Ingegneria genetica Ingegneria genetica e e

applicazioni del DNA ricombinanteapplicazioni del DNA ricombinante

Ingegneria genetica Ingegneria genetica e e

applicazioni del DNA ricombinanteapplicazioni del DNA ricombinante

Le Biotecnologie sono un insieme di tecniche che utilizzano organismi viventi (batteri, lieviti, cellule vegetali, cellule animali) o componenti subcellulari

BIOTECNOLOGIE TRADIZIONALI: utilizzano le proprietà dei microrganismi per la fermentazione di cibi e bevande

BIOTECNOLOGIE INNOVATIVE: trasmissione di caratteri anche tra organismi di specie diverse, modificando il loro patrimonio genetico

Processo di lievitazione:

- Naturale- Chimico - Di birra

Lievitazione: aumento di volume per azione dei gas durante la fermentazione dovuta

al lievito.

L’anidride carbonica prodotta induce un aumento di volume dell’impasto, che viene

contrastato dalla struttura glutinica della farina che, essendo elastica, si oppone

all’espansione del gas di anidride carbonica, racchiudendolo all’interno degli alveoli.

Con questo processo si ottiene un impasto poroso che, durante la cottura in forno, si

trasforma in prodotto morbido e soffice, conservando a lungo queste qualità che sono

la caratteristica dei prodotti ottenuti con le paste lievitate.Bicarbonato di sodio, bicarbonato di

ammonio…Fermentazione delle melasse:monocoltura pura di

S.cerevisiae

Pasta acida: miscela eterogenea di lieviti e batteri

lattici

La preparazione dei derivati del latte si basa sull'utilizzo dei batteri lattici.

Nella produzione dei formaggi intervengono due passaggi fondamentali: la coagulazione delle proteine del latte e la successiva maturazione per i formaggi semi-stagionati e stagionati.

La coagulazione avviene grazie ad un enzima, la rennina, estratto dallo stomaco dei vitelli, che caglia il latte.

La cagliata è sottoposta poi a maturazione in centinaia di modi differenti, che consentono di produrre i diversi formaggi.

Formaggio giovane

Proteine intatte amminoacidi ammoniaca ammine Acidi grassi

Formaggio stagionato

Batteri e funghi

Formaggi a pasta dura

Formaggi teneri

Nella preparazione del burro occorre separare il grasso dalla panna; per far ciò è necessaria una iniziale acidificazione della panna ad opera dei batteri lattici (streptococchi). Questi batteri producono anche piccole quantità di acetoina, una proteina che si ossida spontaneamente e forma il diacetile, un composto che conferisce al burro un odore gradevole.

Poichè ceppi diversi di streptococco danno diversi tipi di acetoina nella produzione del burro è pratica comune quella di inoculare la panna pastorizzata con colture selezionate di streptococco.

Yogurt: viene prodotto inoculando il latte con colture selezionate di batteri lattici: Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophilus.

La fermentazione determina:

Lattosio

galattosio

glucosio Acido piruvico Acido lattico, responsabile dell’acidità e della parziale coagulazione del latte (consistenza cremosa)

La produzione di vino si basa sulla fermentazione di zuccheri (glucosio e fruttosio) presenti nel succo d'uva ad opera di lieviti.

S. cerevisiae è il ceppo di lievito utilizzato per fermentare gli zuccheri del mosto in etanolo e anidride carbonica e non viene inibito dalle concentrazioni di solfito impiegato per inibire la crescita di altri microorganismi.

Temperatura di fermentazione:21°-24°C.

La fermentazione dura 3-5 giorni

I lieviti contribuiscono direttamente ed indirettamente alle caratteristiche aromatiche di un vino.

In natura esistono diversi generi di lievito; quelli appartenenti alle specie S. cerevisiae e S. bayanus possiedono una serie di caratteristiche enologiche positive e pertanto si considerano buoni fermentatori.Tuttavia, sulla superficie delle uve queste due specie sono poco presenti (10/100 ufc/g), mentre prevalgono altri generi di lievito potenzialmente dannosi per la qualità del vino.

Dall'analisi del genoma della vite è emerso che la pianta contiene meno geni rispetto ad altre sequenziate finora come il riso e che possiede molte grandi famiglie di geni che corrispondono e sono responsabili delle caratteristiche organolettiche del vino (sono i geni coinvolti nel metabolismo di tannini e terpeni che danno aroma e sapore al vino).

Dalla disamina del DNA della vite è emerso che ci sono ben 43 geni per la produzione di resvertrolo, la molecola antiossidante divenuta famosa per i suoi effetti allunga-vita su animali.

L'alcool prodotto ha anche la capacità di estrarre il colore dalle bucce dell'uva.

Un di utilizzo di tecnologie aggiuntive nella produzione del vino è rappresentato da alcuni vini dolci francesi; prima della vendemmia le uve vengono irrorate con un fungo: Botrytis cinerea.

L'infezione causa la perdita d'acqua dagli acini, che quindi diventano più dolci. Il mosto dolcissimo che si ottiene viene trattato da lieviti selezionati che fermentano il glucosio ma non il fruttosio che resta intatto e conferisce al vino il sapore dolce che lo rende adatto al dessert.

Durante il primo anno, i vini intraprendono una seconda fermentazione, cosiddetta malo-lattica (ad opera di diversi batteri, tra cui Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus):

acido malico acido lattico ed anidride carbonica.

Il vino perde così acidità e diventa più gradevole.

collezione

mosto

diluizioni seriali

coltura su terreno selettivo

isolamento purificazione

Una pratica divenuta usuale nelle aziende vitivinicole è l’utilizzo di ceppi di lievito selezionati per uso enologico: i produttori si assicurano in questo modo condizioni standard di fermentazione, buoni parametri qualitativi del vino ottenuto e riproducibilità del prodotto da un anno all’altro.

Batteri lattici: fermentazione lattica

f.malolattica, positiva nei vini rossi da invecchiamento

Batteri acetici: ossidano l’etanolo ad acido acetico. Spunto o acescenza

Lieviti aerobi: ossidano l’etanolo ad acetaldeide. Fioretta.

Ceppi diversi di lievito influenzano le caratteristiche organolettiche del vino (es. ceppi produttori di H2S, esteri etilici, acetato di isoamile etc).

La produzione della birra avviene a partire dall'orzo; in alcuni paesi si utilizzano anche il riso ed il mais.

Questi cereali, a differenza dell'uva, non contengono zuccheri fermentabili ma solo amido. L'amido deve essere saccarificato, scisso cioè in maltosio e glucosio che saranno poi fermentati. Tale scissione avviene grazie ad un enzima: l'amilasi, presente nei semi d’orzo germinati. Preparazione della birra:

I chicchi d’orzo vengono ripuliti, messi in acqua per 48h per attivare l’amilasi, trasferiti poi in una camera di germinazione (pH e temp. costanti) per 5-7gg. Chicchi germinati di dimensioni richieste vengono trattati al calore:80°C per un colore chiaro; 105°C per una colorazione scura; 200°C per un colore molto più scuro. Questo orzo germinato secco si chiama malto.

Il malto viene miscelato con acqua, grano o riso; quindi la miscela viene posta in forno per la bollitura; quindi viene passata in una vasca dove la temperatura viene ulteriormente innalzata per stimolare l’attività enzimatica di maltasi e proteasi. La parte liquida (mosto di malto) è trasferita in bollitori di rame dove dopo l’aggiunta del luppolo (un'infiorescenza della rampicante Humulus lupus) viene mantenuta per 30min. Il luppolo rilascia una resina la quale, sciogliendosi, conferisce il tipico sapore amarognolo alla birra. Dopo filtrazione, sedimentazione, raffreddamento, il mosto di malto viene messo in fermentatori nei quali vengono introdotti i lieviti. La birra verde viene separata dai lieviti e trasferita in un contenitore a 0°C per settimane o mesi. La birra matura viene filtrata, arricchita con CO2, pasteurizzata e imbottigliata.

Nel caso della birra, al contrario di quanto avviene per il vino, la fermentazione parte sempre grazie all'aggiunta di lieviti da parte dell'uomo.

I lieviti utilizzati derivano da lievitazioni precedenti e sono del genere Saccaromyces cerevisiae: nel corso dei secoli i birrai hanno selezionato però ceppi con caratteristiche ottimali (ora chiamati lieviti da birra) che non esistono in natura.

I lieviti utilizzati sono di due tipi:

-i lieviti che fermentano al fondo: richiedono temperature tra 6° e 12°C, in 8-10gg

-I lieviti che fermentano in superficie: richiedono temperature tra i 14° e i 23°C, 5-7gg.

E' possibile ottenere dall'amido, utilizzando microrganismi fermentanti, etanolo e metano; quest'ultimo può essere utilizzato come carburante ecologico per i veicoli.

Dal mais è anche possibile ottenere il cosiddetto biodisel, un carburante che abbassa drasticamente le emissioni di sostanze nocive nell'atmosfera e che viene già utilizzato in alcune città per alimentare i mezzi pubblici.

Cambiamento dell'informazione genetica di un organismo vivente mediante modificazione diretta del suo acido nucleico o introduzione di uno o più geni esogeni, attraverso una serie di metodologie, definite nell'insieme "Tecnologia del DNA ricombinante", per ottenere sostanze o prodotti utili all’uomo, oppure per modificare le caratteristiche di altri organismi, o anche per sviluppare microrganismi per usi specifici.

Le BiotecnologieLe Biotecnologie

biologiabiologia

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microbiologiamicrobiologia

agricoltura

geneticagenetica

biologia molecolarebiologia molecolare

fisiologiafisiologia

Medicina

alimentazione

biomateriali e biostrumentazio

ne

farmacologia

veterinaria e zootecnia

bioindustria chimica

ambiente

L'Ingegneria genetica è l'insieme delle tecniche che consentono di modificare in modo stabile e mirato, il patrimonio genetico di un organismo.

La tecnica fondamentale è quella del DNA ricombinante. Essa permette di isolare dei geni (porzioni di DNA che codificano una proteina) e trasferirli in un altro organismo, al fine di produrre proteine ed enzimi.

Il clonaggio genico può essere suddiviso in 5 passaggi: 1. Isolamento e frammentazione del DNA.

 2. Ligazione del frammento di DNA con un vettore di clonaggio

mediante la DNA ligasi.

3. Introduzione nell'ospite con la trasformazione o mediante l’infezione con particelle fagiche. L`incorporazione del DNA nell'ospite generalmente genera una miscela di cloni (genoteca).

 4. Isolamento e purificazione del clone desiderato.

 5.  Produzione di un elevato numero di cellule o batteriofagi

contenenti il clone desiderato per l'isolamento e lo studio del DNA clonato.

 

Isolamento del DNA.

Demolizione della struttura cellulare per liberare il DNA dall’involucro Demolizione della struttura cellulare per liberare il DNA dall’involucro nucleare. nucleare.

Per permettere al DNA di uscire dalla cellula e srotolarsi senza perdere Per permettere al DNA di uscire dalla cellula e srotolarsi senza perdere la sua struttura a doppia elica occorre sia demolire pareti e membrane la sua struttura a doppia elica occorre sia demolire pareti e membrane cellulari, sia eliminare gli istoni.cellulari, sia eliminare gli istoni.

Precipitazione del DNA: una volta ottenuto il DNA libero in soluzione lo si può separare sfruttando la sua proprietà di precipitare in etanolo, addensandosi in una gelatina trasparente.

PCRPolymerase Chain

ReactionReazione a catena della

polimerasiMullis e Faloona, 1987

ScopoOttenere in vitro numerose copie di un gene o di un frammento di DNA

uguali al DNA stampo.

E’ un termostato automatico capace di modificare la temperatura dei tubi di reazione in tempi molto brevio Taq polimerasi

(DNA polimerasi da Thermus aquaticus)

o DNA stampo (anche 1 sola copia!!!)

o Primers (inneschi) oligonucleotidi sintetici (12-15 basi) complementari alle estremità 5’ e 3’ del frammento

o dNTP (ATP, TTP, CTP, GTP)

1 2 34

4 5 6 7K-

100 bpladder

100 bpladder

1500

1250

500

600

700800900

1031

bp

La PCR ha trovato molte applicazioni pratiche.

•  La PCR permette, prima del clonaggio, di amplificare con degli inneschi il gene o i geni di interesse, identificati tramite ibridazione. •  La PCR può essere estremamente

utile anche per il sequenziamento del DNA.•  La PCR può anche essere utilizzata

per produrre grandi quantità di DNA mutato.

• Poiché gli inneschi utilizzati non devono essere perfettamente complementari, la PCR è usata per studi comparativi o evolutivi per isolare da diversi campioni geni già clonati (e sequenziati) da un organismo.•  La PCR può essere utilizzata anche per

amplificare quantità molto piccole di DNA presenti in un campione.

•  La PCR è stata anche utilizzata per sviluppare il DNA "fingerprinting”,

una potente tecnica che può permettere l'identificazione di individui

o relazioni tra individui a partire da piccoli campioni del loro DNA.

Frammentazione del DNA.

Le endonucleasi di restrizione riconoscono una specifica sequenza di DNA (palindromi di 4, 6 o 8 nucleotidi) e tagliano simultaneamente i due filamenti a livello della sequenza riconosciuta.Richiedono Mg2+come cofattore.

Il taglio con gli enzimi di restrizione produce una estremità

3’-OH e una 5’-P

Frequenza di taglio da parte di enzimi di restrizione(DNA a composizione in basi casuale):Per enzimi che riconoscono 4 bp: (1/4)4= 1/256 (1 sito ogni 256 bp)Per enzimi che riconoscono 6 bp (1/4)6= 1/4096 (1 sito ogni 4096 bp)Per enzimi che riconoscono 8 bp (1/4)8 = 1/65536 (1 sitoogni 65536 bp)(rare cutters)Ricordarsi che il DNA non ha in realtà una composizione casuale!

Clonaggio di geni

Mentre geni batterici e virali possono essere tagliati e clonati direttamente in un vettore, spesso i geni eucariotici sono interrotti da introni; si preferisce allora ottenere il gene completo (cDNA) a partire da mRNA maturo

Nella trascrizione primaria tutto il gene viene trascritto (RNA trascritto primario), poi subisce un processo di maturazione (“splicing”), durante il quale le sequenze introni vengono rimosse.L’mRNA maturo può essere retrotrascritto per ottenere una molecola di cDNA che contiene il gene non interrotto.

Estrazione di frammenti di DNA da gel

Dopo aver digerito un DNA con enzimi di restrizione ed averne separato i frammenti risultanti su gel di agarosio, il passo seguente di solito consiste nell’excidere dal gel, con un bisturi, specifiche bande corrispondenti a geni o porzioni di DNA di nostro interesse e purificarle da gel.

Esistono molti sistemi per purificare bande da gel, tra cui:

• elettroeluizione• colonne a scambio ionico• gel-filtration• ultrafiltrazioni• agarosio a basso punto di fusione• ecc. ecc.

Caratteristiche dei vettori di clonaggio:

(1)   origine di replicazione indipendente, in modo tale che la replicazione nella cellula proceda indipendentemente dal controllo diretto del cromosoma;

(2)presenza di siti di taglio, possibilmente singoli,su cui possano agire le endonucleasi così da consentire l’inserimento del DNA estraneo senza che siano alterate le sue funzioni essenziali,come la replicazione.

(3)  dimensioni ridotte che facilitano la penetrazione nella cellula ospite;

(4)  elevato numero di copie nella cellula che rende possibile l'amplificazione del DNA;

(5) presenza di marcatori selezionabili, quali la resistenza ad antibiotici, che ne semplificano l'identificazione e l'isolamento.

Vettori di clonaggio

- Plasmidi  - Cosmidi- Batteriofagi- Virus

Ligazione del frammento di DNA con un vettore di clonaggio mediante la DNA ligasi.

Per ottenere buoni risultati la ligazione deve essere accuratamente ottimizzata rispetto alla:

1. temperatura e al tempo di reazione

2. alla concentrazione totale del DNA

3. alla concentrazione dell’inserto e del vettore.

Ospiti per i vettori di clonaggio

Le caratteristiche ideali di un ospite per il clonaggio dei geni sono:

1. crescita rapida, 2. capacità di crescere in terreni di coltura poco costosi, 3. non patogenicità, 4. capacità di essere trasformato con DNA 5. stabilità in coltura.

Tecniche di trasferimento genico in cellule :

Trasformazione in cellule procariotiche Trasfezione in cellule eucariotiche

In particolari condizioni fisiologiche, che in laboratorio coincidono con la fase di crescita esponenziale, i batteri divengono competenti.

Molte specie batteriche non naturalmente competenti possono essere trasformate artificialmente in laboratorio. Per fare ciò, bisogna permettere alle molecole di DNA di attraversare la membrana rendendola temporaneamente permeabile.

Ciò si può fare mediante metodi fisici o chimici.

In particolari condizioni fisiologiche, che in laboratorio coincidono con la fase di crescita esponenziale, i batteri divengono competenti.

Molte specie batteriche non naturalmente competenti possono essere trasformate artificialmente in laboratorio. Per fare ciò, bisogna permettere alle molecole di DNA di attraversare la membrana rendendola temporaneamente permeabile.

Ciò si può fare mediante metodi fisici o chimici.

•Elettroporazione

L’intesità e la durata dell’impulso vanno stabiliti empiricamente in base al tipo cellulare da trasformare o da trasfettare

cuvette

Il metodo tra i più usati è la elettroporazione, che consiste nell'applicare una differenza di potenziale ai lati della cuvetta che contiene la soluzione con le cellule e il DNA da inserire: lo shock elettrico provoca la formazione di pori nella membrana che permettono l'ingresso del materiale genetico. Ha come difetto l'alta percentuale (%) di cellule che non sopravvivono in seguito al trattamento.

Il metodo tra i più usati è la elettroporazione, che consiste nell'applicare una differenza di potenziale ai lati della cuvetta che contiene la soluzione con le cellule e il DNA da inserire: lo shock elettrico provoca la formazione di pori nella membrana che permettono l'ingresso del materiale genetico. Ha come difetto l'alta percentuale (%) di cellule che non sopravvivono in seguito al trattamento.

Metodi fisici:

•Iniezione diretta:

• Efficienza del 100%• Numero limitato di cellule da trasfettare per ogni singolo esperimento• Utilizzata per cellule grandi (es.: ovociti di Xenopus) e per generare animali transgenici• Trasfezione stabile

• Gene GunIl DNA viene accoppiato ad un solido inerte (solitamente particelle di oro) e sparato direttamente nella cellula.Può essere utilizzato anche su interi organismi e per la trasformazione delle piante.

Metodi chimici Uno dei metodi più semplici e meno costosi è quello che utilizza il calcio fosfato.La procedura prevede il mescolamento di una soluzione tampone HEPES contenente ioni fosfato insieme a una soluzione di cloruro di calcio (CaCl2) e il DNA da trasfettare. Il mescolamento delle due soluzioni produce un precipitato di calcio fosfato, che andrà a legare la molecola di DNA. Il precipitato viene prelevato, risospeso e aggiunto al terreno di coltura (di solito una coltura mono strato). Con un processo ancora non ben noto le cellule legano il precipitato e permettono l'ingresso del DNA.

Uno dei metodi più semplici e meno costosi è quello che utilizza il calcio fosfato.La procedura prevede il mescolamento di una soluzione tampone HEPES contenente ioni fosfato insieme a una soluzione di cloruro di calcio (CaCl2) e il DNA da trasfettare. Il mescolamento delle due soluzioni produce un precipitato di calcio fosfato, che andrà a legare la molecola di DNA. Il precipitato viene prelevato, risospeso e aggiunto al terreno di coltura (di solito una coltura mono strato). Con un processo ancora non ben noto le cellule legano il precipitato e permettono l'ingresso del DNA.

Trasduzione:

Il DNA può infine essere inserito per trasduzione. Per questo vengono di solito utilizzati adenovirus, retrovirus e lentivirus.

Un altro metodo biologico molto efficace sfrutta i liposomi, piccole vescicole lipidiche che inglobano il DNA e sono indotte ad entrare con esso nella cellula simulando i processi di endocitosi cellulare.

Altro metodo prevede l'uso di dendrimeri, molecole altamente ramificate che si legano al DNA e lo trasportano nella cellula.

Un altro metodo biologico molto efficace sfrutta i liposomi, piccole vescicole lipidiche che inglobano il DNA e sono indotte ad entrare con esso nella cellula simulando i processi di endocitosi cellulare.

Altro metodo prevede l'uso di dendrimeri, molecole altamente ramificate che si legano al DNA e lo trasportano nella cellula.

Batteri•elettroporazione•trasformazione chimica con CaCl2•coniugazione batterica

Piante•elettroporazione•trasferimento mediato da Agrobacterium•cannoncino balistico• fusione di protoplasti

Lieviti•PEG•Elettroporazione

Tavola riassuntiva dei principali metodi di trasferimento genico

Cellule animali•PEG•Elettroporazion

e •Ca3(PO4)2

Selezione dei ricombinantiSelezione dei ricombinanti

Il DNA ricombinante ottenuto, che porta la resistenza per un antibiotico, viene introdotto in una cellula ospite (es. E. coli) sensibile; le cellule in cui entra il DNA ricombinante diventano resistenti e possono formare colonie su terreni contenenti l’antibiotico (selezione dei ricombinanti).

Procedura di selezioneScreening bianco-blu

1. Il plasmide (pUC19) contiene due marcatori genetici utili per la selezione: gene amp e gene lac Z

2. Il DNA esogeno viene inserito nel plasmide, dove inattiva il gene lac Z

3. Il plasmide ricombinante viene introdotto nel batterio che diventa ampicillina resistente

4. I batteri vengono seminati su piastre contenenti ampicillina e il substrato per la beta-galattossidasi

5. La crescita di colonie bianche indica la presenza del DNA esogeno. Le colonie blu contengono il gene lacZ e quindi il DNA esogeno non si è inserito

Selezione dei geni clonati

Nella ricerca di base Un esempio di come le biotecnologie vengano usate nella ricerca di

base è quello della creazione di topi transgenici, utili nella ricerca di base in campo biomedico.

Utilizzando le nuove tecniche della genetica molecolare, è possibile introdurre un gene esterno (transgene) nella linea germinale di una cavia, in modo che la progenie risulti portatrice del carattere transgenico.

Diversi metodi sono stati utilizzati nel tempo per la generazione di topi transgenici.

Schema di

generazione

di un topo

transgenico.

o Quando i ricercatori isolano un gene umano dalle funzioni ignote, per comprenderne la funzione inseriscono nel topo una sequenza inattiva del gene isolato, rimpiazzando quello stesso gene presente nell'animale. In questo modo viene creato un particolare tipo di topo transgenico, il topo knock-out, privo cioè di quella certa funzione genica.

Basterà quindi osservare il topo knock-out per comprendere la funzione del gene in questione (ad esempio, se il topo perde l'udito, si deduce che il gene in questione è coinvolto nei meccanismi dell'udito, e la sua alterazione provoca la sordità).

o L'uso del topo per questi scopi nasce dalla particolare similitudine tra il genoma umano e quello del roditore.

Medicina e farmacologia

Diagnostica Produzione farmaci Produzione altre sostanze

Terapia genica

In precedenza, i farmaci venivano prodotti per sintesi chimica o estratti da fonti naturali come, piante e microrganismi. Altre sostanze, come ormoni, venivano ricavate da animali, cadaveri o da sangue umano, ottenendo quantità molto esigue, a costi elevati e col pericolo di contaminazione virale.

L’uso indiscreto e indeterminato di farmaci, inoltre, ha causato il fenomeno della resistenza batterica,  facendo aumentare la richiesta di nuovi farmaci.

Con l’avvento dell’ingegneria genetica, grazie a batteri e piante transgeniche, si sono ottenuti nuovi farmaci, vaccini e ormoni, a bassi costi e in grandi quantità.

Principali proteine ottenute con batteri geneticamente modificati

Ormoni:

Somatotropina

La somatotropina è l’ormone della crescita, il cui deficit provoca forme di nanismo. Per ottenere 0,5 milligrammi di somatotropina pura è necessario estrarla dal cervello di mezzo milione di pecore, mentre, con l’ausilio di un fermentatore e di batteri modificati, basterebbero solo pochi litri di coltura per produrre centinaia di grammi di somatotropina. Insulina

Gli individui diabetici hanno un difetto di produzione di insulina, una proteina prodotta dal pancreas che gioca un ruolo cruciale nel metabolismo del glucosio.

L’ insulina, indispensabile per la vita dei pazienti diabetici, veniva ricavata dal pancreas di mucche e maiali, con il rischio di contaminazione virale. Oggi viene prodotta biotecnologicamente con batteri ricombinati e con il vantaggio di essere identica a quella prodotta nell’uomo.

La strategia di clonazione prevede la produzione della catena A e B separatamente. La catena B è stata sintetizzata in2 tempi:prima la porzione N-terminale, poi quella C-terminale.

Ciascuno dei geni prodotto sinteticamente è stato inserito in un vettore plasmidico, fuso con il gene lacZ e introdotto in E.coli.L’informazione relativa alle catene dell’insulina è stata separata da lacZ mediante un codone codificante la metionina

Il sistema lacZ/β-galattosidasi ha numerosi vantaggi:

il sistema è inducibile

le catene fuse con la β–galattosidasi sono protette dalla demolizione proteolitica.

I plasmidi ricombinanti e le cellule batteriche vengono mescolati. I plasmidi entrano nelle cellule batteriche per trasformazione. Quando le molecole di DNA ricombinante sono entrate con successo nell’ospite batterico si replicano creando molte copie. Quando il batterio si divide il plasmide si divide nelle due cellule figlie e continua a riprodursi. Le cellule batteriche si dividono rapidamente (una volta ogni 20 minuti), un batterio che contiene il cDNA umano (per esempio che codifica l’insulina) genererà rapidamente un milione di cellule simili (cloni) conteneti lo stesso gene umano. 

- I peptidi vengono trattati con bromuro di cianogeno.- Purificati.- Mescolati insieme per permettere la formazione spontanea dei ponti disolfuro

Immunomodulatori:

Interferoni Gli interferoni sono  proteine prodotte da particolari cellule del sistema immunitario, queste proteine sono presenti in piccolissime quantità e sono solo estraibili dall’uomo, poiché quelli estratti da animali sono strutturalmente diversi ed sono inutilizzabili per la difesa immunologia nell’uomo. Con batteri transgenici si possono produrre ingenti quantità, senza particolari processi di lavorazione. (Es.: Interferone α-2a (E. coli), Interferone α-2b (E. coli), Interferone β-1a(cellule CHO).

Enzimi:DNasi umana (cellule CHO))

Farmaci ottenuti da piante transgeniche Sono di gran lunga più sicuri di quelli prodotti da animali, perché non esiste il pericolo di contaminazione virale.

Proteine del sangue:Attivatore tissutale del plasminogeno (E. coli, S. cerevisiae)Fattore VIII di coagulazione (S. pombe, cellule CHO)

Immunomodulatori:

Interferoni Gli interferoni sono  proteine prodotte da particolari cellule del sistema immunitario, queste proteine sono presenti in piccolissime quantità e sono solo estraibili dall’uomo, poiché quelli estratti da animali sono strutturalmente diversi ed sono inutilizzabili per la difesa immunologia nell’uomo. Con batteri transgenici si possono produrre ingenti quantità, senza particolari processi di lavorazione. (Es.: Interferone α-2a (E. coli), Interferone α-2b (E. coli), Interferone β-1a(cellule CHO).

Enzimi:DNasi umana (cellule CHO))

Farmaci ottenuti da piante transgeniche Sono di gran lunga più sicuri di quelli prodotti da animali, perché non esiste il pericolo di contaminazione virale.

Proteine del sangue:Attivatore tissutale del plasminogeno (E. coli, S. cerevisiae)Fattore VIII di coagulazione (S. pombe, cellule CHO)

Vaccini Un vaccino è un farmaco in grado di indurre immunità nei confronti di un agente infettivo.Un tempo venivano utilizzati ceppi indeboliti o uccisi nei quali però è sempre insita la possibilità che il virus non sia stato completamente inattivato e quindi possono essere potenzialmente dannosi per il paziente. Poiché le proteine virali di superficie rappresentano la parte attiva del virus inattivato, oggi vengono utilizzati batteri GM, nei quali sono stati inseriti i geni virali, che sintetizzano la parte proteica del virus. Successivamente, la proteina viene inoculata nell’organismo umano, provocando la produzione di anticorpi resistenti. Utilizzando quest’ultima tecnica, si ha il vantaggio di ottenere vaccini purificati, più sicuri e che manifestino effetti collaterali più controllati. In commercio, sono gia in uso, come il vaccino per l’epatite B (S. cerevisiae, P.pastoris, H. polymorpha).

Vaccini Un vaccino è un farmaco in grado di indurre immunità nei confronti di un agente infettivo.Un tempo venivano utilizzati ceppi indeboliti o uccisi nei quali però è sempre insita la possibilità che il virus non sia stato completamente inattivato e quindi possono essere potenzialmente dannosi per il paziente. Poiché le proteine virali di superficie rappresentano la parte attiva del virus inattivato, oggi vengono utilizzati batteri GM, nei quali sono stati inseriti i geni virali, che sintetizzano la parte proteica del virus. Successivamente, la proteina viene inoculata nell’organismo umano, provocando la produzione di anticorpi resistenti. Utilizzando quest’ultima tecnica, si ha il vantaggio di ottenere vaccini purificati, più sicuri e che manifestino effetti collaterali più controllati. In commercio, sono gia in uso, come il vaccino per l’epatite B (S. cerevisiae, P.pastoris, H. polymorpha).

Vaccini a DNA.Introduzione nell’organismo di DNA ricombinante contenente uno o più geni che codificano per antigeni che vengono prodotti nell’organismo e stimolano una risposta immunitaria protettiva

Applicazioni pratiche

dell’ingegneria genetica

Alcuni importanti composti biotecnologiciprodotti con le tecniche del DNA ricombinanteProdotto FunzioneProteine del sangue  Attivatore del Dissolve i trombiplasminogeno tissutale  Fattori VII VIII, IX Promuovono la coagulazioneEritropoietina Stimola la crescita degli eritrocitiUrochinasi Dissolve i trombiOrmoni  Insulina Trattamento dei diabeteOrmone della crescita umano Trattamento dei nanismoFattore di crescita cicatrizzazione delle feriteepidermico  Ormone paratiroideo Regolazione del calcioP-Endorfina AntidolorificoFattore di crescita osseo OsteoporosiAtriopeptina Diuretico, antipertensìvoImmunomodulatori  Interferoni Agenti antivirali e potenzialmente antitumorali

Interleuchina 2 Stimolatore dei linfociti TFattore di necrosi tumorale Agente antitumoraleFattore di stimolazione delle colonie di granulociti e macrofagi

Trattamento delle infezioni e del cancro

Lisozima AntinfiammatorioVoccini  Epatite B Prevenzione delle epatiti da sieroCitomegalovirus Prevenzione delle infezioniMorbillo Prevenzione dei morbilloColera Prevenzione dei coleraAIDS Prevenzione dell'AIDSRabbia Prevenzione della rabbia

Esempi di prodotti industriali ottenuti mediante l’impiego di microrganismi

-Xenotrapianti: Potenziali donatori di organi per il trapianto in uomo

Gli xenotrapianti sono trapianti di organi o tessuti animali “umanizzati”, nell’uomo. Questi animali transgenici sono frutto dell’ingegneria genetica, con la quale si inseriscono geni umani negli embrioni di alcuni animali, i quali fanno sviluppare una proteina sulla superficie delle cellule, capace di prevenire il rigetto. È molto pericoloso operare gli xenotrapianti perché esiste il rischio di contaminazione da nuove malattie, causate da virus inattivi presenti in questi organi, sviluppando in questo modo malattie molto pericolose,  che colpirebbero l’uomo.

-Xenotrapianti: Potenziali donatori di organi per il trapianto in uomo

Gli xenotrapianti sono trapianti di organi o tessuti animali “umanizzati”, nell’uomo. Questi animali transgenici sono frutto dell’ingegneria genetica, con la quale si inseriscono geni umani negli embrioni di alcuni animali, i quali fanno sviluppare una proteina sulla superficie delle cellule, capace di prevenire il rigetto. È molto pericoloso operare gli xenotrapianti perché esiste il rischio di contaminazione da nuove malattie, causate da virus inattivi presenti in questi organi, sviluppando in questo modo malattie molto pericolose,  che colpirebbero l’uomo.

Applicazioni in prospettiva:

-Cellule staminali -Diagnosi precoce e cura dei tumori -Bio-nanotecnologie

Applicazioni in prospettiva:

-Cellule staminali -Diagnosi precoce e cura dei tumori -Bio-nanotecnologie

-Terapia genetica

Uno dei più grandi obiettivi della medicina genetica è quella di curare malattie genetiche, provocate da alterazioni di uno o più geni o da malattie ereditarie, come la talassemia, la distrofia muscolare di Duchenne e la fibrosi cistica. Una volta individuato il gene difettoso, si disattiva e si sostituisce con quello funzionante (Immunizzazione genica).Questa operazione viene effettuata su cellule somatiche ma potrebbe essere effettuata anche su quelle germinali modificando il patrimonio genetico dei discendenti.

-Terapia genetica

Uno dei più grandi obiettivi della medicina genetica è quella di curare malattie genetiche, provocate da alterazioni di uno o più geni o da malattie ereditarie, come la talassemia, la distrofia muscolare di Duchenne e la fibrosi cistica. Una volta individuato il gene difettoso, si disattiva e si sostituisce con quello funzionante (Immunizzazione genica).Questa operazione viene effettuata su cellule somatiche ma potrebbe essere effettuata anche su quelle germinali modificando il patrimonio genetico dei discendenti.

Fermentazioni microbiche. Numerosi prodotti, soprattutto antibiotici, vengono prodotti

industrialmente usando microrganismi. Le tecniche dell'ingegneria genetica possono essere sfruttate per manipolare gli organismi in grado di produrre antibiotici, al fine di aumentarne la resa o produrre molecole modificate, più efficaci e meno tossiche, abbassando i costi.

- Oltre 6000 antibiotici isolati da vari microrganismi- 100/200 antibiotici scoperti all’anno, di cui solo 1% entra in

commercio.- Streptomyces: principale organismo utilizzato per produrre

antibiotici.

La composizione del terreno influenza enormemente la produzione degli antibiotici: il terreno ideale è quello che risulta più vantaggioso in termini di costi per unità di prodotto.

Il terreno deve contenere una sorgente di:- Carbonio- Energia- Azoto- Fosforo- Oligoelementi

Temperatura, pH e sterilità dell’ambiente devono essere costantemente controllati

Secrezione del prodotto

Alcuni microorganismi non sono capaci di secernere le sostanze da loro prodotte, si sta cercando di ottenere, mediante ingegneria genetica, ceppi microbici forniti di membrane cellulari maggiormente permeabili.

Purificazione del prodotto

Le molecole prodotte devono essere separate da ogni altra sostanza. La separazione può avvenire per affinità

Sintesi di nuovi antibiotici

Tramite introduzione in un unico organismo di vie di sintesi di altri antibiotici appartenenti alla stessa famiglia.

I nuovi antibiotici costituiscono lievi varianti strutturali degli antibiotici preesistenti e sono sintetizzati perché l’intermedio di una via biosintetica può divenire substrato per un’altra via.

Un microorganismo che viene a contatto frequentemente con un antibiotico tende a sviluppare resistenza allo stesso, per cui si cerca sempre di produrne di altri.

Antibiotici naturali Antibiotici semisintetici

Piante e animali transgenici. Oltre alla produzione da parte dei microrganismi di molecole utili, l'ingegneria genetica permette di modificare geneticamente piante ed animali. Si ritiene che questi organismi, detti transgenici, possano essere molto utili per lo sviluppo delle attività agricole grazie alla possibilità di alterare la qualità nutrizionale di carni e vegetali, e di ottenere proteine che non vengono facilmente prodotte mediante microrganismi geneticamente manipolati. Introducendo il DNA clonato in uova fecondate o direttamente in cellule vegetali, è possibile produrre organismi superiori geneticamente modificati.

In campo agroalimentare

E' senz'altro nel settore agro-alimentare che le biotecnologie hanno conosciuto il loro sviluppo più controverso e dibattuto. La produzione di organismi geneticamente modificati a scopo alimentare rappresenta in effetti un ambito di ricerca, produzione e discussione attiva, anche sul piano legislativo.

Una pianta transgenica è una pianta nella quale è stata inserita artificialmente una sequenza di DNA contentente uno o più geni esogeni.

Tali geni possono provenire da un'altra pianta o anche da organismi diversi, come batteri o animali.

Le principali modifiche rigardano la resistenza agli erbicidi (73%), agli insetti (18%) o alla combinazione di entrambi (8%)

• Una delle tecniche maggiormente utilizzate per inserire un gene esogeno in una pianta è quella che sfrutta un "ingegnere genetico" naturale: Agrobacterium tumefaciens è un microrganismo presente in natura che infetta le piante, inserisce alcuni frammenti del suo DNA nel DNA della pianta che produce così alcune proteine batteriche; il microrganismo cresce, formando sulla pianta un tipico callo. E' un esempio di scambio di DNA tra batteri e piante che avviene spontaneamente in natura.

• Con le tecniche del DNA ricombinante è possibile inserire in Agrobacterium tumefaciens un gene esogeno; il microrganismo verrà poi messo a contatto con la pianta, svolgerà il suo ruolo naturale di trasferimento di DNA in quello della pianta trasferendovi anche il gene esogeno.

LIMITI:LIMITI:

• casualità

• invasività del materiale transgenico

Con la tecnica dell’infezione con Agrobacterium tumefaciens fu prodotta nel 1983 la prima pianta transgenica:

una pianta di tabacco resistente ad un antibiotico (Herrera-Estrella et al., 1983).

Classico esempio di biotecnologia è rappresentato dall'inserimento nelle piante di mais del gene cry proveniente dal batterio Bacillus thuringiensis: Il gene conferisce la resistenza ai bruchi dei lepidotteri che attaccano le piante. Le piante transgeniche non hanno più bisogno di essere irrorate con i pesticidi.

Vantaggi: - riduzione del tasso di pesticidi immessi nell'ambiente,

- selettività dell'azione (i pesticidi uccidono tutti gli insetti, la pianta

transgenica solo i bruchi patogeni),

- costo più basso per il coltivatore,

- frutto privo di pesticidi sulla superficie.

• Oltre a piante resistenti agli insetti possono essere create piante resistenti agli erbicidi; la crescita delle erbacce rappresenta un serio problema per le colture intensive, diminuendo sia la quantità che la qualità del raccolto. L'uso degli erbicidi, d'altro canto, danneggia anche la coltura.

E' possibile creare piante transgeniche con enzimi in grado di degradare gli erbicidi: in questo modo l'erbicida può essere usato senza danneggiare le piante, che, a loro volta, contribuiscono a renderlo biodegradabile.

Es di resistenza ad erbicidi.: - al glufosinate d’ammonio

- al glifosate

La resistenza a virus patogeni

inserimento nel genoma vegetale di sequenze di DNA virale, codificanti per la proteina di rivestimento del virus stesso (CP, coat protein). Sembra che l'espressione delle proteine virali CP nella pianta interferisca con uno dei primi steps della replicazione virale, cioè la perdita delle proteine di rivestimento da parte del virus appena entrato nella cellula.

inserimento, nel genoma di organismi vegetali, di sequenze virali che codificano per l’enzima replicasi. In questo caso sembra che l’espressione del gene virale possa comportare il silenziamento della traduzione di geni del virus

Alimenti transgenici

MaisResistenza a insettiTolleranza a diserbanti Resistenza a virus

Pomodoro

Tolleranza alla siccitàProduttivitàResistenza a virus, insetti o funghi

PatataAmido modificatoResistenza a insettiProduzione fruttani

Melanzana

Resistenza a insetti

Soia Tolleranza a diserbanti

Zucchino

Resistenza a virus

OlivoResistenza a funghi patogeni

Cotone Resistenza ai diserbanti

Gli alimenti transgenici più diffusi e le loro caratteristiche modificate

La trasformazione delle piante di pomodoro con una copia "antisenso" del gene della galatturonasi fa diminuire l'espressione di questa proteina del 90%. Per creare il gene antisenso è stato fuso un cDNA del gene della galatturonasi, con orientamento invertito, con un promotore forte. Questo gene invertito, o antisenso, è stato saldato ad un plasmide Ti per Agrobacterium tumefaciens ed introdotto in piante di pomodoro.

Nelle fasi di stoccaggio e trasporto della frutta e degli ortaggi si possono avere perdite ingenti a causa di ammaccature, danni causati dal freddo o dal calore, eccessiva maturazione, sapori e odori sgradevoli e così via. Molti di questi cambiamenti sono legati ad attività di enzimi presenti nei prodotti stessi.

Nel pomodoro, l'enzima poligalatturonasi degrada i componenti della parete cellulare così che, maturando, il frutto diventa più molle.

Degradazione

• Un'altra applicazione è rappresentata dal riso transgenico nel quale viene inserito il gene per la produzione di beta-carotene.

Il riso non contiene una vitamina fondamentale per la nutrizione umana: la vitamina A; circa due miliardi di persone nel mondo, soprattutto in alcune zone povere del pianeta, hanno un'alimentazione basata sul riso e soffrono di carenza di questa vitamina (che provoca cecità notturna, affezioni della cornea che portano alla cecità totale, aumento della mortalità infantile).

Il riso transgenico produce beta-carotene, che viene trasformato dal nostro organismo in vitamina A.

E’ possibile vaccinare una persona dandole da mangiare una banana o una patata modificata in modo da produrre il vaccino

L'ingegneria genetica offre inoltre i seguenti mezzi per ridurre l'uso dei fertilizzanti e l'impoverimento del terreno: - la produzione dei batteri azoto-fissatori ad esempio può essere raggiunta modificandoli in modo che si adattino a convivere in simbiosi con ogni tipo di pianta e non solo con le leguminose;

- si possono produrre piante transgeniche da coltivazione in grado di fissare esse stesse l'azoto; in questo caso i geni batterici responsabili della fissazione dell'azoto dovrebbero essere trasferiti direttamente nel corredo genetico delle piante diventando autofertilizzanti.

Con l'aiuto delle biotecnologie si sta cercando di creare piante resistenti agli stress ambientali in modo da ridurre le perdite di produzione.

Recupero ambientale

Recupero ambientale

Le piante transgeniche trovano anche impiego per la fitorimediazione; con questo termine si indica l'utilizzo di organismi vegetali per la riduzione dell'inquinamento ambientale (da petrolio e metalli pesanti). Alcune piante infatti mostrano interessanti attività fito-estrattive, questa capacità può essere potenziata con la creazione di piante transgeniche che producano grandi quantità di biomassa e al contempo abbiano la capacità di accumulare ioni metallici inquinanti.

L’introduzione di batteri GM nei normali depuratori industriali e civili ha permesso di velocizzare i processi di smaltimento.

Bioindustriale

La produzione di molti composti chimici, in precedenza prodotti dall’industria del petrolio, vengono prodotti biotecnologicamente. I principali motivi economici, che hanno accelerato l’espansione in questo settore, sono legati all’alto costo del petrolio.

Alcuni dei prodotti, ottenuti biotecnologicamente: o l'acido ossalico, impiegato nei processi di stampa e di tintura; o l'acido propenoico, utilizzato come intermedio nella produzione

di alcune materie plastiche; o l'acido lattico, aggiunto come acidificante ad alcuni alimenti;o le sostanze antigelo.

I microrganismi producono, inoltre, molti tipi diversi di enzimi, che, essendo dei catalizzatori, permettono alle reazioni chimiche di procedere in condizioni molto più blande di quanto non avverrebbe, invece, in loro assenza.

La produzione industriale di enzimi utilizzati nei detergenti per rimuovere le macchie ne è un esempio: enzimi ottenuti da organismi opportunamente modificati svolgono un'azione proteolitica (demolizione di proteine) e lipolitica (demolizione di grassi), rendendo possibile un proficuo lavaggio della biancheria anche a basse temperature, con notevole risparmio energetico e basso impatto ambientale.

Nell'industria cartaria gli enzimi ottenuti con metodi biotecnologici vengono invece utilizzati per la lavorazione e la tintura della carta.

Il blu originale veniva prodotto per fermentazione dell’ Indigofera tinctoria da parte di Clostidium.

-Decolorazione: un gene per la perossidasi fungina è stato clonato in lievito. I cloni sopravvissuti alle condizioni di lavaggio sono stati selezionati.-Tessitura: il poliestere ecologicamente sostenibile viene ottenuto con batteri geneticamente modificati che convertono , utilizza ndo un enzima batterico, gli zuccheri in glicerolo, che sarà poi convertito in trimetilen-glicole, grazie ad un enzima di lievito.- Colorazione blu: E. coli diventa blu quando viene clonato in esso il gene della conversione dell’indolo a indaco proveniente da P. putida.Altri ricercatori hanno sviluppatouna coltura fungina mutata che produce lo stesso colorante.-Plastica: i microorganismi possono essere utilizzati per produrre cerniere e altri materiali da imballaggio fatti imballaggio.

Un intenso dibattito tra favorevoli e contrari è in corso nel mondo. La questione sembra comunque essere limitata al cibo. Sarebbe interessante interrogarsi sul perchè il dibattito sia suscitato solo da uno dei tanti possibili campi di applicazione della tecnica di produzione di organismi GM.

Eventuali rischi:Eventuali rischi:

Per la salutePer la salute: tossicità e allergie derivanti dalla presenza

nell’OGM di sostanze provenienti dalla specie “donatrice” di uno specifico tratto

Resistenza ad antibiotici dovuta a geni marcatori

Per l’ambiente:Per l’ambiente: Diffusione di caratteri modificati nell’ecosistema

(proliferazione di infestanti resistenti a specifici prodotti chimici, alla crescita dei predatori,…)

Gli OGM sono strettamente legati ad un modello di produzione agricola che provoca una forte riduzione della biodiversità

Riduzione dei costi di produzione: introduzione di colture che limitano o eliminano l’utilizzo di determinati input

Riduzione delle perdite produttive prima e dopo la raccolta: più resistenza colturale alle avversità patogene e ambientali

Aumento della resa massima