Aspecte Genetice in Apoptoza

  • Published on
    26-Jan-2016

  • View
    224

  • Download
    6

Embed Size (px)

DESCRIPTION

lucrare de diplomaAspecte Genetice in Apoptoza

Transcript

UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

1. Introducere

1.1 Scurt istoric al studiilor asupra apoptozei

Moartea celular este un element necesar n decursul vieii unui organism multicelular, ndeplinind numeroase funcii.

Prima descriere a apoptozei n decursul dezvoltrii embrionare a fost realizat de Vogt1 n 1842, iar primul studiu integrativ care a propus conceptul de apoptoz a fost realizat de ctre Kerr2 n 1972, care a observat recurena fenomenului n timpul proliferrii celulare sau n situaii patologice.

Numeroi cercettori au propus termeni diferii pentru a descrie fenomenul, cum ar fi anoikis, degenerare, autoliz, cromatoliz, sinucidere celular (vezi Majno i Jolis, 1995)3, fapt care se datoreaz modelelor diferite de cercetare.

Dac nainte de precizarea terminologic termenul de necroz era utilizat ca un termen general pentru a descrie toate tipurile de moarte celular, astzi el este folosit cu un coninut limitat la dezintegrarea pasiv a celulei, diferit de distrugerea voluntar, programat a acesteia. Pe parcursul acestei lucrri voi folosi termenul de moarte celular programat (MCP) ca fiind similar celui de apoptoz.

Analiza in vivo diferitelor tipuri de moarte celular non-necrotic a artat existena unor trsturi comune, indiferent de originea celulei sau stimulul utilizat.

Cu toate acestea, studiile in vitro au evideniat diferene n expresia proceselor sau inexistena unor trsturi tipice n anumite cazuri. De pild, utilizarea staurosporinei pentru a induce apoptoz genereaz distrugerea celulei fr formarea corpilor apoptotici, probabil datorit aciunii inhibitorii asupra unor kinaze implicate n apoptoza normal .4De asemenea, metamorfoza insectelor difer n anumite privine de tipul descris ca universal 5, iar n anumite cazuri cnd apoptoza este genetic imposibil, distrugerea capt o expresie diferit 6.

1.2 Necroza vs. Apoptoza

Despre diferenele dintre necroz i apoptoz pn s-a scris o literatura bogata, accentundu-se caracterul voluntar, controlat i dinamic al apoptozei, sau diferenele morfologice caracteristice fiecrui proces n parte. 1

Exist ns unele procese ce mprtesc cu apoptoza multe trsturi dar crora le lipsesc altele caracteristice acesteia, sau care ncalc modelul descris ca fiind tipic. 2S-a observat recurena necrozei n urma acelor procese de leziune celular brutal, cum ar fi atacul a numeroi ageni fizici sau chimici, hipoxia, toxinele, infeciile, fiind acceptat rolul necrozei n rspunsul generat la adresa unor ageni patogeni i importana procesului imflamator. 3Unele dintre elementele necrotice distinctive sunt scderea ATP citosolic, datorit creterii permeabilitii membranare, disfuncia unor canale cationice, degradarea fosfolipidelor i creterea calciului intracitoplasmatic. 4

Are loc prin urmare dilatarea reticulului endoplasmatic, degradarea membranelor mitocondriale i modificarea activitii translaionale.

n a doua faz necrotic se declanaz o degradare accentuat a membranelor celulare i a organitelor, hidratarea mitocondriilor i apariia unor agregate dense i bogate n lipide.

Dac n apoptoz celula n restrnge n mod treptat volumul, n necroz are loc un proces invers; cromatina apare agregat haotic, fiind mprtiat aleatoriu. 5 Celulele devin eozinofile, iar citoplasma este vacuolizat; degradarea final a organitelor nu este urmat de apariia unor structuri similare corpilor apoptotici.

n apoptoz, modificarea volumului celular se realizeaz prin pierderea de ap i ioni, nu ns i de macromolecule, membranele rmnnd relativ intacte; apar cute 6 la suprafaa plasmalemal, iar organitele rmn nedigerate pn la final. Condensarea cromatinei este ordonat, are loc fragmentarea i condensarea sa n mase compacte distincte la nivelul laminei celulare.

Caracteristica definitorie este fr ndoial formarea corpilor apoptotici i activarea programului fagocitar, ceea ce nu declanaz inflamaia.

Procesul apoptotic este controlat genetic, n etape distincte, fiind declanat ireversibil dup depirea unui punct critic 7, iar sinteza proteic nu cunoate un moment similar celui catastrofic necrotic. n acest caz sunt activate endonucleazele (calciu i magneziu dependente i care sunt inhibate de ctre Zn) care fragmenteaz ADN la nivelul fragmentelor linker, rezultnd fragmente de 180 200 perechi de baze 8.

La celulele anucleate apoptoza urmeaz acelai scenariu, chiar n absena degradrii nucleare.

Apoptoza necesit sinteza unor proteine cu rol apoptotic i ca urmare nu se produce o dezorganizare rapid a procesului.

Recent s-a descoperit c procesul sintetic este inhibat prin distrugerea factorului 4G eucariotic 9, ceea ce nu afecteaz sinteza proteinelor cu funcie prooncogen de tip c myc care necesit un segment intern de ataare ribozomal (IRES) localizat la segmentul 5 reglator.

Pentru a sintetiza, apoptoza este caracterizat de urmtoarele trsturi: 101. membranele plasmatice rmn intacte, formnd ns cute;

2. reducerea volumului celular ;

3. condensarea cromatinei la periferia nucleului, ce devine picnotic;

4. fragmentarea ADN si a nucleului;

5. distrugerea structurilor membranare;

6. vacuolizarea citoplasmei;

7. formarea corpilor apoptotici.

1.3 Funciile apoptozei

Acest proces nu este numai unul de curare, ci i unul de construcie, avnd un rol hotrtor n dezvoltare.

Apoptoza intervine n modelarea unor structuri (formarea unor caviti) 1, eliminarea celulelor redundante (neuronii motori ai vertebratelor), sau n turnover-ul tisular normal. 2De asemenea, apoptoza are o funcie esenial n meninerea homeostaziei tisulare, cum ar fi cazul hematopoiezei, meninnd un echilibru ntre proliferare i eliminare. 3Prin apoptoz sunt ndeprtate celulele sistemului imunitar care recunosc antigenele self, celulele imunitare activate inutile, clonele care genereaz anticorpi anti-self, si celulele T care nu recunosc CMH sau cele cu mare afinitate pentru antigenele self. 4Limfocitele T pot fi distruse n manier Fas-independent sau Fas-dependent.

Apoptoza reprezint un mecanism fundamental de protecie a organismului n cazul infeciei virale, cnd mecanismul de atac preferat al virusurilor este sinteza proteinelor cu funcie antiapoptotic, cum ar fi LPM 1 sau LPM 2, n cazul virusului Epstein Barr 5, sau proteina Tat care blocheaz apoptoza, n urma infeciei cu HIV 6.

Alteori virusurile modific proteina cu rol proapoptotic, pentru a favoriza diseminarea.

La fel se ntmpl n cazul infeciilor bacteriene, ns n timp de virusurile au mecanisme eficiente de inhibare a apoptozei pentru a iniia propria replicare, bacteriile au nevoie de supravieuirea celulelor infectate.

Apoptoza este necesar i n procesul de eliminare a celulelor cu rol imflamator, dup ndeplinirea funciei. 7Mecanismele apoptotice nefunctionale duc la apariia tumorilor, dar, dat fiind importana procesului, o vom trata ntr-un capitol separat. 8Apoptoza este implicat n numeroase maladii dintre care citm :

A) Boli neurodegenerative: Alzheimer, Parkinson, scleroz lateral amiotrofic, degenerescen cerebral;

B) Sindrom mielodisplazic;

C) Infarct miocardic.

1.4 Trsturi generale ale apoptozei

1.4.1 Apoptoza n cazul celulelor nucleate.

Putem clasifica trsturile apoptozei n eseniale i neeseniale. Cea mai importan trstur a celui de-al doilea tip este modificarea de la nivelul nucleului, deoarece apoptoza are loc n aceeai form i n celulele anucleate (Jacobson, 1994, Osthoff, 1994)1. Asemenea trsturi sunt clasificate ca postmortem, putnd fi absente n anumite cazuri, i au loc dup punctul de nentoarcere (point of no return).

n 1966 Tata2 a observat faptul c apoptoza necesit ARN i sintez proteic, ceea ce a subliniat faptul c acest proces este unul activ, dinamic, iar recurenta unor trsturi comune a generat speculaia c procesul apoptozei este reprezentat de catre o cale biochimic unic 3 fapt ce a fost ntrit de descoperirea existenei acelorai principii de organizare si n cazul C. elegans i al omului.

Dar faptul care a generat o teorie unificat despre apoptoz a fost descoperirea caspazelor, care au fost identificate n toate organismele, mai puin n drojdii, fiind identificate insa i unele mecanisme apoptotice ce nu necesit existena lor.

Ipoteza original a fost aceea c apoptoza const in primul rand n distrugerea citoscheletului de ctre caspaz, ceea ce a fost infirmat ulterior. (Martin 1995) .41.4.2 Dinamica citoplasmatic

Schimbrile sunt predominant biochimice, nu morfologice, cu excepia dispariiei microvililor ce are loc n urma activrii caspazelor i concomitent cu defosforilarea ezrinelor si a radixinelor care stabilizeaz microvilii prin interaciunea cu actina.

Schimbrile plasmatice cele mai evidente sunt datorate semnalelor fagocitice adresate celulelor nconjurtoare, ceea ce va activa ultima etap a apoptozei. 51.4.3 Schimbri la nivelul formei i structurii

n timpul apoptozei, celula i modific forma, distrugnd relaiile cu vecinii, iar la suprafaa membranei apar anumite cute (blebs) precednd formarea corpilor apoptotici.

La nivelul citoplasmei apar uneori vacuole, proces ce urmeaz distrugerii citoscheletului, in distrugerea acestuia un eveniment fundamental constituiindu-l activarea caspazelor, care distrug direct gelsolina, fodrina, actina sau Gas 2 (Kotha-Kota, Martin, Mashima). 6La soarecii knok-out pentru caspaza 3 apoptoza hepatocitelor i timocitelor prezint o formare mai redus a cutelor, lucru observat i n cazul unei linii celulare derivate dintr-un cancer mamar uman. Dac tratm celulele cu proteinaz K, cutele se formeaz n mod normal, iar adugarea inhibitorilor caspazici anihileaz aceast formare, ceea ce evideniaz rolul caspazelor.

Distrugerea citoscheletului 7 nu e haotic, ci organizat, ea necesitnd actina, care formeaz o structur asemntoare unui cerc la periferie, i gelsolina modificat, soarecii K.O. pentru gelsolin avnd o formare mai ntrziat a cutelor.

Odat declanat de activarea caspazei 3 formarea acestora e inevitabil, chiar dac sunt adugai inhibitori caspazici.

La nivelul miozinei au loc fosforilri pa lanul uor de ctre MLCK (miosin light chain kinase), care determin o nou interacie actin lanul uor al miozinei. 8Reorganizarea citoscheletului necesit numeroase kinaze: MAP kinaza ce fosforileaz hs27 1, (II). Pak 2 ce activeaz p 21, n urma actiunii caspazelor (III). SLK, Ste-20 kinaza, care e clivat de caspaza 3 i care rearanjeaz citoscheletul. Pak 2 e implicat n formarea corpilor apoptotici, iar din moment ce acest proces este inhibat de citocalasina B, probabil ca e implicat i actina F.

Apariia vacuolelor depinde de activarea caspazelor, o protein implicat fiind rabaptina 5 care afecteaz membrana celular.91.4.4 Schimbri la nivelul organitelor citoplasmatice

Distrugerea acetora este tardiv, schimbri mai pronunate aprnd la nivelul RE 10 care se dilat i pierde ribozomii ataai, iar proteina integral Bap 31 de leag de Bcl 2 i pro-caspaza 9, fiiind distrusa de ctre caspaze. Clivarea rabaptinei 5 va afecta fuziunea endozomilor i va dezorganiza metabolismul. Daca sunt translocate caspaze sau numai factori activati de catre acestea ramane de stabilit, in prezent ambele tabere avand argumente pro si contra.

Clivarea laminelor A i B are loc la nceput, ns caspazele nu distrug proteinele direct , ci prin intermediul altor molecule care au funcie special n apoptoz. 11Distrugerea ADN se realizeaz la nivelul unor segmente 200 300 Kpb, iar proteinele numite ICAD/CAD/DFF45/DFF 40 au un rol important n fragmentare, existnd n form inactiv ca dimeri, DFF 40 fiind complexat de DFF 45 protein chapperone. 12DFF 45 e clivat de ctre caspaz i e eliberat DFF 40 care realizeaz tieturi dublu catenare, mai ales in segmentul de legtur dintre nucleosomi.

oarecii trasgenici cu defecte n CAD au o fragmentare incoerent, iar tratamentul celulelor cu caspaz duce la condensarea cromatinei dar procesul e inhibat in urma tratamenului cu DFF 45.

Recent a fost izolat o protein numit Acinus 13 care e activat de ctre caspaz i care induce fagocitoza corpilor apoptotici si acest lucru se realizeaz att in cazul fagocitelor ct i in cel al celulelor nespecializate (de exemplu celulele epiteliale).

Distrugerea celulei se face pe o cale lizozomal n primul rnd n celula apoptotic prin autofagie, fiind descris o protein beclina, care se leag de Bcl 2 i e implicat n fagocitoz.14Alteori corpii apoptotici sunt digerai de ctre celulele vecine pe cale lizozomal.

1.4.5. Mitocondria

Dincolo de funcia apoptotic a mitocondriei datorit Bcl 2, unele modificri apar la nivelul membranei externe care e rupt n urma umflrii matrixului, ulterior aprnd fenomenul de condensare.15 Exist momentan o dezbatere privind implicarea mitocondriei n apoptoz, ideea acceptat de catre majoritatea comuniatii stiintifice a primatului ei n activarea caspazelor fiind contestat de actre o minoritate cu solide argumente in spate. Li Hu de la Burnham Institute a identificat un tip de receptor nuclear care prsete nucleul i intr n mitocondrie, elibernd citocromul c.

A. Marchenko (Stony Brook) a identificat un mecanism similar n cazul p 53, care se poate localiza la nivelul mitocondriei genernd o apoptoz mai rapid.

Alii au subliniat influenele tipurilor de modele de cercetare asupra rezultatelor, studiile pe C. elegans sugernd o activare caspazic independent de modificarea permeabilitii mitocondriale.

H. Steller a artat c p 53, un inhibitor caspazic al unor virusuri, previne apoptoza n retina unor insecte au o structur asemntoare retinis pigmentosa, ceea ce susine ideea aciunii caspazelor naintea aciunii mitocondriei.

1.4.6 Nucleul

Trstura iniial o constituie condensarea periferica a cromatinei, iar ulterior apare fragmentarea nucleului i dezintegrarea sa datorit degradrii ADN i a proteinelor nucleare. 16Caspazele 3 i 6 atac proteinele nucleare, cum ar fi lamine, proteinele scaffold, si DFF 45 ( Inhibitor DNA fragmentating factor/ ICAD).

Nucleul este distrus i integrat n corpii apoptotici; un alt factor implicat n apoptoz, AIF, declaaz apoptoza independent de caspaze i determin condensarea parial a cromatinei.

1.4.7 Reglarea volumului celular

Acesta nu este un mecanism pasiv, 17 pierderea volumului celular din timpul apoptozei n opoziie cu mecanismul necrotic de umplere, unde membrana plasmatic este rupt datorit pierderii timpurii de ATP care oprete transportul ionic, fiind controlata. Ruperea membranei plasmatice i eliberarea coninutului celular duce la un rspuns inflamator, n timp ce apoptoza este acompaniat de scderea volumului celular i meninerea integritii organitelor, iar integritatea plasmalemei se menine pn la sfrit. 18Celula a dezvoltat mecanisme reglatorii prin utilizarea canalelor ionice, transportorilor i reorganizarea citoscheletului pentru a menine ciclul celular.

La mamifere rinichii joac rolul de filtru ionic, ns datorit modificrii biochimice celulele trebuie s-i ajusteze singure volumul prin mecanisme de mrire (RVI) sau scdere (RVD) a volumului.

Principalii ioni sunt...