gènes cibles introgressés (Hospital, 2001). Ainsi,les schémas de sélection seront accélérés puisque lesélectionneur peut inférer la présence du gène par laprésence du marqueur avant même l’expression duphénotype.

Cette sélection assistée par marqueurs est doncd’un intérêt certain pour le sélectionneur puisqu’elleoffre l’avantage d’une sélection efficace, rapide etprécoce, et devient alors un complément nécessaireaux méthodes traditionnelles d’amélioration génétiquedes céréales.

Outre leur intérêt dans le domaine de la sélection,les marqueurs moléculaires constituent des outilspuissants pour la caractérisation moléculaire des gènesde résistance via la cartographie fine des régionscontenant ces gènes menant à leur clonage (Tanksleyet al., 1989 ; Michelmore RW., 1995). L’approche decartographie des RGA (Resistance Gene Analogs)/gènes candidats ouvre potentiellement la voie àl’identification de gènes de résistance chez le blé.Cette caractérisation devrait permettre de comprendreles mécanismes de défense mis en place par la plantelors de l’interaction avec le pathogène ou l’insecte.

Le présent article a pour objectif de décrire lesprincipaux systèmes de marquage moléculaireappliqués chez le blé tendre, puis d’évaluer lesapplications courantes et potentielles de ces marqueursdans l’amélioration de cette culture pour lesrésistances aux maladies et aux insectes.

2. PRINCIPAUX TYPES DE MARQUEURSMOLÉCULAIRES APPLIQUÉS POURL’AMÉLIORATION DU BLÉ

Un marqueur moléculaire est un locus polymorphe quirenseigne sur le génotype de l’individu qui le porte.Un bon marqueur doit être à hérédité simple, multi-

18 Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 2003 7 (1), 17–35 Najimi B., El Jaafari S., Jlibène M., Jacquemin JM.

Marqueurs moléculaires et leurs applications 19

allélique et co-dominant. Les marqueurs moléculairescorrespondent donc au polymorphisme révélé auniveau de l’ADN. L’analyse de ce polymorphisme parles techniques de biologie moléculaire s’adresse àl’ensemble du génome, qu’il soit ou non traduit enprotéines, et est indépendante des conditions del’environnement. En outre, le nombre de marqueursobservables est théoriquement illimité et le génotyped’une plante peut être déterminé à un stade trèsprécoce, aussitôt que le matériel est disponible pourl’extraction de l’ADN. Ces marqueurs seront d’unegrande importance dans l’amélioration des cultures àvaleur agronomique et dans les programmes desélection assistée par marqueurs chez les céréales(Eagles et al., 2001 ; Langridge et al., 2001 ; Dekkers,Hospital, 2002).

De nombreuses techniques de marquagemoléculaire sont aujourd’hui disponibles, et denouvelles sont régulièrement publiées (Gupta et al.,2001 ; Langridge et al., 2001 ; Rafalski, 2002a, b).Les caractéristiques de chacune de ces techniques, sesdomaines d’applications, son principe et son coût sontlargement détaillés dans plusieurs articles de synthèse(Gupta et al., 1999 ; Santoni et al., 2000 ; Langridgeet al., 2001). Ces méthodes peuvent être regroupées endeux grandes catégories : les marqueurs de type RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) et lesmarqueurs basés sur la méthode de PCR (PolymeraseChain Reaction). Le choix du système de marquagedépend de l’objectif précis fixé, des moyens et descompétences disponibles au laboratoire. Nousdécrirons brièvement les principaux systèmes demarquage moléculaire appliqués chez le blé.

2.1. Marqueurs RFLP

La technique RFLP développée par Botstein et al.(1980) repose sur la mise en évidence de la variabilitéde la séquence nucléotidique de l’ADN génomiqueaprès digestion par des enzymes de restriction. Unemultitude de fragments d’ADN de tailles variables estgénérée par digestion enzymatique, puis séparée surgel d’agarose et transférée par capillarité sous formedénaturée sur une membrane de nylon. Cettemembrane est mise en contact avec une solutioncontenant un fragment d’ADN ou sonde qui permet derepérer, par hybridation moléculaire, des fragmentsd’ADN génomique qui lui sont homologues. Lad i fférence entre deux génotypes est révélée parautoradiographie si la sonde est marquée par lephosphore radioactif ou par réaction colorée si elle estassociée à un conjugué enzymatique. Lepolymorphisme détecté est dû à des mutations auniveau des sites de restriction de l’enzyme(polymorphisme de site de restriction) et/ou à desdélétions/insertions d’un fragment d’ADN au

voisinage de la zone génomique reconnue par lasonde. C’est le couple enzyme/sonde qui constitue lemarqueur.

Bien que cette technique soit co-dominante etpermette une analyse génétique complète, elle estlente et laborieuse. Les étapes de transfert etd’hybridation empêchent une automatisation dutravail.

2.2. Marqueurs de type PCR

Le développement de la technique PCR off r el’avantage d’analyser les marqueurs moléculaires enun temps court tout en utilisant des concentrationsfaibles d’ADN. Les marqueurs basés sur la techniquePCR tendent à remplacer les systèmes classiques (lesmarqueurs morphologiques, iso-enzymatiques etRFLP) et deviennent très nombreux. Les pluslargement utilisés chez le blé sont les microsatellitesou SSR (Simple Sequence Repeat) ; l’AFLP,(Amplified Fragment Length Polymorphism) et laRAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA).

Les microsatellites ou SSR ( M o rgante, Olivieri,1993). Ils sont constitués de séquences de di-, tri- outétra-nucléotides répétés en tandem. Ces éléments sontuniformément répartis en plusieurs exemplaires surl’ensemble du génome d’une espèce et présentent untaux de polymorphisme élevé. Ce polymorphismerepose sur la variation du nombre d’unités derépétition constituant le microsatellite. Les séquencesflanquant ces éléments répétés permettent de définirles amorces qui seront utilisées pour l’amplificationPCR. L’analyse des produits amplifiés s’effectue surgel d’acrylamide. C’est la paire d’amorces spécifiquesdes bordures droite et gauche du microsatellite quiconstitue le marqueur.

Si les SSR constituent de bons marqueursmoléculaires (reproductibles, co-dominants et aisésd’utilisation), leur caractérisation initiale est toutefoisassez lourde. En effet, leur production doit passerd’abord par le clonage et le séquençage de ceséléments répétés.

La technique A F L P ( Vos e t a l ., 1995). Elle estfondée sur la mise en évidence conjointe depolymorphisme de sites de restriction et d’hybridationd’amorces arbitraires. Cette technique utilise à la foisles enzymes de restriction et l’amplification PCR.L’ADN génomique est clivé par deux enzymes derestriction. Des adaptateurs de séquences connues etspécifiques des enzymes de restriction utilisées sontajoutés aux extrémités des fragments de restrictiongénérant ainsi une matrice pour l’amplification. Unepremière amplification, dite pré-amplification, estréalisée à l’aide d’amorces de séquences complé-


mentaires à la séquence des adaptateurs et des sites derestriction. La deuxième amplification, dite sélective,utilise des amorces identiques aux premières maisprolongées à l’extrémité 3’ de quelques nucléotidesarbitraires (de 1 à 3 nucléotides). Ainsi, seuls sontamplifiés les fragments possédant les basescomplémentaires de ces bases arbitraires. Ces amorcessélectives permettent de réduire le nombre defragments amplifiés à une centaine. Ces fragmentssont séparés par électrophorèse sur gel d’acrylamidedénaturant puis visualisés par coloration au nitrated’argent ou révélés grâce à un marquage radioactif oufluorescent réalisé lors de l’amplification sélective.C’est la combinaison enzyme de restriction/amorcequi permet de révéler le polymorphisme entre lesindividus et constitue donc le marqueur AFLP.

Cette technique est puissante, stable et rapide. Enoutre, l’AFLP ne nécessite aucune connaissancepréalable de séquences du génome de la plante étudiéeni la construction des banques génomiques ou cDNA,à l’encontre des SSR ou des RFLP. Elle connaît unel a rge application dans le fingerprinting, l’identificationdes cultivars et la détermination de leur relation phylo-génétique, la cartographie des génomes et le clonage.Toutefois, la dominance, le coût élevé (elle estcouverte par un brevet de la société néerlandaiseKeygene qui a mis au point cette technique) et lesdifficultés techniques liées au marquage par AFLPlimitent son utilisation à grande échelle pour desapplications comme la sélection assistée par marqueurs.

La technique RAPD (Williams et al., 1990). Elleconsiste en l’amplification par PCR de fragments del’ADN génomique en utilisant des amorces arbitrairesde taille courte (10 pb). Une amorce RAPD permetgénéralement l’amplification d’une dizaine defragments correspondant à des locus dominants. Lesproduits d’amplification sont généralement visualiséspar électrophorèse sur gel d’agarose. Lepolymorphisme décelé est dû à des mutations soit dansles régions amplifiées soit au niveau des sites defixation des amorces. Le polymorphisme révélé est unpolymorphisme de sites d’hybridation d’amorce. Lesamorces constituent donc les marqueurs.

Cette technique est simple, rapide et ne nécessite niun marquage radioactif ni une connaissance préalablede la séquence nucléotidique. Néanmoins, la RAPDmanque de reproductibilité puisqu’elle est trèssensible à la concentration de l’ADN et aux conditionsd’amplification.

En résumé, les marqueurs RFLP et microsatellitessont spécifiques de locus, co-dominants et sont utilisésgénéralement pour la cartographie et la détection deQ T L (Quantitative Trait Loci) tandis que lesmarqueurs RAPD et A F L P sont dominants, non

spécifiques de locus et servent essentiellement à lasaturation d’une région du génome au voisinage d’ungène d’intérêt en vue de son clonage.

La comparaison des principales techniques demarquage moléculaire est illustrée dans la figure 1.

Chaque technique de marquage moléculaireprésente des avantages et des inconvénients maistoutes, excepté les SSR, restent mal adaptées auxutilisations à grande échelle. Ainsi, la conversion desmarqueurs de type RFLP, A F L P et RAPD enmarqueurs PCR de type SCAR (SequenceCharacterized Amplified Regions) (Paran,Michelmore, 1993) ou STS (Sequence Tagged Site)(Olson et al., 1989) devient nécessaire. En effet, cettenouvelle classe de marqueurs (SCAR/STS)correspond à des marqueurs simples, rapides,reproductibles, co-dominants, non radioactifs et peucoûteux qui pourraient favoriser l’utilisation etl’intégration des marqueurs moléculaires dans lesprogrammes d’amélioration des plantes dans un avenirproche (Hernandez et al., 1999).

Si les études visant à convertir les différents typesde marqueurs moléculaires en marqueurs simples sontnombreuses, très peu ont pu atteindre cet objectif chezle blé. Quelques exemples de succès de latransformation de marqueurs RFLP ou RAPD enmarqueurs STS/SCAR peuvent néanmoins être cités,notamment la conversion de marqueurs RFLP liés auxgènes Pm4a et Pm17 de résistance à l’oïdium et auxgènes Lr35 et Lr47 de résistance adulte à la rouillebrune (Liu DJ. et al., 1998 ; Seyfarth et al., 1999 ;Helguera e t a l ., 2000; Mohler e t a l ., 2001). Parailleurs, pour pallier au problème lié au manque dereproductibilité des marqueurs de type RAPD chez leblé, des marqueurs RAPD liés aux gènes Lr9 et Lr24de résistance à la rouille brune, Dn2 de résistance aupuceron russe et P m 1 3 et P m 2 1 de résistance àl’oïdium ont été transformés avec succès en marqueursSCAR (Schachermayr et al., 1994, 1995 ; Myburget al., 1998 ; Cenci et al., 1999 ; Liu et al., 1999).

Le clonage et le séquençage de marqueursmoléculaires de type AFLP ont été reportés dans unnombre limité de travaux (Qu et al., 1998 ; Shan et al.,1999 ; Parker, Langridge, 2000 ; Prins et al., 2001).Sur 26 marqueurs AFLPidentifiés chez l’orge et le blé,six uniquement ont pu être convertis en marqueursSCAR (Shan e t a l ., 1999). Plus récemment, unmarqueur STS a été développé à partir d’un marqueurAFLP lié au gène Lr19 de résistance à la rouille brune(Prins et al., 2001). Toutefois, tous les travaux précitésont reporté que la conversion des marqueurs AFLPn’est pas facile et que les problèmes liés à laconversion restent à élucider. Pour les marqueurs depetite taille, certains auteurs suggèrent une étapesupplémentaire qui consiste en une PCR inverse pourobtenir les séquences bordant les fragments


polymorphes détectés par l’AFLP (Brigneti e t a l .,1997 ; Bradeen, Simon, 1998). Tandis que pour lesmarqueurs de grande taille, si aucun polymorphismen’est détecté après amplification par les nouvellesamorces choisies, les fragments amplifiés pourraientêtre soumis à des digestions enzymatiques pourdétecter des RFLP à l’intérieur de ces fragments(Mohan et al., 1997 ; Helguera et al., 2000 ; Larocheet al., 2000 ; Venter, Botha, 2000). Prins et al. (2001)ont rapporté que les difficultés liées à la conversion demarqueurs A F L P en marqueurs PCR sont duesprincipalement à la présence de bandes contaminatrices.Ces auteurs suggèrent une étape de pré-clonage et de

vérification des clones pour réduire le nombre desfaux positifs et identifier le clone correct avant deprocéder à son séquençage.

3. APPORT DES MARQUEURSMOLÉCULAIRES À L’AMÉLIORATION DUBLÉ

L’essor des techniques de marquage moléculaire aucours des dernières années a induit des changementsconsidérables dans plusieurs branches de la biologie,notamment la biologie moléculaire (clonagepositionnel), la génétique évolutive (cartographie

Construction d’une banquegénomique ou d’ADNc

Développement de sondesS

Digestion de l’ADNgénomique par des

enzymes de restriction E

RR

rr

E ES

S

Électrophorèse sur geld’agarose et transfert surune membrane de nylon

Hybridation avec la sondemarquée

Autoradiogramme

RR rr Rr

RFLP

ADN génomique

Utilisation d’une seuleamorce P1 lors de

l’amplification par PCR

RR P1

P1rr

P1

Absence du site d’hybridationde l’amorce P1 (pas

d’amplification)

Électrophorèse sur geld’agarose

RR rr Rr

RAPD

ADN génomique

Digestion par 2 enzymesde restriction E1 et E2

Ligation d’adaptateurs A1 et A2

Amplification par PCR1) Pré-amplification par des

amorces P1 et P2

P1

P2A1RR

rrP1

A2

P2

2) Amplification sélective pardes amorces

P1 + NN et P2 + NN(NN: nucléotides arbitraires)

RR

rr

P1 + NN

P1 + NNNN + P2

Séquence noncomplémentaire des basesarbitraires bordant l’amorce

P2 (pas d’amplification)

Construction d’une banquegénomique

Séquençage des régionsmicrosatellites

Choix de 2 amorces P1 etP2 par locus à partir de la

séquence

Amplification par PCR

RR P1

rr P1 P2

P2

Électrophorèse sur gel depolyacrylamide

Électrophorèse sur gel depolyacrylamide

RR

RR

rr

rr

Rr

Rr

AFLP

microsatellites

Figure 1. Comparaison des principales techniques de marquage moléculaire — Comparison of main molecular markertechnologies.


comparative), la génétique quantitative (détection etidentification des locus contrôlant les caractèresquantitatifs (QTL)) et l’amélioration des espèces(sélection assistée par marqueurs).

Les marqueurs de l’ADN ont des applicationsimportantes en sélection, ils permettent d’une part, depositionner sur une carte génétique des gènes/QTLcodant pour des caractères d’intérêt et d’autre part, deles suivre dans un schéma de sélection.

3.1. Cartographie des gènes cibles

La localisation des gènes au sein d’un génome se faitsoit par étiquetage direct de régions particulières dugénome, soit par construction d’une carte génétique deliaison.

Étiquetage direct de la région cible. Cette stratégieest essentiellement limitée aux caractères monogéniquespuisqu’elle consiste en l’étiquetage d’une régionrestreinte du génome codant pour le caractère étudié.

En effet, le marquage de l’ensemble du génome lorsquel’on ne cherche des marqueurs que dans une région spéci-fique ne se justifie pas, et les chances de détecter dans cecas, des marqueurs liés au gène cible seront négligeables.

La localisation de ces gènes majeurs a été facilitéepar l’utilisation, dans un premier temps, de lignéesquasi-isogéniques (Muehlbauer e t a l ., 1988) puis,dans un second temps, de mélanges d’ADN (analysede ségrégations en mélange ou BSA : BulkedSegregant Analysis) (Michelmore et al. , 1991). Lapremière approche consiste à croiser l’hybride F1 issudu croisement de deux parents homozygotes et celuides générations suivantes au parent récurrent. Lacontribution génétique du parent donneur est ainsiréduite de moitié à chaque génération. Il en résulte unindividu d’une constitution génétique identique à celledu parent récurrent à l’exception du segmentchromosomique portant le gène d’intérêt (Figure 2).Ainsi, le polymorphisme détecté entre le parentrécurrent et les lignées quasi-isogéniques développéesest potentiellement lié au segment introgressé.

Parent donneur (R)ARAR

50 % (r): 50 % (R)100 % Hétérozygote

93,75 % (r): 6,25 % (R)Ségrégation

75 % (r): 25 % (R)Ségrégation

87,5 % (r): 12,5 % (R)Ségrégation

96,875 % (r): 3,125 % (R)Ségrégation

Parent récurrent (r)BrBr

Parent récurrentBrBr




Croisement

Croisement

Croisement

Croisement

Croisement

F 1

BC 1

BC 2

BC 3

BC 4

Sélection des R

Sélection des R

Sélection des R

BC n

1-(1/2) n+1 (r):(1/2) n+1 (R)≈BRBR

Figure 2. Principe de création de lignées quasi-isogéniques — Principle of near-isogenic lines production.


La BSA consiste, à partir d’une population enségrégation pour un gène majeur, à regrouper l’ADNdes individus de même phénotype (résistants ousensibles) et à comparer ces mélanges. Ainsi, àl’intérieur de chaque pool, les individus présenterontdes profils identiques pour la région cible qui contientle gène d’intérêt mais arbitraires pour les autresséquences non liées à cette région (Figure 3).

Établissement des cartes de liaisons génétiques.L’une des applications majeures des marqueursmoléculaires est la construction de cartes génétiquesqui peuvent être utilisées pour la localisation des gènesaffectant des caractères simples ou complexes. Cescartes sont développées en analysant un grand nombrede marqueurs dans une population en ségrégationissue de deux parents homozygotes. Les populationsde cartographie les plus couramment utilisées sont :les descendances F2 (F2), les populations issues deretro-croisements ou backcross (BC), les haploïdesdoublés (HD) et les populations de lignéesrecombinantes (LR).

Plusieurs cartes génétiques de liaison du blé tendreont été construites et publiées au cours des dernièresannées (Nelson et al., 1995a, b, c ; Van Deynze et al.,1 9 9 5 ; Marino e t a l ., 1996 ; Röder e t a l ., 1998 ;Mingeot, Jacquemin, 1999 ; Weng et al., 2000). Cescartes permettent de mettre en évidence des gènesimpliqués dans l’expression de caractères d’intérêt àdéterminisme simple ou polygénique.

Le tableau 1 rassemble les récentes publicationsdécrivant les liaisons mises en évidence entre desmarqueurs moléculaires et les principales résistancesmonogéniques du blé tendre, résistance à la mouche deHesse (Mayetiola destructor Say), au puceron russe(Diuraphis noxia Mordvilko), aux rouilles brune(Puccinia recondita Rob.), jaune (Puccinia striiformisWest.) et noire (Puccinia graminis Pers.), à l’oïdium(Erysiphe graminis Em. Marchal), aux caries (Tilletiatritici Bjerk. et T. laevis Kühn) et à la septoriose(Septoria tritici ex Desm.).

On peut distinguer pour certaines maladies, commel’oïdium et les rouilles brune et jaune, deux types derésistance : la résistance spécifique et la résistance nonspécifique.

La résistance spécifique est généralementmonogénique et dominante (Michelmore R., 1995).Elle s’exprime dès le stade plantule et se caractérisepar une très grande spécificité race/cultivar. Cetterésistance résulte d’une interaction spécifique entre ungène de résistance de la plante hôte et un gèned’avirulence du pathogène. Elle a l’inconvénientd’être rapidement surmontée par le pathogène et doncd’être peu durable.

La résistance non spécifique (appelée encorerésistance adulte) est caractérisée par la sensibilité desjeunes plantules mais la résistance des plantes adulteslorsqu’elles sont inoculées par un mélange de racesactuelles du pathogène. Cette résistance s’exprimedonc au stade adulte de certaines variétés et conduit àun ralentissement du développement de la maladie.Ces variétés conservent généralement un bon niveaude résistance durant plusieurs années de culture endifférents lieux. Cette résistance a été détectée chez lescultivars de blé qui ne possèdent aucun gène majeurconnu ou ayant des gènes majeurs devenus inefficaces.Bien que la génétique de la résistance non spécifique,soit principalement quantitative, Börner et al. (2000)ont rapporté que des gènes majeurs uniques peuventêtre impliqués dans cette résistance. En effet, cesauteurs ont montré dans leur étude que la résistanceadulte à la rouille jaune est contrôlée par un seul gènemajeur Yrns-B1 localisé sur le chromosome 3BS. Lenombre de gènes majeurs impliqués dans lesrésistances adultes aux maladies qui sont biencaractérisés (Lr12, Lr13, Lr34, Lr35, Lr46, Yr18,Yr28, Yrns-B1, Sr2, Sr22) reste faible en comparaisonavec les gènes à résistance spécifique. D’autresauteurs ont montré que la résistance adulte à l’oïdiumet à la rouille brune est gouvernée par 2 à 3 gènes àe ffets additifs prédominants (Keller e t a l ., 1999 ;Messmer et al., 2000 ; Liu SX. et al., 2001).

Contrairement aux caractères à déterminismesimple, les caractères quantitatifs polygéniques sontsoumis aux influences conjointes de différents facteursgénétiques (QTL) et de facteurs environnementaux.

Parents F1 Pools F2

RR rr Rr (R) (r)

A

B

C

D

A

B

C

D

A

B

C

D

A

B

C

D

RR Rr rr

Individus F2 (R) Individus F2 (r)

Figure 3. Principe de la méthode BSA appliquée sur unepopulation F2 en ségrégation pour le gène de résistanceR/sensibilité r (Michelmore et al., 1991). La bande épaissecorrespond au locus dominant lié à l’allèle de résistance —Principle of BSAapplied to a F2 population segregating forresistance R/susceptibility r gene (Michelmore et al., 1991).The thick band shows the dominant locus linked to theresistant allele.


Tableau 1. Exemples de gènes majeurs de résistance aux maladies et aux insectes cartographiés au cours des cinq dernièresannées, au moyen des marqueurs moléculaires chez le blé tendre — Recent publications describing the association ofmolecular markers linked with pest and disease resistance major genes in bread wheat.

Caractère Gènes de Nombre et Type Localisation Type de Référencesrésistance de marqueurs chromosomique population

Résistance H3 1 RAPD 5A (Liso) Dweikat et al., 1997à la mouche H5 2 RAPD 1A “ “de Hesse H6 3 RAPD 5A “ “

H9 2 RAPD 5A “ “H10 2 RAPD 5A “ “H11 2 RAPD 1A “ “H12 2 RAPD 5A “ “H13 1 RAPD 6D “ “H14 1 RAPD 5A “ “H16 1 RAPD 5A “ “H17 1 RAPD 5A “ “H21 1 RAPD 2RL “ Seo et al., 1997

Résistance au Dn1 1 SSR 7DS (Liso) et (F2) Liu XM. et al., 2001puceron russe Dn2 1 RFLP 7DL (F2) Ma et al., 1998

4 RAPD / 2 SCAR “ (Liso) et (F2) Myburg et al., 1998 RAPD “ (F2) Venter et al., 19981 SSR 7DS (Liso) et (F2) Liu XM. et al., 20011 SSR 7DS (F2) Miller et al., 2002

Dn4 1 RFLP 1DS (F2) Ma et al., 19981 RFLP 1DS (F2) Liu XM. et al., 2001SSR 1DS (F2) Liu XM. et al., 2002

Dn5 3 RAPD 7DS (F2) Venter et al., 1998 RAPD/ SCAR “ (Liso) et (F2) Venter, Botha, 2000PCR-RFLP “ (F2) Venter, Botha, 20001 SSR 7DS (Liso) et (F2) Liu XM. et al., 2001

Dn6 SSR 7DS (F2) Liu XM. et al., 2002Dn8 1 SSR 7DS (Liso) et (F2) Liu XM. et al., 2001Dn9 1 SSR 1DL (Liso) et (F2) “

Résistance à la Yr10 RFLP 1BS (Liso) Spielmeyer et al., 2000rouille jaune Yr15 1 RFLP 1BS (Liso) Sun et al., 1997

1 RAPD 1B (Liso) “1 SSR 1B (Liso) Fahima et al., 1997SSR/ RAPD 1B (Liso) Chague et al., 1999

Yr17 1 RAPD/1 SCAR 2A (Liso) Robert et al., 1999Yr18 (APR) RFLP 7DS (LR) Singh et al., 2000Yr26 3 SSR 1BS (F2) Ma et al., 2001Yr28 (APR) RFLP 4DS (LR) Singh et al., 2000YrH52 SSR 1B (F2) Peng et al., 1999, 2000

1 RFLP 1B (F2) Peng et al., 1999Yrns-B1 (APR) SSR 3BS (F3) Börner et al., 2000

Résistance à la Lr3 1 RFLP 6BL (F2) Sacco et al., 1998rouille brune Lr10 1 RFLP 1AS cartographie Nelson et al., 1997

1 STS 1AS (Liso) Schachermayr et al., 1997Lr13 (APR) 3 RFLP, 3 SSR 2B (F2) Seyfarth et al., 1998Lr19 AFLP/1STS 7DL délétion/

recombinaison Prins et al., 2001Lr21 RFLP 1DS (Liso) Spielmeyer et al., 2000Lr23 2 RFLP 2BS (Liso) Nelson et al., 1997Lr27 2 RFLP 3BS (F2) Nelson et al., 1997


L’analyse de la variance et la cartographie d’intervalle(Lander, Botstein, 1989) sont les méthodes statistiquesles plus utilisées pour la mise en évidenced’associations entre les locus polymorphes et lecaractère étudié. Des exemples récents d’associationsentre des marqueurs moléculaires et des locusimpliqués dans l’expression de certains caractèresquantitatifs (QTL) chez le blé tendre telle que larésistance aux rouilles brune (Puccinia recondita Rob.ex Desm.) et jaune (Puccinia striiformis West.), àl’oïdium (Erysiphe graminis Em. Marchal), à la tachebronzée (Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechs.)et à la fusariose (Fusarium graminearum Schwabe)

sont présentés au tableau 2. Ces travaux concernentles résistances quantitatives polygéniques où unebonne partie de la variation phénotypique estexpliquée par la ségrégation de quelques QTL à effetsmajeurs.

Dans le cas de la rouille brune, plusieurs régionsgénomiques du blé impliquées dans l’expressionquantitative de la maladie portent également des gènesLr spécifiques (Messmer et al., 2000). Ces auteurs ontsuggéré que le QTL identifié sur le chromosome 2BSpourrait être allélique au gène Lr13 de résistanceadulte à la rouille brune cartographié dans la mêmerégion par Seyfarth et al. (1998). De même pour le

Tableau 1. Suite — continued.

Caractère Gènes de Nombre et Type Localisation Type de Référencesrésistance de marqueurs chromosomique population

Lr28 1 RAPD/1 STS (F3) Naik et al., 1998Lr31 2 RFLP 4BL (F3) Nelson et al., 1997Lr34 (APR) 1 RFLP 7DS cartographie Nelson et al., 1997

3 RFLP, RAPD 7BL, 1DS (LR) William et al., 1997Lr35 (APR) 3 RFLP/ 1STS 2B (F2) Seyfarth et al., 1999Lr39 3 SSR 2DS (F2) Raupp et al., 2001Lr47 1 PCR 7A (BC) Helguera et al., 2000LrTr SSR 4BS (F2) Aghaee-Sarbarzeh e ta l ., 2001

Résistance Sr2 (APR) 1 STS 3B lignées en Bariana et al., 1998durable à la sélectionrouille noire 2 RFLP 3BS, 6DS (LR) Johnston et al., 1998

Résistance Pm 1 RFLP 2B (LR) Rong et al., 1998à l’oïdium Pm1 1 RFLP 7AL (Liso) Jahoor, 1998

1 RAPD/STS 7AL (Liso) Hu et al., 1997Pm1c 1 AFLP 7AL (Liso) Harlt et al., 1999Pm4a 1 AFLP 2AL (F3) Hartl et al., 1999Pm4a & Pm4b 1 STS 2AL (F2) Liu DJ. et al., 1998Pm4b 6 AFLP 2AL (HD) Hartl et al., 1998Pm6 3 RFLP 2B (Liso) Liu DJ. et al., 1998

RFLP 2BL (Liso) Tao et al., 2000Pm13 RAPD, RFLP, STS 3B, 3D (LR) Cenci et al., 1999Pm21 RAPD/2 SCAR 6AL/ 6VS (F2) Liu et al., 1999Pm24 2 AFLP , 3 SSR 1DS (F2) Huang et al., 2000Pm26 RFLP 2BS (F2) et (LR) Rong et al., 2000MIRE SSR 6AL (F3) Chantret et al., 2000

Résistance aux Bt-10 1 PCR (F2) Laroche et al., 2000caries (Tilletia Bt-11 1 RAPD (F4, F5) Linott et al., 1998tritici et T. laevis)

Résistance à 1 AFLP non déterminée (LR) Goodwin et al., 1998la septoriose(Septoria tritici)

(Liso) = Lignées quasi-isogéniques — Near-isogenic lines; (F2) et (F3) = Les descendances F2 et F3 respectivement — F2 and F3 progenyrespectively; (HD) = Les haploïdes doublés — Doubled haploid lines; (LR) = Les populations de lignées recombinantes — Recombinantinbred lines; (BC) = Les populations issues de rétro-croisements ou backcross — Backcross populations; (APR) = Gène de résistanceadulte — Adult plant resistance gene.


QTL détecté dans la région chromosomique 7DScontenant le gène de résistance adulte Lr34. Ces deuxlocus (le QTL et le gène Lr34) expliquent 45 % de lavariation phénotypique pour la résistance à cettemaladie (Nelson et al., 1997). Toutefois, des travauxsupplémentaires seront nécessaires pour vérifier si cesco-localisations sont dues au fait que le QTLet le gènene sont que des formes alléliques d’un même locus ouau fait que le gène et le QTL sont étroitement liés.

Des QTL impliqués dans la résistance adulte à larouille jaune ont été récemment identifiés en utilisantdeux populations de lignées recombinantes de blé(Boukhatem et al., 2002). Ces auteurs ont mis en reliefl’importance de la région centromérique duchromosome 2B et télomérique des chromosomes2AL et 7DS dans la résistance durable à la rouillejaune.

D’un autre côté, 18 Q T L impliqués dans larésistance adulte à l’oïdium, distribués sur tout legénome du blé et expliquant 77 % de la variationphénotypique ont été détectés (Keller et al., 1999).Deux QTL à effet majeur ont été maintenus dans lescinq environnements étudiés, dont un correspond au

locus Pm5 situé sur le chromosome 7B. Le deuxièmeQ T L est situé sur le chromosome 5A mais necorrespond à aucun gène Pm connu. Trois autres QTLlocalisés sur les chromosomes 1B, 2A et 2B etexpliquant 17, 29 et 11 % respectivement de lavariation totale de lignées de blé pour la résistanceadulte à l’oïdium ont été identifiés (Liu SX. et al.,2001). Chantret et al. (2001) ont détecté un QTLmajeur impliqué dans la résistance à l’oïdium situé surle chromosome 5D, stable dans tous lesenvironnements testés et aux deux stades (adulte etplantule) de développement de la plante. De même,Mingeot et al. (2002) ont détecté deux QTL communsaux deux fonds génétiques de populations d’haploïdesdoublés de blé utilisés ; un QTL situé sur lechromosome 5D et un autre localisé au locus MIRE(6A).

Cinq types de résistance à la fusariose ont étédécrits chez le blé. La résistance de type II quicorrespond à la résistance à la propagation de lamaladie dans l’épi est la mieux étudiée. Plusieurs QTLmajeurs de résistance à cette maladie ont été identifiéset cartographiés (Kolb et al., 2001 ; Buerstmayr et al.,

Tableau 2. Exemples de QTL de résistance aux maladies cartographiés, au cours des cinq dernières années, au moyen desmarqueurs moléculaires chez le blé tendre — Recent publications describing the association of molecular markers withdisease resistance QTL in bread wheat.

Caractère Nombre et Type Localisation Type de Référencesde marqueurs chromosomique population

Résistance à RFLP 7DS, 7BL cartographie Nelson et al., 1997la rouille brune RAPD 7BL, 1DS ou 1BS (LR) (F8) William et al., 1997

3 RFLP, 3 SSR 2B (F2) Seyfarth et al., 19981 RFLP/1 STS 2B (F2) Seyfarth et al., 1999

Résistance à RFLP, SSR 2B, 7D, 5A, 3D, 6D (LR) Boukhatem et al., 2002la rouille jaune RFLP, SSR 2B, 2A (LR) Boukhatem et al., 2002Résistance 2 SSR, 2 RFLP non déterminée (F3) Liu SX. et al., 1998à l’oïdium RFLP, SSR 5A, 7B (LR) Keller et al., 1999

SSR 5D, 6A (F3) Chantret et al., 2000RFLP, SSR 5D, 4A, 6A (HD) Chantret et al., 2001RFLP, SSR 5D, 4A, 6A, 7A, 7B F2: F3 “RFLP, SSR 1B, 2A, 2B (LR) Lui SX. et al., 2001RFLP, SSR 4A, 5D, 6A (HD) Mingeot et al., 2002RFLP, SSR 2B, 5D, 6A, 1A, 2A, 3A, 7B (HD) Mingeot et al., 2002

Résistance à la RFLP 1AS/2DL, 4AL, 4AS, 3BL, (LR) Faris et al., 1997tache bronzée 1BL, 2DL et 1AS/2DL

RFLP 1AS (LR) Effertz et al., 1998Résistance à la RAPD 5AL (HD) Ban, Suenaga, 1997fusariose 1 AFLP 3BS (F2) Anderson et al., 1998

4 RFLP 2AL, 6BS, 4AL, 6BS (F2) “11 AFLP non déterminée (LR) Bai et al., 1999RFLP 3BS, 6BS, 4BS, 2AL (LR) (F5) Waldron et al., 1999AFLP, RFLP, SSR 3AL, 6AS (LR) Anderson et al., 2001SSR , AFLP 3BS, 5A, 1B (HD) Buerstmayr et al., 2002

(F2) et (F3) = Les descendances F2 et F3 respectivement — F2 and F3 progeny respectively; (HD)= Les haploïdes doublés — Doubledhaploid lines; (LR) = Les populations de lignées recombinantes — Recombinant inbred lines.


2002). La majorité des études ont détecté au moins unQTL porté par le chromosome 3BS, ce qui pourraitsuggérer que ce chromosome porte un gène à effetmajeur pour la résistance à la fusariose (Waldronet al., 1999 ; Anderson et al., 2001 ; Buerstmayr et al.,2002).

Les gènes majeurs et/ou les QTL m a j e u r simpliqués dans la résistance adulte ou polygéniquepeuvent être combinés avec les gènes majeursspécifiques via la sélection assistée par marqueursdans le but de créer des variétés avec des niveaux derésistance élevés et efficaces pour une longue période.

3.2. Clonage des gènes

La localisation des gènes dans une carte de liaison, viales marqueurs moléculaires, offre une stratégiealternative de clonage de gènes contrôlant lescaractères désirés et dont seul le phénotype est connu(Tanksley et al., 1989 ; Michelmore RW., 1995) : onparle de clonage positionnel. Il consiste à isoler ungène à partir de marqueurs qui lui sont étroitementliés. Cette stratégie implique l’utilisation combinéed’une carte fine du fragment d’ADN contenant le gènecible et des outils moléculaires pour approcher le gènecible et le cloner sans connaître son produit. Elle a étéappliquée avec succès pour isoler plusieurs gènes derésistance chez différentes espèces végétales (Mohanet al., 1997 ; Lukowitz et al., 2000).

Le clonage positionnel est particulièrementd i fficile pour l’isolation de locus impliqués dansl’expression de caractères quantitatifs (QTL).Cependant, durant les deux dernières années, desétudes séparées ont publié l’isolation v i a c e t t eapproche, de QTL impliqués dans le contrôle de lataille et du contenu en sucre chez la tomate (Fw2.3,Brix9-2-5), du temps de floraison chez l’Arabidopsis(FRI) et de la date d’épiaison chez le riz (Hd1 et Hd6)(Remington e t a l ., 2001). Étant donné que cetteapproche est lourde et longue à appliquer dans lesgénomes complexes, elle est souvent associée à uneapproche de cartographie comparée (clonage du gènehomologue du gène recherché dans une espèce voisineà génome simple) ou clonage d’analogues de gènes derésistance/gènes candidats.

Analogues de gènes de résistance. Les gènes derésistance aux maladies déjà clonés à partir du génomede différentes espèces végétales montrent une fortehomologie de séquences ainsi que la conservationd’un certain nombre de motifs structuraux. Cesséquences sont réparties en 4 classes sur la base desd i fférentes associations des domaines conservés(LRR, NBS, Tir et Ser/Thr Kinase) au sein desproduits de gènes R (Hammond-Kosack, Jones, 1997).

Le domaine Sérine/Thréonine kinase (Ser/Thr kinase)peut se présenter seul, c’est le cas par exemple desproduits des gènes Pto et Fen chez la tomate, ouassocié à un domaine riche en leucines (LRR, leucine-rich repeat) comme c’est le cas du produit du gèneXa21 chez le riz. La classe LRR est représentée par lesgènes Cf2, Cf4, Cf5 et Cf9 de la tomate. La classeNBS-LRR caractérisée par la présence d’un site deliaison nucléotidique (Nucleotide Binding Site, NBS)et d’un domaine riche en leucines (LRR) estreprésentée par les produits des gènes RPM1 et RPS2d’Arabidopsis, du gène L du lin et du gène Cre3 quiconfère la résistance aux nématodes à kyste(Heterodera avenae Woll.) chez le blé. Le gène Hm1qui contrôle à la fois la résistance au champignonpathogène (Cochliobolus carbonum Nelson) race 1 etl’expression d’une toxine réductase chez le maïsn’appartient à aucune de ces quatre classes. Cestravaux ont été repris dans plusieurs revues desynthèse (Mohan et al., 1997 ; Langridge et al., 2001).

La classe NBS-LRR constitue la principale classede gènes clonés jusqu’à présent (Martin, 1999). Lesséquences adjacentes à cette classe sont conservées etpermettent de définir des amorces PCR consensuspour l’amplification d’analogues de gènes derésistance (RGA : Resistance Gene Analogs) étudiés(Leister et al., 1999 ; Seah et al., 1998 ; Collins et al.,2001). La plupart de ces RGA sont organisés enclusters et co-localisés avec des gènes de résistanceconnus (Spielmeyer et al., 1998 ; Rivkin et al., 1999 ;Seah et al., 1998). Ces RGA ont été employés commesondes afin d’identifier et de localiser ces locus chez leblé. Ces locus étaient situés sur l’ensemble des septgroupes de chromosomes homéologues du blé(Spielmeyer et al., 1998).

Le polymorphisme d’analogues de gènes derésistance (RGAP) a permis la cartographie deplusieurs gènes de résistance aux maladies chez le blé,notamment les gènes Yr9, Yr10 et Yr17 de résistance àla rouille jaune (Spielmeyer et al., 2000 ; Seah et al.,2001 ; Shi et al., 2001), les gènes Lr21, Lr37 et Lr 40de résistance à la rouille brune (Spielmeyer et al.,2000 ; Huang, Gill, 2001 ; Seah et al., 2001) et desgènes de résistance aux nématodes à kystes (Seahet al., 2000 ; Ogbonnaya et al., 2001a).

Cette approche de cartographie des RGA ouvrepotentiellement la voie à l’identification de gènes derésistance chez le blé.

Gènes candidats. Pour certains caractèresquantitatifs, l’étiquetage des gènes est plus facilementréalisable par la stratégie de “gènes candidats” que parle clonage positionnel. Cette stratégie consiste àcartographier des séquences d’ADN caractériséescomme susceptibles d’intervenir dans les mécanismesphysiologiques régissant le caractère étudié. Ces


séquences peuvent rendre compte de l’effet de certainsQTL et remplacer, après validation, le marqueur lié auQTL. Faris et al. (1999) ont rapporté l’intérêt de cetteméthode pour l’identification de QTL impliqués dansles résistances à certaines maladies polygéniquescomme la tache bronzée, les rouilles brune et noire etles caries.

Jusqu’à aujourd’hui, aucun gène de résistance n’aété isolé à partir du génome du blé bien que des gènescandidats codant pour la résistance aux nématodes àkystes (Lagudah et al., 1997) et aux rouilles noire(Frick et al., 1998) et brune (Feuillet et al., 1997) aientété identifiés.

Les premiers exemples publiés de gènes candidatsqui pourraient correspondre à des QTL sont les gènesSh2 intervenant dans la synthèse de l’amidon dans legrain et Sh1 contrôlant le clivage du saccharose englucose et fructose chez le maïs (Goldman et al.,1993 ; Causse et al., 1995).

3.3. Comparaison des cartes de liaisons génétiques

La génétique comparative constitue l’une des voiesqui permet de mieux comprendre le génome du blé etson évolution. Bien que les génomes des différentesespèces céréalières diffèrent par leur taille, leur niveaude ploïdie et leur nombre de chromosomes, lacomparaison des cartes génétiques des plantesmodèles comme le riz et d’autres céréales a montréune grande similitude de la structure du génome et uneconservation de l’ordre des gènes sur leschromosomes, un phénomène appelé synténie oucolinéarité (Gale, Devos, 1998). De fortes similitudesont été observées entre le génome du blé et celui du riz(Kurata et al., 1994). D’autres études ont montré deshomologies entre les génomes du blé tendre et d’autrescéréales comme le maïs (Devos et al., 1994) et l’orge(Dunford et al., 1995). Une carte consensus a étéconstruite en comparant le génome de plusieursespèces de graminées : le blé, l’orge, le maïs, le riz,l’avoine, le millet, le sorgho et la canne à sucre (Gale,Devos, 1998). Plus récemment, l’utilisation de sondesappartenant à différentes classes d’analogues de gènesde résistance (RAG) dans la cartographie des génomesdu blé et de l’orge a montré une conservation deslocalisations des RAG orthologues chez les deuxcéréales (Collins et al., 2001).

Cette homologie des séquences d’ADN au sein desd i fférentes espèces permettrait l’étude de régionsspécifiques d’une espèce au moyen des marqueursmoléculaires déjà localisés chez les autres espèces. Lacartographie comparée chez les céréales peut être trèsutile, notamment pour les espèces à génome complexecomme le blé. Ainsi est apparue l’idée du séquençageintégral du génome du riz, plante modèle des Poacées(Goff et al., 2002 ; Yu et al., 2002). Ces résultats

permettent de dresser un inventaire de l’ensemble desgènes du riz pour étudier leur organisation, leursfonctions, leurs régulations et leurs interactions (c’estla génomique), et de rechercher les gènes ayant lamême fonction dans des espèces différentes grâce auxoutils de la bioinformatique. Il devient alors possiblede transférer les connaissances acquises sur une plantesimple comme le riz aux espèces à génome complexeau travers du développement de marqueurs génétiquesconsensus.

Les premières analyses comparatives desséquences d’ADN ont montré que la colinéarité entreles génomes des graminées est bien maintenue auniveau moléculaire (micro-colinéarité). La micro-colinéarité a été vérifiée entre les génomes du blé et del’orge au niveau de locus codant pour les analoguesdes récepteurs des kinases (Feuillet, Keller, 1999).Toutefois, certaines études ont montré qu’à l’intérieurde ces régions colinéaires, différents réarrangementscomme les délétions et/ou translocations de petitsfragments d’ADN, l’inversion d’un gène ou saduplication, ou la combinaison de tous cesréarrangements, peuvent apparaître (Bennetzen,2 0 0 0 ; Feuillet, Keller, 2002). Si les micro-réarrangements (petites inversions et duplications d’ungène) peuvent être sans effet sur la micro-colinéarité,les délétions et les translocations peuvent, par contre,compliquer amplement les analyses. À titre d’exemple,l’insertion d’un fragment d’ADN de 10-15 kb auvoisinage du gène rpg1 de résistance à la rouille noirechez l’orge est à l’origine de la perte de micro-colinéarité entre ce gène et la région orthologue chezle riz (Kilian et al., 1997). Ainsi, l’utilisation du rizcomme plante modèle pour l’isolation de gènes àpartir d’autres espèces de graminées pourrait êtrecompliquée par ces réarrangements locaux.

Plusieurs travaux récents (Devos, Gale, 2000 ;Bennetzen, 2000 ; Feuillet, Keller, 2002 ; Laurie,Devos, 2002) ont été consacrés à la génétiquecomparative et ont montré l’intérêt de ces études pourla compréhension de l’organisation et de l’évolutiondu génome des graminées.

3.4. Intérêt des marqueurs moléculaires ensélection

Outre leurs intérêts fondamentaux, les marqueursmoléculaires suscitent un grand intérêt dans ledomaine de la sélection (Hernandez, 1999 ; Eagleset al., 2001 ; Moreau et al., 2001 ; Dekkers, Hospital,2002). Le développement considérable des marqueursmoléculaires au cours des dernières décennies apermis une meilleure compréhension du génome deblé et la cartographie de plusieurs dizaines de locusliés aux résistances aux maladies et insectes. Leprochain défi auquel seront confrontés les


sélectionneurs est l’application de ces marqueurs dansdes programmes de sélection. L’utilisation d’unmarqueur moléculaire dans un programme desélection doit passer d’abord par sa validation, enexaminant le polymorphisme détecté dans différentsfonds génétiques et par l’évaluation du rapportefficacité attendue/coûts occasionnés.

La sélection assistée par marqueurs est basée sur lapossibilité d’inférer la présence d’un gène par la re-cherche du marqueur qui lui est étroitement lié. Cettesélection est particulièrement avantageuse lorsque legène cible est récessif et/ou lorsque son expression esttardive ou influencée par les conditions de l’environ-nement. Elle est également justifiée lorsque les testsd’infection sont fastidieux et/ou coûteux et lorsquel’importation du pathogène comporte un risque.

Les perspectives d’application des marqueursmoléculaires en sélection sont nombreuses.

Construction de génotypes assistée par marqueurs.L’un des objectifs majeurs du sélectionneur estd’intégrer, dans un même génotype, différents gènesmajeurs/QTL à valeur agronomique, provenant deplusieurs lignées élites. L’accumulation, v i a l e smarqueurs moléculaires, des différents gènes/QTLfavorables dans un même génotype permet de créerdes variétés stables et performantes. Cette approchepermet un gain de temps considérable par rapport auxméthodes classiques de rétro-croisement.

Très peu de travaux visant à regrouper l’ensembledes allèles favorables des QTLà l’intérieur d’un mêmegénotype ont été effectués. Le premier exemple publiéconcerne l’amélioration du rendement en grain dumaïs par introgression d’allèles favorables dans desvariétés élites (Stuber, Sisco, 1993). Plus récemment,Yousef et Juvik (2002) ont rapporté l’efficacité desmarqueurs moléculaires pour l’identification etl’introgression de QTL favorables pour l’améliorationgénétique du maïs.

Sélection contre le fonds génétique du pare n tdonneur. Outre leur intérêt pour contrôler les gènesm a j e u r s / Q T L introgressés, les marqueurs moléculairespeuvent permettre d’accélérer le retour au fondsgénétique du parent récurrent et limiter la taille dessegments introgressés lors d’un programme de rétro-croisement (Hospital, 2001). À chaque génération, lesmarqueurs peuvent être utilisés d’une part, pouridentifier les individus porteurs des allèles favorablesaux gènes/QTL considérés et d’autre part, pour choisirparmi ces individus celui qui présente le plus deressemblance avec le parent récurrent pour le reste dugénome.

Pyramidage des gènes. Un autre domaine d’intérêtdes marqueurs moléculaires dans l’amélioration des

plantes aux résistances aux maladies et insectes est lepyramidage de plusieurs gènes de résistance au mêmepathogène ou insecte dans une seule variété (Tanksleye t a l ., 1989). Avec le développement rapide denouveaux biotypes, les méthodes traditionnelles de lasélection deviennent lourdes et compliquées lorsquedeux gènes ou plus sont à identifier simultanément. Lecumul de plusieurs gènes de résistance dans un seulcultivar, via les marqueurs moléculaires, permettraitl’obtention d’une résistance multigénique que l’onpeut espérer être difficilement contournée par lepathogène ou l’insecte.

L’utilisation des marqueurs moléculaires dans lesprogrammes de sélection, via MAS, est encore à sesdébuts. Quelques exemples peuvent néanmoins êtrementionnés, notamment le travail de Dweikat et al.(1997) qui ont pu suivre le pyramidage dans desvariétés de blé sensibles à la mouche de Hesse desgènes de résistance H5 et H11 d’une part, et des gènesH 9 et H 1 6 d’autre part, grâce à l’utilisation demarqueurs moléculaires associés à chacun des gènesutilisés. Plus récemment, Liu et al. (2000) ont pu, de lamême manière, pyramider les trois gènes Pm2, Pm4aet Pm21 de résistance à l’oïdium dans des variétés deblé. D’autres travaux ont confirmé la validité demarqueurs liés à des gènes de résistance à l’oïdiumchez le blé après leur transfert dans différents fondsgénétiques et ont pu exploiter ces marqueurs avecsuccès dans les programmes d’amélioration du blépour la résistance à cette maladie (Hartl et al., 1995 ;Liu et al., 1997). Par ailleurs, une population de blé enségrégation pour deux gènes de résistance auxnématodes à kystes a été évaluée par trois marqueursmoléculaires. L’utilisation de ces marqueurs dans lesprogrammes d’amélioration du blé pour la résistanceaux nématodes à kystes a montré une grande fiabilitéque ce soit lors de la sélection des plantes portant cesgènes ou lors du pyramidage de ces gènes dans unemême variété (Ogbonnaya et al., 1998 ; 2001b). Lemême travail serait très difficile, voire impossible,avec les méthodes de sélection phénotypique.

4. CONCLUSION

Les efforts de recherche sur le blé tendre sont à lamesure de l’importance économique de cette culture.En effet, malgré le faible polymorphisme observé et lataille et la complexité du génome du blé tendre, descartes génétiques ont été élaborées et plusieurscaractères ont été étiquetés en utilisant les différentestechniques de marquage moléculaire.

Aujourd’hui, avec le marquage moléculaire, denouvelles perspectives s’ouvrent pour le sélectionneur.La mise en évidence de marqueurs moléculaires liés àdes gènes de résistance aux maladies et insectes dans


des lignées de blé tendre en cours de sélection, ouservant de parents potentiels dans les croisements,permet d’intervenir précocement au niveau d’unschéma de sélection. Cette sélection permettra desconstructions de génotypes qui sont diff i c i l e m e n tréalisables par la sélection phénotypique. De plus,dans la sélection classique, les effets des gènespeuvent être masqués lors de l’accumulation defacteurs de résistance à une même maladie et lephénotype ne permet donc pas le choix, avec certitude,de la combinaison de gènes souhaités.

Cependant, les interactions potentielles entre lesQTL et les conditions de l’environnement et/ou lefonds génétique réduisent l’efficacité de la sélectionassistée par marqueurs (MAS) pour l’amélioration descaractères quantitatifs (Young, 1999 ; Moreau et al.,2001 ; Dekkers, Hospital, 2002).

Par ailleurs, la création de variétés résistantes pardes rétro-croisements assistés par marqueurs est uneméthode qui reste économique et écologique et neprésente, contrairement aux organismes génétiquementmodifiés (OGM), aucun risque ni problème éthiqueconcernant leur acceptabilité puisque les ressourcesgénétiques sont utilisées depuis le début de lasélection.

Les marqueurs moléculaires ont déjà fait leurpreuve de robustesse et de précision pour l’étiquetageet la cartographie de caractères d’intérêt chez lesplantes, particulièrement chez le blé. Toutefois, bienque leur utilisation devienne une réalité, la maîtrise ducoût de marquage constitue encore un défi pourbeaucoup d’utilisateurs. Ce coût peut être réduit d’unepart, par la simplification et la robotisation destechniques de marquage moléculaire et d’autre part,par l’intégration d’outils de génomique développéschez le riz, plante modèle pour lesmonocotylédones/céréales et de bioinformatique quipermettent d’analyser les séquences des gènes chezcette plante simple, et de rechercher les gènes ayant lamême fonction dans des espèces différentes.

Le développement de nouvelles technologiescomme les SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)(Rafalski, 2002a, b) qui permettent la recherche etl’exploitation du polymorphisme au nucléotide prèsouvre de nouvelles voies d’applications pour lagénétique végétale. Ces techniques s’avèrent trèsprometteuses pour les utilisations à grande échelle etpeuvent être considérées comme les marqueursmoléculaires de demain (Gupta et al., 2001 ; Rafalski,2002a, b).

Ces nouvelles approches (génomique, bioinfor-matique, SNP) ainsi que l’accès aux banques deséquences EST (Expressed Sequence Tags) peuventaccélérer la cartographie génomique et l’étiquetagedes gènes chez les cultures à génome complexecomme le blé tendre.

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Applications des marqueurs moléculaires dans l'amélioration du blé