Aula de Bioprocessos

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Estgios no processo produtivo

Aula 2 - Profa Dra Ilana L. B. C. Camargo Cincias Fsicas e Biomoleculares

IFSC - USP

1- Os trs estgios do bioprocesso

2- Biorreatores

3- Upstream

3.1 Escolha do Biocatalisador

3.2 Obteno do Biocatalisador

3.3 Conservao do Biocatalisador

Estgios no processo produtivo

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1. Os trs Estgios do bioprocesso

Biotecnologia do bioprocesso tem trs estgios:

Processo Upstream

Biorreatores e biorreao

Processo Downstream

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Upstream

Biorreao /Biorreator

Downstream

Bioprocesso aplicao industrial de reaes ou vias biolgicas

mediadas por clulas vivas inteiras de animais, plantas,

microrganismos ou enzimas sobre condies controladas para a

biotransformao de matrias primas em produtos

Bioprocesso tambm pode ocorrer sem resultar em um

produto direto biorremediao, desintoxicao de resduos

ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados

Produto alimento, medicamento ou composto industrial

Escala laboratorial Escala industrial

Estgios do processo produtivo

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2. Biorreatores

Biorreator ou fermentador

Biorreatores, reatores

bioqumicos, reatores biolgicos

so os reatores qumicos nos

quais ocorrem uma srie de

reaes qumicas catalisadas por

biocatalisadores

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Biorreator de 90L

Biorreator de bancada

http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930

Biorreator ou fermentador

http://en.wikipedia.org/wiki/Bioreactor

3- Processo Upstream

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Processo Upstream

Escolha do biocatalisador

Preparo da matria prima ou substrato a ser processado

Preparao de meio e sua esterilizao

Alimentao do biorreator

Regulao de temperatura, pH e presso

Inoculao da cultura no meio assepticamente

Biorreao

Caractersticas gerais desejveis de microrganismos para aplicao industrial:

1. Apresentar elevada eficincia na converso do substrato

em produto;

2. Permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter

elevada concentrao do produto no caldo fermentado;

3. No produzir substncias incompatveis com o produto;

4. Apresentar constncia quanto ao comportamento

fisiolgico;

5. No ser patognico

6. No exigir condies de processo muito complexas;

7. No exigir meios de cultura dispendiosos;

8. Permitir a rpida liberao do produto para o meio.

Processo Upstream

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1 - Apresentar elevada eficincia na converso do substrato em

produto;

Matrias-primas incidem pesadamente no custo do produto final

(38 a 73% do custo total de produo)

C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2

1 g glicose 0,511g de etanol

S. cerevisiae rendimento de 90% da reao de fermentao anaerbia

Destilao - perda

Quando o produto produzido em menor quantidade em relao ao acar

consumido (enzimas ou antibitico) o custo com a recuperao do

produtos so mais onerosas

Processo Upstream

2 - Permitir o acmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentrao do produto no caldo fermentado; Sem sofrer inibio mais acentuada em virtude deste acmulo 3 -No produzir substncias incompatveis com o produto; Sem produzir proteases extracelulares Linhagens que crescem relativamente menos, ou que acumulem menos compostos intermedirios incrementam a sntese do produto

Processo Upstream

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3 -No produzir substncias incompatveis com o produto;

Exemplo: Aspergillus produz glicoamilase glicoamilase Amido Glicose Vrias aplicaes (xaropes de glicose na indstria de alimentos)

Alguns microrganismos tambm sintetizam transglicosidase que polimeriza a glicose novamente, porm de uma forma que

no so mais hidrolisadas pela glicoamilase

Processo Upstream

Caracterstica importante: Estabilidade fisiolgica da linhagem

No basta uma linhagem hiperprodutora de uma substncia,

mas que se conhea as tcnicas mais adequadas para sua

conservao e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente

produtora da substncia de interesse ao longo de todas as

etapas envolvidas desde sua proliferao no laboratrio,

germinadores e biorreator principal

Processo Upstream

4. Apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico

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Para a clula h sempre a tendncia de otimizar o crescimento,

em detrimento da sntese do produto, motivo pelo qual no

basta verificar se a clula cresce, mas se ela continua a

acumular o produto de maneira eficaz!!

Durante a proliferao da clula h sempre chances de

mutaes naturais!!

Massa pequena de clulas no inculo

Biorreatores de dezenas de milhares de litros 10g de matria seca de clulas/ L

Processo Upstream

5. No ser patognico!!

Sem riscos ambientais, particularmente nas etapas

seguintes ao trmino da fermentao (downstream)

Se manuseasse microrganismos patognicos em reatores de

dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante

aumentados, o que incidiria em custos adicionais

So utilizados patgenos para produo de vacinas em reatores de

pequeno porte (poucos milhares de litros), porm confinados em

cmaras asspticas, tomando-se precaues necessrias para a no

contaminao do meio ambiente

Processo Upstream

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Tcnicos do Instituto Butantan trabalham na rea de fermentao da linha de produo de vacinas

http://planetasustentavel.abril.com.br/album/albumFotos_301191.shtml?foto=3

http://www.leptospirosenobrasil.com.br/index.php

Fort Dodge (Pfizer)

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6. No exigir condies de processo muito complexas

pH e Temperatura: em reatores de grande porte no h controle

preciso, por isso o ideal que o microrganismo tenha uma faixa

de valores timos dessas grandezas e no valores pontuais,

particularmente no que se refere ao acmulo do produto

Processo Upstream

Heterogeneidade ao longo da altura do reator

Reatores de grandes portes (dezenas de milhares de L)

Importante: clulas devem manter seu

desempenho dentro de uma faixa de

valores timos!!

pH e oxignio

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Biotecnologia do bioprocesso


Tenso de oxignio: os microrganismos que conseguem manter

um bom desempenho quando cultivados em baixas concentraes

de oxignio so muito interessantes

H maior gasto de energia para

a agitao e aerao do meio!

Processo Upstream


Tenso de oxignio:

Processo Upstream

Microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por

exemplo) so evitados, pois a concentrao de oxignio no meio de

cultivo ter de ser mais elevada, a fim de que as clulas mais internas

destes aglomerados tenham acesso a este oxignio, quando

comparadas s clulas que crescem isoladamente

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No conveniente trabalhar com linhagens que excretam uma

quantidade exagerada de protenas para o meio

Gerao de espuma.

Isso torna complexo os processos aerbios

devido necessidade de aerar e agitar o

contedo do biorreator


Processo Upstream


7. No exigir meio de cultura dispendioso

1. Ser o mais barato possvel;

2. Atender s necessidades nutricionais do microrganismo;

3. Auxiliar no controle do processo, como o caso de ser

ligeiramente tamponado, o que evita variaes drsticas do

pH, ou evitar uma excessiva formao de espuma;

4. No provocar problemas na recuperao do produto;

5. Os componentes devem permitir algum tempo de

armazenagem, a fim de estarem disponveis o tempo todo;

6. Ter composio razoavelmente fixa;

7. No causar dificuldades no tratamento final do efluente.

Processo Upstream

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Meios sintticos ou definidos podem ser onerosos, mas tem composio

conhecida e podem ser reproduzidos a qualquer instante.

Para clulas que apresentam bom desempenho em meios desse tipo,

espera-se a ocorrncia de um sistema produtivo muito estvel, alm de

no apresentarem problemas quanto recuperao e purificao do

produto final.

Meios definidos ou sintticos podem ser preferidos se permitirem uma

maior economia nas etapas de recuperao do produto

Processo Upstream



Algumas linhagens precisam de fatores de crescimento como aminocidos ou vitaminas (biotina, timina, riboflavina etc)

Adiciona-se as substncias puras para manter o meio em sua forma

mais definida No entanto... Isso pode se tornar invivel financeiramente quando as instalaes so de grande porte.

Alternativa: adicionar materiais complexos como extrato de levedura (autolisado de levedura), extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de protenas) etc Problema: substncias caras, composio varivel (ao longo do tempo de armazenagem e na dependncia do fabricante e do lote empregado) oscilao no processo fermentativo!!!

Processo Upstream

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Meios mais complexos e menos caros empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala:

Matrias-primas naturais: caldo de cana-de-acar, melaos, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), gua de macerao de

milho (Corn Steep Liquor) etc

Composio qumica desconhecida

Pode-se conhecer os teores de aucares disponveis, nitrognio, fsforo,

mas no se conhecem os teores dos sais minerais

Sempre so completados com alguns sais (contento nitrognio e fsforo)

Variao conforme: solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante colheita e estocagem etc oscilaes no processo fermentativo!!

Processo Upstream



Empresas que produzem antibiticos ou enzimas e que utilizam essas

matrias primas naturais, principalmente a gua de macerao de milho,

devem manter uma planta piloto para o ajuste da composio do meio a

cada novo lote de matria-prima recebida para evitar surpresas nos

biorreatores de grande porte

Por serem as mais baratas so as mais utilizadas

Porm podem causar problemas adicionais na recuperao e purificao

do produto final, bem como problemas nos tratamentos das guas

residurias

Processo Upstream

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8. Permitir a rpida liberao do produto para o meio

Se o produto liberado no meio, ele poder ser recuperado nas

etapas seguintes de uma forma mais simples, sem a necessidade de

lise celular e outras reaes que elevam o custo

Se algum produto permanecer dentro das clulas ele poder ser

perdido aps a separao das clulas do meio aps a fermentao

Pode haver uma eventual inibio do prprio microrganismo pela

reteno de um dado produto do metabolismo

Reteno de certos produtos nas clulas depende entre outros

fatores de: linhagem empregada, da composio do meio de cultura e

das condies impostas (pH, temperatura, etc)

Processo Upstream

3.2. Obteno de Biocatalisadores

Processo Upstream

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3.2. Obteno de Biocatalisadores

Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser

obtidos basicamente das seguintes formas:

Isolamento a partir de recursos naturais

Compra em colees de culturas (ATCC, NCTC...)

Manipulaes genticas:

1. Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais

2. Fuso de protoplastos

3. Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de

engenharia gentica

Processo Upstream

Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais

Solo gua Plantas

Atividade de grande importncia para obteno de novas

linhagens de interesse industrial como linhagens melhor

produtoras de um dado produto. Alm disso, pode conduzir

descoberta de novos produtos, o que confere a esta

prtica uma relevncia inequestionvel

Muito trabalho experimental Custo relativamente elevado


Processo Upstream

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Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais

Compra em colees de culturas

Agricultural Research Service Culture Collection - (EUA) American Type Culture Collection (ATCC) - (EUA) http://www.atcc.org/

Coleo de Culturas Tropical (Campinas-SP) http://www.cct.org.br

National Collection of Type Cultures (NCTC) - (Reino Unido) http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp

German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Alemanha) Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Sade - INCQS Lab. de Microrganismos de Referncia - Fundao Oswaldo Cruz - FIOCRUZ

Disponveis em vrios pases Compra bastante vivel Facilidade atravs dos recursos da Internet

Microrganismos produtores de antibiticos, em geral, no esto disponveis em uma coleo de culturas

Oriundos de programas de melhoramento gentico

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Manipulaes genticas

1. Obteno de mutantes induzidos por mtodos convencionais

2. Fuso de protoplastos

3. Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de

engenharia gentica


Processo Upstream

Obteno de mutantes induzidos por

mtodos convencionais

Proliferao celular mutao natural

Isolados

Potencialidade de produo

- Mutantes naturais muito tempo - Mtodos que foram a mutao: radiaes ultra-violeta, substncias qumicas (nitrosoguanidina) Destri-se a maioria das clulas e recuperam-se as mutadas Verifica-se se a mutao ocorreu na direo desejada

Mutao deleo ou adio de uma ou mais partes qumicas

da molcula do DNA

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Penicillium chrysogenum NRRL 1951 Modificada por mutaes

Produo de penicilina aumentou de 120 UI para 2658 UI (~20x)

Mutao pode levar perda da funo de

caractersticas indesejadas ou aumento da

produo por perda das funes de controle

Raramente leva ao aparecimento de novas

funes ou propriedades

Utilizar em microrganismo com a

caracterstica desejada para melhoramento

Fuso de protoplastos Protoplastos Frgeis sem parede celular Sem capacidade reprodutiva

Sem parede celular, a probabilidade de fuso celular entre diferentes

espcies aumenta

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Protoplasto

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Protoplast_fusion.jpg

Protoplastos de clulas das folhas de petnias

Protoplasto de fuso da clula da folha com a da ptala

Digesto da parede celular

Meio isotnico

Fuso de protoplastos

Muito utilizados com leveduras, fungos filamentosos e plantas

1. Protoplastos so preparados cultivando as clulas em meios

isotnicos enquanto tratam-nas com enzimas;

2. Os protoplastos so regenerados usando estabilizadores osmticos

como a sacarose;

3. Se a fuso ocorre para formar hbridos, os recombinantes desejados

so identificados atravs de meios seletivos;

4. Aps a regenerao da parede celular, o microrganismo pode ser

utilizado para futuros estudos.

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- Fuso pode ser realada usando polietileno glicol e

tratamento das preparaes com irradiao ultravioleta

- Fuso de clulas humanas ou de animais

-Usado para o melhoramento da produo de antibiticos por

combinar mutaes de diferentes linhagens ou at mesmo

espcies

-Facilita a transferncia de DNA recombinante

-Mtodo de associar grupos inteiros de genes entre diferentes

linhagens de macro- e microrganismos


Fuso de clulas de mamferos que levam produo de anticorpos monoclonais.

Anticorpos so a principal defesa dos mamferos. Uma clula de linfcito

B produz um nico tipo de anticorpo

A produo de linfcitos B em meios de cultura no teve sucesso pois eles ou morriam ou paravam de produzir anticorpos

1975 Georges Khler e Cesar Milstein

demonstraram a produo de anticorpos monoclonais de um hibridoma (produto de fuso) de Linfcitos B (clulas produtoras de anticorpos) e

clulas tumorais de mieloma

1984 Prmio Nobel

1990s o valor comercial de terapias por anticorpos sozinha valia US$ 6 bilhes!!!


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Mudana:

Clulas secretoras de anticorpos

com tempo de vida limitado

Clulas com capacidade contnua de crescimento (imortais) que mantm o

potencial de secretar anticorpos


Hibridomas podem ser congelados e re-utilizados mais tarde

Aplicaes do anticorpo monoclonal:

-Diagnstico in vitro em sade humana, plantas e agricultura

animal

-Futuro: terapia com anticorpos para carregar uma droga

citotxica para o stio de clulas cancergenas

-Biotecnologia industrial: usados como ligantes de alta

afinidade para ligar e purificar produtos caros


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Diagnstico imunolgico

Aplicaes do anticorpo monoclonal

Obteno de microrganismos recombinantes por

tcnicas de engenharia gentica

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Linhagens instveis limitam o emprego de sistemas de

fermentao mais eficientes, como processos contnuos, pois

poder acontecer, ao longo do tempo, a seleo de clulas que

privilegiem o crescimento em detrimento do acmulo do produto

Linhagens naturais Linhagens mutantes Clulas recombinantes por introduo de plasmdeos podem ser instveis

Obteno de microrganismos recombinantes por

tcnicas de engenharia gentica

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3.3 - Conservao do Biocatalisador

Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, ela deve ser conservada

Tcnicas de conservao:

1) Transferncia ou sub-cultura peridica em tubos ou placas

de Petri com meio de cultura slido (viabilidade: semanas)

2) Congelamento em freezers -20 C ou -70 C (anos)

3) Ultracongelamento: -196C, N lquido (anos)

4) Liofilizao: desidratao por sublimao da gua,

sob vcuo (anos ou dcadas)

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Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, elas devem ser conservadas

Walsh G., Pharmaceutical Biotechnology, Willey ed., 2007

... 100

... 100

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Criotubos

Lento

Rpido

Desequilbrio osmtico

Fromao de cristais

intracelulares lise

Congelamento

Bactrias

Clulas de mamferos

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Manual de Criopreservao Nunc

Congelamento rpido minimiza os efeitos de concentrao do soluto pois o gelo forma

uniformemente

Congelamento lento, por outro lado, resulta em grandes perdas de gua da clula e

menos gelo intraceclular, mas aumenta os efeitos da soluo

Congelamento

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Agente de criopreservao

agente qumico que protege as clulas durante o

congelamento. Pode minimizar os efeitos prejudiciais do

aumento da concentrao do soluto e formao de cristal

Congelamento

Mais comuns: Dimetilsulfxido (DMSO) e glicerol (menos txico que DMSO). Escolha depende da clula!! Agentes de criopreservao podem penetrar na clula e causar um congelamento lento intracelular e diminuir os efeitos de soluo. DMSO - Diminui a temperatura de congelamento e permite melhor desitradao da clula antes do congelamento intracelular. DMSO penetra melhor nas clulas e geralmente mais usado para clulas maiores, mais complexas como os protistas.

4 - Produo de etanol

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Upstream

Biorreao /Biorreator

Downstream

Exemplo prtico: Produo de etanol

Upstream

Downstream

Obteno da matria prima; Tratamento/preparo Escolha do microrganismo Preparo do pr-inculo e inculo

Resduos dos gros

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Smith J E, Biotechnology, ed. Cambridge, 2004

Biorreao Biorreatores

Pr-inculo

Inculo

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Prximas aulas!!

- Obteno de microrganismos recombinantes por tcnicas de engenharia gentica

- Biorreatores

- Biorreao

-Processo Downstream

Referncias

Manual de criopreservao Nunc ver site da disciplina

Captulo 3 - Genetics and biotecnology (John Smith Biotechnology)

ver site da disciplina

Prescott, Harley and Klein. 2002 Microbiology, 5th edition, The McGraw-Hill (Chapter 42- Biochemistry - Industrial Microbiology And Biotechnology) ver site da disciplina

Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia

Industrial: Engenharia Bioqumica. Volume 2. Ed Edgard Blcher

LTDA, So Paulo, 2001. Cap. 2.

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