Approche moléculaire de la pneumocystose

APPROCHE MOLI2CULAIRE DE LA PNEUMOCYSTOSE

Sophie Latouche a, Lena Diop Santos a, Phil ippe Lacube a, Josiane Bolognini a, Patricia Roux a,*

R d s u m d

Pneumocystis carinii (Pc), est un micro-organisme eucaryote ubi-

quitaire. II s'agit d'un champignon opportuniste pouvant se develop-

per chez differents mammiferes. II determine chez les patients

immunodeprimes, en particulier au cours du sida, une pneumopa~

thie grave, fatale en I'absence de traitement. Bien que le diagnostic

et la therapeutique soient maintenant maftrises, de nombreuses

enigmes persistent en particulier au niveau epidemiologique. En

effet, en I'absence de milieu de culture permettant d'isoler Pc in

vitro, on ignore toujours ou et sous quelle(s) forme(s) il se trouve

dans la nature. Ainsi le mode de contamination reste & preciser,

m6me si la voie aerienne semble la plus probable du fait de la Ioca-

lisation pulmonaire de la pneumocystose (PPC).

Les techniques de biologie moreculaire, et plus specialement I'ana-

lyse par PCR et sequenoage de differents fragments de genes de

Pc, ont permis de demontrer I'existence de specificite d'h6tes et

I'h~terog6neit~ genetique, cruciale pour I'etude de 1'6pidemiologie

de la PPC. Elles ont permis de demontrer la possibilite de contami-

nation de novo, de co-infection par differentes souches, et de detecter I'ADN de Pc dans I'environnement. Le typage apparaft

indispensable & realiser pour les cas groupes de PPC avant de

conclure & une eventuefle infection nosocomiale ou transmission

inter-humaine. II a egalement montre son int6r6t pour la recherche

de marqueurs de resistance aux traitements tel que les mutations

sur le gene de la dihydropteroate synthetase.

Ces techniques permettront, conjointement & I'utilisation de cul-

tures in vitro r6cemment decrites, de preciser de nombreux aspects

~pid~miologiques tels que I'infectiosite des souches d6tect6es et

leur circulation dans la nature, ainsi que de decrire le cycle 6volutif de ce champignon atypique.

P n e u m o c y s t i s c a r i n i i - g 6 n o t y p a g e - b i o d i v e r s i t ~ - 6 p i d e -

rn io log ie .

S u m m a r y

Pneumocystis carinii (Pc) is an eukaryotic ubiquitous micro-orga-

minsm which cause fatal pneumonia in immunocompromised indi-

viduals especially in AIDS patients. Despite major improvements

in diagnosis and therapy, epidemiofogica! data are fragmentary.

The mode of transmission is poorly understood, in large part due

to a lack of a continuous in vitro culture system for its isolation, but

contamination probably occurs through inhalation of unknown forms present in air.

Molecular techniques, such as DNA amplification and sequence

analysis of Pc genes, have played an important role in demonstra-

ting a large degree of specificity and heterogeneity among the dif-

ferent Pc organisms and in studying Pneumocystis carinii pneumo-

nia (PCP) epidemiology.

The genes analysis aflowed to show that recurrence may be due

to de novo infection rather than reactivation of organisms not eli-

minated by treatment during the first episode, the existence of

coinfection with two different strains of Pc and to detect Pc DNA

in ambient air. Studies of suspected person-to-person transmis-

sion, typing different DNA regions, most of the time rule out

transmission within couple or hospitalized patients and therefore

suggest that the most probable mode of transmission is environ-

mental. Typing gene methods have also permit studies on drug-

resistant markers such as mutation on dJhydropt&roate synthe-

thase gene of Pc.

Pc typing may be simultaneously use with in vitro cultivation to

improve our knowledge on PCP epidemio/ogy such as environ-

mental reservoirs, fife cycle of this atypic fungus.

P n e u m o c y s t i s c a r i n f i - g e n o t y p i n g - b i o d i v e r s i t y - e p i d e -

m i o l o g y .

a Laboratoire de parasitologie-rnycologie Centre hosloitalier universitaire Saint-Antoine 184, rue du Faubourg Saint-Antoine 75571 Paris cedex t2

* Correspondance.

article re4tu le 26 juillet, accept6 le 28 octobre 1999.

© Elsevier, Paris.

1. Introduct ion

p neumocystis carinfi (Pc) est un micro-organisme eucaryote ubi- quitaire, consider6 definitivement comme un champignon atypique

opportuniste, pouvant se developper chez differents mammiferes. II est responsable, chez les sujets atteints du syndrome d'immunodeficience acquise (sida) ou d'autres immunodeprimes, de pneumopathie grave, mortelle en I'absence de traitement. Cette pneumonie & Pneumocystis cariniJ (PPC) relativement rare jusqu'au debut des annees 1980, emerge au premier rang des infections opportunistes avec la survenue de

Revue Fran(~aise des Laboratoires, f~vrier/mars 2000, N ° 320 63

• • f . Dossier sclenti ique Epid~miologie moleculaire

Esp6ce h6te

rat prototype

rat variant

humain

furet

Pneumocystis caring f sp caring

Pneumocystis carinii f sp rattus

Pneumocystis caring f sp hominis

Pneumocystis caring f sp mustetae

souris Pneumocystis carinii f sp muris

cheval Pneumocystis carinii f sp equi

cochon Pneumocystis caring f sp suis

lapin Pneumocystis caring f sp oryctolagi

1'6pid6mie de sida et reste & ce jour souvent revelatrice de I'infection par le virus de I'immunodeficience humaine (VIH) en Europe et aux Etats-Unis [63].

L'impossibilite de cultiver Pc in vitro de faq, on continue a [imite des etudes sur les aspects biochimiques, immunologiques et 6pidemiolo- giques de la PPC [68]. Ces dix dernieres annees, le developpement des techniques de biologie moleculaire a permis de progresser considera- blement dans les domaines de la taxinomie et de I'epidemiologie.

2. Taxinomie

La position taxinomique a Iongtemps fait I'objet de nombreuses contro- verses. S'agissait-il d'un protozoaire ou d'un champignon ? De nombreux arguments plaidaient en faveur de chacune des hypotheses.

Pc presente de nombreux aspects structuraux des protozoaires [50], est sensible a certaines molecules anti-protozoaires [61]; enfin sa quantite d'ADN serait plus proche de celle des protozoaires que de celle des champignons [24].

Bien que Pc ne se developpe pas in vitro sur les milieux appropries & la culture fongique (Sabouraud), de nombreux elements morpholo- giques et biochimiques evoquent une appartenance fongique : la structure trilamellaire de la paroi du kyste, I'existence de 6 (1-3) glucane dans cette meme paroi et la presence de mitochondries presentant des cristae [65]. De plus, I'existence d'un facteur d'elongation FE3 necessaire & la synth~se des proteines present dans de nombreux genres fongiques a ete demontree chez Pc et presente une affinite d'environ 57 0/0 avec Saccharomyces cerevisiae [81 ]. Outre ces donnees, des etudes immunologiques ont mis en evidence I'existence d'epitopes communs entre Pc et certains champignons [48].

C'est surtout gr&ce aux etudes genetiques portant sur I'analyse de nombreux genes et & la constitution d'arbres phylogenetiques, que Pc a definitivement ete rapproche des champignons. Cependant la classification precise reste & definir; la comparaison de la structure du gene 5S de I'ARN ribosomal (ARNr) de Pc avec celui d'autres organismes suggere qu'il est associe au groupe de rhizopodes/myxomycetes/zygo- mycetes [78]. Au contraire, I'etude des genes 16S, 5,8S et 26S de I'ARNr et I'analyse du gene de la 6 tubuline de Pc montrent I'existence d'affinites avec les Ascomycetes [42, 43, 67]. Wakefield a montre que la grande sous-unite de I'ARNr mitochondrial (mt LSU de I'ARNr) de Pc etait proche des Basidiomycetes et plus precisement des levures roses [77]. En 1994, Eriksson, a cree une nouvelle famille taxinomique au sein des Ascomycetes : les Pneumocystidacae ayant pour ordre les Pneumocystidales [18]. Ces difficultes de classification illustrent le caractere singulier de Pneumocystis.

3. Specificite d'h6te

Pendant de nombreuses annees, on a pense que Pc parasitant I'homme et les differents autres mammiferes 6tait un meme organisme responsable de zoonose. Get argument fonde sur les caracteres mor- phologiques observes en microscopie optique a 6te depuis battu en breche par differentes equipes. Uutilisation de techniques immuno- Iogiques et les donnees des etudes genetiques ont permis de demontrer I'existence de differences entre Pc parasitant differents hetes.

Des variabilites antigeniques, entre Pc issus de differentes especes hetes, ont ete etablies par caracterisations electrophoretiques de proteines ou glycoproteines (Western Blot) avec des anticorps polyclo- naux ou monoclonaux [32]. La plupart des anticorps diriges contre Pc d'une meme espece hete ne presentent pas de r(~actions croisees avec les preparations d'antig(~nes provenant de Pc d'autres especes. Des essais de contamination croisee avec des souris SCID ou des rats nude inocules par des isolats de Pc provenant d'hetes differents (lapin, furet et homme) ont echoue, les animaux ne developpant pas de pneumocystose [1,3]. Cette observation suggere une veritable sp6cificite d'h6te. II existerait donc plusieurs entites de Pc et la maladie ne serait pas transmissible d'un mammifere & I'autre [21 ].

L'analyse des chromosomes en gel d'electrophorese en champ pulse a montre que le caryotype etait different en taille et/ou en nombre de chromosomes (chez le rat, la souris, le furet et I'homme) avec des pro- ills de migration differents d'une espece & I'autre [27, 66, 79]. Uetude de sequence nucleotidique de plusieurs genes : mt LSU de I'ARNr, la petite sous-unite de I'ARNr, la [3 tubuline, la thymidylate synthase, les espaceurs internes transcrits (ITSs), le gene arom codant pour la biosynthese d'un amino acide aromatique, a montre de nombreuses variabilites entre les especes h6tes, et confirme que chaque espece de Pc est g6netiquement distincte [6, 16, 29, 51,75]. Cette specificite d'h(~te a justifie en 1994, la proposition d'experts [59], d'appliquer une nouvelle nomenclature trinominale en ajoutant a Pc, le nom latin de chaque espece h6te chez laquelle il se developpe (voir tableau I). Ainsi Pc se developpant chez I'homme se nomme Pneumocystis carinfif, sp. hominis (Pc hominis). Pc f. sp. hominis n'est donc pas agent de zoonose. Les reservoirs seraient donc I'homme et/ou I'environnement siil existe une source environnementale.

4. Biodiversite" heterogeneit6 au sein d'une m me espece

Uhypothese d'une heterogeneit6 au sein d'une meme espece avait ete evoquee pour le Pc de rat par Hong et coll. des 1990 [27] avecla raise en evidence de differences de migration des chromosomes par electrophorese en champ pulse revelant I'existence de deux types distincts. De telles differences entre souches de Pc sont egalement presentes au niveau d'un fragment de genes comme le 18S [13], 26S [43], I'ATPase [52], et mt LSU de I'ARNr [14]. Cette heterogeneite n'est pas propre au rat, puisqu'elle a ete egalement rapportee chez la musaraigne [56] et chez le furet [5, 6].

Pour Pc hominis, I'etude par electrophorese en champ pulse a 6te realisee mais abandonnee au profit du sequenoage de certains fragments de genes apres PCR [27], compte tenu des difficultes & obtenir de grandes quantites d'ADN pur. Differents auteurs ont rapportes la supe- riorite des genes ITSs (ITS1 et ITS2) pour mettre en evidence une biodiversite avec un maximum de 59 souches differentes sur 207 ana- lysees (voff tableaux II et Ill) alors que seules 4 souches differentes sont decrites sur mt LSU de FARNr qui represente un gene beaucoup plus conserve [34, 35, 36, 41,45, 75]. D'autres travaux utilisent I'etude du polymorphisme de conformation simple brin (SSCP), qui est une methode rapide de detection des polymorphismes d'ADN permettant

64 Revue Fran9aise des L&boratoires, fevrier/rnars 2000, N ° 320

6 12 15 21 23-24 Souche R T T A T TT S o u c h e l C T A T - - S o u c h e 2 C A T - - Souche 3 C A T - - Souche 4 C T A T - - Souche 5 T A T - - Souche 6 T A T - - Souche 7 T A T " '~- Souche 8 T A T - - Souche 9 T S o u c h e l O

A c

TT t t - -

S o u c h e 1 1 T C T - -

S o u c h e 1 2 T A T - - S o u c h e 1 3 T A T - - S o u c h e 1 4 T A - - Souche 15 T T A

A T

- = a b s e n c e d e n u c t # o t i d e , R = r e f e r e n c e .

28 34 T T

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42 53-54 80-81 115-118 T AT A G TTTA T . . . . TTTA T - -

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48-49 52-57 62 -66 6 8 - 7 2 Souche R A A TAATAA AAATA AATAT

Souche 1 - - TAA- - - A A - TA AATAT Souche 2 Souche 3 Souche 4

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Souche 6 - - AATAT

Souche 7 - - AATAA Souche 8 - - AATAT Souche 9 - - AATAA

Souche 10 - - AATAA

Souche 11 - - AATAA Souche 12 . . . . . . .

Souche 13 AATAA

Souche 14 AATAT

- - TAATAA

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- - TAA- - -

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TAA- - - A A - TA

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Souche 15 Souche 16

AATAA

AATAA Souche 17 AATAA

Souche 18 AATAT

Souche 19 AATAT

Souche 20 AATAA

- = a b s e n c e d e n u c / 6 o t i d e ; R = r e t ~ r e n c e .

76 122 T C

C

C

T

160 G

G

1 6 6 ' 1 6 9 173 178-184 ATAT G AAAATAC ATAT G . . . . . . .

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6 . . . . . . A

. . . . . . A AAAATAC G . . . . . . A . . . . . . . . .

e . . . . e . . . . . . . . .

G A T - - G . . . . . . . . .

G 1-1-- - A . . . . . . . . .

T G ATAT G . . . . . . . . .

T A T - - G . . . . . . . . . T G A . . . . . . . . .

I d e n t f c a t o n de d i f ferentes souches. Elle cons is te en I 'analyse, sur gel

de polyacry lamide, des changemen ts de mobi l i te des deux br ins d ' A D N

en cas de mutat ions. En effet, une subst i tu t ion de n u d e o t i d e s change

la con fo rmat ion d 'un s imple brin qui alors migre d i f fe remment . Les tra-

vaux de Hauser et coll., ut i l isant ce p roced6 , ont de tec te des var iat ions

gene t iques au sein de plusieurs genes de Pc hominis, conf i rmant ainsi

I 'he terogene i te de ce mic ro -o rgan isme [25] .

5. Coinfection

La co in fec t i on par d i f fe ren tes s o u c h e s de Pc a e te o b s e r v e e pou r la

premiere fois chez le rat par H o n g et coll. en 1 9 9 0 [27] avec la coexis-

tence de deux s o u c h e s g e n e t i q u e m e n t d is t inc tes . C e t t e obse rva t i on

a par la sui te ere con f i rmee par C u s h i o n et coll. [13 ] chez le rat et par

d 'au t res chez le furet [5, 6]. Chez I 'homme, la co in fec t ion par p lus ieurs

s o u c h e s de Pc hominis a e te ega lemen t o b s e r v 6 e par p lus ieurs

auteurs, soit par sequengage direct de produi t amplif ie (presence simul-

tan~e de 2 bases d i f fe ren tes & la meme pos i t ion) , soi t par de tec t i on

de plusieurs c lones d i f ferents [6, 3 1 , 3 6 , 45, "70]. Enfin cer ta ines tech-

n iques c o m m e la S S C P appa ra i ssen t p lus sens ib les pou r la mise en

ev idence des co in fec t ions [25]. Elles pe rmet ten t de de tec te r une coin-

fec t ion dans 69 % des cas con t re 20 & 3 0 % par d 'au t res techn iques .

6. Diagnostic

II r epose sur la mise en e v i d e n c e de Pc darts res p re levemen ts d 'or i -

g ine pu lmona i re . C e s p re levemen ts ont evo lue au cou rs de I 'h istoi re

de la pneumocys tose . Avant 1982 , le d iagnos t i c eta i t pose par la raise

Revue Franga ise d e s Laborato i res , fev r ie r /mars 2 0 0 0 , N ° 3 2 0 65

Dossier scientifique Epidemiologie moleculaire

en 6vidence de kystes par impregnation argentique (Gomori Grocott) dans les biopsies pulmonaires. Depuis 1982, le lavage bronchoaF veolaire (LBA), technique moins invasive, est devenu I'e×amen de refe- rence en France. Le diagnostic est pose par mise en evidence de Pc par examen direct & I'etat frais des LBA, par coloration au bleu de tolui- dine O ou impregnation argentique (kystes), au Giemsa (corps intra- kystiques, formes libres) ou par immunofluorescence (IF). Pour I'e×- pectoration induite (El), technique encore moins invasive, I'IF presente une sensibilite superieure aux colorations usuelles [69].

La mise au point de I'amplification genique, polymerase chain reac- tion (PCR), depuis le debut des annees 1990, a permis d'augmen- ter la sensibilite de detection de Pc dans les El et represente la technique de choix pour ces prelevements [76]. De meme la PCR apparaft comme la plus sensible pour detecter Pc dans les LBA de patients VlH- ainsi que chez les patients VlH+ recevant une prophylaxie et pour lesquels le diagnostic peut 6tre delicat. La sensibilite de la PCR a ate amelioree par I'utilisation de PCR nichee. Actuellement, I'abandon de I'hybridation au profit de la revelation du produit PCR avec des sondes froides par technique ELISA represente une alternative plus simple et plus rapide. Leur application est tout particulierement indiquee sur des prelevements encore moins invasifs que sont les lavages oropharyn- gas (LOP) avec une specificite de 100 o/0 et une sensibilite allant de 55 & 83 % [4, 46, 68]. Les LOP presentent I'avantage d'etre plus faciles & realiser, en particulier de fagon iterative.

Uutilisation de la PCR pour la detection d'ADN de Pc dans les prelevements sanguins de patients presentant une pneumocystose a ere realisee par differentes equipes. Si tousles auteurs s'accordent sur I'interet de cette technique pour le diagnostic de pneumocystose extra- pulmonaire ou disseminee, les discordances apparaissent concernant la detection de I'ADN de Pc au cours d'atteinte pulmonaire, voire meme avant I'apparition des signes cliniques [68].

7, Epidemiologie de la pneumocystose

Des marqueurs genotypiques ont revele une diversite genetique au sein des populations de Pc. De tels marqueurs devraient permettre de mieux comprendre I'epidemiologie de la PPC. En effet, on ignore oQ et sous quelle(s) forme(s) se trouve Pc dans la nature. Ainsi est-il difficile de preciser le mode de contamination meme si la vole aerienne semble la plus probable, compte tenu de la Iocalisation quasi exclusivement pulmonaire de la pneumocystose. S'agit-il de reactivation de souches latentes au sein des alveoles pulmonaires ou de contamination de novo ? Pc peut-il 6tre responsable d'infection nosocomiale, un patient contamine represente-t-il un danger pour un autre patient immu- nodeprime ? Pc e×iste-t-il dans I' environnement (air, sol, support vega- tal, eau) ? Existe-t-il un ou des reservoirs de Pc? Existe-t-il des souches resistantes au traitement ?

7.1. Reac t i va t ion ou c o n t a m i n a t i o n de novo ?

La physiopathologie des rechutes fait depuis Iongtemps I'objet de dis- cussions. S'agit-il de reactivation ou de contamination de novo ? Des arguments plaident en faveur de chacune des deux hypotheses.

L'hypothese d'une reactivation, & la faveur d'une immunodepression, de Pc endogenes presents & I'etat latent au sein des alveoles pulmonaires a Iongtemps prevalu, minimisant ainsi le rele d'une eventuelle contamination exogene. En effet, la raise en evidence d'anticorps spe- cifiques chez des patients sains y compris chez des enfants des r&ge de 4 ans suggerent un contact precoce avec Pc des I'enfance [58]. II apparaft qu'un etat d'immunodepression soit indispensable & I'ins- tallation d'une PPC. Ces donnees semblent etre confirmees par le fait qu'il suffise d'immunodeprimer des animaux pour qu'ils developpent une pneumocystose [62].

Des travaux r6cents ont remis en question I'hypothese de la latence. Des etudes effectuees chez des souris immunodeprimees presentant une PPC montrent I'absence de detection de Pc ou de son ADN dans les poumons ou dans des sites extra-pulmonaires, apres reconstitu- tion de I'immunite et suggerent que le developpement d'une PPC resul- terait de I'exposition & une source exogene [12]. Chez le rat, des etudes ont indique que la survie des Pc dans les poumons apres une premiere infection etait limitee & environ un an [71 ]. Uutilisation des techniques sensibles relies que I'immunofluorescence et la PCR [57] n'a pas permis de detecter Pc dans les poumons de sujets immunocompetents autopsies. D'autres n'ont qu'exceptionnellement retrouve Pc, par PCR, chez les personnes indemnes de PPC [76]. De plus, chez les sujets traites pour un episode de PPC et guerissant cliniquement, la nega- tivation parasitologique par les differentes techniques de detection (colorations standards, IF, PCR) a ate observee dans un delai d'environ un mois [17, 64].

Ces arguments plaident donc contre I'existence d'une latence de Pc. De plus, I'etude de souches de Pc issues de LBA iteratifs effectues au cours d'episodes recurrents de PPC a montre qu'elles peuvent etre genetiquement distinctes au cours des differents episodes, demon- trant ainsi I'existence d'une contamination de novo & partir de souche exogene [31,38, 70].

Certains auteurs ont suggere que la souche du second episode de PPC aurait pu ¢tre presente des le premier episode mais non dece- lee car minoritaire. Keely et coll. (31) ont montre par hybridation spe- cifique que la souche presente Iors du second episode n'etait pas retrouvee dans les prelevements effectues au cours du premier.

7.2. P n e u m o c y s t o s e n o s o c o m i a l e / t ransmiss ion in te r -humaine ?

Apres la seconde guerre mondiate, des epidemies de pneumocystose survenant chez des enfants prematures ou malnutris vivant dans des institutions telles que des orphelinats ou des creches ont 6t6 rap- portees [20]. Plus tard, la survenue - d'epidemies ,, ou de - cas groupes>, en milieu hospitalier chez des sujets VlH-, greffes ou autres immunodeprimes, hospitalises simultanement & des patients VlH+, suggere le possible oaractere nosocomial de I'infection et la transmission inter-humaine [11,22, 23, 60]. Dans ce cadre, le partage des salles d'attente de consultations et de soins entre transplantes et malades VIH+ ayant une PPC ¢tait mis en cause. Des equipes suisses ont propose en 1991 de traiter dans des lieux separes les malades VlH+ et les autres immunodeprimes [11]. La transmission de Pc au personnel soignant a egalement ate recherchee. C'est dans ce contexte, pour 6valuer la possibilite de transmission inter-humaine, que Lundgren et coll. [47] ont mene une etude serotogique en milieu hospitalier, en comparant les anticorps de personnels soignants, au contact ou non avec des patients presentant une pneumocystose. Les resultats observes ne montrent pas de difference significative entre les deux groupes et ne permettent pas de conclure & la transmission par un patient au personnel soignant.

Si de nombreuses publications suggerent la possibilite de transmission inter-humaine, seules deux equipes ont 6tudi6 le genotype des souches mises en cause au cours de ,,cas groupes>> de pneumocystose survenant chez des patients V lH- et VlH+ en milieu hospi- tafier et au sein de couples de patients [26, 37, 40]. Ces etudes, ayant retrouve le plus souvent des souches de Pc hominis genetiquement distinctes, n'ont pu demontrer la transmission inter-humaine. Le typage moleculaire s'avere, par consequent, indique en cas de suspicion d'infection nosocomiale et/ou de transmission inter-humaine afin de corn- parer les souches en cause.

Si la transmission inter-humaine n'apparatt pas comme une eventua- lite frequente, il faut envisager une contamination de novo & partir de souches environnernentales dont on ignore & ce jour le reservoir.

66 Revue Frangaise des Laboratoires, fevrier/mars 2000, N ° 320

7.3. P resence de Pc dans I ' env i ronnemen t ?

La Iocalisation quasi exclusivement pulmonaire de la PPC suggere un mode de contamination par inhalation & partir de souche presente dans le milieu exterieur. La grande sensibilite de la PCR pour la detection d'ADN de Pc constitue &ce jour le seul moyen pour sa detection dans I'environnement. Des prelevements d'air utilisant des collecteurs de particules en suspension ont ere realises et ont permis la mise en evidence d'ADN de Pc.

En milieu rural, en Grande-Bretagne, il a ate observe que Pc pouvait etre cons/dare comme un composant de I'air, Pc hominis et Pc sp. f. carinii (Pc prototype de rat) etaient les principales especes retrouvees [74]. Pc a egalement ate retrouve dans des animaleries de laboratoires oQ vivaient des rats ou des lapins presentant une pneumocystose [7, 39, 55, 74].

En milieu hospitalier, des etudes ont eta menees darts des chambres de patients presentant une PPC, dans des chambres inoccupees (& titre de contrele) et dans les couloirs. Les resultats variables montrent que la souche de Pc hominis detectee dans I'air peut etre identique ou differente de celle du patient [7, 8, 54]. L'ADN de Pc a egalement eta detects dans t'eau [10].

Ces etudes montrent que Pc est effectivement present dans I'environnement mais ces recherches do/vent etre poursuivies a/in de preciser la circulation des differentes especes de Pc, leur habitat (sol, support vegetal, habitat urbain...) et I'infectiosite des formes detectees. I'utilisation, dans I'avenir, de systeme permettant d'obtenir le deve- Ioppement in vitro de Pc pourrait etre un complement important pour decrire les formes infestantes et le cycle de ce champignon.

7 .4 R(~sistance au t ra i t emen t ?

Le traitement de choix de la pneumocystose, tant prophylactique que curatif repose principalement sur I'utilisation du cotrimoxazole (Bactrim ®, Eusaprim®), association d'une diaminopyrimidine, le tri- methoprime (TMP) et d'un sulfamide, le sulfamethoxazole (SMZ). La dapsone est une alternative en cas d'intolerance au cotrimoxazole. Le SMZ et la dapsone inhibent une enzyme, la dihydropteroate synthetase (DHPS) intervenant dans la biosynthese de I'acide folique et donc des acides nucleiques [73].

Une resistance aux sulfamides a ate rapportee pour de nombreuses bacteries comme Neisseria meningitidis et Streptococcus pneumo- niae [19, 44] ainsi que pour des parasites tels que Toxoplasma gon- d/let Plasmodium falciparum [2, 9]. Elle est liee a I'existence de mutations ponctuelles sur le gene codant pour la DHPS responsables de changements d'acides amines au niveau du site de liaison de I'enzyme aux sulfamides. De recentes etudes ont decrit de tetles substitutions dans

des regions hautement conservees du gene de la DHPS de Pc (en posi- tions 165 et 171 ) et suggereraient une press/on selective du SMZ pou- rant etre responsabie de resistance [30, 33, 53]. I 'existence d'une correlation entre la presence de mutations sur le gene de la DHPS et I'utilisation en prophylaxie de cotrimoxazole ou de dapsone a ate confir- m~e par plusieurs auteurs [15, 28, 49, 72]. En revanche, une equipe a demontre une correlation entre souches mutees et deces ou non reponse au traitement par cotrimoxazole ou dapsone [28]. Une etude recente, real/see sur un effectif beaucoup plus large, demontre que la mortalite & 3 mois est significativement trois lois plus frequente chez les patients ayant des souches mutees [26 b/s]. La possibilite de contamination de novo par une souche presentant les mutations a St6 retrouvee au cours d'episodes recurrents de PPC [15]. Des mutations ont eta egalement trouvees chez des patients n'ayant jamais reou de prophylaxie [15]. Ces donnees suggerent la circulation dans le milieu exterieur de souches mutees eventuellement moins sensibles. L'emergence de telles souches est sQrement liee& la press/on medicamenteuse par prophylaxie mal adaptee mais il semble trop premature de parler de reelle resistance, qui pourrait etre en cours d'evolution.

8. Conclusions

L es techniques de biologie moleculaire, et plus specialement I'analyse par PCR et sequengage de differents genes de Pc, ont per-

mis de demontrer la possibilite de contamination de novo, de co-infection par differentes souches. Le typage apparaft indispensable & realiser en cas de suspicion de cas groupes de PPC avant de conclure & une eventuelle infection nosocomiale ou transmission entre individus. De plus I'ADN de Pc a et~ detecte dans I'environnement.

En 1999, bien que la PPC soit en diminution, en Europe et aux I~tats- Unis, grace & une meilleure prise en charge des patients VlH+ (ame- lioration des traitements antiretroviraux, tritherapie), elle reste souvent revelatrice de I'infection par le VIH et demeure une infection redoutable chez les patients VIH-. Devant I'efficacit6 des therapeutiques antire- trovirales, il semble possible de proposer d'interrompre les prophylaxies anti-Pc. Cette strategie, si elle est effective, permettrait de diminuer la press/on de selection et le risque de dissemination de souches moins sensibles voire resistantes. Parallelement, il apparaft indispensable d'ame- liorer les connaissances epidemiologiques de la PPC a/in de pouvoir envisager des conseils de prevention adapteso Dans ce cadre, de nombreux points restent & preciser, tels que I'infectiosite des souches detectees et leur circulation dans la nature. Des reponses pourraient etre apportees prochainement par I'utilisation simultanee du typage moleculaire et des modeles in vitro tels qu'ils ont ate recemment decrits [80].

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Documents

Approche moléculaire de la pneumocystose