Aus dem Institut für Pathologie (Direktor Univ.- Prof. Dr ... fileAus dem Institut für Pathologie (Direktor Univ.- Prof. Dr. med F. Dombrowski) Abteilung für Neuropathologie (Leiter:

Aus dem Institut für Pathologie

(Direktor Univ.- Prof. Dr. med F. Dombrowski)

Abteilung für Neuropathologie (Leiter: Univ.-Prof. Dr. med. R. Warzok)

der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Thema: Die Expression von P-Glycoprotein, Survivin, Ki-67 und Caspase-3 in menschlichen Astrozytomen und Oligodendrogliomen unterschiedlicher WHO-Grade

Inaugural - Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin (Dr. med.)

der

Medizinischen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2008

vorgelegt von: Alexandra Dreßler geb. am: 19.06.1976 in: München

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer

1. Gutachter: Prof. Dr. R. Warzok (Greifswald)

2. Gutachter: Prof. Dr. Ch. Hagel (Hamburg)

Ort, Raum: Universitätsklinikum Greifswald, Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie,

Raum D 0.31

Tag der Disputation: 29.06.2009

Torsten Dreßler gewidmet.

München, November 2008

Inhaltsverzeichnis II

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I

Abkürzungsverzeichnis III

1. Einleitung 1

1.1 Astrozytäre und oligodendrogliale Hirntumoren 1

1.2 Genetische Grundlagen der Hirntumorentstehung 3

1.3 P-Glycoprotein (P-gp) 4

1.4 Apoptose 6

1.5 Survivin 8

1.6 Zielsetzung dieser Arbeit 11

2. Material und Methoden 12

2.1. Puffer und Lösungen 12

2.2 Chemikalien 13

2.3 Kits und Fertiglösungen 13

2.4 Antikörper 14

2.5 Primer 14

2.6 Gewebeproben 14

2.7 Methoden 15

2.7.1 Immunhistochemie 15

2.7.1.1 Nachweis von P-Glycoprotein (P-gp) 15

2.7.1.2 Nachweis von Survivin 16

2.7.1.3 Nachweis von Caspase-3 16

2.7.1.4 Nachweis von Ki-67 17

2.7.2 In situ Hybridisierung 17

2.7.2.1 Herstellung der DIG-markierten RNA-Sonden 17

2.7.2.2 In situ Hybridisierung von P-Glycoprotein (P-gp) und Survivin 19

2.8 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen und in situ

Hybridisierung 20

2.9 Statistische Auswertung 20

Inhaltsverzeichnis III

3. Ergebnisse 21

3.1 Aufteilung der Gewebeproben 22

3.2 Lokalisation der Hirntumoren 22

3.3 Die Expression von P-Glycoprotein (P-gp) 24

3.4 Die Expression von Survivin 27

3.5 Die Expression von Ki-67 30

3.6 Die Expression von Caspase-3 34

3.7 Die Expression von P-Glycoprotein-RNA 38

3.8 Die Expression von Survivin-RNA 41

3.9 Korrelationen 44

4. Diskussion 47

4.1 Astrozytäre Hirntumoren 48

4.2 Oligodendrogliale Hirntumoren 53

5. Zusammenfassung 57

6. Literaturangabe 58

7. Eidesstattliche Erklärung 69

8. Lebenslauf 70

9. Danksagung 71

Abkürzungsverzeichnis IV

Abkürzungsverzeichnis Abb. = Abbildung

APAF 1 = Apoptose protease activating factor 1 (Apoptose Protease

aktivierender Faktor 1)

AIF = Apoptose inducing factor (Apoptose induzierender Faktor)

ABC = Adenosin-Triphosphat-binding-casette (Adenosin

Triphosphat bindende Kasette

Anti-DIG-AP = Anti-Digoxigenin Antikörper, verbunden mit alkalischer

Phosphatase

ATP = Adenosintriphosphat

Bcl-2 = B-cell lymphoma 2 (B-Zell Lymphom 2)

BCIP = 5-Bromo-4-Chloro-Indolyl-Phosphatase

BCRP = Breast cancer resistance proteine (Brustkrebs-Resistenz-Protein)

Bid = Bcl-2 interacting domain (B-Zell Lymphom 2 interagierende

Domäne)

BIR = Baculovirus inhibitor of apoptosis repeat

BIRP = BIR-domain containing proteins

bzw. = beziehungsweise

CBTR-US = Central brain tumor registry of the United States (Zentrales

Hirntumorregister der Vereinigen Staaten von Amerika)

CD = Cluster of differentiation (Differenzierungscluster)

CDK4 = Cyclin dependant Kinase 4 (Cyclin abhängige Kinase 4)

CDKN2A = Cyclin dependant Kinase 2A-Gene (Cyclin abhängige Kinase 2A-

Gen)

DAB = Diaminobenzidin

DD = Death domain (Todesdomäne)

DED = Death effector domain (Todeseffektordomäne)

d.h. = das heißt

DISC = Death induced signalling complex (Zelltod induzierender

Signalkomplex)

DNA/DNS = Desoxyribonucleinacid/-säure

cDNA = Codierende DNA

DIG = Digoxenin

DIG-dUTP = digoxigenin-markiertes Deoxyuridintriphosphat

Abkürzungsverzeichnis V

DNT = Dysembryoplastischer neuroepithelialer Tumor

dNTP = Deoxinukleotid

DR = Death receptor (Todesrezeptor)

EGFR = Epidermal growth factor receptor (Rezeptor für epidermalen

Wachstumsfaktor)

EGFP = Enhanced Green Fluorescent Protein

FAS = Apoptosis stimulating fragment (Apoptosestimulierendes

Fragment)

FADD = Apoptosis stimulating fragment-associated death domain

(Apoptosestimuliernedes Fragment assoziierte Todesdomäne)

Hep G2 = Zellkultur eines Leberzellkarzinoms

HL 60 = Zellkultur aus humanen promyelozytischen Leukämiezellen

HRP = Horse raddish peroxidise (Meerettichperoxidase)

IAP = Inhibitor of apoptosis protein (Apoptoseinhibierendes Protein)

IHC = Immunhistochemie

ISH = In situ Hybridisierung

kDalton = Kilo Dalton

Ki 67 = Kiel 67 Antigen

LSAB = Labeled (Markierte) (Strept)avidin Biotin Methode

LOH = loss of heterocygosity (Verlust der Heterozygotizität)

M = Mol (Masseneinheit)

MDM2 = Murine-double-minute-2

MiB 1 = Made in Borstel (Antikörper gegen Ki 67)

MOD = mittlere optische Dichte

MDR = multidrug resistance (Multidrug-Resistenz)

MRP = multidrug resistance associated protein (Multidrug-Resistenz-

assoziiertes-Protein)

NBD = Nucleotid binding domain (Nukleotidbindende Domäne)

NBT = Nitroblue Tetrazolium (Nitroblautetrazolium)

PDGF = Platelet derived growth factor (Wachstumsfaktor aus

Blutplättchen)

PDGFR = Platelet derived growth factor receptor (Rezeptor für

Wachstumsfaktor aus Blutplättchen)

PCR = Polymerase chain reaction (Polymerasekettenrekation)

Abkürzungsverzeichnis VI

P-gp = P-Glycoprotein

P-TEN = Phosphatase and tensin homologue (Phosphatase und Tensin

Homolog)

Rb = Retinoblastom-Gen

RNA/RNS = Ribonucleinacid/-säure

mRNA = messenger RNA (Boten-RNA)

RT-PCR = Reverse transcriptase polymerase chain reaction

(Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion)

SMAC = Second mitochondrial activator of caspases

Tab. = Tabelle

TNF = Tumor necrosis factor (Tumor Nekrose Faktor)

TNFR = Tumor necrosis factor receptor (Tumor Nekrose Faktor Rezeptor)

TP 53 = Tissue Polypetide 53 (Gewebspolypeptid 53)

TRADD = TNF receptor associated death domain protein (Tumor Nekrose

Faktor Rezeptor assoziiertes Todesdomänenprotein)

WHO = World Health Organisation (Weltgesundheitsorganisation)

z. B. = zum Beispiel

ZNS = Zentrales Nervensystem

Einleitung 1

1. Einleitung

Der Anteil von primären Hirntumoren an der Gesamtzahl aller an malignen

Neubildungen verstorbenen Patienten macht etwa 3-5 % aus. Die Inzidenz beträgt

durchschnittlich 10,2 Neuerkrankungen pro 100000 Einwohner pro Jahr in

Industrieländern. Das bedeutet für Deutschland in etwa 8000 Neuerkrankungen an

primären Hirntumoren pro Jahr. Exakte Zahlen existieren jedoch nicht, da es in

Deutschland kein nationales Krebsregister gibt [STEINER et al., 1998].

Hirntumoren werden nach histologischen Kriterien in WHO-Grade eingeteilt, welche

auch Aussagen über die Dignität bzw. die Prognose liefern (Tabelle 1).

Tab. 1 : Übersicht über die WHO-Grade bei Hirntumoren. (aus: WHO Classification of Tumors, Pathology and Genetics, Tumors of the Nervous System, 2007)

Statistisch ist eine gewisse Häufung in Ländern der Ersten Welt im Vergleich zu

Entwicklungsländern erkennbar. Dies wird unter anderem auf die wesentlich besser

entwickelten diagnostischen Möglichkeiten in den Industrienationen zurückgeführt.

Allgemein ist aber das Risiko eines Angehörigen der kaukasischen Rasse für die

Entwicklung eines Hirntumors höher [OHGAKI et al., 2005].

Sogenannte Risikoberufsgruppen konnten ebenfalls bestimmt werden. Hierzu

gehören Ärzte, besonders Anatomen und Pathologen, Feuerwehrleute und

Landwirte. Hingegen konnte kein Umweltkarzinogen identifiziert werden, das

reproduzierbar zur Entwicklung eines Hirntumors führt. Insbesondere die Strahlung

von Mobiltelefonen oder Nikotinabusus waren hier in