Az immundeficienciák Az immundeficienciák kimutatásának kimutatásának laboratóriumi laboratóriumi

módszereimódszerei

Nagy Gábor

DEOEC III. Belgyógyászati KlinikaDEOEC III. Belgyógyászati Klinika

Regionális Immunológiai LaboratóriumRegionális Immunológiai Laboratórium

ODLA III. évfolyamODLA III. évfolyam

Immunológiai diagnosztikai módszerekImmunológiai diagnosztikai módszerek

2010. március 16.2010. március 16.

Diagnosztikai Diagnosztikai algoritmusalgoritmus

Kezdeti vizsgálatokfizikális vizsgálat, anamnézis

családi anamnézisvérkép, össz Ig osztályok

mikrobiológia, mellkas röntgenszekunder immundef. kizárása

Humorális immunr.szűrő jellegű vizsg.

Sejtes immunr.szűrő jellegű vizsg.

Komplementrendszer

szűrő jellegű vizsg.Fagocitasejt

szűrő jellegű vizsg.

Speciális vizsgálatok Speciális vizsgálatok Speciális vizsgálatok Speciális vizsgálatok

Genetikai vizsgálatok Genetikai vizsgálatok Genetikai vizsgálatok Genetikai vizsgálatok

Első vizsgálatok:Első vizsgálatok:vérképvérkép metodika:metodika:

– optikai elvoptikai elv– impedancia elvimpedancia elv

paraméterek:paraméterek:– össz fehérvérsejt számössz fehérvérsejt szám– absz. limfocita számabsz. limfocita szám– absz. granulocita számabsz. granulocita szám– thrombocita szám és méret (MPV)thrombocita szám és méret (MPV)

Első vizsgálatok:Első vizsgálatok:össz IgG, IgA, IgMössz IgG, IgA, IgM

Turbidimetria

A fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri

Nefelometria

A szórt fény intenzitását méri

Immunglobulin szintek Immunglobulin szintek életkor függéseéletkor függéseIm

mun

glob

ulin

ok

men

nyis

ége

IgG

IgM

IgA

Immunglobulin Immunglobulin szintek: össz IgEszintek: össz IgE Több nagyságrenddel Több nagyságrenddel

alacsonyabb koncentrációalacsonyabb koncentráció ELISA (indirekt jelölésű)ELISA (indirekt jelölésű) kU/lkU/l hiper IgE-syhiper IgE-sy

Össz Ig szintek Össz Ig szintek változása változása immundeficienciákbanimmundeficienciákban hipogammaglobulinémia esetén ki kell hipogammaglobulinémia esetén ki kell

zárni a veszést (pl. nephrosis sy)zárni a veszést (pl. nephrosis sy) Szelektív IgA hiány:Szelektív IgA hiány:

– se és nyál IgA mérhetetlenül alacsonyse és nyál IgA mérhetetlenül alacsony Hiper IgM: IgMHiper IgM: IgM, IgA, IgA, IgG, IgG Hiper IgE: IgE Hiper IgE: IgE (>2000 kU/l) (>2000 kU/l) congenitális agammaglobulinémia: congenitális agammaglobulinémia:

IgG, A, M IgG, A, M CVID: Ig CVID: Ig (>=két Ig osztályban) (>=két Ig osztályban) ALPS: Ig ALPS: Ig

Szűrő jellegű Szűrő jellegű vizsgálatokvizsgálatok

Immunológiai szűrőtesztek immundefektus gyanúja eseténImmunológiai szűrőtesztek immundefektus gyanúja esetén

Feltételezett Feltételezett immundefektusimmundefektus

Immunológiai tesztImmunológiai teszt

HumorálisHumorális Szérum -IgM, -IgG, -IgA és alosztály vizsgálatokSzérum -IgM, -IgG, -IgA és alosztály vizsgálatokIzohemagglutinin-titerIzohemagglutinin-titerFehérje antigénre adott immunválasz Fehérje antigénre adott immunválasz

(Diphtheria toxin e.antitest, Tetanus toxin (Diphtheria toxin e.antitest, Tetanus toxin e.antitest)e.antitest)

Poliszacharid antigénre adott immunválasz Poliszacharid antigénre adott immunválasz (H.influenzae e.antitest, Pneumococcus (H.influenzae e.antitest, Pneumococcus e.antitestek)e.antitestek)

SejtesSejtes Abszolút limfocitaszámAbszolút limfocitaszámTuberkulin-bőrtesztTuberkulin-bőrtesztTetanus-bőrtesztTetanus-bőrtesztDiphteria-bőrtesztDiphteria-bőrtesztCandida-bőrtesztCandida-bőrteszt

Fagocitasejt-defektusFagocitasejt-defektus Abszolút granulocitaszámAbszolút granulocitaszámNBT tesztNBT tesztSzérum IgESzérum IgE

KomplementdefektusKomplementdefektus Összkomplement-aktivitás mérése hemolitikus Összkomplement-aktivitás mérése hemolitikus módszerrel (klasszikus és alternatív út)módszerrel (klasszikus és alternatív út)

Humorális Humorális immunrendszer:immunrendszer:IgG alosztályokIgG alosztályok G1, G2, G3, G4 alosztályokG1, G2, G3, G4 alosztályok metodika: nefelometriametodika: nefelometria az össz IgG ált normális az össz IgG ált normális

tartományban van (kivéve, ha IgG1 tartományban van (kivéve, ha IgG1 hiányzik)hiányzik)

izolált alosztály deficienciaizolált alosztály deficiencia szelektív IgA hiány mellett gyakranszelektív IgA hiány mellett gyakran

IzohemagglutininIzohemagglutinin

az A és B vércsoport ellenes, alacsony az A és B vércsoport ellenes, alacsony affinitású IgM típusú At-ek, melyek a affinitású IgM típusú At-ek, melyek a vércsoport-szabálynak megfelelően vércsoport-szabálynak megfelelően fiziológiásan megjelennek, fiziológiásan megjelennek, valószínűleg bakteriális Ag-ek valószínűleg bakteriális Ag-ek keresztrekaciója miattkeresztrekaciója miatt

hiányuk B-sejt defektusra utalhiányuk B-sejt defektusra utal módszer: hemagglutinációmódszer: hemagglutináció hiányzik: pl. CVIDhiányzik: pl. CVID

Fehérje és poliszacharid Fehérje és poliszacharid specifikus antitestekspecifikus antitestek

Fehérje antigénre adott immunválaszFehérje antigénre adott immunválasz– Diphtheria toxin e. antitestDiphtheria toxin e. antitest– Tetanus toxin e. antitestTetanus toxin e. antitest

Poliszacharid antigénre adott immunválaszPoliszacharid antigénre adott immunválasz– H. influenzae e. antitestH. influenzae e. antitest– Pneumococcus e. antitestekPneumococcus e. antitestek– Meningococcus e. antitestekMeningococcus e. antitestek

módszer: ELISAmódszer: ELISA

Fehérje és PS specifikus Fehérje és PS specifikus antitestekantitestek

csökkent válasz: CVID

Sejtes immunrendszer Sejtes immunrendszer vizsgálatai:vizsgálatai:Absz. limfocita számAbsz. limfocita szám

Absz. limfocita számAbsz. limfocita szám– életkorfüggő referencia tartományéletkorfüggő referencia tartomány– elsősorban a T-sejtszámot tükrözielsősorban a T-sejtszámot tükrözi– limfopénia:limfopénia:

SCID (gamma-lánc, ADA, PNP, reticuláris SCID (gamma-lánc, ADA, PNP, reticuláris dysgenesis)dysgenesis)

cong. agammaglobulinémiacong. agammaglobulinémia

– csökken lehet: CVIDcsökken lehet: CVID

BőrtesztekBőrtesztek

T-sejt funkció jó szűrőtesztjeT-sejt funkció jó szűrőtesztje vírus és gomba fertőzésekvírus és gomba fertőzések antigén:antigén:

– Tuberkulin-bőrtesztTuberkulin-bőrteszt– Tetanus-bőrtesztTetanus-bőrteszt– Diphteria-bőrtesztDiphteria-bőrteszt– Candida-bőrtesztCandida-bőrteszt

elve: késői típusú hiperszenz.elve: késői típusú hiperszenz. in vitro: limfocita proliferációs in vitro: limfocita proliferációs

tesztektesztek

Áramlási citometriaÁramlási citometria

Áramlási citometriaÁramlási citometria

T limfocita markerek:T limfocita markerek: CD3, CD2, CD7CD3, CD2, CD7 B limfocita markerek: B limfocita markerek: CD19, CD20, CD19, CD20, CD21CD21 Helper T limfocita marker:Helper T limfocita marker: CD4CD4 Citotoxikus T limfocita marker:Citotoxikus T limfocita marker: CD8CD8 NK sejt markerek:NK sejt markerek: CD56, CD16CD56, CD16 T sejt aktivációs markerek:T sejt aktivációs markerek: CD69, CD25, CD69, CD25, HLA-DRHLA-DR Neutrofil granulocita markerek:Neutrofil granulocita markerek: CD16, CD32CD16, CD32 Monocita markerek:Monocita markerek: CD13, CD14CD13, CD14 Makrofág markerek:Makrofág markerek: CD36, CD68, CD36, CD68, CD71CD71

Áramlási citometriaÁramlási citometria

limfocita limfocita szubpopuláció:szubpopuláció:– T: CD3+T: CD3+

Th: CD4+Th: CD4+ Tc: CD8+Tc: CD8+

– B: CD19+B: CD19+– NK: CD16+, NK: CD16+,

CD56+CD56+

Áramlási citometriaÁramlási citometria

BetegségBetegség BB TT NKNK

Bruton-kórBruton-kór -- ++ ++

CVIDCVID +/-+/- ++ ++

gamma-lánc gamma-lánc defdef

++ -- --

ADAADA -- -- --

PNPPNP ++ -- --

RAG1/2 def.RAG1/2 def. -- -- ++

MHC-I def.MHC-I def. ++ +(CD8+(CD8)) ++

MHC-II def.MHC-II def. ++ +(CD4+(CD4)) ++

DiGeorge-syDiGeorge-sy ++ +/-+/- ++

Áramlási citometriaÁramlási citometria

CD40, CD40L, sIgA/G/D (hiperIgM)CD40, CD40L, sIgA/G/D (hiperIgM) MHC I-II (MHC deficienciák)MHC I-II (MHC deficienciák) CD4-/CD8- T-sejt CD4-/CD8- T-sejt : ALPS: ALPS Treg Treg

(CD4+,CD25bright,FOXP3+):(CD4+,CD25bright,FOXP3+):– Immunodysregulation, Immunodysregulation,

polyendocrinopathy, enteropathy X-polyendocrinopathy, enteropathy X-linked (IPEX)linked (IPEX)

ADA, PNP enzimaktivitásADA, PNP enzimaktivitás

purin anyagcsere enzimeipurin anyagcsere enzimei– Adenozin dezamináz:Adenozin dezamináz:

adenozin-inozin átalakításadenozin-inozin átalakítás

– Purin nukleozid foszforiláz:Purin nukleozid foszforiláz: guanozin-guaninguanozin-guanin inozin-hipoxantin átalakításinozin-hipoxantin átalakítás

Súlyos kombinált IDSúlyos kombinált ID– ADA: T és BADA: T és B– PNP: elsősorban T (valószínűleg a T sejtek PNP: elsősorban T (valószínűleg a T sejtek

magas dGTP tartalma miatt)magas dGTP tartalma miatt)

ADA, PNP enzimaktivitásADA, PNP enzimaktivitás

eritrociták enzimaktivitását határozzuk megeritrociták enzimaktivitását határozzuk meg vvt-ket 3x mossukvvt-ket 3x mossuk beállítjuk a hgb-tbeállítjuk a hgb-t lizáljuk a vvt-ketlizáljuk a vvt-ket megfelelő szubszrátot adunk a rendszerhezmegfelelő szubszrátot adunk a rendszerhez

– adenozin (ADA)adenozin (ADA)– inozin (PNP)inozin (PNP)

a keletkező végterméket UV a keletkező végterméket UV spektrofotometriával mérjükspektrofotometriával mérjük

az enzimaktivitást hgb-ra normálva adjuk az enzimaktivitást hgb-ra normálva adjuk megmeg

ADA, PNP enzimaktivitásADA, PNP enzimaktivitás

az enzimaktivitás:az enzimaktivitás:– homozigóta formában mérhetetlenül homozigóta formában mérhetetlenül

alacsonyalacsony– heterozigóta formában kb. az heterozigóta formában kb. az

kontrollok felekontrollok fele parciális ADA deficiencia:parciális ADA deficiencia:

– vvt-ben nem mérhető aktivitás, de vvt-ben nem mérhető aktivitás, de más szövetekben van (instabil enzim)más szövetekben van (instabil enzim)

Fagocita rendszer Fagocita rendszer vizsgálatai:vizsgálatai:abszolút neutrofil számabszolút neutrofil szám Kostmann syKostmann sy ciklikus neutropéniaciklikus neutropénia Chediak-Higashi syChediak-Higashi sy reticularis reticularis

dysgenesisdysgenesis WHIM sy (Wart, WHIM sy (Wart,

HypogammaglobulinHypogammaglobulinemia, Infection, and emia, Infection, and Myelokathexis Myelokathexis syndrome)syndrome)

kemoth.kemoth. gyógyszerekgyógyszerek

– immunimmun– nonimmunnonimmun

autoimmunautoimmun alloimmunalloimmun hiányállapotok (B2, hiányállapotok (B2,

folsav, réz)folsav, réz) AIDSAIDS

Fagocita sejtek Fagocita sejtek vizsgálata:vizsgálata:granulocita ellenes at.granulocita ellenes at. a mérés elve lehet:a mérés elve lehet:

– áramlási citometriaáramlási citometria– sejtes ELISAsejtes ELISA

Fagocita sejtek Fagocita sejtek vizsgálata:vizsgálata:funkcionális vizsgálatokfunkcionális vizsgálatok adherenciaadherencia

– granulocita szám mérésgranulocita szám mérés– üveggyönggyel inkubációüveggyönggyel inkubáció– granulocita szám mérésgranulocita szám mérés

adhezív proteinek (áramlási adhezív proteinek (áramlási citometria):citometria):– LAD1: CD11a,b,c/CD18LAD1: CD11a,b,c/CD18– LAD2: CD15LAD2: CD15

kemotaxiskemotaxis– Boyden-kamraBoyden-kamra

Fagocita sejtek Fagocita sejtek vizsgálata:vizsgálata:funkcionális vizsgálatokfunkcionális vizsgálatok fagocitózisfagocitózis

– mikroszkóp: particulumok (élesztőgomba)mikroszkóp: particulumok (élesztőgomba)– FC: FITC-cel jelölt immunglobulinnal FC: FITC-cel jelölt immunglobulinnal

preopszonizált E. colipreopszonizált E. coli– telepszámlálás: be nem kebelezett telepszámlálás: be nem kebelezett

baktérium visszamérésebaktérium visszamérése intracelluláris killingintracelluláris killing

– telepszámlálás: bekebelezés után életben telepszámlálás: bekebelezés után életben maradt baktériumok visszamérésemaradt baktériumok visszamérése

Fagocita sejtek Fagocita sejtek vizsgálata:vizsgálata:funkcionális vizsgálatokfunkcionális vizsgálatok oxidatív burstoxidatív burst

– NBT (nitroblue-tetrasolium) redukcióNBT (nitroblue-tetrasolium) redukció sárga NBT->kék/fekete formazánsárga NBT->kék/fekete formazán mikroszkópos kiértékelésmikroszkópos kiértékelés

– DHR (dihidro-rodamin) oxidációDHR (dihidro-rodamin) oxidáció DHR->rodamin (fluoreszkál)DHR->rodamin (fluoreszkál)

– teljes vér kemilumineszcenciateljes vér kemilumineszcencia H2O2 + luminol -> 3-aminoftalát* -> 3-aminoftalát + H2O2 + luminol -> 3-aminoftalát* -> 3-aminoftalát +

fotonfoton– szuperoxid anion termelésszuperoxid anion termelés

ferricitokróm-C szuperoxid-dizmutázzal ferricitokróm-C szuperoxid-dizmutázzal gátolható redukciója gátolható redukciója (fotometriás kiértékelés)(fotometriás kiértékelés)

csökkent: CGDcsökkent: CGD

Fagocita sejtek Fagocita sejtek vizsgálata: vizsgálata: enzimdefektusokenzimdefektusok MPOMPO

– primer, azurofil granulumban primer, azurofil granulumban található enzimtalálható enzim

– H2O2->HOClH2O2->HOCl– deficienciája gyakori: 1:2000deficienciája gyakori: 1:2000– benzidin-hidrokloridot oxidálja->kék benzidin-hidrokloridot oxidálja->kék

színszín

Fagocita sejtek Fagocita sejtek vizsgálata:vizsgálata:mikroszkópos morfológiamikroszkópos morfológia Chediak-Chediak-

Higashi syHigashi sy kóros a kóros a

fagolizoszófagolizoszóma ma formálásformálás

Komplement rendszer:Komplement rendszer:deficienciákdeficienciák

Komplement rendszer:Komplement rendszer:össz komplement össz komplement aktivitásaktivitás klasszikus út: CH50klasszikus út: CH50

– szenzitizált birka vvt.szenzitizált birka vvt. alternatív út: AH50alternatív út: AH50

– nyúl vvt.nyúl vvt.

Komplement rendszer:Komplement rendszer:CH50 meghatározásCH50 meghatározás

50x 100x 200x 400x

Vak

Spontán lísis kontroll

Teljes lízis kontroll

Beteg1

Beteg2

Betegx

hemolízis%=

(ODminta-OD(SPLK))/OD(TLK)

Komplement rendszer:Komplement rendszer:CH50 meghatározásCH50 meghatározás

logx=logK+1/n*log(y/(1-y))

x=szérum térfogat

y=hemolízis%

CH50=annak a szérumtérfogatnak a reciproka, ami 50%-os lízist okoz

Komplement rendszer:Komplement rendszer:értékelésértékelésCPCP APAP C3C3 C4C4 MagyarázatMagyarázat

00 NN NN NN C1q, C1r, C1q, C1r, C1s, C2 C1s, C2 deficienciadeficiencia

00 00 NN C3 def.C3 def.

00 NN NN C4 def.C4 def.

00 00 NN NN C5-C9 defC5-C9 def

NN NN HANOHANO

NN CP CP comsumptiocomsumptio

Komplement rendszer:Komplement rendszer:egyes faktorokegyes faktorok antigén meghatározás:antigén meghatározás:

– radiális immundiffúzióradiális immundiffúzió– rakétaelektroforézisrakétaelektroforézis– nefelometrianefelometria– ELISAELISA

funkciónális meghatározás:funkciónális meghatározás:– hemolitikus assay (a mérendő faktor hemolitikus assay (a mérendő faktor

kivételével a faktorok feleslegben)kivételével a faktorok feleslegben)– klasszikus út komponensei: szenzitizált klasszikus út komponensei: szenzitizált

birka vvt.birka vvt.– alternatív út komponensei: nyúl v. alternatív út komponensei: nyúl v.

tengerimalac vvt.tengerimalac vvt.