ASP 2010 CECC - Les Antioxydants

1

Les Antioxydants

Identification et adresse des auteurs du projet :

Jol Nron 795 boulevard Campbell, Chibougamau, QC [email protected]

Gabryelle Gagnon 130 rue Jaculet, Chibougamau, QC [email protected]

Abstract :

The objective of our project was to determinate the concentrations of phenols in red wines, white wines and many different types of tea. In order to do that, we needed to measure the absorbance of each sample at 765 nm. Before we could measure the absorbance, we needed to make a solution with 1.68 mL of water, 100 L of Folin-Ciocalteu reagent, 300 L of sodium carbonate solution and 20 L of the sample we wanted to measure. For white wines and teas, we directly added 20 L to the solution, but in the case of red wines, we needed to dilute the wine by 10 before we could add 20 L to the solution. We did this experiment with 3 different white wines, 3 different red wines and many different types of teas. The average concentration of phenol antioxidants in white wines is 317,73 mg/L, the average in red wines is 2177,04 mg/L, the average in green tea is 750,99 mg/L, the average in black tea is 663,68 mg/L, the average in white tea is 905,17 mg/L and the average in gray tea is 854,17 mg/L. To conclude, the sample that contains the greatest concentration of phenol antioxidants is the red wine, then the concentration decreases in the following order: white tea, gray tea, green tea, black tea and white wine. If you want to drink something that contains a lot of antioxidants, you can drink red wine but we also recommend the white tea because, although it contains less antioxidants, it does not contain alcohol, so it can be drunk in greater quantities without causing the problems that alcohol could cause.

Mots Cls :

Polyphnol (antioxydant) Spectrophotomtre UV Vin Th Biologie Chimie

2

Introduction :

Lobjectif du projet tait de mesurer la concentration en antioxydants de diffrents vins rouges, vins blancs et ths de toutes sortes. La problmatique qui parle de limportance des antioxydants se lit comme suit :

De nos jours, de plus en plus de personnes souffrent de diffrents types cancers. Le cancer est une maladie cause par un drglement dune ou de plusieurs cellules qui se divisent beaucoup plus rapidement que les cellules normales. Ce drglement peut, entre autres, tre caus par les radicaux libres, des ions trs ractifs produits par de nombreuses ractions chimiques du corps. Les antioxydants aident prvenir les cancers causs par les radicaux libres. En effet, les antioxydants consomms ragissent avec les radicaux libres du corps pour les neutraliser et ainsi viter que ceux-ci ragissent avec les cellules en sant et les transforment en cellules cancreuses. Cest pourquoi il est trs important de consommer un nombre suffisant dantioxydants.

Les hypothses vrifier au sujet de la quantit dantioxydants dans les vins et les ths taient : (internet 4, 10,15)

1) La quantit dantioxydants de

type polyphnol dcroit dans

lordre suivant : Th, vin rouge,

vin blanc.

2) La source principale

dantioxydants de type

polyphnol du vin rouge est la

pellicule des raisins (Dufour,

2010).

Un antioxydant est une molcule qui

diminue ou empche loxydation

d'autres substances chimiques.

L'oxydation fait partie d'une raction

d'oxydorduction, qui transfre des

lectrons d'une substance vers un agent

oxydant. Cette raction peut produire

des radicaux libres qui entranent des

ractions en chane destructrices. Les

antioxydants sont capables darrter ces

ractions en chane en s'oxydant avec

les radicaux libres et en inhibant ainsi

leur action. Ces proprits se trouvent

beaucoup dans les familles des thiols et

des phnols (internet 4). Les radicaux

libres sont des substances instables

surtout composes doxygne. Cest la

structure chimique des radicaux libres

qui fait en sorte quils endommagent les

autres atomes en les oxydant. Si les

radicaux libres deviennent plus

nombreux que la capacit de

lorganisme les neutraliser, ils

contribuent lapparition de maladies et

au vieillissement. Il existe plusieurs

sources dantioxydants, mais la

principale est les fruits et lgumes. De

plus, cest un peu pour cette raison que

le guide alimentaire canadien

recommande de 5 10 portions de fruits

et lgumes par jour. Du ct des fruits,

ce sont les petits qui sont les plus

antioxydants : bleuets, mres,

canneberges, framboises, fraises et

pruneaux. Pour les lgumes, ce sont

lartichaut, lasperge, le brocoli, le chou

rouge, le poivron jaune et les pommes

de terre. De plus, les lgumineuses

telles que les haricots blancs, pinto et

rognons sont trs antioxydantes

3

(internet 5). Les molcules

antioxydantes que les organismes

vivants produisent ou utilisent sont par

exemple la vitamine C, la vitamine E, le

glutathion ou il y a certaines enzymes

comme la catalase, le superoxyde

dismutase etc. (internet 4) Lunit de

mesure utilise pour mesurer les

antioxydants quun aliment contient est

lORAC. ORAC est lacronyme de

oxygne radical absorbance capacity

(capacit dabsorption des radicaux

oxygne). Cette mthode provient de

recherche luniversit Tufts Boston

et elle consiste mesurer la quantit de

radicaux libres quune substance peut

absorber. Ainsi, la communaut

scientifique est capable de classer les

aliments en fonction de leur pouvoir

antioxydant (internet 8).

Figure 1 : Modle spatial de la molcule

du glutathion. La sphre jaune

reprsente l'atome rducteur de soufre

qui apporte la fonction antioxydante. Les

sphres rouges, bleues, blanches et

grises reprsentent respectivement les

atomes d'oxygne, d'azote, d'hydrogne

et de carbone.

Lors de lexprience ralise, les

antioxydants doss taient de type

polyphnol. Un phnol est un compos

cyclique 6 carbones portant une

fonction hydroxyle OH. Les drivs

portant plusieurs fonctions -OH sont

appels des polyphnols (internet 6).

Les polyphnols constituent une famille

de molcules organiques largement

prsente dans le rgne vgtal. Les

trois principaux antioxydants de type

polyphnol sont les catchines, les

thaflavines et les tharubigines. Ils sont

caractriss, comme lindique le nom,

par la prsence de plusieurs

groupements phnoliques associs en

structures plus ou moins complexes

(internet 5-7). Les vins et les ths

contiennent notamment de ce type

dantioxydant.

Figure 2 : Le phnol - Le plus simple des composs phnoliques

Figure 3 : Une molcule danthocyane

un polyphnol prsent dans le raisin

Cabernet-sauvignon.

4

Les bienfaits des antioxydants sur le corps sont nombreux. La plupart de ces bienfaits sont lis aux maladies cardiovasculaires, aux cancers et dautres maladies lies au vieillissement. Voici quelques exemples de cela tir de la littrature. Un oxydant naturel, le Resvratrol, trouv dans les peaux de raisins et dans le vin rouge, peut aider dtruire les cellules cancreuses du pancras en paralysant la fonction des mitochondries des cellules (internet 9). Les antioxydants du th empchent le cholestrol de soxyder et dadhrer aux parois des artres alors, pour cette raison, ils diminuent les risques de maladies cardiaques (internet 10).

Le vin rouge est obtenu par la fermentation du mot de raisin noir avec sa pellicule et ses ppins tendis que le vin blanc est fabriqu partir de la fermentation alcoolique de raisins pulpe non colore et pellicule blanche ou noire. Pour le vin blanc, on ne garde pas la pellicule du raisin (internet 11 et 12) (Dufour, 2010). Le cpage, soit la varit de vigne utilise pour produire un vin, dtermine le genre de vin qui sera produit. Par exemple, si le cpage est un merlot, le vin sera du mme nom. Le vin est une bonne source dantioxydant et cest en grande partie grce au raisin qui le compose.

Camellia sinensis, ou plus

communment appel le th, est un

arbuste de la famille des thaces. Il

est largement cultiv pour ses feuilles

qui une fois sches et plus ou moins

oxydes, servent la prparation par

infusion du th. (internet 5-13). Il existe

plusieurs sortes de th comme le th

vert, le th gris, le th blanc, le th noir

et bien dautre. Ils proviennent tous de la

mme varit darbustes, mais ce qui

crer les diffrentes sortes de th cest

la faon de le cultiver, lendroit o la

plante a pouss, le temps que lon a

laiss les plants dans le champ, la sorte

de fermentation que lon fait subir aux

feuilles, la saison, sa fracheur etc. Le

th contient plusieurs antioxydants de

type polyphnol comme les catchines,

les thaflavines et les tharubigines. Il

contient galement dautres sortes

dantioxydants comme la thanine, la

cafine et les flavonols

Matriel et mthode :

Pour la liste du matriel et des solutions,

voir lannexe 1.

Mthode de Folin-Ciocalteu

Cette mthode est habituellement employe pour mesurer les phnols totaux dans les vins. Ce procd peut galement tre employ pour l'analyse des phnols totaux dans le th. Le protocole emploi le volume minimum de ractifs et limine le gaspille de ceux-ci. Une micropipette doit tre utilise pour faire lexprience. Des cuvettes en plastique ou en verre peuvent tre utilises lors de la mesure de lchantillon dans le spectrophotomtre UV. Ce protocole est bas sur la mthode rapporte dans : (Slinkard, 1977); seulement les volumes ont t rduits.

5

Ractif de Folin-Ciocalteu : Ce ractif est dcrit comme tant du tungstate de sodium, du molybdate de sodium, du sulfate de lithium, du brome, de lacide chlorhydrique concentre et de lacide phosphorique (Singleton et Rossi, 1965) (internet 14). Lorsquils sont en prsence de phnols, les acides prsents dans le ractif sont rduits en un mlange doxydes bleus de tungstne (W8O23) et de molybdne (Mo8O23) (internet 14). Solution courante d'acide gallique ou acide 3,4,5-trihydroxybenzoque (internet 16):

Figure 4 : Molcule dacide gallique. Lacide gallique est un acide organique de couleur jaune qui se retrouve de faon naturelle dans les galles de sumac, dhamamlis, les feuilles de th, lcorce de chne entre autres plantes. Cest un polyphnol et sa formule chimique est C6H2(OH)3COOH (internet 16). Pour prparer cette solution, la procdure suivante a t effectue. Dans un ballon jaug de 100 mL, 0,5 g d'acide gallique sec ont t dissous dans 10 mL d'thanol puis le volume a t complt avec de leau distille. Il peut tre ouvert quotidiennement, mais au magasin ils le maintiennent ferm dans un rfrigrateur jusqu' deux semaines.

Solution de carbonate de sodium. 200 g de carbonate de sodium anhydre ont t ajouts dans 800 mL d'eau distille puis la solution a t porte bullition. Aprs refroidissement, quelques cristaux de carbonate de sodium ont t ajouts, et aprs 24 heures, la solution a t filtre et son volume a t ajust 1 L. Courbe talon : Pour prparer une courbe talon, 0, 1, 2, 3, 5, et 10 ml de la solution courante dacide gallique ont t ajouts dans un ballon jaug de 100 mL, puis le volume a t complt 100 mL deau distille. Ces solutions avaient des concentrations en phnol de 0, 50, 100, 150, 250, et 500 mg/l d'acide gallique. chantillons : Dans chaque solution de calibrage, 20 L dchantillon ont t ajouts avec la micropipette dans des cuvettes spares, et chacun, 1.58 mL d'eau distille ont t ajouts, puis, 100 L du ractif de Folin-Ciocalteu ont t ajouts avant le brassage de la solution. Puis, 300 L de la solution de carbonate de sodium ont t ajouts aprs avoir attendu de 30 secondes 8 minutes. Ensuite, la solution a t brasse une nouvelle fois. Les solutions sont restes 20 C pendant 2 heures avant quil soit possible de dterminer l'absorbance de chacun dentre eux 765 nm contre le blanc (la solution de 0 ml ) et de tracer une courbe de l'absorbance en fonction de la concentration en antioxydants. Pour les vins blancs, 20 L ont t ajouts dans les solutions de calibrage,

6

mais dans le cas des vins rouges, les vins ont t dilus par 10 avant dajouter les 20 L. Une courbe talon a t cre avec les valeurs pour dterminer les niveaux de concentration de polyphnol dans les chantillons. Les valeurs ont t mesures avec le spectrophotomtre UV. Les concentrations des vins rouges ont t multiplies par 10, en raison des dilutions.

Figure 4 : Spectrophotomtre UV. Interfrences. Les sucres rducteurs tels que le glucose et le fructose pouvaient causer des interfrences mineures et devaient tre corrigs. Les sulfites pouvaient galement causer une interfrence, mais la grandeur tait variable. Ce n'est habituellement pas un facteur important except pour les vins blancs avec un milieu aux niveaux levs de sulfite (mg/l >50) et aux niveaux bas de phnols (mg/l

7

Puis, la concentration dantioxydants

dans deux chantillons de vin rouges et

deux de vins blancs a t calcule.

Comme montre dans le tableau ci-

dessous, la concentration dantioxydants

tait environ sept fois plus leve dans

les vins rouges que dans les vins

blancs.

Tableau 2 : Absorbance et concentration

des vins rouges et blancs :

Nom des vins A

(765 nm) [ ]

(mg/L)

Clos de la coutale (rouge) 0,314 2807

Wallaroo trail (rouge) 0,180 1691

Wyndham estate (blanc) 0,378 334

Wallaroo trail (blanc) 0,304 272

Par la suite, la concentration

dantioxydants des mmes chantillons

de vin ainsi que celle de trois

chantillons de th vert de marque

Legend of China infus pendant

1 minute, 3 minutes et 5 minutes, de

trois chantillons de th noir cha de

marque Stash infus pendant 1 minute,

3 minutes et 5 minutes, dun chantillon

de th vert la menthe infus pendant

5 minutes, dun chantillon de th vert

au jasmin infus pendant 5 minutes et

dun autre chantillon de th vert de

marque Legend of China infus pendant

5 minutes ont t calcules.


des vins et des ths lors du premier

essai.

Nom des chantillons A

(765 nm) [ ]

(mg/L)





Th vert LOC 1min 0,569 493



Thnoir stash 1min 0,533 463



Th vert menthe 0,947 808

Thvert jasmin 0,784 672


Puis, la concentration dantioxydants

des vins a t calcule une nouvelle

fois, mais cette fois les vins rouges nont

pas t dilus par 10 avant de mesurer

leur absorbance afin de vrifier la

pertinence de cette tape du protocole.


des vins rouges et blancs sans dilution.

nom des vins A

(765 nm) [ ]

(mg/L)

Chardonnay (blanc) 0,483 401

Wyndham (blanc) 0,396 331


Bourgogne (rouge) 1,817 1472



Ensuite, la concentration dantioxydants

dun chantillon de th noir cha de

marque four Oclock infus pendant

8

5 minutes, dun chantillon de th gris

de marque Vogue teas infus pendant

5 minutes, dun chantillon de th noir

lrable infus pendant 5 minutes, dun

chantillon de th blanc imprial infus

pendant 5 minutes, dun chantillon de

th blanc la grenade infus pendant

5 minutes, dun chantillon de th robos

de marque Four Oclock infus pendant

5 minutes, de trois chantillons de th

noir cha de marque stash infuss

pendant 1 minute, 3 minutes et

5 minutes, de neuf chantillons de th

vert de marque legend of china infuss

de 1 minute 5 minutes par intervalles

de 30 secondes, ainsi que des mmes

chantillons de vin numrs plus haut

ont t calculs.


des vins et des ths lors du deuxime

essai.

Nom des vins et des ths

A (765 nm)

[ ] (mg/L)

Th vert jasmin 0,682 561

Th vert menthe 0,910 744

Th noir chai 0,717 589

Th gris 1,047 854

Th noir rable 0,804 659

Th blanc imprial 1,322 1075

Th blanc grenade 0,899 735

Th roibos 0,395 331





Th vert LOC 1,5min 0,707 581








Bourgogne (rouge) 0,236 2029




Chardonnay (blanc) 0,445 371


Pour dterminer le lien entre le temps dinfusion et la concentration dantioxydants de type polyphnol prsent dans le th, un graphique de la concentration en polyphnol du th noir de marque Stash en fonction de son temps dinfusion a t trac.

Figure 5 : Graphique de la concentration dantioxydants dans le th noir en fonction de son temps dinfusion. Discussion : Les rsultats de ces exprimentations sont que parmi tous les chantillons ayant t mesurs, celui qui contient le plus dantioxydants est le vin rouge de marque Clos de la Coutale, soit 2882 mg/L dantioxydants de type polyphnol. Rtroactivement, lchan-tillon qui en contient le moins est le vin

0

200

400

600

800

0 2 4 6

Co

nce

ntr

atio

n d

'an

tio

xyd

ants

(m

g/L)

Temps d'infusion (min)

Th noir stash

9

blanc de marque Wallaroo trail, soit 276 mg/L dantioxydants de type polyphnol. Il est possible de dire, d'aprs les rsultats, que les trois vins rouges qui ont t mesurs contiennent plus dantioxydants que les chantillons de vins blancs et de th vert. La premire hypothse qui se lit comme suit : La quantit dantioxydants de type polyphnol dcroit dans lordre suivant : th vert, vin rouge, vin blanc a donc t infirme. Le rel ordre dcroit comme suit : vin rouge, th vert, vin blanc. De plus, avec des recherches plus approfondie sur internet, il a t possible de conclure que lordre qui avait t tabli au dbut tait faux. Par contre, il tait possible daffirmer que la deuxime hypothse mise est vraie soit que la source principale dantioxydants de type polyphnol du vin rouge est la pelure des raisins. Elle tait vraie, car le vin rouge est ferment avec le raisin avec sa pelure et le vin blanc avec le raisin sans pelure. Puisque les rsultats taient que le vin rouge contient beaucoup plus dantioxydants de type polyphnol que le vin blanc, il tait donc possible de conclure que la principale source dantioxydant du vin rouge est la pelure des raisins, (voir tableau 3). Il y a certaine des interfrences qui ont pu biaiser les rsultats obtenus comme les sucres rducteurs, les sulfites et lascorbate (internet 1). Par contre, ils nont pas t pris en compte, car tant donn le temps restreint, il na pas t possible de faire les tests ncessaires pour savoir si les chantillons contenaient des substances crant de linterfrence. En revanche, ces interfrences taient minimes alors elles ne drangeaient pas les rsultats finaux, soit lordre de dcroissance. Les vins et certains des ths contenaient des armes de fruits et les fruits peuvent

contenir des antioxydants de types polyphnols ce qui a pu fausser les rsultats la hausse. Conclusion :

En rsum, la mthode de Folin-

Ciocalteu est assez simple raliser et

elle est donc idale pour le niveau

collgial. De plus, lutilisation du

Spectrophotomtre UV a grandement

facilit la tche du sa facilit

dutilisation et sa rapidit. Par contre,

le dfaut majeur de cette mthode tait

quil ne mesurait que les antioxydants

de type polyphnol. Il y a dautres

familles dantioxydants, tel que les

thiols, et ils ne pouvaient pas tre

mesurs lors de cette exprience. Cest

un peu en raison de cela quil y a eu des

erreurs lors de la rdaction de

lhypothse de dpart, car lordre

dcroissant a t tabli en fonction des

antioxydants totaux. Le th vert contient

plus dantioxydants totaux, mais le vin

rouge contient plus dantioxydants de

type polyphnol. Il y a galement

certaines substances qui ont pu causer

des interfrences lors de la prise de

mesure et ces interfrences sont donc

une source derreur supplmentaire

(internet 1). Pour terminer, mme si

cette mthode contient certaines

lacunes, elle reste assez fiable et elle

est utilise un peu partout et considre

comme une bonne mthode. La

mthode de Folin-Ciocalteu est

considre comme plus efficace que la

mthode de dosage par HPLC qui sous

estime la quantit dantioxydants et est

10

galement plus efficace que la mthode

de dosage par spectrophotomtre UV

visible qui, elle, surestime la quantit

dantioxydants (internet 3). Ainsi, il a t

possible de conclure quen raison du

matriel qui tait disponible, la mthode

de Folin-Ciocalteu tait la meilleure

utiliser.

Suggestions et perspectives

davenir :

Pour tous ceux et celles qui voudraient

poursuivre ce projet, il vous est conseill

dutiliser la mthode de Folin-Ciocalteu

mais pour doser autre chose. Il a t

trouv en faisant des recherches quil

est mme possible, laide de cette

mthode, de mesurer les antioxydants

de certains aliments durs comme la

laitue et les pinards (internet 2). Une

autre alternative qui pourrait tre

intressante serait de faire votre propre

ractif de Folin-Ciocalteu. Il y a

galement possibilit deffectuer les

expriences un grand nombre de fois et

dtablir des statistiques avec les

donnes. Pour terminer, si vous vouliez

refaire exactement la mme exprience,

il vous serait suggr de mettre les

chantillons dans ltuve, car lorsquils

sont 40 C, ils nont besoin que de 30

minutes pour faire ragir les

antioxydants de lchantillon (au lieu de

2 heures 20 C) (internet 1). Pour finir,

les antioxydants pourraient tre les

molcules de lavenir et elles gagnent

tre connues, car elles pourraient viter

bien des problmes de sant, comme

les cancers, car elles inhibent certaines

ractions chimiques nfastes qui se

produisent dans le corps humain comme

par loxydation. Il y a ici certainement

beaucoup faire.

Remerciements :

Laide de certaines personnes

grandement influenc le droulement de

cette exprience il est donc important de

les remercier pour leur aide.

Premirement, merci Laurent Bazinet,

professeur lInstitut des

Nutraceutiques et des Aliments

Fonctionnels (INAF) luniversit Laval,

car cest lui qui a fourni le protocole

utilis. Ensuite, merci Steve Gamache,

notre tuteur, qui a grandement aid

dans ce projet, et ce, plusieurs

niveaux. Merci galement Marc

Dufour, qui a tout particulirement aid

pour la partie biologique du projet et

dans llaboration dune des

hypothses. Pour terminer, merci

Marie Lefranois, qui a grandement aid

pour tout ce qui est du matriel et de la

commande des produits utiliss lors de

lexprimentation.

Rfrences :

Internet 1:http://waterhouse.ucdavis.edu

/phenol/folinmicro, Folin-Ciocalteau

Micro Method for Total Phenol in Wine,

consult le 3 fvrier 2010.

Internet 2:lpva.snv.jussieu.fr/.../TP%20p

hnols%20LV213.doc, Consult le 11

mai 2010.

11

Internet 3 : http //www.valdevire-

bioactives.com/francais/produits/dosage

.php, consult le 11 mai 2010.

Internet 4:http://fr.wikipedia.org/wiki/Antioxydant, consult le 3 fvrier 2010.

Internet 5: www.passeportsante.net, consult le 21 mars 2010.

Internet 6:http://fr.wikipedia.org/wiki/Ph%C3%A9nol_(groupe), consult le 11 mai 2010.

Internet 7:http://fr.wikipedia.org/wiki/Polyph%C3%A9nol, consult le 11 mai 2010.

Internet 8: www.planetezen.net, consult le 21 mars 2010.

Internet 9:www.medicms.be/dt4/vinrouge.htm , consult le 21 mars 2010.

Internet 10:www.selection.ca/mag/2005/11/aliments_sant.php, consult le 21mars 2010.

internet 11:http://fr.wikipedia.org/wiki/Vin_blanc, consult le 11 mai 2010.

internet 12 :http://fr.wikipedia.org/wiki/Vin_rouge, consult le 11 mai 2010.

internet 13 :http://fr.wikipedia.org/wiki/Camellia_sinensis,consult le 11 mai 2010.

Internet 14 :http://news.reseau-concept.net/images/oiv/Client/MA-F-AS2-10-INDFOL.pdf, consult le 12 mai 2010.

Internet 15 : www.ispc-int.com/.../other.../ispc_workshop_carnaval_in_venice_bentobox_fr.ppt, consult le 3 fvrier 2010.

Internet 16 : http://fr.wikipedia.org/wiki/Acide_gallique, consult le 12 mai 2010.

Slinkard: Singleton, V. L. Total Phenol Analysis: Automation and Comparison with Manual Methods. American Journal of Enology and Viticulture 1977, 28: 49-55

Singleton et Rossi: AJEV 1965, 16: 144 158

Dufour 2010: Marc Dufour, professeur de biologie au centre dtudes collgiales Chibougamau.

12

Annexe 1

(Liste du matriel et des solutions)

Matriel :

Micropipette 10 cuvettes de plastiques ou de verre 10 ballons jaugs de 100 mL Balance analytique Nacelles Pipette de 10 mL Plaque chauffante Bcher de 1000, 500, 100 mL Ballon jaug de 1000 mL Entonnoir Papier filtre Spectrophotomtre UV Bouteille de verre Tige de verre

Solutions :

Eau distille Ractif de Folin-Ciocalteu Solution courante dacide gallique Solution de carbonate de sodium Vins rouges Vins Blancs Ths

13

Annexe 2

(Courbe talon)

y = 803,01x + 13,326 R = 0,9935

0

100

200

300

400

500

600

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

con

cen

trat

ion

d'a

cid

e g

alliq

ue

(an

tio

xyd

ants

)

absorbance a 765nm

courbe talon

14

Annexe 3

(Protocole de Folin-Ciocalteu)

Folin-Ciocalteau Micro Method for Total Phenol in Wine

Andrew Waterhouse Department of Viticulture & Enology

University of California, Davis

This method is used routinely in our lab to measure total phenol. The procedure is also used for analysis of total phenol in tea. It uses the minimum volume of reagents and almost eliminates wasted reagent. Good micro pipets must be used for reproducibility. Plastic or glass cuvettes can be used. It is based on the method reported in Slinkard, K.; Singleton, V. L. Total Phenol Analysis: Automation and Comparison with Manual Methods. American Journal of Enology and Viticulture 1977, 28: 49-55; only the volumes have been reduced. If you cannot reproducibly measure such small volumes, try to reduce the volumes to the smallest you can. This reduces waste and disposal volume. http://www.milonic.com/removelink.php Folin Ciocalteu Reagent. This is usually purchased as the 2N reagent available from Sigma (F9252) or from Fisher Scientific (ICN19518690), and presumably others.

15

Singleton and Rossi AJEV 1965, 16: 144-158, describe the preparation of the reagent from sodium tungstate, sodium molybdate, lithium sulfate, bromine, and some acids.

Gallic Acid Stock Solution. In a 100-mL volumetric flask, dissolve 0.500 g of dry gallic acid in10 mL of ethanol and dilute to volume with water. Can be opened daily, but to store, keep closed in a refrigerator up to two weeks.

Sodium Carbonate Solution. Dissolve 200 g of anhydrous sodium carbonate in 800 mL of water and bring to a boil. After cooling, add a few crystals of sodium carbonate, and after 24 hr, filter and add water to 1 L.

To prepare a calibration curve, add 0, 1, 2, 3, 5, and 10 mL of the above phenol stock solution into 100 mL volumetric flasks, and then dilute to volume with water. These solutions will have phenol concentrations of 0, 50, 100, 150, 250, and 500 mg/L gallic acid, the effective range of the assay.

From each calibration solution, sample, or blank, pipet 20 L into separate cuvettes, and to each add 1.58 mL water, and then add 100 L of the Folin-Ciocalteu reagent, and mix well. Wait for between 30 sec and 8 min, and then add 300 L of the sodium carbonate solution , and shake to mix. Leave the solutions at 20C for 2 hr and determine the absorbance of each solution at 765 nm against the blank (the "0 mL" solution) and plot absorbance vs. concentration. Alternatively, they can be left at 40C for 30 min before reading the absorbance.

For white wines, add 20 L as for the calibration solutions, but in the case of red wines, dilute the wines by 10 first, then add 20 L (or skip the dilution and add 2 L if you have precise micro pipettors).

Create a calibration curve with the standards and determine the levels in the samples. Do not neglect to multiply the observed concentrations by any dilution factor of the original sample. Results are reported at Gallic Acid Equivalent, GAE, because the phenols in wine contain mostly other phenols, and only small amounts of gallic acid.

Interferences. Reducing sugars such as glucose and fructose cause minor interferences and must be corrected. Sulfites also cause an interference but the magnitude is variable. It is usually not an important factor except for white wines with medium to high sulfite levels (>50 mg/L) and low phenol levels (

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the stability of gallic acid standard solutions and we can say they lose less than 5% of their value over two weeks when refrigerated and kept tightly closed.

You MUST make up your own standard curve each time the analysis is run. Do not use this data as a standard curve. It is here only as an example of a typical standard curve.

For more details on the Folin Ciocalteau analysis procedure, please see: Waterhouse,

A.L., Determination of Total Phenolics, in Current Protocols in Food Analytical

Chemistry, I1.1.1-I1.1.8, Wrolstad, R.E., Wiley, 2001, or Singleton, V. L.; Orthofer, R.;

Lamuela-Raventos, R. M. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and

antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent. Methods in Enzymology 1999, 299,

152-178.

http://waterhouse.ucdavis.edu/phenol/folinmicro

Documents

ASP 2010 CECC - Les Antioxydants