Bachelorarbeit-Endfassung neu bunt Westphal (Bachelorarbeit 2013).pdf · Friedrich-Schiller-Universität Jena Biologisch-Pharmazeutische Fakultät Institut für Ernährungswissenschaften

Friedrich-Schiller-Universität Jena Biologisch-Pharmazeutische Fakultät

Institut für Ernährungswissenschaften Arbeitsgruppe Bioaktive Pflanzenstoffe

Analytische Charakterisierung von Samen zweier Tomatensorten

als Basis einer möglichen Reststoffverwertung

in der Lebensmittelindustrie

Bachelorarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades eines Bachelor of Science

im Studiengang Ernährungswissenschaften (B. Sc.)

vorgelegt von

Anna Westphal

aus Bollberg

Jena, im September 2013

Gutachter: 1. PD Dr. habil. Volker Böhm

Friedrich-Schiller-Universität Jena Institut für Ernährungswissenschaften Arbeitsgruppe Bioaktive Pflanzenstoffe Dornburger Straße 25 07743 Jena

2. Prof. Dr. Konrad Otto

Hochschule Ostwestfalen-Lippe Fachgebiet Getränketechnologie Liebigstraße 87 32657 Lemgo

INHALTSVERZEICHNIS

I

INHALTSVERZEICHNIS

I Tabellenverzeichnis ....................................................................................................................... III

II Abbildungsverzeichnis ................................................................................................................. IV

III Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................................. V

1 EINLEITUNG ........................................................................................................................ 1

2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN ............................................................................................. 2

2.1 Tomaten ............................................................................................................................. 2

2.1.1 Aufbau und Inhaltsstoffe der Tomatenfrucht ....................................................................... 2

2.1.2 Der Tomatenmarkt und die Problematik der Reststoffverwertung ..................................... 4

2.2 Carotinoide ......................................................................................................................... 5

2.2.1 Struktur und Vorkommen ..................................................................................................... 5

2.2.2 Funktionen ............................................................................................................................ 7

2.3 Vitamin E ............................................................................................................................ 7

2.3.1 Struktur und Vorkommen ..................................................................................................... 7

2.3.2 Funktionen ............................................................................................................................ 8

2.4 Bestimmung der antioxidativen Kapazität ............................................................................ 9

2.4.1 Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu ............................................................................. 10

2.4.2 TEAC-Test ............................................................................................................................ 11

2.4.3 ORAC-Test ........................................................................................................................... 12

2.5 Die Ölgewinnung aus Ölsaaten und deren Fettsäurezusammensetzung .............................. 12

3 MATERIAL UND METHODEN .............................................................................................. 14

3.1 Untersuchungsmaterial ..................................................................................................... 14

3.2 Probenvorbereitung .......................................................................................................... 14

3.3 Trockenmassebestimmung ................................................................................................ 14

3.4 Bestimmung des Carotinoid- und Vitamin-E-Gehaltes ........................................................ 14

3.4.1 HPLC-Analytik ...................................................................................................................... 15

3.4.1.1 HPLC-Analytik Carotinoide ............................................................................... 15

3.4.1.2 HPLC-Analytik Vitamin E ................................................................................... 15

3.5 Bestimmung der antioxidativen Kapazität .......................................................................... 16

3.5.1 Extraktionsmethoden zur Gewinnung von hydrophilen und lipophilen Extrakten ............ 16

3.5.2 Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu ............................................................................. 17

3.5.3 H-TEAC-III-Test .................................................................................................................... 17

3.5.4 H-ORACFl-Test ...................................................................................................................... 18

3.5.5 αTEAC-Test .......................................................................................................................... 18

3.6 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung ....................................................................... 19

3.6.1 Fettextraktion nach Folch ................................................................................................... 19

3.6.2 Methylierung ....................................................................................................................... 19

3.6.3 Dünnschichtchromatographie ............................................................................................ 20

3.6.4 GC-Analytik.......................................................................................................................... 20

3.7 Statistische Datenauswertung ........................................................................................... 20

INHALTSVERZEICHNIS

II

4 ERGEBNISSE ...................................................................................................................... 21

4.1 Bestimmung der Trockenmasse ......................................................................................... 21

4.2 Quantifizierung der Carotinoide ........................................................................................ 21

4.3 Quantifizierung der Vitamin-E-Verbindungen ..................................................................... 21

4.4 Ermittlung der antioxidativen Kapazität ............................................................................. 22

4.4.1 Gesamtphenolgehalt und hydrophile antioxidative Kapazität ........................................... 22

4.4.2 Lipophile antioxidative Kapazität ........................................................................................ 25

4.5 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung ....................................................................... 25

4.5.1 Fettextraktion und Dünnschichtchromatographie ............................................................. 25

4.5.2 Fettsäurezusammensetzung ............................................................................................... 26

5 DISKUSSION ...................................................................................................................... 28

5.1 Carotinoide in Tomatensamen ........................................................................................... 28

5.2 Vitamin-E-Verbindungen in Tomatensamen ....................................................................... 29

5.3 Antioxidative Kapazität von Tomatensamen ...................................................................... 31

5.3.1 Gesamtphenolgehalt und hydrophile antioxidative Kapazität ........................................... 32

5.3.2 Lipophile antioxidative Kapazität ........................................................................................ 36

5.4 Fettsäurezusammensetzung von Tomatensamen ............................................................... 39

6 ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................... 43

7 SUMMARY ........................................................................................................................ 45

LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................................................. 47

ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN ..................................................................................... VII

A.1 Verzeichnis der verwendeten Geräte ......................................................................................... VII

A.2 Verzeichnis der verwendeten Arbeitsmittel .................................................................................. X

A.3 Verzeichnis der verwendeten Chemikalien und Lösungen ........................................................... XI

ANHANG B: METHODEN ............................................................................................................. XV

B.1 Bestimmung des Carotinoid- und Vitamin-E-Gehaltes ............................................................... XV

B.2 Bestimmung der antioxidativen Kapazität .................................................................................. XV

B.3 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung ............................................................................... XIX

ANHANG C: ANALYSENDATEN ..................................................................................................... XX

Selbstständigkeitserklärung

Danksagung

TABELLENVERZEICHNIS

III

I TABELLENVERZEICHNIS

Tab. 1 Ausgewählte Inhaltsstoffe von frischen Tomaten ................................................................ 3

Tab. 2 Ausgewählte Methoden zur Bestimmung der AOC ............................................................ 10

Tab. 3 Wassergehalte der zwei Samensorten ................................................................................ 21

Tab. 4 Carotinoidgehalte der zwei Samensorten ........................................................................... 21

Tab. 5 Gehalte an Vitamin-E-Verbindungen in den zwei Samensorten ......................................... 22

Tab. 6 Hydrophile AOC der zwei Samensorten, gemessen mit unterschiedlichen Testmethoden 23

Tab. 7 Lipophile AOC der zwei Samensorten, gemessen mit dem αTEAC-Test ............................. 25

Tab. 8 Rohfettanteile der zwei Samensorten ................................................................................ 26

Tab. 9 Carotinoidgehalt der Tomaten der Sorten Waltinger und Red Currant ............................. 28

Tab. 10 Publizierte Carotinoidgehalte von Tomatensamen im Vergleich zu den eigenen Daten ... 28

Tab. 11 Einfluss einer steigenden Probenkonzentration von Reinsubstanzen, Nahrungsmittel-extrakten und den selbst untersuchten Tomatensamenextrakten auf die AOC (gemessen mit verschiedenen Testmethoden) und den Gesamtphenolgehalt .................................... 33

Tab. 12 Publizierte hydrophile AOC von Tomatensamen im Vergleich mit den eigenen untersuch-ten Samen ........................................................................................................................... 34

Tab. 13 Publizierte Gehalte an extrahierten Ölgehalten aus Tomatensamen ................................. 39

Tab. 14 Publizierte Fettsäurezusammensetzungen von Öl aus Tomatensamen im Vergleich mit den eigenen Daten ..................................................................................................................... 40

Tab. C1 Wassergehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung ....... XX

Tab. C2 Absorptionsmaxima und spezifische Extinktionskoeffizienten der ermittelten Carotinoide in Ethanol ............................................................................................................................ XX

Tab. C3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze für Lutein und Zeaxanthin für C30-Develosil RPAQUEOUS-Analysensäule (250 x 4,6 mm; 5 μm) ............................................................ XX

Tab. C4 Carotinoidgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung .. XX

Tab. C5 Absorptionsmaxima und spezifische Extinktionskoeffizienten der Tocopherole und Tocotrienole in Ethanol ....................................................................................................... XX

Tab. C6 Nachweis- und Bestimmungsgrenze für α- und γ-Tocopherol für Knauer Eurospher-100 DIOL-Analysensäule (250 x 4,0 mm; 7 µm) ........................................................................ XXI

Tab. C7 Tocopherolgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung XXI

Tab. C8 Vitamin-E-Aktivität der Tocopherole und Tocotrienole ..................................................... XXI

Tab. C9 Gesamtphenolgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung ............................................................................................................................................ XXI

Tab. C10 Hydrophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem H-TEAC-Test ........................ XXII

Tab. C11 Hydrophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem ORAC-Test .......................... XXIII

Tab. C12 Lipophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem αTEAC-Test ........................... XXIII

Tab. C13 Summenformel, Trivialname, Abkürzung und Einordnung aller detektierten Fettsäuren .......................................................................................................................................... XXIV

Tab. C14 Fettsäureverteilung in den beiden Samensorten ............................................................. XXV

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

IV

II ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abb. 1 Horizontaler Querschnitt einer Tomate .................................................................................. 2

Abb. 2 Einteilung der verarbeiteten Tomatenprodukte und einige Beispiele .................................... 4

Abb. 3 Übersicht über die Herstellung von Tomatenerzeugnissen .................................................... 5

Abb. 4 Strukturformeln ausgewählter Carotinoide ............................................................................ 6

Abb. 5 Carotinoidprofil von Tomaten ................................................................................................. 6

Abb. 6 Strukturformeln von Tocopherolen und Tocotrienolen .......................................................... 8

Abb. 7 Übersicht über die Extraktionsschritte für die kombinierte Carotinoid- und Vitamin-E-Be-stimmung ............................................................................................................................... 15

Abb. 8 Übersicht über die Aufarbeitung der Samen und die Extraktionsschritte für die unterschied-lichen Extrakte, die im Anschluss auf deren AOC getestet wurden ...................................... 17

Abb. 9 Übersicht über die Aufarbeitungsschritte für die Analyse der Fettsäurezusammensetzung 19

Abb. 10 Gehalte an α- und γ-Tocopherol in den zwei Samensorten .................................................. 22

Abb. 11 Gesamtphenolgehalte der zwei Samensorten vor und nach der Hydrolyse ......................... 23

Abb. 12 Hydrophile AOC bestimmt mit dem H-TEAC-Test, Gegenüberstellung der beiden Samen-sorten vor und nach der Hydrolyse in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen............... 24

Abb. 13 Hydrophile AOC bestimmt mit dem ORAC-Test, Gegenüberstellung der beiden Samensorten vor und nach der Hydrolyse in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen .......................... 24

Abb. 14 Lipophile AOC der beiden Samensorten in Abhängigkeit der Verdünnungsstufen............... 25

Abb. 15 DC-Trennung des extrahierten Fettes beider Samensorten vor und nach der Methylierung mittels n-Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v) im Vergleich zu einem Standard-gemisch .................................................................................................................................. 26

Abb. 16 Gegenüberstellung der dominierenden Fettsäuren der zwei Samensorten ......................... 27

Abb. 17 Gegenüberstellung einiger relevanter Parameter der Fettverteilung der zwei Samensorten ............................................................................................................................................... 27

Abb. 18 Prozentuale Anteile der Vitamin-E-Verbindungen (bezogen auf Gesamt-Vitamin-E) in Toma-ten der Sorten Waltinger und Red Currant ........................................................................... 30

Abb. 19 Prozentuale Anteile der Schalen, des Fruchtfleisches und der Samen an den Antioxidantien und der AOC von ganzen Tomaten ........................................................................................ 34

Abb. 20 Anteile der hydrophilen und lipophilen AOC an der gesamten AOC beider Tomatensamen-sorten, bestimmt mit dem H-TEAC-III-Test und dem αTEAC-Test; Darstellung in Abhängig-keit von den Verdünnungsstufen ........................................................................................... 37

Abb. 21 Gegenüberstellung der anhand der Einzelsubstanzen theoretisch ermittelten AOC und der tatsächlich bestimmten AOC .................................................................................................. 38

Abb. 22 Fettsäurezusammensetzung verschiedener Pflanzenöle im Vergleich zu dem aus den zwei Samensorten gewonnenem Öl .............................................................................................. 41

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

V

III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

αTE α-Tocopheroläquivalente (engl. α-tocopherol equivalents) αTEAC α-Tocopherol äquivalente antioxidative Kapazität

(engl. α-tocopherol equivalent antioxidant capacity) AAPH 2,2'-Azobis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid Abb. Abbildung ABTS●+ 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Radikalkation AG Arbeitsgruppe a.K. außerhalb der Kalibrierung AOC Antioxidative Kapazität (engl. antioxidant capacity) AUC Fläche unter der Kurve (engl. area under the curve) BHT 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxytoluol bspw. beispielsweise c Konzentration DC Dünnschichtchromatographie DGE Deutsche Gesellschaft für Ernährung ε molarer Extinktionskoeffizient E trans (lat. „weit entfernt bzw. gegenüber“) - geometrische Konfiguration E Extinktion E1cm1% spezifischer Extinktionskoeffizient

ET bzw. SET Ein-Elektronen-Übergang (engl. single electron transfer) et al. und andere (lat. et alii) FAME Fettsäuremethylester (engl. fatty acid methyl ester) FM Frischmasse GAE Gallussäure-Äquivalente (engl. gallic acid equivalents) HAT Wasserstoffatom-Übergang (engl. hydrogen atom transfer) HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid

chromatography) hpts. hauptsächlich MC-FA mittelkettige Fettsäuren (engl. middle chain fatty acids) MeOH Methanol meq Milliäquivalent MgCO3 Magnesiumcarbonat mglw. möglicherweise MtBE Methyl-tert-Butylether MUFA einfach ungesättigte Fettsäuren MW arithmetischer Mittelwert Na2SO4 Natriumsulfat NP normal phase n.q. nicht quantifizierbar n.s. nicht signifikant O2 Sauerstoff ORAC engl. Oxygen Radical Absorbance Assay p Signifikanzniveau bzw. Irrtumswahrscheinlichkeit PDA Photodiodenarray pH lat. pondus hydrogenii PUFA mehrfach ungesättigte Fettsäuren r Korrelationskoeffizient RC Red Currant (Tomatensorte) ROO● Peroxylradikal

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

VI

RP reversed phase SC-FA kurzkettige Fettsäuren (engl. short chain fatty acids) SFA gesättigte Fettsäuren SPSS Statistical Package for Social Sciences

Stabw Standardabweichung

T Temperatur in °C Tab. Tabelle TE Trolox-Äquivalente (engl. Trolox equivalents) THF Tetrahydrofuran Trolox 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure UV Ultraviolett (Licht im Wellenlängenbereich von~ 200-400 nm) var. Varietät (lat. varietas) VF Verdünnungsfaktor vis visuell (Licht im Wellenlängenbereich von ~ 400-800 nm) W Waltinger (Tomatensorte) Z cis (lat. „zusammen bzw. nah beieinander“) - geometrische Konfiguration

EINLEITUNG

1

1 EINLEITUNG

Die Tomate (Lycopersicon esculentum) stammt ursprünglich aus der Andenregion Südamerikas. Dort

wuchs sie als tropische Wildpflanze, die der modernen Kirschtomate (Lycopersicon esculentum var.

cerasiforme) ähnelt [1,2]. Bald nach der Entdeckung Amerikas, Anfang des 16. Jahrhunderts, gelangte

die Tomate nach Europa, wo sie zunächst aufgrund der angeblichen Giftigkeit nur als Zierpflanze

kultiviert wurde [1,2]. Heute zählt sie nach der Kartoffel zu den weltweit beliebtesten und am

häufigsten angebauten Gemüsesorten [2,3]. Ihre Popularität resultiert daraus, dass sie sowohl als

Frischgemüse als auch in vielen verarbeiteten Formen, wie z. B. als Tomatensaft, -sauce, -mark oder

-suppe, verzehrt wird [1]. Bezüglich der Erntemengen für den Frischgemüsemarkt und für die

verarbeitende Industrie existieren große Unterschiede. In den USA ist der Anteil an Tomaten, der der

industriellen Verarbeitung bereitgestellt wird, fünf- bis sechsmal höher als der Anteil für den frischen

Markt [4]. Die immer größer werdenden Ausmaße dieses Industriezweiges sind mit ernsten wirt-

schaftlichen, technischen und ökologischen Problemen verbunden [5]. In der lebensmittelverarbei-

tenden Industrie fallen ständig große Mengen an Nebenprodukten oder Reststoffen an, die entsorgt

und verwertet werden müssen. Hauptkomponente der Verarbeitungsreststoffe in der Tomaten-

industrie sind Tomatensamen [6], die zu den nicht vermeidbaren Lebensmittelabfällen zählen [7]. In

diesem Zusammenhang erlangt die Thematik der Reststoffverwertung in der Lebensmittelproduktion

einen immer höheren Stellenwert. So wird nach Alternativen gesucht, wie aus eigentlichen Abfall-

produkten neue Produkte hergestellt werden können. Besonders Rückstände aus der Obst- und

Gemüse-verarbeitenden Industrie sind reich an bioaktiven Substanzen, wie sekundären Pflanzen-

stoffen, sowie an Vitaminen und sind somit eine gute Quelle für Lebensmittelzusatzstoffe oder

kosmetische Inhaltsstoffe [8]. Auch die in der tomatenverarbeitenden Industrie anfallenden

Tomatensamen sind ein sogenannter Sekundärrohstoff. Die Erforschung von Verfahren, wie aus dem

üblicherweise als geringwertig angesehenem Nebenprodukt durch die Gewinnung von bioaktiven

Substanzen wertvolle Produkte erzeugt werden können, begann bereits vor fast 100 Jahren. Einen

Schwerpunkt bildet die Weiterverarbeitung zu Speiseöl, welches eine hohe antioxidative Kapazität

besitzt [9].

Die vorliegende Arbeit soll dazu beitragen, das Wissen über die chemische Zusammensetzung und

die Inhaltsstoffe von Tomatensamen im Hinblick auf eine nachhaltige Reststoffverwertung in der

Lebensmittelindustrie zu erweitern. Als Untersuchungsmaterial dienten die Samen von zwei

Tomatensorten. Ein erster Schwerpunkt lag auf der Bestimmung und Beurteilung der Carotinoid- und

Vitamin-E-Gehalte der Samen. Diese beiden Substanzklassen tragen u. a. zu dem antioxidativen

Potential bei. Die Samen gelten als wichtigste Quelle für Tocopherole und Tocotrienole in Tomaten.

Diese lipidlöslichen Antioxidantien sind zudem essentielle Vitamine, die hauptsächlich in Pflanzen-

saaten und Ölen vorkommen. Angesichts der gesundheitlichen sowie industriellen Bedeutung von

Antioxidantien in Nahrungsmitteln erfolgte eine Bestimmung der antioxidativen Kapazität der

Tomatensamen. Verschiedene Extrakte der Samen wurden mittels unterschiedlicher Testmethoden

analysiert, verglichen und bewertet. Erfasst wurde letztlich der Anteil an freien und gebundenen

wasserlöslichen sowie an fettlöslichen Antioxidantien. Bezüglich einer möglichen Weiterverarbeitung

der Tomatensamen zu pflanzlichem Öl ist außerdem das Fettsäuremuster von Interesse, da dieses ein

wichtiges Kriterium für ernährungsphysiologisch wertvolle Öle ist. Aus diesem Grund erfolgte eine

gaschromatographische Bestimmung der korrespondierenden Fettsäuremethylester.

THERORETISCHE GRUNDLAGEN

2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN

2.1 Tomaten

2.1.1 Aufbau und Inhaltsstoffe der

Die Tomate (Lycopersicon esculentum

essbare Teil der Pflanze aus den befruchteten Blüten entwickelt.

schattengewächse (Solanaceae

wachsen an einjährigen, krautigen Pflanzen

Spross mit großen, gefiederten Blättern

Früchte hervor, die nach der

Form und Farbe erheblich unterscheiden

Weltweit existieren mehr als 2

te es sich um die Sorten Waltingers Cocktail und Red Currant.

Tomate mit einem Fruchtgewicht von bis zu 10

ein saftig weiches Fruchtfleisch. Die Schale ist eher fest und der Geschmack süß

Currant ist eine Wildtomate, die

tomate genannt wird. Sie stammt aus Südamerika und ist ebenfalls

Fruchtkammern und entwickelt ein Fruchtgewicht bis 10

aromatisch und süß beschrieben, haben aber eine relativ harte

Die Tomatenfrucht besteht aus verschiedenen Geweben: dem

karp, Mesokarp und Endokarp

[15] (Abb. 1).

Abb. 1 Horizontaler Querschnitt einer Tomate

Das Perikarp als Fruchtwand besitzt als äuße

artigen Kutikula überzogen ist

äußeren Schichten verwendet. Das innere Abschlussgewebe bildet das Endokarp und grenzt das

Perikarp zu den Fruchtkammern hin ab. Die dicke Gewebeschicht zwischen Exo

Mesokarp. Die Plazenta bildet den

Laufe der Fruchtentwicklung wächst diese zu einem markreichen Gewebe aus

Funiculi (Nabelstränge) sind die Samen mit der Plazenta verbunden.

förmigen Samen sind mit kurzen steifen Härchen bedeckt und von einer stark verschleimenden

Zellschicht umgeben, die botanisch als Myxotesta bezeichnet wird

Samen wird durch ein gallertartiges Ge

Perikarp

Mesokarp

Exokarp

Endokarp

THERORETISCHE GRUNDLAGEN

THEORETISCHE GRUNDLAGEN

Aufbau und Inhaltsstoffe der Tomatenfrucht

Lycopersicon esculentum) wird als sogenanntes Fruchtgemüse

essbare Teil der Pflanze aus den befruchteten Blüten entwickelt. Sie gehört

Solanaceae), zu der u. a. auch Kartoffel, Paprika oder Aubergine zählen.

krautigen Pflanzen, die einen bis zu 1,5 m hohen sympodial verzweigten

mit großen, gefiederten Blättern aufweisen [10]. Die kleinen gelben Einzelb

nach der botanischen Klassifizierung Beeren sind. Diese können

rbe erheblich unterscheiden.

Weltweit existieren mehr als 2 500 Tomatensorten [11]. Bei den beiden untersuchten Samen handel

Sorten Waltingers Cocktail und Red Currant. Waltingers Cocktail ist eine runde, rote

Fruchtgewicht von bis zu 10 g. Sie besteht aus zwei Fruchtkammern und besitzt

ein saftig weiches Fruchtfleisch. Die Schale ist eher fest und der Geschmack süß

eine Wildtomate, die gemäß der Übersetzung ins Deutsche auch

omate genannt wird. Sie stammt aus Südamerika und ist ebenfalls rund, rot

und entwickelt ein Fruchtgewicht bis 10 g. Die kleinen Tomaten werden als sehr

aromatisch und süß beschrieben, haben aber eine relativ harte Schale [12-14]

besteht aus verschiedenen Geweben: dem fleischigen Perikarp

karp, Mesokarp und Endokarp unterteilt wird, der Plazenta und den Fruchtkammer

Querschnitt einer Tomate [16]

Das Perikarp als Fruchtwand besitzt als äußeres Abschlussgewebe das Exokarp

artigen Kutikula überzogen ist [17]. Oft wird die botanisch unkorrekte Bezeichnung Schale für die


Perikarp zu den Fruchtkammern hin ab. Die dicke Gewebeschicht zwischen Exo

bildet den zentralen Gewebebereich, an dem sich die Samen entwickeln. Im

Laufe der Fruchtentwicklung wächst diese zu einem markreichen Gewebe aus

Funiculi (Nabelstränge) sind die Samen mit der Plazenta verbunden. Die zahlreichen kleinen nieren


Zellschicht umgeben, die botanisch als Myxotesta bezeichnet wird [3,10]. Der Raum zwischen den

ertartiges Gewebe ausgefüllt [10].

Plazenta

Same

Funiculus

2

angesehen, da sich der

gehört zur Familie der Nacht-

a. auch Kartoffel, Paprika oder Aubergine zählen. Tomaten

m hohen sympodial verzweigten

Einzelblüten bringen die

Diese können sich in Größe,

. Bei den beiden untersuchten Samen handel-

Waltingers Cocktail ist eine runde, rote

g. Sie besteht aus zwei Fruchtkammern und besitzt

ein saftig weiches Fruchtfleisch. Die Schale ist eher fest und der Geschmack süß. Die Sorte Red

gemäß der Übersetzung ins Deutsche auch rote Johannisbeer-

rund, rot, besteht aus zwei

Die kleinen Tomaten werden als sehr

].

Perikarp, welches in Exo-

Fruchtkammern mit den Samen

res Abschlussgewebe das Exokarp, das von einer wachs-

. Oft wird die botanisch unkorrekte Bezeichnung Schale für die


Perikarp zu den Fruchtkammern hin ab. Die dicke Gewebeschicht zwischen Exo- und Endokarp ist das

Gewebebereich, an dem sich die Samen entwickeln. Im

Laufe der Fruchtentwicklung wächst diese zu einem markreichen Gewebe aus [10]. Über sogenannte

Die zahlreichen kleinen nieren-


. Der Raum zwischen den

Plazenta

Same

Funiculus


3

Die Inhaltsstoffe von Tomaten sind ein wichtiges Qualitätsmerkmal und beeinflussen Farbe, Konsis-

tenz, Nährwert, Geschmack und Aroma der Früchte. Dabei ist die chemische Zusammensetzung von

verschiedenen Faktoren abhängig: sowohl Sorte und Reifegrad als auch Umwelt- und Wachstums-

bedingungen haben einen Einfluss auf die Inhaltsstoffe [3]. Eine Übersicht über die wichtigsten

Inhaltsstoffe, Vitamine und Mineralstoffe gibt Tab. 1.

Tab. 1 Ausgewählte Inhaltsstoffe von frischen Tomaten, Gehaltsangaben pro 100 g Frischmasse (nach SOUCI, FACHMANN & KRAUT 2008 [18] und INBARAJ & CHEN 2008 [19])

Inhaltsstoff Gehalt Inhaltsstoff Gehalt

Hauptinhaltsstoffe Vitamine

Wasser (g) 94,2 Vitamin C (mg) 19

Eiweiß (g) 0,95 Gesamtcarotinoide (mg) 7-19A

Kohlenhydrate (g) 2,60 β-Carotin (µg) 230A

Fett (g) 0,21 Lycopin (mg) 9,27A

Mineralstoffe (g) 0,61 Gesamttocopherole (µg) 930

Ballaststoffe (g) 0,95 Folsäure (µg) 22

Mineralstoffe + Spurenelemente Pantothensäure (µg) 310

Natrium (mg) 3,3 Biotin (µg) 4,0

Kalium (mg) 242 Vitamin K (µg) 5,7

Magnesium (mg) 12 Nicotinsäure (µg) 530

Eisen (µg) 332 Riboflavin (µg) 35

Zink (µg) 154 Thiamin (µg) 57

A nach INBARAJ & CHEN 2008 [19], restliche Angaben nach SOUCI, FACHMANN & KRAUT 2008 [18]

Frische Tomaten bestehen zum größten Teil (ca. 94 %) aus Wasser [18]. Die verbleibenden 6 % bein-

halten anorganische Bestandteile, organische Säuren, Zucker, in Ethanol unlösliche Feststoffe (Pro-

teine, Cellulose, Pektin, Polysaccharide), Carotinoide und Lipide [20]. Bei den löslichen Feststoffen in

Tomaten handelt es sich zu mehr als 60 % um Zucker, die zum Aroma der Früchte beitragen [3]. Die

Gehalte sind von Lichtintensität und -dauer abhängig und nehmen mit dem Reifeprozess zu [3,21].

Der freie Zucker setzt sich im Wesentlichen aus Glucose und Fructose sowie geringen Konzentratio-

nen an Saccharose zusammen [21]. MORETTI et al. (1998) bestimmten die höchsten Zuckerkonzentra-

tionen im Plazentagewebe, da dieses die Kohlenhydrate für das Wachstum und die Entwicklung der

Samen bereitstellen muss [22]. Der Lipidanteil in Tomaten besteht aus Triglyceriden, Sterolen, Sterol-

estern, freien Fettsäuren und Kohlenwasserstoffen [3], wobei die Samen zum Großteil des Fettgehal-

tes beitragen. MADHAVI & SALUNKHE (1998) berichten, dass 33 gesättigte und ungesättigte Fettsäuren

im Perikarp von verschiedenen untersuchten Sorten gefunden wurden [3]. Dabei dominierten Linol-,

Linolen-, Öl-, Stearin-, Palmitin- und Myristinsäure. Der Proteingehalt liegt bei etwa 1 % und setzt sich

aus 43,3 % freien Aminosäuren und 56,7 % Protein-Aminosäuren zusammen [21].

Außerdem enthalten Tomaten Vitamin B1 (Thiamin), B2 (Riboflavin), B3 (Nicotinsäure) und B6 sowie

Vitamin C, Folsäure, Pantothensäure, Biotin, Vitamin E und K [3,20]. Im Gegensatz zu den meisten

Gemüsearten ist die vorherrschende organische Säure die Zitronensäure, die zusammen mit der

Äpfelsäure zum typischen Geschmack der Tomaten beiträgt [3,21]. Bei den Mineralstoffen ist der

hohe Kaliumgehalt bei gleichzeitig niedrigem Natriumgehalt hervorzuheben, da sich dieses Verhältnis

positiv auf Bluthochdruck auswirkt [23]. Außerdem können Tomatenpflanzen in allen Teilen ein

Steroid-Glykoalkaloid, das Tomatin, bilden [21]. Im unreifen, grünen Zustand sind ebenfalls geringe

Mengen an Solanin enthalten. Reife rote Tomaten sind allerdings vollständig frei von Alkaloiden [10].


4

2.1.2 Der Tomatenmarkt und die Problematik der Reststoffverwertung

Die Tomate gilt sowohl qualitativ als auch quantitativ als bedeutendes Gemüse. Die steigende Nach-

frage beruht zum einen auf ihrem ernährungsphysiologischen Gesundheitswert, der sie zum optima-

len Frischgemüse für eine leichte und gesunde Ernährung macht, und zum anderen auf deren

Verwendung als Basis für viele verarbeitete Produkte [4]. Im Jahr 2011 betrug die weltweite Toma-

tenproduktion über 159 Mio. t [24]. China, Indien, die USA und die Türkei trugen zu mehr als der

Hälfte der Gesamtproduktion bei. Laut BUNDESANSTALT FÜR LANDWIRTSCHAFT UND ERNÄHRUNG sind

Tomaten in Deutschland das beliebteste Gemüse [25]. Im Wirtschaftsjahr 2012/13 verzehrten wir

20,6 kg Tomaten pro Kopf, davon 6,7 kg frische Tomaten und 13,9 kg verarbeitete Tomatenprodukte

[25]. In den USA wurden 80 % der konsumierten Tomaten in Form verarbeiteter konservierter

Produkte verzehrt [26]. Das macht die Tomate zum weltweit führenden Gemüse in der Industrie [27].

COSTA & HEUVELINK (2005) geben einen Überblick über die Vielfalt an Tomatenprodukten [1] (Abb. 2).

Das am meisten produzierte Erzeugnis ist Tomatenmark [27], da es oft als Basis für weitere Produkte,

wie Ketchup, Suppen und Saucen, dient.

Abb. 2 Einteilung der verarbeiteten Tomatenprodukte und einige Beispiele (nach COSTA & HEUVE-LINK (2005) [1])

Aus verschiedenen Verarbeitungsprozessen der Tomatenindustrie resultiert der sogenannte Toma-

tentreber oder Tomatentrester. Dieser besteht zum größten Teil aus den Schalen, Samen, aber auch

aus faserigen Bestandteilen und aussortierten Tomaten [28]. Die Schalen werden bei konservierten

Erzeugnissen mit Hilfe spezieller Methoden entfernt. Die Abtrennung der Samen erfolgt meist me-

chanisch, wobei oft Bestandteile des Fruchtfleisches unvermeidbar daran haften bleiben. Im Jahr

2009 ergaben sich laut FAOSTAT 12,9 Mio. t Abfall aus 152,7 Mio. t produzierten Tomaten, was

einem Anteil von 8,5 % entspricht [24]. Bei der Gewinnung von Tomatensaft enden bspw. 3-7 % des

Ausgangsmaterials als Abfall [29]. Die Samen machen dabei einen Anteil von etwa 60 % aus [30].

Abb. 3 zeigt ein Fließdiagramm zur Herstellung verschiedener Tomatenerzeugnisse und bildet die

Zweigpunkte ab, an denen verschiedene Reststoffe anfallen. Schon im Jahr 1917 erkannte RABAK

(1917), dass die wirtschaftliche Maßnahme der Wiederverwertung des Abfalls aus der industriellen

Verarbeitung von Tomatenprodukten für die Landwirtschaft und Industrie sehr bedeutend ist [31].

Eine Abfallentsorgung hat neben weiteren Kosten eine Verschmutzung der Umwelt zur Folge, wes-

halb die Abfallaufarbeitung einen immer höher werdenden Stellenwert annimmt.

Tomatensamen sind eine Quelle für Fett und Protein [30]. Arbeiten, die sich intensiver dem Fettge-

halt und der Lipidzusammensetzung widmeten, machten deutlich, dass das gewonnene Öl reich an

ungesättigten Fettsäuren ist und durchaus als Speiseöl, Lebensmittelzusatzstoff oder auch als Zusatz-

stoff in Kosmetika genutzt werden kann [30-35]. Der Proteingehalt der Samen beträgt 22,2-33,9 %

konservierte

Tomatenprodukte

getrocknete

Tomatenprodukte

Lebensmittel auf Tomaten-

Basis

ganze geschälte Tomaten, Tomatensaft, Tomatenmark,

Tomatenpulpe, passierte Tomaten

Tomatenpulver, Tomatenflocken, ganze getrocknete Tomaten

Tomatensuppe, Tomatensauce,

Tomatenketchup, Chilisauce


5

[32]. Der Presskuchen, der nach der Ölextraktion zurückbleibt, wird als Proteinquelle z. B. in Futter-

mitteln verwendet [34]. Auch das Lycopin als natürlicher roter Farbstoff der Tomaten geht durch die

Entfernung der Schalen zu einem großen Teil bei der Verarbeitung verloren. BAYSAL et al. (2000)

entwickelten dahingehend eine Extraktionsmethode, um Lycopin und β-Carotin aus Abfällen der

Tomatenmarkherstellung zu gewinnen [36].

2.2 Carotinoide

2.2.1 Struktur und Vorkommen

Carotinoide sind eine heterogene Gruppe sekundärer Pflanzenstoffe, von denen heute rund 750 Ver-

bindungen bekannt sind [38,39]. Meist handelt es sich um Tetraterpene, die aus 8 Isoprenoideinhei-

ten bestehen [40]. Aufgrund ihrer chemischen Struktur werden die Carotinoide in die sauerstoff-

freien Carotine und die sauerstoffhaltigen Xanthophylle eingeteilt, die verschiedene Polaritäten und

Fettlöslichkeiten aufweisen. Zu den Carotinen zählen bspw. α-Carotin, β-Carotin und Lycopin. Lutein,

Zeaxanthin und β-Cryptoxanthin sind typische Vertreter der Xanthophylle (Abb. 4).

Ein auffälliges und typisches Merkmal der Carotinoide ist die lange Polyen-Struktur, die durch die

Absorption bestimmter Teile des sichtbaren Lichtspektrums deren charakteristische Farben (gelb,

orange, rot) bedingt. Außerdem kann jedes Carotinoid durch die Doppelbindungen geometrische

Abb. 3 Übersicht über die Herstellung von Tomatenerzeugnissen (nach EYRING 2004 [37]), grau unter-legt: Reststoffe

Frischtomaten

Entladen 1. Waschen

2. Waschen Sortieren

Schältomaten

Schalen

Schneiden oder Passieren =

Tomatenpulpe Samen

Zerkleinern (Hot Break oder

Cold Break)

Sieben

Zentrifugieren Samen, Schalen, Cellulose

Konzentrieren = Tomatenmark

Transportfertiges Produkt zur Weiterverwendung

Walzen- oder Sprühtrocknung

zu Pulver

Ketchup Suppen und

Saucen

Rückverdünnung zu Tomatensaft

Erhitzen Schälen Verlesen


6

Isomere bilden. So existieren für die bekannten Verbindungen mehr als 200 000 verschiedene

Isomere [40]. Aufgrund der höheren thermodynamischen Stabilität dominiert die all-trans-Form

((all-E)-Form) in der Natur [41].

Abb. 4 Strukturformeln ausgewählter Carotinoide

Die mittlere Carotinoid-Zufuhr liegt in Deutschland nach WATZL & BUB (2001) bei 5,3 mg/Tag [40].

Obst und Gemüse sind die Hauptquelle für diese Gruppe der sekundären Pflanzenstoffe [40]. Aber

auch verschiedene tierische Lebensmittel, wie z. B. Krustentiere, Lachs und Eier, enthalten Carotino-

ide, da Tiere diese ebenfalls über die Nahrung aufnehmen [38]. Carotine kommen in orange-gelb-

rotem Gemüse und Obst vor, Xanthophylle finden sich hauptsächlich in grünblättrigem Gemüse. To-

maten und Tomatenprodukte sind eine gute Quelle für verschiedene Carotinoide, insbesondere das

Lycopin. Dieses Carotin ist für die rote Farbe der Tomaten verantwortlich und trägt zu mehr als 60 %

der Gesamtcarotinoide bei [42] (Abb. 5). Nach einer Studie von GARCÍA-CLOSAS et al. (2004) stehen To-

maten an erster Stelle bei den Versorgungsquellen für Lycopin [43]. Weiterhin wurden die farblosen

Carotinoid-Vorstufen Phytoen und Phytofluen, freie und veresterte Xantophylle sowie kleine Anteile

an weiteren Carotinen (β-Carotin, γ-Carotin, ζ-Carotin, α-Carotin, δ-Carotin) gefunden [19].

Abb. 5 Carotinoidprofil von Tomaten (nach TONUCCI et al. 1995 [42])

GAMA et al. (2006) berichteten, dass die Carotine 86-91 % und die Xanthophylle 9-14 % der Gesamt-

carotinoide der Tomaten ausmachten [44]. Studien über die Verteilung der Carotinoide in Tomaten

ergaben, dass die äußere Perikarpschicht den höchsten Anteil an den Gesamtcarotinoiden aufwies,

β-Carotin 2%

γ-Carotin 10%

ζ-Carotin 1%

Lutein 1%

Lycopin62%

Neurosporin 7%

Phytoen 12%

Phytofluen 5%

(all-E)-β-Carotin

(all-E)-Lycopin

(all-E)-Zeaxanthin

(all-E)-Lutein


7

während der β-Carotingehalt in den Fruchtkammern am höchsten war [45]. Somit scheinen die

Schalen der Tomaten besonders reich an Lycopin zu sein, was darauf hindeutet, dass dieses Carotin

an den unlöslichen Faserstoffen anhaftet. β-Carotin war gleichmäßig in den Tomaten verteilt [19]. In

den Samen waren hingegen die Xantophylle vorherrschend [46].

2.2.2 Funktionen

In Pflanzen spielen die Carotinoide eine bedeutende Rolle bei der Photosynthese in Chloroplasten.

Dort sind sie zum einen bei der Lichtabsorption beteiligt, zum anderen schützen sie Chlorophyll vor

oxidativen Schäden [40]. Letzteres beruht auf der antioxidativen Aktivität der Carotinoide, d. h. auf

der Fähigkeit, Elektronen oder Wasserstoffatome abzugeben sowie auf ihrer leichten Oxidierbarkeit

[47]. Diese Schutzfunktionen werden auch in tierischen und menschlichen Geweben diskutiert. Die

Carotinoide erwiesen sich in vitro als Fänger von energiereichem Singulettsauerstoff, der im Körper

zu Zell- und DNA-Schäden führen kann. Die Eigenschaft als Radikalfänger lässt vermuten, dass die

Antioxidanswirkung einen Schutzmechanismus vor Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen darstellt

[47]. So besteht ein positiver Zusammenhang zwischen einer hohen Zufuhr und Gewebekonzentra-

tion an Carotinoiden und einem niedrigeren Risiko für chronische Erkrankungen [48]. Die bekanntes-

te Funktion der Carotinoide im menschlichen Organismus ist wahrscheinlich die Wirkung als Vorstufe

des Vitamin A‘. α-Carotin, β-Carotin und β-Cryptoxanthin sind Provitamin-A-wirksame Verbindungen,

da sie mindestens einen unsubstituierten β-Iononring am Ende der Polyenkette besitzen [38]. In

Folge dessen spielen die Carotinoide eine wichtige Rolle bei der Prävention von Vitamin-A-Mangel-

erkrankungen. Lycopin zeigt diese Wirkung nicht, ihm wird allerdings eine große Bedeutung bei der

Prostata-Krebs-Prävention zugeschrieben [48]. Daneben sind Lutein und Zeaxanthin die zwei Caroti-

noide, die sich besonders im menschlichen Auge anreichern und im Zusammenhang mit dem Schutz

vor häufig auftretenden Augenerkrankungen wie altersbezogener Makuladegeneration (AMD),

Katarakten oder Retinitis pigmentosa stehen [49].

2.3 Vitamin E

2.3.1 Struktur und Vorkommen

Unter dem Begriff Vitamin E werden acht isomere, fettlösliche Moleküle zusammengefasst, zu denen

vier Tocopherole (α-, β-, γ- und δ-Tocopherol) mit gesättigter Seitenkette und vier Tocotrienole

(α-, β-, γ- und δ-Tocotrienol) mit ungesättigter Seitenkette gehören (Abb. 6). Charakterisiert werden

die Tocopherole durch einen 6-Chromanolring mit unterschiedlichem Methylierungsmuster in den

Positionen 5, 7 und 8, und einer Phytyl-Seitenkette mit 16 Kohlenstoffatomen in Position 2. Bei den

Tocotrienolen ist diese isoprenoide Seitenkette ungesättigt mit drei trans-Doppelbindungen in den

Positionen 3‘, 7‘ und 11‘. Die spezifischen Tocopherole und Tocotrienole unterscheiden sich in der

Anzahl und Position der substituierten Methylgruppen am aromatischen Chromanolring, wodurch die

α-, β-, γ- und δ-Isomere entstehen [50]. Tocopherole und Tocotrienole werden zusammen als

Tocochromanole bezeichnet. Die Tocopherole besitzen drei asymmetrische Kohlenstoffatome.

Natürlicherweise liegen die Tocopherole in der RRR-Konformation vor. Das gängigste synthetische

Vitamin E ist das all-rac-α-Tocopherol, ein racemisches Gemisch von gleichen Anteilen aller acht

Stereoisomere.


8

Abb. 6 Strukturformeln von Tocopherolen (oben) und Tocotrienolen (unten)

Besonders hohe Gehalte an Vitamin E weisen Pflanzenkeime und -saaten sowie daraus hergestellte

Öle auf. In Weizenkeim-, Sonnenblumen- und Olivenöl liefert RRR-α-Tocopherol mit 50-100 % den

Hauptanteil des Vitamin E, während in Soja- und Maiskeimöl das γ-Tocopherol dominiert [51]. Zu

finden ist dieses Vitamin aber auch in Nüssen, Mandeln und Getreidekeimen. Nach der Nationalen

Verzehrsstudie II sind neben den Fetten alkoholfreie Getränke und Gerichte auf Gemüsebasis Haupt-

lieferanten von Vitamin E [52]. In Tomaten ist Vitamin E ausschließlich in den Samen vorhanden. Da

diese meist bei der Verarbeitung der Tomaten entfernt werden, kommt dem Vitamin in dieser Hin-

sicht keine Bedeutung bei der menschlichen Ernährung zu [20]. Bei Betrachtung des aus den Samen

gewonnenen Öls wird deutlich, dass dieses wesentlich höhere Tocopherolwerte aufweist. Des

Weiteren muss beachtet werden, dass die Tocochromanole unterschiedliche biologische Wirksamkei-

ten aufweisen. Aus diesem Grund wurde das sogenannte α-Tocopherol-Äquivalent (engl. α toco-

pherol equivalent, αTE) eingeführt, wobei die Wirkung von α-Tocopherol gleich 100 % gesetzt wird.

So wird der Gehalt an Vitamin E in Lebensmitteln meist als Summe der αTE angegeben. Der Bedarf an

Vitamin E wird im Zusammenhang mit der Zufuhr an mehrfach ungesättigten Fettsäuren formuliert:

je g Diensäure sollten 0,5 mg RRR-α-Tocopherol aufgenommen werden [51]. Die tägliche Zufuhr-

empfehlung in Deutschland liegt nach der DGE (2008) zwischen 12 und 14 mg α-TE [53].

2.3.2 Funktionen

Die bekannteste und am intensivsten erforschte Funktion des Vitamin E ist dessen Wirkung als lipo-

philes Antioxidans in Pflanzen und Tieren. In tierischen Zellen schützt α-Tocopherol als Bestandteil

aller biologischen Membranen die Membranlipide vor Lipidperoxidation und fängt reaktive Sauer-

stoffspezies ab. Daneben wirkt Vitamin E für die Lipoproteine und Depotfette als Antioxidans [51,54].

Auch der Einfluss von Vitamin E auf biochemische und zellbiologische Prozesse im menschlichen

Körper ist vielseitig. Neben dem antioxidativen Potential besitzen Tocochromanole Gen-regulierende

Eigenschaften, sowie Funktionen als Signalmolekül, die sich zwischen den isomeren Molekülen durch

ihre biologische Verfügbarkeit und Aktivität unterscheiden. Mögliche positive Effekte in der Präven-

tion von Krebs und Atherosklerose wurden ebenfalls ermittelt [55]. Auch in Ölen sind die Tocophe-

role die wichtigsten natürlichen Antioxidantien. Sie stabilisieren Hydroperoxid-Radikale und freie

Radikale und verhindern damit die Lipidperoxidation. Dies hat einen maßgeblichen Einfluss auf die

Aroma- und Geschmacksqualität des Öles [56] und spielt eine wichtige Rolle für die Lagerstabilität

[33]. In den Pflanzenölen besteht ein direkter Zusammenhang zwischen dem Sättigungsgrad und dem

Tocopherol-Gehalt. Liegen viele ungesättigte Fettsäuren in einem Öl vor, so ist die Wahrschein-

lichkeit einer Oxidation größer. Zum Schutz dieser sind entsprechende Tocopherol-Konzentrationen

erforderlich.

R1 R2 R3

α CH3 CH3 CH3 β CH3 H CH3 γ H CH3 CH3 δ H H CH3


9

2.4 Bestimmung der antioxidativen Kapazität

Antioxidantien werden im Allgemeinen als Stoffe definiert, die „… in niedrigen Konzentrationen im

Vergleich zum oxidierbaren Substrat, eine Oxidation des Substrates verzögern oder verhindern“ [57].

Das Ausmaß, mit dem Substrate vor einem oxidativem Angriff geschützt werden, wird in Form der

antioxidativen Kapazität (engl. antioxidant capacity, AOC) gemessen. In der Ernährungsforschung

besteht in zweierlei Hinsicht ein wachsendes Interesse an der Bestimmung dieses Parameters. Zum

einen ist der sogenannte oxidative Stress, bei dem wichtige zelluläre Bestandteile durch reaktive Ver-

bindungen oxidiert werden, häufig die Ursache verschiedener Erkrankungen [58]. Um neue Ansätze

zur Prävention entwickeln zu können, spielt die Bestimmung des antioxidativen Status‘ im Organis-

mus eine entscheidende Rolle. Insbesondere die Antioxidantien aus der Nahrung, hauptsächlich

sekundäre Pflanzenstoffe (Carotinoide und Polyphenole, wie Phenolcarbonsäuren und Flavonoide),

Vitamin C und E aus Obst und Gemüse, haben einen vorbeugenden Einfluss auf diese Erkrankungen

[59,60]. Zum anderen profitiert die Lebensmittelindustrie von diesen Erkenntnissen. Die Vorgänge,

die beim oxidativen Verderb von frischen und verarbeiteten Lebensmitteln sowie bei Kosmetika ab-

laufen, werden so besser verstanden. Damit können entsprechende Maßnahmen bei der Lagerung

und Verpackung sowie bei der Zugabe von Antioxidantien als Zusatzstoffe ergriffen werden [58].

Bisher wurden viele Schnelltests zur Bestimmung der gesamten AOC entwickelt. Die Erforschung der

Antioxidantien ist allerdings ein sehr komplexes Feld, sodass noch keine standardisierte, universell

anwendbare Methode existiert, die die AOC von Lebensmitteln und biologischen Proben verlässlich,

exakt und quantitativ erfasst [58,61,62]. Die Tatsache, dass eine Vielzahl verschiedenster Radikal-

spezies, Oxidantien und Antioxidantien vorliegen und dass diese auf vielfältigste Art und Weise

miteinander reagieren, erschweren die Entwicklung einer solch standardisierten Methode [63]. Die

verschiedenen entwickelten Testmethoden weisen Unterschiede bezüglich verwendeter Radikal-

quellen, Substrate, Reaktionsbedingungen und Quantifizierungsmethoden auf.

Des Weiteren muss bedacht werden, dass sowohl hydrophile Antioxidantien (Ascorbinsäure, Poly-

phenole etc.) als auch lipophile Antioxidantien (Vitamin E, Carotinoide etc.) vorliegen, die sich in

ihrem Löslichkeitsverhalten im Testmedium unterscheiden. Der Großteil der antioxidativen Testsys-

teme eignet sich nur für wasser- und alkohollösliche Antioxidantien. MÜLLER (2011) optimierte bzw.

entwickelte verschiedene Methoden neu, um lipophile Antioxidantien messen zu können [58].

Grundsätzlich existieren drei Reaktionsmechanismen, nach denen Antioxidantien Radikale deaktivie-

ren: Adduktbildung, Elektronentransfer (engl. single electron transfer, SET bzw. ET) und Wasserstoff-

atom-Transfer (engl. hydrogen atom transfer, HAT) [58,61]. Die beiden letzteren dienen gleichzeitig

als Ansatz zur Erfassung der AOC und teilen die Testsysteme in zwei Kategorien.

HAT-basierte Methoden messen die Radikalfängerkapazität eines Antioxidans über eine Wasserstoff-

atom-Übertragung [62], durch die eine Radikalkettenreaktion unterbrochen wird.

ROO• + PH → ROOH + P• (1)

ROO• + AH → ROOH + A• (2)

Den meisten HAT-Tests liegt ein kompetitiver Reaktionsmechanismus zugrunde, bei dem Antioxidan-

tien (AH) mit einem fluoreszierenden Substrat (PH) um vorhandene Radikale (z. B. Peroxylradikale

ROO•) konkurrieren [58,61]. Dabei müssen die Antioxidantien schneller mit den Radikalen reagieren

als die Substrate, um diese effektiv vor dem oxidativen Angriff zu schützen [64]. Somit beinhalten die

HAT-Testmethoden im Allgemeinen drei Komponenten:


10

a. einen synthetischen, thermolabilen Peroxylradikal-Generator,

b. ein fluoreszierendes Substrat, das bei oxidativem Angriff seine optischen Eigenschaften

ändert und damit den Reaktionsverlauf nachvollziehbar macht und

c. eine antioxidativ wirksame Probe, die mit dem Substrat um die gebildeten Radikale kon-

kurriert und damit die Reaktion verzögert [61].

Schließlich wird das Ausmaß, mit dem diese Oxidation verhindert wird, bestimmt und eine Quantifi-

zierung mit Hilfe eines standardisierten Antioxidans‘ (meist Trolox) vorgenommen [65].

Dagegen messen SET-basierte Methoden die Fähigkeit von Antioxidantien, Elektronen zu übertragen

um Oxidantien, wie Metalle, Carbonyle oder freie Radikale, zu reduzieren [63]. An der Reaktion ist

eine antioxidative Probe (AH) und ein Substrat bzw. Oxidationsmittel (PH) beteiligt. Es handelt sich

folglich um eine einfache Redoxreaktion, bei der ein Elektron von dem Antioxidans auf das Oxidans

übertragen wird. Daher wird die bestimmte AOC auch als Reduktionskapazität bezeichnet [61].

PH(n) + AH → PH(n-1) + AH•+ (3)

Die Reduktion des Oxidans‘ resultiert in einer Absorptions- bzw. Farbänderung, die photometrisch

gemessen wird. Die Farbveränderung verhält sich dabei proportional zur Konzentration des Antioxi-

dans‘ [61]. Folgende Tabelle (Tab. 2) gibt eine Übersicht über einige Testmethoden zur Bestimmung

der AOC.

Tab. 2 Ausgewählte Methoden zur Bestimmung der AOC (nach HUANG et al. 2005 [61], VALENTINI 2009 [65])

Bezeichnung Messung von

Was

sers

toff

ato

m-

tran

sfer

(H

AT)

ORAC Oxygen Radical Absorbance

Capacity AOC gegenüber Peroxylradikalen

TRAP Total Radical Trapping

Antioxidant Parameter AOC gegenüber Peroxylradikalen

TOSC Total Antioxidant

Scavenging Capacity

AOC gegenüber Peroxylradikalen, Hydroxylradikalen und Peroxynitrit

Elek

tro

nen

- tr

ansf

er (

SET)

TEAC Trolox Equivalent

Antioxidant Capacity AOC gegenüber ABTS•+

Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu

molybdänreduzierende Fähigkeit von

Antioxidantien

FRAP Ferric Ion Reducing

Antioxidant Power

eisenreduzierende Fähigkeit von Antioxidantien

Aufgrund der Tatsache, dass für die Arbeit drei der aufgeführten Tests (ORAC, TEAC, Gesamtphenol-

test nach Folin-Ciocalteu) angewendet wurden, schließt sich eine nähe Erläuterung dieser an.

2.4.1 Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu

Diese kolorimetrische Testmethode wurde viele Jahre gemäß ihrem Namen zur Bestimmung des Ge-

samtphenolgehaltes in Pflanzenerzeugnissen genutzt [63]. Das verwendete Folin-Ciocalteu-Reagenz

besteht aus einer Mischung aus Phosphomolybdat und Phosphowolframat, die exakte Zusammen-

setzung ist allerdings unbekannt. Durch eine Reaktion mit den in einer Probe enthaltenen phenoli-

schen Gruppen entsteht ein blau gefärbtes Produkt, welches photometrisch bei 765 nm gemessen


11

wird [66]. Hierbei wird angenommen, dass ein einzelnes Elektron von dem Substrat, dem Phenol, auf

das komplexierte sechswertige gelbe Molybdän (Mo6+) übertragen wird, wodurch eine Reduktion

zum fünfwertigen blauen Molybdän (Mo5+) stattfindet. Damit wird deutlich, dass der zugrunde lie-

gende Reaktionsmechanismus auf einer Ein-Elektronen-Übertragung (SET-Mechanismus) basiert und

die reduzierende Kapazität einer Probe gemessen wird. Infolgedessen gilt dieser Test als unkompli-

zierte und exakte Methode zur Bestimmung der AOC. Aufgrund der Ähnlichkeit der Reaktions-

mechanismen wurde beim Vergleich des Gesamtphenoltests mit SET-basierten antioxidativen Tests,

wie dem TEAC, oft eine lineare Korrelation zwischen dem Gesamtphenolgehalt und der AOC nachge-

wiesen [61,67]. Diese Erkenntnis impliziert, dass die phenolischen Inhaltsstoffe überwiegend zu den

antioxidativen Eigenschaften in vielen Pflanzen beitragen. Daneben existieren einige Berichte, so

auch eine Studie von EVERETTE et al. (2010), die zeigten, dass das Folin-Ciocalteu-Reagenz auch mit

anderen reduzierenden Verbindungen außer Phenolen, wie bestimmten Thiolen, Vitaminen oder

Aminosäuren, reagiert und nicht nur spezifisch für Phenole ist [66].

2.4.2 TEAC-Test

Der TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)-Test wurde 1993 von MILLER et al. entwickelt und

später durch andere Forschungsgruppen überarbeitet [68,69]. Die Bestimmung der AOC basiert bei

diesem Test auf der Absorption des farbigen Radikalkations ABTS•+ [68]. Im Allgemeinen wird der

TEAC-Test den SET-Reaktionen zugeordnet. Allerdings kann das genannte Radikalkation sowohl durch

Reduktion per Elektronen-Übertragung als auch durch Radikalfänger per Wasserstoffatom-Übertra-

gung neutralisiert werden [63]. Demzufolge nutzt die Methode sowohl den SET- als auch den HAT-

Mechanismus. ABTS (2,2‘-Azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat)) wird durch Peroxylradikale

oder andere Oxidantien in seine blau-grün gefärbte Radikalform ABTS•+ umgewandelt, dessen Ab-

sorption bei etwa 730 nm spektralphotometrisch gemessen wird. Antioxidantien besitzen die Fähig-

keit, dieses Radikal zu reduzieren und bewirken dadurch eine Entfärbung der Reaktionslösung. Die

Abnahme der Absorption von ABTS•+ in Gegenwart der Probe bzw. Trolox-Standardlösungen wird zu

einem festgelegten Zeitpunkt gemessen und zur Berechnung der AOC genutzt [63].

Inzwischen existieren drei Varianten des TEAC-Tests. In der ursprünglichen Version, dem TEAC I,

dient die Peroxidaseaktivität von Metmyoglobin zur Generierung des Radikalkations ABTS•+ [70].

Durch die Aktivierung von Metmyoglobin mit Wasserstoffperoxid entsteht Ferrylmyoglobin, das mit

ABTS reagiert und das Radikalkation erzeugt [68]. Antioxidantien verzögern hierbei die Bildung des

Radikalkations um die sogenannte Lag-Phase, die als Maß für die AOC dient [70]. Kritik wurde von

STRUBE et al. (1997) an der Reihenfolge der Reagenzienzugabe geäußert [71]. Die antioxidative wir-

kende Probe wurde bereits vor der Radikalbildung in das Reaktionsmedium gegeben, wodurch nicht

nur das Abfangen freier Radikale, sondern auch der hemmende Einfluss auf die Radikalbildung er-

fasst wurde. Das kann eine Überschätzung der AOC zur Folge haben. STRUBE et al. (1997) optimierten

die Methode daraufhin mit einem sogenannten „Post-addition Assay“ [71]. Dabei wird die Probe erst

nach der Erzeugung der Radikale zugegeben, sodass nur die radikalabfangende Wirkung des Antioxi-

dans‘ wiedergespiegelt wird.

Im Laufe der Zeit wurden weitere Test-Abwandlungen bezüglich ABTS•+-Bildung, eingesetzter Wellen-

längen sowie Quantifizierungsmethoden vorgenommen [63]. Bei dem TEAC-II-Test wurde bspw. das

ABTS-Radikal mittels Mangandioxid gebildet und nach der Zugabe von Antioxidantien die Abnahme

der Extinktion gemessen [72]. Diese Testvariante diente ursprünglich zur Analyse von lipidlöslichen

Antioxidantien [70], woraus sich die Kennzeichnung als L-TEAC-II-Test ergab. Durch den Austausch


12

des wasserlöslichen Trolox gegen sein fettlösliches Analogon α-Tocopherol als Kalibrierstandard

wurde der Test daraufhin in α-Tocopherol Equivalent Antioxidant Capacity (αTEAC)-Test umbenannt

[58]. RE et al. (1999) nutzten Kaliumperoxodisulfat als alternative Radikalquelle zur Oxidation von

ABTS [69]. Dies entspricht dem TEAC-III-Test, für den ebenfalls eine hydrophile und eine lipophile

Variante existieren [69]. Die hydrophile Variante des TEAC-III-Tests (im Folgenden als H-TEAC-Test

bezeichnet) sowie der αTEAC-Test fanden Anwendung bei der Analyse der Tomatensamen.

2.4.3 ORAC-Test

Der ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)-Test ist eine etablierte Methode, die auf einer

Wasserstoffatom-Übertragung basiert. Das angewendete Verfahren wird explizit als H-ORACFl be-

zeichnet. Die Kennzeichnung H-ORAC impliziert die Anwendung auf hydrophile Antioxidantien. Die

Grundlagen zu diesem Verfahren lieferten WAYNER et al. (1986), einige Änderungen wurden später

von CAO et al. (1993) und OU et al. (2001) vorgenommen [73-75]. Als Radikalgenerator bildet

2,2‘-Azobis-(2-amidinopropan)-dihydrochlorid (AAPH) durch thermische Zersetzung Peroxylradikale

[78], die ein fluoreszierendes Substrat oxidieren und damit abbauen, woraus eine Fluoreszenzab-

nahme resultiert. Bei diesem Substrat handelte es sich ursprünglich um das Protein β-Phycoerythrin,

bei dem einige Autoren allerdings feststellten, dass die Verbindung unter den Reaktionsbedingungen

nicht photostabil ist und dass Wechselwirkungen mit Polyphenolen durch unspezifische Protein-

bindungen stattfinden [75].

Aufgrund dieser Tatsachen modifizierten OU et al. (2001) die Methode weiter, indem sie das photo-

stabile Fluoreszein als Indikatorfarbstoff verwendeten [75]. Daher resultiert die Bezeichnung

H-ORACFl. In Anwesenheit von Antioxidantien wird die Reaktion zwischen den Peroxylradikalen und

dem Fluoreszein verzögert, da ein Teil der Peroxylradikale mit den Antioxidantien reagiert und

dadurch neutralisiert wird [65]. Die erreichte Verzögerung der Fluoreszenzabnahme dient als Mess-

größe für die AOC [76]. Die Reaktion wird so lange verfolgt, bis alle Antioxidantien und das Fluores-

zein durch die Peroxylradikale oxidiert wurden [74], die Fluoreszenz bis auf Null abgesunken ist. Als

Referenzsubstanz zur Erstellung einer Kalibriergerade wird Trolox verwendet. Zur Quantifizierung der

AOC wird die Fläche unter der gemessenen Fluoreszenzkurve (area under the curve, AUC) der Probe

ermittelt und anschließend die Fläche des Blindwertes (ohne Antioxidantien) abgezogen [65]. Die

Fläche unter der Kurve ist proportional der AOC [74]. Die Einzigartigkeit des ORAC-Tests besteht

darin, dass sowohl Ausmaß als auch Dauer der Fluoreszenzabnahme durch die Antioxidantien in

einer Messgröße erfasst werden [75].

2.5 Die Ölgewinnung aus Ölsaaten und deren Fettsäurezusammensetzung

Die Gewinnung von Ölen aus pflanzlichen Materialien kann durch verschiedene technologische Ver-

fahren realisiert werden. Als Rohstoffe dienen jeweils ölhaltige Samen, Keime oder Früchte. Das am

häufigsten angewandte Verfahren ist die Extraktion mit Lösungsmitteln [9]. Diese Methode zur Öl-

gewinnung verursacht gegenüber der traditionellen Methode, dem Pressen der Ölsaaten, nur etwa

50 % der Kosten einer Pressung. Außerdem ermöglicht die Vorgehensweise deutlich niedrigere Rest-

ölgehalte [77]. Als weitere Möglichkeiten zur Ölgewinnung kann eine Kombination aus beiden Ver-

fahren oder auch eine Hochdruckextraktion (z. B. mit überkritischem Kohlenstoffdioxid) zum Einsatz

kommen [9].


13

Zudem wird zwischen kaltgepressten und raffinierten Ölen unterschieden. Kaltgepresste Speiseöle

werden ohne Wärmezufuhr ausschließlich durch mechanische Verfahren gewonnen. Im Gegensatz

dazu werden dem Rohöl bei der Raffination unerwünschte, natürliche Begleitstoffe und Verunreini-

gungen entzogen, indem es entschleimt, entsäuert, gebleicht und gedämpft wird [78]. Allerdings

gehen bei diesem Prozess auch Aromakomponenten und ernährungsphysiologisch relevante Inhalts-

stoffe verloren [54].

Pflanzenöle bestehen hauptsächlich aus Triglyceriden, Ester aus drei Fettsäuren und Glycerin. Die Zu-

sammensetzung oder das Muster der Fettsäuren ist für viele Eigenschaften des entsprechenden Öles

verantwortlich. Dazu zählen Parameter, die für die industrielle Herstellung, sowie Lagerung und Ver-

wendung von Bedeutung sind, wie z. B. die Viskosität, der Schmelzpunkt, die Stabilität beim Erhitzen,

die Oxidierbarkeit, aber auch die ernährungsphysiologischen Eigenschaften [79]. Neben der Art der

Fettsäuren ist deren Position an dem Glycerinmolekül für unterschiedliche physikalische und chemi-

sche Eigenschaften verantwortlich [79]. Die Fettsäuren unterscheiden sich zum einen in ihrer Ketten-

länge und zum anderen in ihrem Sättigungsgrad. Die meisten natürlich vorkommenden Fettsäuren

haben eine gerade Anzahl an Kohlenstoffatomen [80]. Bezüglich des Sättigungsgrades wird zwischen

gesättigten (SFA) sowie einfach (MUFA) und mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) unterschie-

den. Die ungesättigten Fettsäuren können weiter in sogenannte ω(omega)-Serien eingeteilt werden.

Dieser griechische Buchstabe kennzeichnet das Methyl-Ende einer Fettsäure und ist die Grundlage

einer Nomenklatur, bei der die Doppelbindung angezeigt wird, die sich in nächster Nähe zu dem

Methyl-Ende befindet [81]. Demnach gibt es in Abhängigkeit von der Position der Doppelbindung die

essentiellen ω3- und ω6-Fettsäuren sowie die nicht essentiellen ω9-Fettsäuren.

Pflanzenöle zählen zu den wichtigsten Quellen, die den Menschen mit Fettsäuren versorgen. Diese

spielen eine wichtige Rolle im Metabolismus, da sie Energie liefern, Bestandteile biologischer Mem-

branen sind und sich auf die Genregulation auswirken [81]. Aus ernährungsphysiologischer Sicht

sollte auf die Zusammensetzung der Fettsäuren geachtet werden, da diese gerade in Abhängigkeit

vom Sättigungsgrad unterschiedliche biologische Effekte hervorrufen. Eine hohe Aufnahme von ge-

sättigten Fettsäuren steht in engem Zusammenhang mit erhöhten Serumcholesterinwerten und den

hohen Sterberaten aufgrund der koronaren Herzkrankheit [82]. Den ungesättigten ω3- und ω6-Fett-

säuren werden wiederum positive Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System nachgesagt [81].

Der sogenannte P:S-Index, der das Verhältnis der mehrfach ungesättigten zu den gesättigten Fett-

säuren darstellt, sollte nach KANG et al. (2005) zwischen 1,0 und 1,5 liegen [82]. Pflanzenöle sind

generell reich an ungesättigten Fettsäuren. Außerdem tragen die enthaltenen fettlöslichen Vitamine

A, D, E und K zu den gesundheitlich bedeutsamen Inhaltsstoffen von Pflanzenölen bei [83].

Im Hinblick auf eine sinnvolle Reststoffverwertung für die großen Mengen an Tomatensamen, die in

der verarbeitenden Industrie anfallen, wurden auch hier Verfahren zur Ölgewinnung aus diesen

Samen entwickelt. In den Samen wurde ein Fettgehalt von etwa 25 % festgestellt [30] und Schätzun-

gen zufolge könnten weltweit mehr als 0,14 Mio. t Öl pro Jahr aus den Samen der Tomatentrester

gewonnen werden [9]. RABAK (1917) berichtete, dass schon im Jahr 1901 von dem Italiener Battaglia

Untersuchungen zu diesem Öl angestellt wurden [31]. Später konnten genauere Analysen zu der

Fettzusammensetzung und dem Fettsäuremuster betrieben werden. Dabei wurde ein hoher Gehalt

an ungesättigten Fettsäuren, speziell der Linolsäure, festgestellt [34].

MATERIAL UND METHODEN

14

3 MATERIAL UND METHODEN

Die verwendeten Reagenzien, Geräte und Arbeitsmittel für die einzelnen Testmethoden sind im

Anhang A aufgelistet. Die ausführlichen Methodenbeschreibungen befinden sich im Anhang B.

3.1 Untersuchungsmaterial

Gegenstand der Untersuchungen waren Samen der zwei Tomatensorten Waltinger und Red Currant.

Beide Samen wurden von Herrn Hoser aus Wolfratshausen (Bayern) zur Verfügung gestellt und

stammen aus dem Jahr 2010. Bei der Sorte Waltinger lagen ca. 3 600 Samen mit einem Gewicht von

4,96 g vor. Die Samenanzahl der Sorte Red Currant belief sich auf ca. 3 220 mit einem Gewicht von

3,72 g. Dies verdeutlicht, dass die Waltinger-Samen ein geringfügig höheres Samengewicht hatten.

Beide Samensorten wurden bis zum Untersuchungszeitpunkt in verschlossenen Papiertütchen im

Dunkeln bei Raumtemperatur aufbewahrt.

3.2 Probenvorbereitung

Die Tomatensamen sollten für die Analysengänge in pulverisiertem Zustand vorliegen. Aufgrund der

sehr geringen Probenmengen konnten die Samen nicht in einer Labormühle vermahlen werden,

sondern wurden stattdessen mit flüssigem Stickstoff in einem Mörser zu einem möglichst homo-

genen Pulver zerkleinert und vermahlen. Im Anschluss wurde das Samenmehl bis zur Aufarbeitung

portionsweise bei - 30 °C eingefroren.

3.3 Trockenmassebestimmung

Für die Bestimmung der Trockenmasse wurden für eine Zweifachbestimmung jeweils 500 mg der ver-

mahlenen Samenproben in luftdicht verschlossene Probengläschen eingewogen. Gleichzeitig wurden

drei Gläschen für den Blindwert an der Umgebungsluft stehen gelassen und anschließend ebenfalls

luftdicht verschlossen. Die Bestimmung des Wassergehaltes in den Proben erfolgte nach der titri-

metrischen Karl-Fischer-Methode, die sich besonders für Lebensmittel mit geringem Wassergehalt

eignet. Dabei wurden letztendlich nur ca. 50 mg Probensubstanz verwendet, sodass dennoch eine

Dreifachbestimmung durchgeführt werden konnte. Grundlage dieser Bestimmungsmethode ist die

sogenannte „Bunsengleichung“, bei der Iod und Schwefeldioxid nur in Gegenwart von Wasser mit-

einander reagieren (Gl. 4). Dadurch wird das Wasser spezifisch und selektiv erfasst.

2 H2O + SO2 + I2 ↔ SO42- + 2 I- + 4 H+ (4)

3.4 Bestimmung des Carotinoid- und Vitamin-E-Gehaltes

Die Bestimmung des Carotinoid- und des Vitamin-E-Gehaltes erfolgte nach einer kombinierten

Methode, die in der AG Bioaktive Pflanzenstoffe entwickelt wurde. Diese orientiert sich an einer

Methode, die für Hartweizen, Grieß und Nudeln entworfen wurde [38] und in ähnlicher Weise auch

für Saaten und Presskuchen angewandt wurde [54,84]. Vor der flüssigchromatographischen Analyse

erfolgte die Aufarbeitung der Samen und die Extraktion mit Methanol (MeOH)/Tetrahydrofuran

(THF) (1/1, v/v, + 0,1 % BHT) unter gleichzeitiger Homogenisierung mittels Ultra-Turrax. Eine Über-

sicht über die einzelnen Extraktionsschritte gibt Abb. 7. Die detaillierten Extraktionsschritte werden

im Anhang B.1 beschrieben.


15

Abb. 7 Übersicht über die Extraktionsschritte für die kombinierte Carotinoid- und Vitamin-E-

Bestimmung

Alle Arbeitsschritte wurden im Labor unter gedämpftem Licht durchgeführt, da die Carotinoide licht-

empfindlich sind und so Abbau- und E/Z-Isomerisierungsreaktionen vermieden werden können [85].

Die Tocochromanole sind ebenso leicht oxidierbar und alle Bedingungen, die eine Oxidation während

der Probenaufarbeitung und -lagerung hätten verursachen können, wie z. B. Hitze oder Licht, wurden

weitgehend ausgeschlossen.

3.4.1 HPLC-Analytik

Die erhaltenen Extrakte wurden in zwei verschiedenen HPLC-Apparaturen analysiert. Die flüssig-

chromatografische Auftrennung der Carotinoide wurde mithilfe einer Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC,

engl. reversed phase) erreicht, während bei der Vitamin-E-Bestimmung eine Normalphasen-HPLC

(NP-HPLC, engl. normal phase) zum Einsatz kam.

3.4.1.1 HPLC-Analytik Carotinoide Die flüssigchromatographische Analyse der Carotinoide erfolgte nach einer modifizierten Methode in

Anlehnung an MÜLLER et al. (2011) mit einer RP-C30-Säule [86]. Die Trennung von Carotinoiden erfolgt

meist an RP-Materialien [87]. Außerdem wurden die meisten Trennungen von Lutein und Zeaxanthin,

die nach RYMAL & NAKAYAMA (1974) die bedeutendsten Verbindungen in Tomatensamen sind, an RP-

Systemen durchgeführt [46,88]. Zur Optimierung der Trennung wurde eine binäre Gradienten-

methode mit Methyl-tert-Butylether (MtBE) und Methanol verwendet. Die HPLC-Bedingungen

befinden sich im Anhang A.1.

3.4.1.2 HPLC-Analytik Vitamin E Die Analyse der Tocochromanole erfolgte mittels NP-HPLC nach der modifizierten Methode von

FRANKE et al. (2010)[84]. Bei der Auftrennung des Vitamin-E-Extraktes wird eine NP-HPLC bevorzugt,

da diese alle acht Tocochromanole auftrennen kann [89]. Außerdem erlaubt diese Methode das

Arbeiten mit unpolaren Lösungsmitteln, in denen sich die einzelnen Vitamin-E-Verbindungen besser

lösen. Die HPLC-Bedingungen werden im Anhang A.1 erläutert.

Quellung mit HPLC-Wasser

Extraktion 3 x 5 min am Ultra-Turrax

Filtration der Extrakte über Büchner-Trichter

Zugabe von MgCO3 (basisch), Na2SO4, internen Standards und Lösungsmittel

Eindampfen der vereinigten Extrakte

Vitamin-E-HPLC Carotinoid-HPLC

Tomatensamen


16

Die einzelnen Carotinoid- und Vitamin-E-Verbindungen wurden über den Vergleich der Retentions-

zeiten mit denen der Standardsubstanzen identifiziert. Zur Quantifizierung wurden die Peakflächen

mit denen der Standards definierter Konzentrationen verglichen. Die Stammlösungen von

(all-E)-Lutein und (all-E)-Zeaxanthin wurden dafür im Verhältnis 1:100, 1:200, 1:500 und 1:1 000 mit

Ethanol verdünnt. Für die Standardkalibrierung der Tocopherole wurden aus den Stammlösungen

von α- und γ-Tocopherol folgende Verdünnungen hergestellt: 1:100, 1:200, 1:500, 1:1 000, 1:2 000,

1:5 000, 1:10 000. Bei den Konzentrationsberechnungen wurden die Wiederfindungsraten der inter-

nen Standards einbezogen. Anhand der molaren Massen der Einzelverbindungen wurden die

Gesamtcarotinoid-Gehalte und Gesamttocopherol-Gehalte ermittelt.

Die photometrische Konzentrationsbestimmung der Carotinoid- und Tocopherol-Stammlösungen

wurde regelmäßig durchgeführt. Die Extinktionsmessung erfolgte in Mikro-Quarzküvetten bei den

entsprechenden Absorptionsmaxima. Mit Hilfe der spezifischen Extinktionskoeffizienten (E1cm1% )

(Tab. C2, C5) wurden die Konzentrationen nach folgender Formel berechnet:

c [g/100 ml] = E

E1cm1% · VF (5)

VF: Verdünnungsfaktor

Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen der relevanten Carotinoide und Tocopherole wurden

anhand des Basislinienrauschens festgelegt. Die Nachweisgrenze entspricht etwa dem dreifachen

und die Bestimmungsgrenze etwa dem zehnfachen Basislinienrauschen [90] (Tab. C3,C6).

3.5 Bestimmung der antioxidativen Kapazität

3.5.1 Extraktionsmethoden zur Gewinnung von hydrophilen und lipophilen

Extrakten

Um die AOC der Tomatensamen bestimmen zu können, war eine vorangehende Aufarbeitung und

Extraktion notwendig (Abb. 8). Durch die unterschiedlichen Extraktionen und eine Hydrolyse konnte

die AOC von freien und gebundenen wasserlöslichen sowie von lipidlöslichen Substanzen analysiert

werden. Zu Beginn wurde eine Extraktion mit 70 %igem Ethanol durchgeführt, wodurch ein hydro-

philer Extrakt entstand, der als Überstand jeweils abgenommen wurde. Dieser wurde mit drei ver-

schiedenen antioxidativen Tests analysiert. Der Rückstand wurde anschließend durch Inkubation mit

Salzsäure- und Natriumhydroxid-Lösung hydrolysiert und wiederum mit 70 %igem Ethanol extrahiert.

Die drei antioxidativen Testmethoden wurden auch mit diesem hydrophilen Extrakt durchgeführt.

Letztlich wurde der verbliebene Rückstand vollständig getrocknet und mit n-Hexan extrahiert, wobei

der abgenommene Überstand diesmal ein lipophiler Extrakt war. Dieser wurde dem entsprechenden

lipophilen αTEAC-Test unterzogen. Die ausführlichen Arbeitsschritte sind im Anhang B.2 zu finden.

Um Messwerte innerhalb der jeweiligen Kalibrierung zu erhalten, wurden für die einzelnen Tests aus

den Extrakten stets noch zwei Verdünnungen hergestellt. Letztendlich wurden die unverdünnte

Probe, eine 1:2-Verdünnung und eine 1:5-Verdünnung gemessen.


17

Abb. 8 Übersicht über die Aufarbeitung der Samen und die Extraktionsschritte für die unterschied-lichen Extrakte, die im Anschluss auf deren AOC getestet wurden

3.5.2 Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu

Die Vorgehensweise bei der Bestimmung des Gesamtphenolgehaltes erfolgte nach MÜLLER et al.

(2010), die einige Modifikationen an der Originalmethode von SINGLETON & ROSSI (1965) vornahmen

[91,92]. Der Test beruht auf einer Redoxreaktion der Phenole in alkalischem Milieu mit Phospho-

molybdat und Phosphowolframat zu einem blauen Farbkomplex, dessen Extinktion bei 750 nm

gemessen wird.

Na2WO4/Na2MoO4 → (Phenol-MoW11O40)–4 (6)

Mo(VI) (gelb) + e– → Mo(V) (blau) (7)

Die Durchführung des Tests erfolgte in Makroküvetten. Die Bestimmung der Gesamtphenolgehalte in

den Proben erfolgte mittels einer Gallussäure-Kalibriergeraden [91] und die Ergebnisse wurden als

Gallussäure-Äquivalente (GAE) in mg/100 g Probe angegeben. Alle Arbeitsschritte werden im

Anhang B.2 beschrieben.

3.5.3 H-TEAC-III-Test

Die Durchführung des H-TEAC-III-Tests erfolgte in Anlehnung an die Originalmethode von RE et al.

(1999), die durch MÜLLER et al. (2010) modifiziert und angepasst wurde [69,91]. Die Erzeugung des

stabilen blau-grün gefärbten ABTS-Radikals erfolgte mit einer Kaliumperoxodisulfat-Lösung. Die ent-

haltenen hydrophilen Antioxidantien reduzieren das Radikal und bewirken eine Entfärbung der Reak-

tionslösung (Gl. 9). Der Test wurde in Halbmikroküvetten durchgeführt. Die Abnahme der Absorption

in Gegenwart der Probe bzw. Trolox-Standardlösungen wurde nach 2 min spektralphotometrisch bei

734 nm gemessen und zur Berechnung der AOC genutzt [63]. Die Angabe der TEAC-Werte der Proben

erfolgt als Trolox-Äquivalente (TE) in µmol/100 g Probe. Die Details zur Methode befinden sich im

Anhang B.2. Ab sofort wird der Test vereinfacht H-TEAC-Test genannt.

Tomatensamen

Extraktion mit 70 %igem Ethanol

Rückstand

Hydrolyse

Extraktion mit 70 %igem Ethanol

trockener Rückstand

Extraktion mit n-Hexan

Überstand = hydrophiler Extrakt

Überstand = hydrophiler Extrakt

Überstand = lipophiler Extrakt

H-TEAC

H-ORACFl

Gesamtphenoltest nach FC

H-TEAC

H-ORACFl

Gesamtphenoltest nach FC

αTEAC

vor

der

Hyd

roly

se

=

frei

e Su

bst

anze

n

nac

h d

er H

ydro

lyse

=

geb

un

den

e Su

bst

anze

n


18

(8)

3.5.4 H-ORACFl-Test

Dem angewendeten H-ORACFl-Test liegt die Originalmethode von OU et al. (2001) zugrunde [75].

Auch hier wurden Anpassungen nach MÜLLER et al. (2010) vorgenommen [91]. Der Test wurde auf

einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt und basiert auf einer Fluoreszenzabnahme von Fluores-

zein durch eine Reaktion mit Peroxylradikalen. Diese wurden durch AAPH erzeugt.

(9)

Die Fluoreszenzintensität wurde jede Minute für 4 Stunden bei 37 °C gemessen (Anregung: 490 nm,

Emission: 520 nm). Die Ergebnisse wurden als Trolox-Äquivalente (TE) in mmol/100 g Probe angege-

ben. Die ausführlichen Details zur Methode sind im Anhang B.2 zu finden. Im Folgenden wird dieser

Test vereinfacht nur noch ORAC-Test genannt.

3.5.5 αTEAC-Test

Die Durchführung des lipophilen α-Tocopheroläquivalente-antioxidative Kapazitätstests wurde nach

MÜLLER et al. (2010) vorgenommen [93]. Die Erzeugung des ABTS-Radikals erfolgte entsprechend

MILLER et al. (1996) mittels Mangandioxid [72]. Der αTEAC-Test beruht auf der Reduktion des farbigen

ABTS-Radikal durch lipophile Antioxidantien. Als Kalibriersubstanz diente α-Tocopherol. Die Abnah-

me der Absorption in Gegenwart der Probe bzw. α-Tocopherol-Standardlösungen wurde nach 2 min

spektralphotometrisch bei 734 nm gemessen und zur Berechnung der AOC genutzt. Die Angabe der

TEAC-Werte der Proben erfolgte als µmol αTE/100 g Probe. Die Details zur Methode befinden sich im

Anhang B.2.

Der Versuch wurde aufgrund nicht zufriedenstellender Ergebnisse zweimal durchgeführt. Die Mess-

reihenfolge von Proben, Blindwert und Standards war wie folgt:

1. Durchgang: Proben → Blindwert + Standards → Proben

2. Durchgang: Blindwert + Standards → Proben → Blindwert + Standard

•+

ABTS (farblos) ABTS•+

(blaugrün)

+ O2 - N2

T > 30 °C

Antioxidantien

Fluoreszenz-

verlust

AAPH

Fluoreszein

Antioxidantien

R1 = COOH, R2 = OCOOH


19

Gaschromatographie

3.6 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung

Die Ermittlung des Fettsäuremusters eines Fettes wird heute routinemäßig durch Gaschromato-

graphie der Fettsäuremethylester (FAME) realisiert. Insgesamt waren für diese Analyse drei Arbeits-

schritte notwendig (Abb. 9), die im Folgenden näher erläutert werden.

Abb. 9 Übersicht über die Aufarbeitungsschritte für die Analyse der Fettsäurezusammensetzung

3.6.1 Fettextraktion nach Folch

Zunächst mussten die Lipide aus dem Probenmaterial, den Tomatensamen, isoliert werden. Eine

Fettextraktion aus biologischen Proben sowie Pflanzenmaterialien kann durch unterschiedliche Me-

thoden und unter Verwendung verschiedener lipophiler Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische

erfolgen. Ein klassisches und verlässliches Verfahren ist die Methode nach FOLCH et al. (1957), bei der

Chloroform und Methanol im Verhältnis 2:1 (v/v) als Extraktionsmittel dienen [94,95]. Aufgrund der

geringen Probenmenge von nur 300 mg wurde die Methode in einem kleinen Maßstab durchgeführt

und daher als „Mini-Folch-Methode“ bezeichnet. In der Originalmethode wurde ein Teil Probe zu 20

Teilen Extraktionsmittelgemisch verwendet [94]. Wird entsprechend mit 300 mg Probenmaterial

gearbeitet, wird das 20fache Volumen (6 ml) an Extraktionsmittel benötigt. Bei der vorliegenden

Analyse wurden allerdings 9 ml Chloroform/Methanol-Gemisch eingesetzt und es wurde jeweils eine

Dreifachbestimmung für die zwei Samensorten durchgeführt. Die ausführliche Beschreibung der

Vorgehensweise befindet sich im Anhang B.3.

3.6.2 Methylierung

Die erhaltenen Fettextrakte wurden im Anschluss einer Spaltung und Derivatisierung zu den korres-

pondierenden FAME unterzogen. Diese Methylierung ist ein notwendiger Arbeitsschritt, um die Fett-

säuren gaschromatographisch trennen zu können. Die Lipidkomplexe weisen aufgrund ihres hohen

Molekulargewichtes eine geringe Flüchtigkeit auf [96] und können die GC-Säule nicht passieren. Die

daraus gebildeten FAME besitzen einen niedrigeren Siedepunkt, sind weniger polar und ermöglichen

die GC-Analyse [97]. Da sich herausstellte, dass es sich bei den Lipiden in den beiden Samensorten

ausschließlich um Triacylglyceride handelte (siehe 3.5.3), wurde die Natriummethylat-Methode ange-

wendet. Diese gehört zu den basenkatalysierten Methylierungverfahren, die sich für Triglyceride,

aber nicht für freie Fettsäuren eignen [98]. Die FAME wurden letztlich in zwei verschiedenen Gas-

chromatographen analysiert (siehe 3.6.4). Die Vorgehensweise bei der Methylierung ist im An-

hang B.3 beschrieben.

Fettextraktion nach Folch

Methylierung/Umesterung mit Natriummethylat

Dünnschichtchromatographie



20

3.6.3 Dünnschichtchromatographie

Um festzustellen, (1) welche Lipidklassen in den aus den Samen gewonnen Ölen enthalten sind und

(2) ob die anschließende Methylierung erfolgreich war, wurden die entsprechenden Lösungen der

zwei Samensorten zusätzlich dünnschichtchromatographisch getrennt. (1) Zur Ermittlung der in den

Ölen enthaltenen Lipidklassen wurden die aus den Ölextrakten für die Methylierung hergestellten

2 %igen Lösungen mit n-Hexan verwendet. Von diesen Lösungen wurden 15 µl punktuell auf die

Kieselgelplatte aufgetragen. (2) Zur Kontrolle der Methylierung wurden 15 µl der 2 %igen methylier-

ten Lösungen punktuell aufgetragen. Parallel dazu wurden 5 µl eines Mischstandards ebenfalls als

Punkt auf die Platte gebracht. Die Trennung erfolgte innerhalb von 30 min mit einem Laufmittel-

gemisch aus n-Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v). Die Entwicklung der Banden wurde

durch das Besprühen der Platte mit 2‘,7‘-Dichlorfluoreszein (in Ethanol) visualisiert. Die Auswertung

erfolgte unter UV-Licht durch Vergleich der Banden der Proben mit denen des Mischstandards.

3.6.4 GC-Analytik

Die Analyse der FAME wurde mit zwei verschiedenen Shimadzu-Gaschromatographen (GC3 und

GC4), die mit je einem Flammenionisationsdetektor gekoppelt waren, durchgeführt. Auf der kürzeren

Säule (60 m) mittlerer Polarität (DB 225MS) des GC3 konnten die FAME in etwa 70 Fettsäuren aufge-

trennt werden. An dem GC4 mit einer 200 m langen hochpolaren (CP-select for FAME) Säule konnte

hingegen die Trennung der trans-Isomere realisiert werden. Wichtige Chromatographieparameter

sowie Einstellungen der Messprogramme können dem Anhang A.1 entnommen werden.

Die Chromatogramme wurden mit Hilfe der Software GC Lab Solutions ausgewertet. In Abhängigkeit

von den Wechselwirkungen mit der stationären Phase der Säule und der Siedetemperatur wiesen die

einzelnen FAME unterschiedliche Retentionszeiten auf. Anhand dieser und durch den Vergleich mit

verschiedenen FAME-Referenzstandards konnten die entsprechenden Fettsäuren identifiziert wer-

den. Die Summe der Peakflächen aller vorhandenen Fettsäuren wurde gleich 100 % gesetzt und der

Anteil jeder einzelnen Fettsäure durch Bezug der Einzelpeakflächen zur Gesamtpeakfläche errech-

net. Die als Reste angegebenen Integrale, die nicht als Fettsäuren identifiziert wurden, wurden von

dem Software-Programm herausgerechnet. Die Ergebnisse werden in Prozent der Gesamtfettsäuren

angegeben.

3.7 Statistische Datenauswertung

Alle Analysen wurden als Dreifachbestimmung durchgeführt. Die Berechnung der Mittelwerte (Mw),

Standardabweichungen (Stabw) und Variationskoeffizienten (VK) erfolgte mit Hilfe des Tabellen-

kalkulationsprogramms Excel (Microsoft Office 2007). Der Variationskoeffizient diente zur Beurtei-

lung der Streuung innerhalb einer Dreifachbestimmung. Idealerweise sollte dieser 10 % nicht über-

schreiten. In einigen Fällen, besonders bei sehr kleinen Verdünnungen bei den antioxidativen Tests,

war es trotz Wiederholung der Analyse nicht möglich, unter diese 10 % zu gelangen (siehe

Diskussion). Die Ergebnisse in allen Tabellen sind als Mw ± Stabw angegeben. In den Diagrammen

sind die Mittelwerte mit den entsprechenden Standardabweichungen als Fehlerbalken dargestellt.

Die statistische Datenauswertung wurde mit Hilfe des Programms IBM SPSS Statistics 21 für Windows

(SPSS Inc., Chicago, IL) durchgeführt. Für die Korrelationsrechnung nach PEARSON wurde das Signifi-

kanzniveau (p) mit 0,05 festgelegt. Der paarweise Vergleich von Mittelwerten erfolgte mit dem

verbundenen und unverbundenen t-Test. Hierfür lag das Signifikanzniveau bei 0,05.

ERGEBNISSE

21

4 ERGEBNISSE

Die ausführlichen Analysendaten befinden sich im Anhang C.

4.1 Bestimmung der Trockenmasse

Die Bestimmung des Wassergehaltes der beiden Samensorten Waltinger und Red Currant mittels

Karl-Fischer-Titration ergab Werte zwischen 7 und 8 % (Tab. 3). Damit betrug die Trockenmasse

92-93 %.

Tab. 3 Wassergehalte der zwei Samensorten (in %)

Wassergehalt

Waltinger 7,91 ± 0,33A

Red Currant 7,01 ± 0,44B

Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (p < 0,05, t-Test)

4.2 Quantifizierung der Carotinoide

In beiden Samensorten wurden die Xantophylle (all-E)-Lutein und (all-E)-Zeaxanthin gefunden. Die

Gehalte beider Verbindungen lagen allerdings nur im µg-Bereich pro 100 g Samen (Tab. 4).

(all-E)-Zeaxanthin bildete jeweils den größeren Anteil. (all-E)-Lutein konnte in beiden Samensorten

nachgewiesen, in den Red-Currant-Samen aber nicht quantifiziert werden, da die Werte unterhalb

der Bestimmungsgrenze lagen. Die Waltinger-Samen wiesen gegenüber den Red-Currant-Samen

einen etwa viermal höheren Gesamtcarotinoid-Gehalt auf.

Tab. 4 Carotinoidgehalte der zwei Samensorten

Carotinoide (µg/100 g) Gesamtcarotinoide

(all-E)-Lutein (all-E)-Zeaxanthin (µg/100 g) (µmol/100 g)

Waltinger 58,8 ± 3,4 100,1 ± 7,7A 158,9 ± 10,8A 0,28 ± 0,02A

Red Currant n.q. 38,0 ± 4,8B 38,0 ± 4,8B 0,07 ± 0,01B

n.q. nicht quantifizierbar (unterhalb LOQ, siehe Tab. A3) Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb einer Spalte unterscheiden sich signifikant (p < 0,05, t-Test)

4.3 Quantifizierung der Vitamin-E-Verbindungen

Durch den Vergleich der HPLC-Chromatogramme mit denen der Standardsubstanzen wurde deutlich,

dass beide Samensorten α- und γ-Tocopherol enthielten. Es konnten keine Tocotrienole nachgewie-

sen werden. Die Quantifizierung der jeweiligen Tocopherole lässt erkennen, dass γ-Tocopherol bei

beiden Samensorten zu 97-98 % des Gesamttocopherol-Gehaltes beitrug (Abb. 10), sodass α-Toco-

pherol nur eine untergeordnete Rolle spielte. Dabei wiesen die Samen der Tomatensorte Waltinger

sowohl höhere α-Tocopherol- als auch γ-Tocopherol-Gehalte im Gegensatz zu den Red-Currant-

Samen auf. Die γ-Tocopherol-Gehalte der Waltinger-Samen waren mit 32,7 mg/100 g etwa doppelt

so hoch wie die der Red-Currant-Samen mit 17,5 mg/100 g.

ERGEBNISSE

22

Tab. 5 Gehalte an Vitamin-E-Verbindungen in den zwei Samensorten

α-Tocopherol

(mg/100 g) γ-Tocopherol (mg/100 g)

∑ Tocopherole (µmol/100 g)

Waltinger 0,68 ± 0,01A 32,7 ± 1,7A 78,5 ± 4,0A

Red Currant 0,56 ± 0,05B 17,5 ± 0,6B 42,5 ± 1,3B

Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb einer Spalte unterscheiden sich signifikant (p < 0,05, t-Test)

Abb. 10 Gehalte an α- und γ-Tocopherol in den zwei Samensorten

* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten für beide Tocopherole (p < 0,05, t-Test)

4.4 Ermittlung der antioxidativen Kapazität

4.4.1 Gesamtphenolgehalt und hydrophile antioxidative Kapazität

Der Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu (FC), der H-TEAC-Test sowie der ORAC-Test wurden für

die Samen der zwei Tomatensorten jeweils zweimal angewendet: Zunächst wurden die hydrophilen

Ethanol-Extrakte ohne vorherige Hydrolyse mit den drei Tests auf deren AOC untersucht. Im An-

schluss wurde der entstandene Rückstand hydrolysiert, ebenfalls mit 70 %igem Ethanol extrahiert

und nochmals mit den drei Testmethoden analysiert (siehe Abb. 8). Bei der Anwendung der Tests vor

der Hydrolyse wurden die frei in der Lösung vorliegenden antioxidativen Substanzen erfasst. Die

Hydrolyse führte anschließend zur Freisetzung der glykosidisch gebundenen Verbindungen, sodass

auch diese analysiert werden konnten.

Wie im Abschnitt 3.5.1 beschrieben, wurden stets der unverdünnte Extrakt (VF 1) sowie eine

1:2-Verdünnung (VF 2) und eine 1:5-Verdünnung (VF 5) analysiert. Im Folgenden wird von drei

Verdünnungsstufen gesprochen, auch wenn die Verdünnungsstufe 1 dem unverdünnten Extrakt

entspricht. Aus Tab. 6, die eine Übersicht über die mit den verschiedenen hydrophilen Testmethoden

bestimmten AOC gibt, ist zu entnehmen, dass die Ergebnisse in unterschiedlicher Art und Weise

angegeben wurden. Bei dem Gesamtphenoltest nach FC wurde im Gegensatz zum H-TEAC-Test und

ORAC-Test kein eindeutiger Effekt der Probenkonzentration auf die AOC festgestellt, sodass ein

Mittelwert aus allen drei Verdünnungsstufen gebildet wurde. Bei den anderen beiden Tests zeigte

sich bei allen gemessenen Proben die Tendenz, dass mit sinkender Probenkonzentration (steigender

Verdünnungsstufe) höhere AOC auftraten. Dementsprechend wurden aus den Dreifachbestimmun-

gen jeder Verdünnungsstufe die Mittelwerte gebildet.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Waltinger Red Currant

c [m

g/1

00

g]

γ-Tocopherol

α-Tocopherol

*

ERGEBNISSE

23

0

100

200

300

400

500

600


Ges

amtp

hen

ole

[m

g G

AE/

10

0g]

nach Hydrolyse

vor Hydrolyse

Tab. 6 Hydrophile AOC der zwei Samensorten, gemessen mit unterschiedlichen Testmethoden

Gesamtphenole nach FC

(mg GAE/100 g) VF

H-TEAC (mmol TE/100 g)

ORAC

(mmol TE/100 g) W

alti

nge

r

vor Hydrolyse 167,6 ± 1,7 *˚

1 1,17 ± 0,03 *˚ 7,1 ± 0,8

2 1,28 ± 0,05 * 8,7 ± 0,5 *

5 1,43 ± 0,01 * 13,4 ± 0,8 *

nach Hydrolyse

203,2 ± 3,4 *˚

1 1,01 ± 0,00 *˚ -

2 1,25 ± 0,03 * 10,3 ± 0,9 *

5 1,45 ± 0,04 * 13,5 ± 0,7 *

Red

Cu

rran

t

vor Hydrolyse

204,8 ± 4,7 *˚

1 1,50 ± 0,01 *˚ 11,8 ± 2,9

2 1,81 ± 0,02 *˚ 12,6 ± 0,2 *

5 2,04 ± 0,02 *˚ 18,8 ± 0,8 *

nach Hydrolyse

309,4 ± 9,9 *˚

1 1,44 ± 0,01 *˚ -

2 1,84 ± 0,02 *˚ 16,2 ± 1,5 *

5 2,26 ± 0,02 *˚ 18,9 ± 1,0 *

VF: Verdünnungsfaktor * Werte desselben VF unterscheiden sich signifikant innerhalb einer Spalte zwischen den zwei Samensorten (p < 0,05,

t-Test) ˚ Werte desselben VF unterscheiden sich signifikant innerhalb einer Spalte vor und nach der Hydrolyse innerhalb einer

Samensorte (p < 0,05, t-Test)

Die Samen der Sorte Red Currant wiesen in allen drei Testvarianten sowohl vor als auch nach der Hy-

drolyse stets höhere AOC auf als die Waltinger-Samen. Die AOC der Waltinger-Samen betrug im Mit-

tel nur 66-76 % der AOC der Red-Currant-Samen. Die Diagramme, die beide Samensorten gegen-

überstellen, verdeutlichen diese Tatsache (Abb. 11-13). Bei dem ORAC-Test fehlen die Werte beider

Samensorten für den VF 1 nach der Hydrolyse, da diese außerhalb der Kalibrierung lagen und nicht

errechnet werden konnten. Bei den Waltinger-Samen lag der Gesamtphenolgehalt vor der Hydrolyse

bei 167,6 mg GAE/100 g und nach der Hydrolyse bei 203,2 mg GAE/100 g. Für die Red-Currant-Samen

betrugen die Werte 204,8 und 309,4 mg GAE/100 g. Bei den anderen beiden Testverfahren war die

Auswertung durch die Einbeziehung der Verdünnungsstufen komplexer. Zur Vereinfachung dienen

die Diagramme.

*

Abb. 11 Gesamtphenolgehalte der zwei Samensorten vor und nach der Hydrolyse

* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten vor und nach der Hydrolyse (p < 0,05, t-Test)

ERGEBNISSE

24

Abb. 12 Hydrophile AOC bestimmt mit dem H-TEAC-Test, Gegenüberstellung der beiden Samensor-ten vor und nach der Hydrolyse in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen (Darstellung verdeutlicht den Verdünnungseffekt: mit steigender Verdünnungsstufe (VF) stieg die AOC, gilt entsprechend auch für Abb. 13, 14 und 21)

* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten für alle VF (p < 0,05, t-Test)

Abb. 13 Hydrophile AOC bestimmt mit dem ORAC-Test, Gegenüberstellung der beiden Samensorten vor und nach der Hydrolyse in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen

* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten für VF 2 und VF 5 (p < 0,05, t-Test)

Bei einem Vergleich der Werte vor und nach der Hydrolyse fällt bei dem Gesamtphenoltest und dem

ORAC-Test auf, dass die AOC nach der Hydrolyse stets höher war, auch wenn die Unterschiede

teilweise nur geringfügig waren. Bei dem H-TEAC-Test zeigten sich bei diesem Vergleich in Abhängig-

keit von den Verdünnungsstufen allerdings unterschiedliche Ergebnisse, was in Abb. 12 deutlich wird.

Bei den unverdünnten Lösungen (VF 1) beider Samensorten waren die Werte vor der Hydrolyse

höher, bei Verdünnungsfaktor 5 lagen die Werte für die Red-Currant-Samen nach der Hydrolyse wie-

derum höher. Bei den Waltinger-Samen waren die Gehalte an freien und gebundenen antioxidativ

wirkenden Substanzen bei den Verdünnungsstufen 2 und 5 nahezu identisch. Keine Unterschiede

fanden sich auch bei VF 2 der Red-Currant-Samen.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

vor Hydrolyse nach Hydrolyse vor Hydrolyse nach Hydrolyse


hyd

rop

hile

AO

C

[mm

ol T

E/1

00

g]

VF 5VF 2VF 1

0

5

10

15

20

25

vor Hydrolyse nach Hydrolyse vor Hydrolyse nach Hydrolyse


hyd

rop

hile

AO

C

[mm

ol T

E/1

00

g]

VF 5

VF 2

VF 1

*

* *

*

ERGEBNISSE

25

4.4.2 Lipophile antioxidative Kapazität

Zu Beginn fällt auf, dass wieder eine Abhängigkeit der AOC von der Probenkonzentration vorlag und

aus diesem Grund die Mittelwerte für jede Verdünnungsstufe angegeben wurden (Tab. 7). Dabei war

die gleiche Tendenz wie bei den hydrophilen Tests zu beobachten: mit zunehmender Verdünnung

stieg die AOC. Bei allen Ergebnissen ließ sich jeweils eine große Streuung um den Mittelwert fest-

stellen (Abb. 14), woraus Variationskoeffizienten deutlich über 10 % resultierten. Trotz einer Wieder-

holung des Tests konnte keine Verbesserung dieser Streuungsparameter erreicht werden. Durch die

hohen Standardabweichungen unterschieden sich die bestimmten AOC nicht zwischen den zwei

Samensorten. Bei der Durchführung wurden einige Schwierigkeiten festgestellt, die auch bei der

Wiederholung nicht behoben werden konnten (siehe 5.3.2).

Tab. 7 Lipophile AOC der zwei Samensorten, gemessen mit dem αTEAC-Test

VF antioxidative Kapazität (µmol αTE/100 g)


1 41,3 ± 7,0 * 56,5 ± 7,6

2 64,8 ± 22,2 * 110,0 ± 17,4

5 133,0 ± 60,7 * 256,1 ± 72,0

* Werte unterscheiden sich nicht signifikant (p > 0,05, t-Test)

Abb. 14 Lipophile AOC der beiden Samensorten in Abhängigkeit der Verdünnungsstufen

n. s. = kein signifikanter Unterschied zwischen den zwei Samensorten für alle VF (p > 0,05, t-Test)

4.5 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung

4.5.1 Fettextraktion und Dünnschichtchromatographie

Um die Fettsäurezusammensetzung der zwei Samensorten zu analysieren, wurden zunächst die

Lipide aus den Samen mittels einer Mini-Folch-Methode extrahiert. Die in Tab. 8 aufgeführten Roh-

fettanteile der Samen verdeutlichen, dass die Samen der Sorte Waltinger einen etwas höheren

Fettanteil aufwiesen (25,8 % gegenüber 20,2 %). Allerdings können diese Ergebnisse nur als Nähe-

rungswerte angesehen werden, da keine absolut quantitative Fettgehaltsbestimmung vorgenommen

wurde.

0

50

100

150

200

250

300

350


lipo

ph

ile A

OC

[µ

mo

l αTE

/10

0 g

]

VF 5

VF 2

VF 1

n.s.

ERGEBNISSE

Tab. 8 Rohfettanteile der zwei Samensorten

Werte mit verschiedenen Buchstaben

Die dünnschichtchromatographische Auftrennung liefert

Vorgehensweise: Zum einen

beider Samensorten aufgetragen

glichen. Wie erwartet, waren nur flu

Somit bestanden die aus den Samen extrahierten Öle

dieser Erkenntnis konnte die anschließende Methylierungsmethode ausgewählt werden, da sich

nicht jede Methode für jede Fettfraktion eignet.

zur Umwandlung der veresterten Fettsäuren

tographie machte zum anderen

erfolgreich verlief (Abb. 15, rechts).

ständig verschwunden und es erschienen zwei

Abb. 15 DC-Trennung des extrahierten Fettes beider Samensorten vor (links) und nach (rechts) der Methylierung mittels einem Standardgemisch (1 = Phospolipide, 2 = Cholesterin, 3 = freie FS, 4 = Tria5 = FAME, 6 = Cholesterinester)

4.5.2 Fettsäurezusammensetzung

Die Fettsäuren wurden, ausgedrückt als Methylester

samt konnten 29 verschiedene Fettsäuren bestimmt werden.

Anteile aller Fettsäuren, sowie eine Erläuterung der Abkü

C13, C14).


Waltinger

5

4

3

2

1

der zwei Samensorten

Werte mit verschiedenen Buchstaben innerhalb einer Spalte unterscheiden sich signifikant (p < 0,05, t

Die dünnschichtchromatographische Auftrennung lieferte zwei wichtige Ergebnisse

Zum einen wurden die nach der Mini-Folch-Methode erhaltenen Fett

aufgetragen (Abb. 15, links), aufgetrennt und mit einem Standardgemisch ver

waren nur fluoreszierende Banden auf Höhe der Triacyglyceride sichtbar.

Somit bestanden die aus den Samen extrahierten Öle ausschließlich aus Triacylglyceriden


ede Methode für jede Fettfraktion eignet. Die angewendete Natriummethylat

veresterten Fettsäuren in die entsprechenden FAME. D

zum anderen deutlich, dass die Umwandlung der Triacylglyceride in die FAME

, rechts). Die Banden auf Höhe der Triacylglyceride waren nahezu voll

ständig verschwunden und es erschienen zwei fluoreszierende Banden bei den F

Trennung des extrahierten Fettes beider Samensorten vor (links) und nach (rechts) der Methylierung mittels n-Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v) im Vergleich zu einem Standardgemisch (1 = Phospolipide, 2 = Cholesterin, 3 = freie FS, 4 = Tria5 = FAME, 6 = Cholesterinester)

Fettsäurezusammensetzung

ausgedrückt als Methylester, mittels Gaschromatographie analysiert. Insge

samt konnten 29 verschiedene Fettsäuren bestimmt werden. Eine Übersicht über die prozent

Anteile aller Fettsäuren, sowie eine Erläuterung der Abkürzungen befindet sich im Anhang

Fettanteil

25,8 ± 1,9Red Currant 20,2 ± 0,6



Stan-dard

vor der Methylierung

nach der Methylierung

2

3

6

5

4

1

26

< 0,05, t-Test)

wichtige Ergebnisse für die weitere

erhaltenen Fettextrakte

, aufgetrennt und mit einem Standardgemisch ver-

oreszierende Banden auf Höhe der Triacyglyceride sichtbar.

aus Triacylglyceriden. Mit Hilfe


Natriummethylat-Methode diente

Die Dünnschichtchroma-

Triacylglyceride in die FAME

auf Höhe der Triacylglyceride waren nahezu voll-

bei den FAME.

Trennung des extrahierten Fettes beider Samensorten vor (links) und nach (rechts) der Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v) im Vergleich zu

einem Standardgemisch (1 = Phospolipide, 2 = Cholesterin, 3 = freie FS, 4 = Triacylglyceride,

, mittels Gaschromatographie analysiert. Insge-

Eine Übersicht über die prozentualen

rzungen befindet sich im Anhang C (Tab.

Fettanteil (%)

25,8 ± 1,9A

20,2 ± 0,6B

ERGEBNISSE

27

57%20%

13%

5%2%

3%

Red Currant

Größtenteils waren signifikante Unterschiede zwischen beiden Samensorten vorhanden. Die er-

mittelten Werte besaßen nur geringe Standardabweichungen, d. h. die Messungen waren gut repro-

duzierbar. Aufgrund dessen ergaben sich bereits bei nur sehr geringen Abweichungen signifikante

Unterschiede. So waren beide Samensorten trotzdem vergleichbar. Die dominierende Fettsäure in

beiden Samensorten war die Linolsäure mit Anteilen von 57 % bzw. 59 %. Anteilsmäßig folgten für

beide Samensorten Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure und α-Linolensäure (Abb. 16). Die mehrfach

ungesättigten Fettsäuren nahmen etwa 60 % der Gesamtfettsäuren ein. Der Gehalt an einfach

ungesättigten und gesättigten Fettsäuren betrug jeweils rund 20 % (Abb. 17). Die dominierende

Fettsäure unter den gesättigten Fettsäuren war die Palmitinsäure, die in beiden Samensorten zu

etwa 13 % vorkam. Daraus resultierte ein P/S-Index von 3. Weiterhin waren sowohl ω6- als auch ω3-

Fettsäuren vorhanden. Zu den ω6-Fettsäuren trug die Linolsäure zum größten Teil bei, Delta-11-

cis,14-cis-Eicosadiensäure und Delta-13-cis,16-cis-Docosadiensäure bildeten den Rest. α-Linolensäure

war die einzige ω3-Fettsäure.

0

10

20

30

40

50

60

70

SFA MUFA PUFA ∑ ω-3 ∑ ω-6

An

teil

[%]

Waltinger

Red Currant

59%18%

13%

4% 3%3%

Waltinger

C18:2 c9,c12

C18:1 c9

C16:0

C18:0

C18:3 c9,c12,c15

andere FA

Abb. 16 Gegenüberstellung der dominierenden Fettsäuren der zwei Samensorten

Abb. 17 Gegenüberstellung einiger relevanter Parameter der Fettverteilung der zwei Samensorten

* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten (p < 0,05, t-Test)

* *

* *

*

DISKUSSION

28

5 DISKUSSION

5.1 Carotinoide in Tomatensamen

Während zahlreiche Untersuchungen zu der Carotinoidzusammensetzung ganzer Tomaten existieren,

ist der Kenntnisstand zu diesen Pigmenten in Tomatensamen vergleichsweise gering. Das Haupt-

augenmerk liegt bei Tomaten auf dem Lycopin, das besonders in verarbeiteten Tomatenprodukten

eine quantitativ bedeutende Rolle spielt. Als wichtiges Antioxidans werden ihm präventive Effekte

bei verschiedenen Erkrankungen zugesprochen. Interessant ist, dass die zwei Sorten von Tomaten,

aus denen die Samen stammten, im Jahr 2010 auf ihre Carotinoidgehalte untersucht wurden (Tab. 9).

Hierbei betrugen die Lycopinanteile 85-90 %. Außerdem wurden geringe Mengen an β-Carotin und

Lutein bestimmt.

Tab. 9 Carotinoidgehalt der Tomaten der Sorten Waltinger und Red Currant (in mg/100 g FM) (nicht veröffentlichte Ergebnisse der AG Bioaktive Pflanzenstoffe, 2010)

(all-E)- Lutein

(all-E)-Zeaxanthin

(all-E)- β-Carotin

(Z)-Lycopin

(all-E)-Lycopin

Gesamt-Lycopin

Gesamt-carotinoide

Waltinger 0,27 n.n. 1,59 0,69 10,12 10,82 12,67

Red Currant 0,20 n.n. 1,43 0,77 12,82 13,59 15,23

n.n. nicht nachweisbar

Nun stellte sich die Frage, ob einige dieser Carotinoide auch in den Samen dieser Tomatensorten vor-

kommen. Die Farbe der Samen ließ bereits vermuten, dass keine hohen Gehalte zu erwarten waren.

Trotz des hohen Lycopinanteils in den Tomaten wurde dieses Carotin in den Samen mittels HPLC

nicht nachgewiesen. So wurden lediglich sehr geringe Gehalte an (all-E)-Lutein und (all-E)-Zeaxanthin

detektiert. In der Literatur existieren nicht viele Daten über die Carotinoidzusammensetzung von

Tomatensamen. Drei Arbeiten stammen aus den 1970er und 1980er Jahren, eine ist aktueller aus

dem Jahr 2005. Ein Vergleich der eigenen Daten mit den publizierten Carotinoidgehalten, sowie ein

Vergleich der publizierten Werte untereinander zeigen fast keinerlei Übereinstimmungen (Tab. 10).

Tab. 10 Publizierte Carotinoidgehalte von Tomatensamen im Vergleich zu den eigenen Daten (in µg/100 g)

RYMAL & NAKAYAMA 1974

[46]A

RODRIGUEZ et al. 1975

[99]

AL-WANDAWI

et al. 1985 [100]

KNOBLICH et al. 2005

[101]

eigene Daten

W RC

Lutein 59,7-90,2 %

650 58,8 n.q.

Zeaxanthin

100 100,1 38,0

α-Carotin

60 40

β-Carotin 5,3-22,2 % 1 290 0 1 440

γ-Carotin

80

Lycopin 4,5-14,1 % 820 0 13 000

A Samen drei verschiedener Tomatensorten, Angabe als % der Gesamtcarotinoide

n.q. nicht quantifizierbar

RYMAL & NAKAYAMA (1974) untersuchten drei verschiedene Samensorten [46]. Sie beschrieben, dass

die Xantophylle bei allen Sorten gegenüber den Carotinen überwogen. Diese Tatsache stimmt mit

DISKUSSION

29

den eigenen Werten überein, allerdings dominierte in der Literatur Lutein, bei den eigenen Analysen

Zeaxanthin. Demgegenüber wurden von RODRIGUEZ et al. (1975) überhaupt keine Xantophylle nachge-

wiesen [99]. Hier zeigte β-Carotin die höchsten Gehalte, gefolgt von Lycopin. Qualitativ gesehen,

enthielten die Samen dieselben Carotinoide wie die Tomatenfrucht, allerdings in wesentlich geringe-

ren Konzentrationen. Dieser Aussage kann nicht zugestimmt werden. Unverhältnismäßig hohe

Lycopingehalte wurden von KNOBLICH et al. (2005) nachgewiesen [101]. Die aufgeführten 13 mg/100 g

entsprechen den Gehalten, die in ganzen Tomaten bestimmt wurden (Tab. 9). Auch wenn die Samen

Reststoffprodukte aus der Tomatenindustrie waren und dadurch noch Tomatenreste daran haften

konnten, muss hier dennoch ein Irrtum vorliegen. In einem Textabschnitt dieser Arbeit wurden

zudem 130 µg Lycopin/kg angegeben, was eher der Realität entspricht, sodass es sich um einen

Fehler bei den angegebenen Einheiten handeln könnte.

Generell ist über die Bedeutung der Carotinoide in Samen im Gegensatz zu anderen Pflanzen-

geweben nicht viel bekannt. Carotinoide in Samen sind u. a. für die Bildung von einem Phytohormon,

der Abscisinsäure, notwendig, die die Samenruhe reguliert. Außerdem tragen sie zu dem anti-

oxidativen System in den Samen bei, welches radikal-induzierten Membranschädigungen sowie der

Saatalterung entgegenwirkt [102].

Als Stoffgruppe sind Carotinoide sehr empfindlich gegenüber Licht, Wärme und Sauerstoff, was im

Hinblick auf die Ölgewinnung und Verarbeitung der Samen eine bedeutende Rolle spielt. In raffinier-

ten Ölen sind nahezu keine Carotinoide vorhanden, da sie durch die verschiedenen Aufarbeitungs-

schritte, wie Bleichen und Dämpfen, zerstört werden [103,104]. Dabei sind die Xanthophylle Lutein

und Zeaxanthin anfälliger als die unpolaren Carotine [84]. In Tomatensaatöl wurde Lycopin mit etwa

9,6 mg/100 g als Hauptcarotinoid beschrieben [6]. Damit trug es 82 % zu den Gesamtcarotinoiden

bei. Außerdem enthielt es beachtliche Mengen an β-Carotin und Lutein mit Anteilen von 14 % und

4 %. Damit muss es sich bei dem untersuchten Öl noch weitgehend um das Rohöl gehandelt haben.

Die hohen Carotinoid- und speziell Lycopinanteile des Öles weisen darauf hin, dass bei der Herstel-

lung möglicherweise auch die Schalen extrahiert wurden. In verschiedenen anderen kaltgepressten

Ölen, Saaten und Presskuchen wurden dagegen nur Lutein und Zeaxanthin nachgewiesen [84].

Die Aussagen zu den in Tomatensamen enthaltenen Carotinoiden unterscheiden sich teilweise er-

heblich, was eine abschließende Bewertung erschwert. Unumstritten ist allerdings, dass sie nur einen

geringen Teil zu den Carotinoiden in Tomaten beitragen. Im Hinblick auf die Reststoffverwertung

leisten sie einen Beitrag zu den Inhaltsstoffen in Tomatensaatöl, solange auch die Schalen verwendet

werden und das Öl in unraffinierter Form vorliegt. Letztlich nehmen die Tomatenschalen eine

wesentlich bedeutendere Rolle bei der Verwertung von Tomatentrester ein, da sie das wertvolle

Lycopin in großen Mengen enthalten. Dieses wird bspw. als Farbstoff für fettreiche Produkte

verwendet oder auch als Krebsmedikament eingesetzt [32].

5.2 Vitamin-E-Verbindungen in Tomatensamen

Das lipidlösliche Vitamin E kommt hauptsächlich in Pflanzensamen vor. Aus diesem Grund haben

Tomatensamen einen großen Anteil an dem Vitamin-E-Gehalt von Tomaten. Die ganzen Tomaten der

beiden Sorten Waltinger und Red Currant hatten einen Vitamin-E-Gehalt von ca. 3,5 mg/100 g. Den

dominierenden Anteil nahm α-Tocopherol ein (Abb. 18), was charakteristisch für Tomaten und

Tomatenprodukte ist [105]. Die Samen enthielten dagegen eine fünf- bis zehnfach höhere

Tocopherol-Konzentration und vorrangig γ-Tocopherol. Dabei war der γ-Tocopherol-Gehalt der

Waltinger-Samen fast doppelt so hoch wie der der Red-Currant-Samen und damit signifikant

DISKUSSION

30

verschieden. α-Tocopherol machte nur 2-3 % des gesamten Vitamin-E-Gehaltes der Samen aus.

SEYBOLD et al. (2004) beschrieben, dass der α-Tocopherol-Gehalt der Samen nur 2 % des gesamten

α-Tocopherol-Gehaltes der Tomaten ausmachte, da sich dieses hauptsächlich in den Randschichten

der Tomate befindet [105]. Die Samen trugen immerhin zu 65 % des γ-Tocopherol-Gehaltes bei.

Diese Verteilung der Tocopherole wurde auch bei Paprika festgestellt, die ebenfalls zur Familie der

Nachtschattengewächse gehört [106].

Abb. 18 Prozentuale Anteile der Vitamin-E-Verbindungen (bezogen auf Gesamt-Vitamin-E) in

Tomaten der Sorten Waltinger und Red Currant (nicht veröffentlichte Ergebnisse der AG Bioaktive Pflanzenstoffe, 2010)

Untersuchungen von Tomatensaatöl auf dessen Vitamin-E-Gehalte ergaben höhere Konzentrationen

als die, die bei den Samen ermittelt wurden. Während der Vitamin-E-Gehalt der Waltinger-Samen

334 mg/kg und der Red-Currant-Samen 180 mg/kg betrug, wurden für die Öle zwischen 1 261 und

1 452 mg/kg Öl angegeben [6,33]. In Abhängigkeit von der Extraktionsmethode bestimmten ELLER

et al. (2010) zwischen 940 mg/kg (beschleunigte Lösungsmittelextraktion mit Ethanol) und

1 110 mg/kg (Extraktion mit überkritischem CO2) [107]. Bei GOFFMANN & MÖLLERS (2000) war der

Gesamttocopherol-Gehalt von Rapssamen etwa 15 % niedriger als der von den daraus extrahierten

Ölen [108]. Dafür war die Tatsache verantwortlich, dass die für die Ölgewinnung angewandte

Soxhlet-Extraktion effizienter war, um die Tocopherole zu extrahieren, als die „Batch-Extraktions-

methode“, nach der die Samen behandelt wurden. Da die ermittelten Vitamin-E-Konzentrationen der

eigenen Samen aber sogar 72-85 % niedriger waren als die der oben genannten Tomatensaatöle,

könnte zusätzlich die zweijährige Lagerdauer einen Einfluss gehabt haben. GOFFMANN & MÖLLERS

(2000) stellten bei Rapssamen keine signifikanten Änderungen des Tocopherol-Gehaltes über 24 Wo-

chen bei Raumtemperatur fest [108]. GOPALAKRISHNAN et al. (1996) beschrieben dagegen eine 50 %ige

Reduzierung des Tocopherol-Gehaltes in Flax- und Rapssamen nach 30-tägiger Lagerung [109].

In der Literatur ergaben sich große Unterschiede bei den dominierenden Tocopherolen von Toma-

tensaatöl. LAZOS et al. (1998) bestimmten δ-Tocopherol als Hauptkomponente [33]. Bei MÜLLER et al.

(2013) und ELLER et al. (2010), die kein oder nur sehr wenig δ-Tocopherol nachwiesen, dominierte

γ-Tocopherol [6,107]. Die α-Tocopherol-Gehalte waren bis auf geringere Werte von ELLER et al. (2010)

(30-50 mg/kg) vergleichbar (202 bzw. 246 mg/kg) [107]. Aufgrund der Tatsache, dass in den

Tomatensamen hauptsächlich γ-Tocopherol vorkam und dass hohe γ-Tocopherol-Gehalte typisch für

Saatöle sind, erscheinen die Literaturdaten von MÜLLER et al. (2013) korrekter [6]. Im Vergleich mit

anderen kommerziellen Pflanzenölen ist der Vitamin-E-Gehalt des Tomatensaatöls fünfmal höher als

der Vitamin-E-Gehalt von Olivenöl (260 mg/kg) und doppelt so hoch wie der von kaltgepresstem

Sonnenblumenöl (639 mg/kg) [84,110]. Vergleichbare Konzentrationen wies bspw. Öl aus Hage-

buttensamen oder Apfelkernen auf [111].

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Waltinger

Red Currant

Anteil

α-Tocopherol

β-Tocopherol

γ-Tocopherol

β-Tocotrienol

DISKUSSION

31

FRANKE et al. (2010) analysierten außerdem die Tocopherol-Gehalte einzelner Saaten [84]. Demnach

wiesen Leinsamen ähnliche Tocopherol-Gehalte und Verteilungen auf wie die Red-Currant-Samen

(19,3 mg/100 g gegenüber 18,0 mg/100 g). Die Waltinger-Samen waren mit Rapssamen vergleichbar

(33,4 mg/100 g gegenüber 33,7 mg/100 g), allerdings wiesen letztere etwa gleich hohe Konzentra-

tionen an α- und γ-Tocopherol auf, während bei den Tomatensamen deutlich das γ-Tocopherol

dominierte.

Als wichtiges fettlösliches Vitamin beeinflusst Vitamin E maßgeblich die lipophile AOC von Pflanzen-

ölen [112]. Die verschiedenen Tocochromanole besitzen die Fähigkeit, Doppelbindungen ungesättig-

ter Fettsäuren in Ölen vor oxidativen Schäden zu schützen. Die untersuchten Tomatensamen

erwiesen sich als gute Quelle für Tocopherole und eignen sich besonders für die Herstellung von Öl.

Dabei unterschieden sich die Vitamin-E-Gehalte der Waltinger-Samen mit einer fast doppelt so

hohen Konzentration signifikant von den Red-Currant-Samen. Sowohl der Genotyp als auch klimati-

sche Bedingungen während des Wachstums und der Reifung, Lagerbedingungen und -dauer, die

Versorgung der Tomatenpflanzen mit Kalium oder der Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren

können einen Einfluss auf den Vitamin-E-Gehalt haben [84,113,114]. Verschiedene Raffinations-

schritte würden auch hier eine Reduktion der Tocopherole bewirken. Im Gegensatz zu den Caro-

tinoiden waren die Verluste allerdings nicht so erheblich [33], sodass das Tomatensaatöl dennoch als

ausgezeichnete Vitamin-E-Quelle gilt. Die Vitamin-E-Aktivität des von MÜLLER et al. (2013) unter-

suchten Tomatensaatöls entspricht etwa 37 mg αTE/100 g (Umrechnungstabelle siehe Anhang

Tab. A8) [6]. Nach den DACH-Referenzwerten sollte eine Erwachsener 12-14 mg αTE/100 g pro Tag zu

sich nehmen [53]. Mit 18 g Tomatensaatöl (etwa 4-5 Teelöffeln) kann bereits die Hälfte dieser Nähr-

wertempfehlung gedeckt werden.

5.3 Antioxidative Kapazität von Tomatensamen

Die positiven Effekte von vielen Nahrungsmitteln und Getränken für die menschliche Gesundheit

werden auf deren antioxidative Aktivität zurückgeführt [64]. Aufgrund dieser Tatsache wächst das

Interesse der Gesellschaft und Wissenschaft an der Bestimmung dieses Parameters. Trotz zahlreicher

Methoden, die zur Bestimmung der AOC entwickelt wurden, existiert bis heute kein universell an-

wendbares Verfahren [61,63]. Die Problematik besteht darin, dass die verschiedenen Testmethoden

untereinander nicht vergleichbar sind. Jede Methode lässt nur eine Aussage in Bezug auf die verwen-

deten Reaktionen und Bedingungen zu [61,115]. Auch wenn die Interpretation und Auswertung der

Ergebnisse dadurch erschwert wird, vermitteln die erzielten Werte eine Vorstellung von der

schützenden Wirkung von sekundären Pflanzenstoffen und pflanzlichen Nahrungsmitteln [64]. In Ab-

hängigkeit von den Reaktionsmechanismen, die den einzelnen Tests zugrundeliegen, und den ver-

wendeten Radikale bzw. Oxidantien reagieren die antioxidativen Substanzen auf unterschiedlichste

Art und Weise. Aus diesem Grund rieten SCHLESIER et al. (2002) mindestens zwei Tests mit unter-

schiedlichen Reaktionsmechanismen zu verwenden [116]. Problematisch ist außerdem die Wahl des

Kalibrierstandards. NENADIS et al. (2007) bezeichneten dies als einen „Critical control point“ bei der

Bewertung der AOC [117]. Aufgrund dessen sollten sich auch die Kalibrierstandards in den verwen-

deten Tests unterscheiden.

Diese Anforderungen wurden bei der Bestimmung der AOC der Samen berücksichtigt. Sie wurden mit

Hilfe drei verschiedener hydrophiler und einem lipophilen antioxidativen Test auf deren Fähigkeit

untersucht, Substrate vor oxidativem Angriff zu schützen [65]. Dabei kamen ebenfalls verschiedene

Standardsubstanzen zum Einsatz. Bei den drei hydrophilen Tests wurde zum einen Gallussäure

DISKUSSION

32

(Gesamtphenoltest nach FC) verwendet, zum anderen Trolox (H-TEAC, ORAC). α-Tocopherol diente

zur Kalibrierung bei dem lipophilen αTEAC-Test. Die Grundprinzipien der Testmethoden beruhen zum

einen auf der Reduktionskapazität (SET-Mechanismus) oder auf der radikalfangenden Aktivität (HAT-

Mechanismus) der Antioxidantien. Um konzentrationsabhängige Effekte feststellen und diskutieren

zu können, wurden außerdem jeweils drei Probenkonzentrationen hergestellt und gemessen [118].

Vor der eigentlichen Messung der AOC waren einige Schritte zur Probenvorbereitung notwendig, die

die Endergebnisse enorm beeinflussen können. Dazu zählten u. a. die stufenweisen Extraktions-

schritte, die Hydrolyse, das vollständige Trocknen oder auch die Herstellung der Verdünnungen.

Zunächst spielt die Extraktion eine bedeutende Rolle, um eine möglichst hohe Ausbeute an antioxi-

dativen Substanzen zu erreichen. Die Bestimmung von hydrophilen und lipophilen Antioxidantien in

demselben Medium erwies sich als untauglich. WU et al. (2004) betonten, dass die hydrophile und

lipophile AOC separat bestimmt und anschließend beide Werte verrechnet werden sollten [119].

Damit wird verhindert, dass bestimmte lipophile Komponenten mit den Hydrophilen extrahiert

werden. Eine weitere mögliche Fehlerquelle können chemische Veränderungen sein, die sich wäh-

rend der Extraktion vollziehen. Möglich wären eine Oxidation oder eine thermische Schädigung der

Phenole [60].

5.3.1 Gesamtphenolgehalt und hydrophile antioxidative Kapazität

Zur Bestimmung der hydrophilen AOC der Tomatensamen wurden der Gesamtphenoltest nach Folin-

Ciocalteu, der H-TEAC-Test und der ORAC-Test angewandt. Die Samen wurden mit 70 %igem Ethanol

extrahiert, der Rückstand anschließend einer Hydrolyse unterzogen und mit dem gleichen Lösungs-

mittel nochmals extrahiert. Damit wurden die frei vorliegenden und schließlich auch die gebundenen

antioxidativen Verbindungen erfasst.

Der Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu liefert nicht nur Aussagen zu dem Gesamtphenolgehalt,

sondern dient auch zur Bestimmung der reduzierenden AOC. Auf diesem Gebiet erfreut sich diese

Methode allgemeiner Beliebtheit, da sie als einfach und präzise gilt [61,63]. Bereits bei den Vor-

versuchen bewährte sich diese Einschätzung. Im Vergleich zu den anderen beiden hydrophilen Tests

stellte sich der Gesamtphenoltest als die zuverlässigste und robusteste Methode heraus. Darüber

hinaus wurden bei der Auswertung der Ergebnisse keine konzentrationsabhängigen Effekte fest-

gestellt, sodass ein Mittelwert aus allen drei Verdünnungsstufen gebildet werden konnte. In dem

H-TEAC-Test und ORAC-Test zeigten die unterschiedlichen Probenkonzentrationen dagegen einen

eindeutigen Einfluss. Mit abnehmender Konzentration der Probenlösung stieg die AOC deutlich an.

Dieses Phänomen des sogenannten Verdünnungseffektes wurde von HENGST et al. (2009) genauer

untersucht [118]. Dafür wurden bestimmte Reinsubstanzen und Nahrungsmittelextrakte mit sieben

gängigen antioxidativen Testmethoden, darunter der Gesamtphenoltest, H-TEAC III und ORAC,

untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die in den verschiedenen Tests verwendeten Proben-

konzentrationen einen signifikanten Einfluss auf die AOC hatten (Tab. 11).

Die grundlegenden Ursachen für diesen Verdünnungseffekt sind allerdings bislang unbekannt. Durch

die Existenz zahlreicher unbekannter Faktoren, die einen Einfluss auf die verschiedenen Mess-

methoden nehmen, war es bislang unmöglich, eine eindeutige Erklärung zu finden. Darüber hinaus

variierten die Ergebnisse innerhalb der Studie von HENGST et al. (2009) und so wurden ebenfalls

einige Abweichungen gegenüber anderen Publikationen festgestellt [118]. Dabei erfolgte eine

kritische Betrachtung der Vergleichbarkeit mit den Ergebnissen anderer Laboratorien. Die Angabe

von Literaturwerten kann bspw. als Mittelwert verschiedener Konzentrationen erfolgen oder aber

DISKUSSION

33

auch als Mittelwert von wiederholten Messungen gleicher Konzentration. Aus diesem Grund wurde

von HENGST et al. (2009) empfohlen, mindestens drei Probenkonzentrationen zu messen und sich

dieser Tatsachen bewusst zu sein, um Analysenwerte richtig zu bewerten [118].

Tab. 11 Einfluss einer steigenden Probenkonzentration von Reinsubstanzen, Nahrungsmitteextrakten und den selbst untersuchten Tomatensamenextrakten auf die AOC (gemessen mit verschie-denen Testmethoden) und den Gesamtphenolgehalt (nach HENGST et al. 2009 [118])

Gesamtphenoltest H-TEAC III ORAC

Ascorbinsäure ↑* ↔ ↑ Gallussäure cal ↓ ↕ Harnsäure ↔ ↓ ↕ Erdbeernektar ↓* ↓ ↓*

Weißer Tee ↓ ↓* ↓ Tomatenextrakt ↕ ↓* ↑

Tomatensamenextrakte (Waltinger und Red Currant)

↕ ↓ ↓

↔ konstant, ↑ Zunahme, ↓ Abnahme, ↕ fluktuierend, cal Kalibrierstandard, * geringfügige Zunahme/Abnahme (Variations-koeffizient innerhalb der gesamten Probenkonzentrationen war unter 10 %)

Bei Betrachtung der ermittelten Tendenzen für die Tomatensamenextrakte zeigten sich im Vergleich

mit den Ergebnissen von HENGST et al. (2009) teilweise Übereinstimmungen, teilweise Abweichungen

[118]. Bei dem Gesamtphenoltest wurden, außer bei dem weißen Tee, ebenso wie bei den Tomaten-

samen keine bedeutenden konzentrationsabhängigen Effekte beschrieben. Vereinbar sind auch die

Tendenzen bei dem H-TEAC-III-Test. Bei fast allen Substanzen (außer der Ascorbinsäure) und auch bei

den eigenen untersuchten Samenextrakten nahm die AOC mit steigender Probenkonzentration ab.

Inhomogene Trends zeigten sich dagegen bei dem ORAC-Test. Die bei den Samenextrakten beobach-

tete Abnahme der AOC mit zunehmender Probenkonzentration wurde nur bei dem Tomatenextrakt

beschrieben. Bei dem weißen Tee wurde bspw. eine gänzlich entgegengesetzte Tendenz festgestellt.

Auffällig beim Vergleich der Ergebnisse aller drei Testmethoden war, dass die Red-Currant-Samen

gegenüber den Waltinger-Samen stets eine höhere AOC aufwiesen. Der Gehalt an antioxidativen

Substanzen in ganzen Tomaten hängt von vielen Faktoren ab, die selbstverständlich auch einen Ein-

fluss auf die enthaltenen Samen haben. Dazu zählen Sorte, genetische Faktoren, Umweltfaktoren

(Temperatur, Licht, Wasser, Nährstoffversorgung), verwendete Agrartechniken (Einsatz von Pflanzen-

wachstumsgeneratoren, Erntezeitpunkt) und Lagerungsbedingungen nach der Ernte [120]. Die

Literatur konzentriert sich bezüglich der Effekte von Umweltfaktoren auf die Antioxidantien Lycopin,

Ascorbinsäure und andere phenolische Substanzen in Tomaten. In den Samen waren keine nennens-

werten Mengen an Lycopin enthalten (siehe 5.1), sodass dieses Carotinoid nicht bedeutend zur AOC

beiträgt. TOOR et al. (2005), die die antioxidative Aktivität in verschiedenen Tomatenfraktionen von

drei unterschiedlichen Tomatensorten untersuchten, fanden heraus, dass der mittlere Ascorbin-

säuregehalt in den Schalen signifikant höher war als in den Samen und im Fruchtfleisch [121]. Zusätz-

lich wurden auf Basis des tatsächlichen Gewichtsanteils der einzelnen Fraktionen in Tomaten die

Anteile berechnet, mit der Samen, Schalen und Fruchtfleisch an den Antioxidantien und der AOC

beteiligt waren. So wurde deutlich, dass die Samen 23 % zur AOC und 28 % zu den Gesamtphenolen

von Tomaten beitrugen (Abb. 19). TOOR et al. (2005) bestimmten diese zwei Parameter sowohl in den

hydrophilen als auch in den lipophilen Extrakten [121]. Dabei wurde deutlich, dass die hydrophilen

Extrakte der drei Fraktionen den größten Anteil (91-93 %) der AOC ausmachten.

DISKUSSION

34

Abb. 19 Prozentuale Anteile der Schalen, des Fruchtfleisches und der Samen an den Antioxidantien

und der AOC von ganzen Tomaten (nach TOOR et al. 2005 [121])

Diese Gesamtphenolgehalte und die TEAC-Werte von TOOR et al. (2005) betragen im Vergleich mit

denen der Waltinger- und Red-Currant-Samen nur etwa ein Zehntel (Tab. 12) [121]. Eine mögliche

Ursache für diese Abweichungen könnte die bestimmte Trockenmasse sein. Die Waltinger- und Red-

Currant-Samen hatten einen Trockenmasseanteil zwischen 92 und 93 %. Ein überraschend geringer

Trockenmasseanteil von im Mittel 6 % wurde von TOOR et al. (2005) bestimmt [121]. Diese erheb-

lichen Unterschiede können entweder nur durch eine irrtümliche Verwechslung von Trockenmasse

und Wassergehalt zustande gekommen sein oder es haftete noch so viel Fruchtfleisch an den Samen,

dass der Wassergehalt der Samenfraktion enorm in die Höhe getrieben wurde. Dies würde auch die

niedrigen antioxidativen Werte erklären. Das wässrige Fruchtfleisch besitzt geringere AOC und würde

die Werte für die Samenfraktion verringern. Außerdem wurden zur Bestimmung der Gesamtphenole

nach FC und bei dem TEAC-Test andere Vorgehensweisen genutzt, so wurde nicht der TEAC III,

sondern der TEAC II verwendet.

Tab. 12 Publizierte hydrophile AOC von Tomatensamen im Vergleich mit den eigenen untersuchten Samen

Gesamtphenole

nach FC (mg GAE/100 g)

H-TEAC (mmol TE/100 g)

ORAC

(mmol TE/100 g)

vor Hydrolyse

nach Hydrolyse

vor Hydrolyse

nach Hydrolyse

vor Hydrolyse

nach Hydrolyse

Waltinger 167,6 203,2 1,2-1,4A 1,0-1,4A 8,7-13,4B 10,3-13,5B

Red Currant 204,8 309,4 1,5-2,0A 1,4-2,3A 12,6-18,8B 16,2-18,9B

TOOR et al. 2005 [121] 22,0 0,114

GAHLER et al. 2003 [122]

31,0 91,9C

A Angabe der Werte von drei Verdünnungsstufen (1:1, 1:2, 1:5) B Angabe der Werte von nur zwei Verdünnungsstufen (1:2, 1:5) C Wert beinhaltet freie und gebundene antioxidative Substanzen

Die Tatsache, dass Samen oder Kerne im Vergleich zu den Schalen den höchsten Beitrag zur antioxi-

dativen Aktivität leisten, wurde bspw. bei Trester aus roten Weintrauben beobachtet [123]. Grund

waren die hohen Proanthocyanidingehalte. Auch GAHLER et al. (2003) stellten überraschend fest, dass

0 20 40 60 80 100

Gesamtphenole

Flavonoide

Lycopin

Ascorbinsäure

antioxidative Kapazität

Anteil in %

Schale

Fruchtfleisch

Samen

DISKUSSION

35

der Gesamtphenolgehalt in den Samen der untersuchten Tomaten mit 31,0 mg GAE/100 g im Ver-

gleich zum inneren Fruchtfleisch und den äußeren Schichten (Perikarp und Schale) am höchsten war

[122]. In der Regel sind allerdings die äußeren Randschichten von Früchten und Gemüse reicher an

Phenolen [122]. Im Vergleich mit den eigenen Werten war der Gehalt wiederum sehr gering (Tab.

12). Weiterhin wurde beschrieben, dass eine Hydrolyse zu höheren Gesamtphenolgehalten in allen

Fraktionen führte. Dies wurde bei den eigenen untersuchten Samen ebenfalls festgestellt. Hierbei

muss beachtet werden, dass GAHLER et al. (2003) die Hydrolyse nicht mit dem Rückstand einer ersten

Extraktion (für die freien Substanzen) durchführten, sondern vom Ausgangsmaterial ausgingen [122].

Somit wurde die Summe aus freien und gebundenen Substanzen angegeben. Für die eigenen Samen

wurden diese beiden Werte separat angegeben. Bei den Gesamtphenolen war bei beiden Samen-

sorten Waltinger und Red Currant der Anteil an gebundenen Substanzen deutlich höher als der Anteil

an freien Substanzen. In dem H-TEAC-Test und ORAC-Test waren die Unterschiede weniger deutlich.

Aufgrund des Verdünnungseffektes konnte hier keine eindeutige Aussage getroffen werden.

Beim Vergleich des TEAC- und ORAC-Tests, die dieselbe Referenzsubstanz Trolox nutzen, fällt auf,

dass letzterer höhere AOC ergab. Dieser Unterschied wird dadurch veranlasst, dass beide Testmetho-

den auf verschiedenen Reaktionsmechanismen beruhen. So werden verschiedene Radikalquellen,

Substrate, Reaktionsbedingungen und Quantifizierungsmethoden verwendet. TABART et al. (2009)

bestimmten die AOC verschiedener phenolischer Verbindungen mittels unterschiedlicher Test-

methoden [124]. Nahezu alle mit dem ORAC getesteten phenolischen Verbindungen zeigten eine

höhere AOC, als wenn diese mit dem TEAC gemessen wurden. So zeigten bspw. Kämpferol-3-O-

Glykosid, Hesperidin und Naringenin eine sehr niedrige bis gar keine AOC im TEAC-Test. Im ORAC-

Test erwiesen sie sich als starke Antioxidantien.

Ein Aspekt, der eine besondere Rolle zu spielen scheint, ist die Messdauer der zwei Tests. Im TEAC-

Test erfolgte die Extinktionsmessung 2 min nachdem die ABTS•+-Lösung mit der Probe vermischt

wurde, eine sogenannte Endpunkt-Messung. Im ORAC-Test wird der Reaktionsverlauf bis zum Abfall

der Fluoreszenzkurve auf Null gemessen, d. h. bis alle Antioxidantien mit den Radikalen reagiert

haben. Im TEAC-Test kommt es durch die kurze Messzeit oft zu einer Unterschätzung der AOC. Pro-

blematisch sind langsame Reaktionen, die eine lange Zeit zum Erreichen des Endpunktes benötigen.

SAMANIEGO S´ANCHEZ et al. (2007) bestimmten die AOC von nativem Olivenöl mittels TEAC-Test und

verlängerten die Reaktionszeit sogar bis auf 30 min [125]. PRIOR et al. (2005) behaupteten, dass

Testmethoden, die das AUC-Verfahren nutzen, zu exakteren Ergebnissen führen als Tests, deren

Messung zu einem festgelegten Zeitpunkt erfolgt [63]. Gerade auch bei Lebensmittelproben, die oft

aus vielen verschiedenen Stoffen zusammengesetzt sind und die eine komplexe Reaktionskinetik

vorzeigen, eignet sich der ORAC-Test besser als der TEAC-Test. VAN DEN BERG et al. (1999)

schlussfolgerten, dass die quantitative Beurteilung der AOC mit dem TEAC-Test sehr mühsam oder

sogar unmöglich ist [126]. Die Methode kann aber durchaus herangezogen werden, um zumindest

eine Einstufung der Antioxidantien zu erhalten.

Bei einem Vergleich des Gesamtphenolgehaltes und der AOC wurde eine geringe bis mittlere

Korrelation festgestellt (Gesamtphenole-TEAC: r = 0,58, Gesamtphenole-ORAC: r = 0,68). Literatur-

daten sind in dieser Hinsicht sehr gegensätzlich. Von verschiedenen Autoren wurde eine starke

Korrelation zwischen dem Gesamtphenoltest und dem TEAC-Test beschrieben, mit der Begründung,

dass beiden ähnliche Reaktionsmechanismen zugrundeliegen [61,127]. Ebenso wurden von ANDRE et

al. (2007) eine gute Korrelation zwischen den Gesamtphenolen und dem ORAC gefunden [128]. Bei

TABART et al. (2009) und KÄHKÖNEN et al. (1999) zeigten sich allerdings keine signifikanten

Korrelationen zwischen Gesamtphenolgehalt und AOC bei den untersuchten Standardsubstanzen

DISKUSSION

36

bzw. Pflanzenextrakten [124,129]. Eine mögliche Ursache könnte sein, dass der Gesamtphenoltest

nach FC nicht spezifisch für Phenole ist, da auch andere Substanzen durch das Folin-Ciocalteu-

Reagenz oxidiert werden können. Dazu zählen möglicherweise Zucker oder Proteine [130]. Eine hohe

signifikante Korrelation konnte dagegen bei der AOC gemessen mit dem TEAC-Test und ORAC-Test

festgestellt werden (r = 0,92). SILVA et al. (2007) beschrieben hingegen nur eine mäßige Korrelation

zwischen diesen beiden Testmethoden, da der ORAC-Test im Gegensatz zum TEAC-Test wesentlich

mehr antioxidative Substanzen erfasst [127]. Außerdem misst der TEAC die reduzierende Aktivität

von Antioxidantien in Bezug auf das ABTS-Radikal, während der ORAC die Fähigkeit von Antioxi-

dantien bestimmt, radikalische Kettenreaktionen abzubrechen.

Die Übertragbarkeit der mit den Testmethoden bestimmten AOC auf tatsächliche Lebensmittel bleibt

allerdings fraglich. In einer heterogenen Lebensmittelmatrix laufen wesentlich mehr Wechselwirkun-

gen mit anderen Inhaltsstoffen ab als in einer kontrollierten, homogenen Lösung mit einem künstli-

chen Radikalgenerator oder Oxidans. In der Realität werden die radikalischen Reaktionen durch Licht,

Metallionen oder Hitze während der Verarbeitung oder Lagerung in Gang gesetzt [61] und sind

wesentlich schlechter kontrollierbar. Wie sich die AOC der Tomatensamen bspw. bei einer Aufarbei-

tung zu Öl oder anderen Extraktionsverfahren im großtechnischen Maßstab in der Industrie verhal-

ten, bleibt somit ungewiss. Dahingehend müssen noch einige Forschungen durchgeführt werden.

Auch wenn die Industrie z. B. das ORAC-Verfahren bereits so weit annimmt, dass die Hersteller von

Nutrazeutika die ORAC-Werte auf ihren Produkten ausweisen [63], so sollten diese dennoch kritisch

betrachtet werden. Die Tests basieren auf rein chemischen Reaktionen in vitro und weisen keine

Ähnlichkeit mit biologischen Systemen auf. Zudem geben sie keine Aussagen zu Bioverfügbarkeit,

Stabilität in vivo, Geweberetention der Antioxidantien sowie Reaktivität in situ [61].

TOOR et al. (2005) stellten letzten Endes heraus, dass das Entfernen der Schalen und Samen bei der

Herstellung von verarbeiteten Tomatenprodukten mit einem Verlust an wichtigen antioxidativ wirk-

samen Stoffen einhergeht, die bei einer Reststoffverwertung sinnvoll genutzt werden könnten [121].

Bisher existieren nicht viele Arbeiten, die sich mit der AOC von Tomatensamen befassen. Aufgrund

der Tatsache, dass jährlich aber enorme Mengen an Samen anfallen, wäre es wünschenswert, mehr

über die genaue Zusammensetzung der Antioxidantien in Erfahrung bringen zu können.

5.3.2 Lipophile antioxidative Kapazität

Die lipophile AOC von Lebensmitteln oder pflanzlichen Materialien beruht hauptsächlich auf deren

Gehalt an unpolaren Carotinoiden und Vitamin-E-Verbindungen [112]. Die experimentelle Bestim-

mung erfolgte mit dem αTEAC-Test, einer von MÜLLER et al. (2010) modifizierten Variante des TEAC-

II-Tests [93]. Dieser diente ursprünglich zur Analyse lipophiler Antioxidantien [116], bei der das ABTS-

Radikal durch eine chemische Reaktion mit Mangandioxid erzeugt wird [63]. Als Ausgangsmaterial für

die Gewinnung der lipophilen Substanzen aus den Tomatensamen diente der zuvor hydrolysierte, mit

70 %igem Ethanol extrahierte Rückstand. Für die darauffolgende Extraktion mit n-Hexan musste

dieser Rückstand vollständig getrocknet werden.

In den untersuchten Samen wurden Vitamin-E-Gehalte von 78,5 µmol/100 g bei den Red-Currant-

Samen bzw. 42,5 µmol/100 g bei den Waltinger-Samen bestimmt, wobei γ-Tocopherol den Haupt-

anteil einnahm. Daneben wurden geringe Carotinoidkonzentrationen ermittelt. Aufgrund dieser

Tatsache wurde erwartet, dass die Samen eine gewisse lipophile AOC aufweisen. Die detektierten

Vitamin-E-Verbindungen α- und γ-Tocopherol zählen zu den unpolareren Tocopherolen, sodass die

Wahrscheinlichkeit, dass diese zuvor mit 70 %igem Ethanol bereits extrahiert wurden, gering ist.

DISKUSSION

37

Dagegen sind Lutein und Zeaxanthin Vertreter der Xantophylle, die eine geringere Lipophilie auf-

weisen. Deren antioxidative Wirkungen wurden möglicherweise bereits teilweise in den hydrophilen

Tests erfasst.

Bei der Auswertung des αTEAC-Tests wurde ein deutlicher Verdünnungseffekt festgestellt. Mit ab-

nehmender Probenkonzentration stiegen die lipophilen TEAC-Werte an, weshalb die Mittelwerte für

jede Verdünnungsstufe angegeben wurden. Trotzdem wiesen die Mittelwerte hohe Standardab-

weichungen und folglich Variationskoeffizienten deutlich über 10 % auf. Dies ließ auf einige Schwie-

rigkeiten bei der Versuchsdurchführung schließen. Trotz Wiederholung der Messungen mit einer

abgeänderten Messreihenfolge von Proben, Blindwert und Standards (siehe 3.5.5) konnte keine

Verbesserung dieser Streuungsparameter erreicht werden.

Vermutlich lagen zwei Ursachen zugrunde: Zum einen wurden lediglich sehr geringe Extinktions-

differenzen zwischen Blindwert und Proben erreicht. Die daraus bestimmten AOC nahmen dement-

sprechend sehr geringe Werte an. Obwohl die Kalibrierung an die geringen Konzentrationen ange-

passt wurde, lagen die Werte trotzdem teilweise unterhalb der Standardkonzentrationen. Zum

anderen wurde eine unerwartet schnelle Abnahme der Absorption der ABTS•+-Arbeitslösung beo-

bachtet. Innerhalb von 60 min nahm die Extinktion um ca. 0,05 ab, die Messungen dauerten aller-

dings etwa 1,5-2 h. Allein durch diese Tatsache kann eine höhere AOC bei den Proben vorgetäuscht

werden, die am Ende des Messzeitraumes gemessen werden.

Abb. 20 Anteile der hydrophilen und lipophilen AOC an der gesamten AOC beider Tomatensamen- sorten, bestimmt mit dem H-TEAC-III-Test und dem αTEAC-Test; Darstellung in Abhängig- keit von den Verdünnungsstufen

Die Versuchsergebnisse lassen aufgrund der hohen Standardabweichungen keine präzise Auswertung

zu. Die Samen der Waltinger-Cocktailtomaten wiesen Werte zwischen 41,3 ± 7,0 und

133,0 ± 60,7 µmol αTE/100 g auf, die Samen der Red-Currant-Tomaten zwischen 56,5 ± 7,63 und

256,1 ± 72,0 µmol αTE/100 g. Signifikante Unterschiede zwischen beiden Samensorten konnten auf-

grund der hohen Streuungen nicht festgestellt werden. In Abb. 20 werden die Anteile der hydro-

philen und lipophilen AOC an der gesamten AOC beider Tomatensamensorten dargestellt. Ein Ver-

gleich beider AOC ist trotz der unterschiedlichen Standardsubstanzen Trolox und α-Tocopherol

möglich, da beide Einzelsubstanzen in ihrer antioxidativen Wirkung sehr ähnlich sind. KRANL et al.

(2005) beschrieben keine signifikanten Unterschiede in der AOC zwischen beiden Substanzen bei

einer Bestimmung mittels lipophilem TEAC-Test [131]. Aus der Abbildung wird deutlich, dass die

0 1 2 3 4 5

VF 1

VF 2

VF 5

VF 1

VF 2

VF 5

Wal

tin

ger

Red

C

urr

ant

Antioxidative Kapazität (mmol TE/100 g bzw. mmol αTE/100 g)

H-TEAC

αTEAC

DISKUSSION

38

hydrophilen Extrakte hauptsächlich (94-98 %) zur gesamten AOC beitrugen. Diese Tatsache wurde

auch von TOOR et al. (2005) beschrieben [121].

TOOR et al. (2005) bestimmten die hydrophile und lipophile AOC der Samenfraktion der Tomaten mit

dem TEAC-II-Test [121]. Die Verwendung von Trolox als Standardsubstanz bei der lipophilen Variante

führt nach MÜLLER (2011) zu uneinheitlichen Reaktionsbedingungen [58]. Das hydrophile Trolox kann

nur in wässrigen Lösungsmitteln gelöst werden, während sich die Proben in einem lipophilen Milieu

befinden. Der Austausch gegen das fettlösliche Analogon α-Tocopherol erreichte, dass n-Hexan

sowohl für die Kalibriersubstanz als auch für die lipophilen Verbindungen als Lösungsmittel genutzt

werden konnte [58]. TOOR et al. (2005) bestimmten eine lipophile AOC von 9,4 µmol TE/100 g, die

deutlich unter den eigenen Werten liegt [121].

Die AOC der einzelnen Tocopherole und Tocotrienole sowie Carotinoide wurde bereits mit verschie-

denen lipophilen Testmethoden analysiert [93,112]. Die Tocochromanole, speziell α-Tocopherol,

gelten als wirksame kettenbrechende und Peroxylradikal-fangende Antioxidantien. Bei der Analyse

mit dem αTEAC-Test wurden keine signifikanten Unterschiede in der AOC aller Vitamin-E-Isoformen

gefunden. Weder der Methylierungsgrad noch Sättigungsunterschiede der Seitenketten beein-

flussten die Fähigkeit, das synthetische ABTS-Radikal zu reduzieren [93].

Auf Basis der Gehalte an Tocochromanolen und Carotinoiden in den jeweiligen Samen und den anti-

oxidativen Aktivitäten dieser Substanzen aus der Literatur [93,112] wurden die theoretischen Anteile

dieser Verbindungen an der AOC berechnet. γ-Tocopherol trug aufgrund seines hohen Mengen-

anteils hauptsächlich zur AOC bei. Abb. 21 stellt die theoretischen AOC und die tatsächlich ermittel-

ten AOC (in Abhängigkeit von den Verdünnungsstufen) gegenüber.

Abb. 21 Gegenüberstellung der anhand der Einzelsubstanzen theoretisch ermittelten AOC (weiße Balken) und der tatsächlich bestimmten AOC (graue Balken, zusätzliche Darstellung des Verdünnungseffektes durch Angabe der Verdünnungsfaktoren)

Aufgrund der geringeren γ-Tocopherol-Gehalte ist die theoretische AOC der Red-Currant-Samen

geringer als die der Waltinger-Samen. Dagegen weisen letztere eine niedrigere tatsächliche lipophile

AOC auf. Ein gewisser Anteil der AOC konnte nicht auf die antioxidative Aktivität der Carotinoide und

Vitamin-E-Verbindungen zurückgeführt werden. Noch nicht identifizierte lipophile Minorkomponen-

ten oder synergistische Wechselwirkungen zwischen Carotinoiden und Tocochromanolen könnten

dafür verantwortlich sein [6]. Nach MÜLLER et al. (2011) sollte stets bedacht werden, dass die

theoretische AOC

theoretische AOC

VF1

VF1

VF2

VF2

VF5

VF5

0 50 100 150 200 250 300 350

Red Currant

Red Currant

Waltinger

Waltinger

Lipophile AOC [µmol αTE/100 g]

DISKUSSION

39

Betrachtung der AOC der einzelnen antioxidativen Substanzen in einer Lebensmittelmatrix unzweck-

mäßig ist, um die gesamte AOC zu bestimmen [112]. Das Auftreten von synergistischen oder antago-

nistischen Wechselwirkungen zwischen einzelnen Antioxidantien können bedeutende Abweichungen

hervorrufen.

Für Tomatensaatöl wurde mit dem αTEAC-Test eine hohe lipophile AOC von ca. 600 µmol αTE/100 g

bestimmt [6]. Neben den Tocopherolen, die auch in den Samen nachgewiesen wurden, enthielt das

Öl hohe Mengen an Lycopin und β-Carotin. Lycopin besitzt unter den Carotinoiden die stärkste

Fähigkeit, ABTS-Radikale abzufangen [112] und hat damit einen großen Einfluss auf die AOC des Öles.

Dieses Carotin zeigte eine vierfach höhere Aktivität als α-Tocopherol, Lutein und Zeaxanthin zeigten

eine doppelt so hohe Aktivität [112]. Eine Kalkulation der theoretischen Anteile dieser Verbindungen

an der AOC ergab, dass die Lycopin-Isomere insgesamt 12 %, γ-Tocopherol 22-56 % der gesamten

antioxidativen Aktivität des Öles ausmachte. Ein Anteil von 8-45 % der AOC konnte auch hier nicht

auf die antioxidative Aktivität der Carotinoide und Vitamin-E-Verbindungen zurückgeführt werden.

5.4 Fettsäurezusammensetzung von Tomatensamen

Nach RABAK (1917) wurden Untersuchungen zu dem aus Tomatensamen gewonnenen Öl und dessen

Eigenschaften bereits seit 1901 durchgeführt [31]. Aufgrund der Tatsache, dass die industrielle Verar-

beitung von Tomaten seit dieser Zeit immer größere Ausmaße annahm, befassten sich später einige

weitere Forschungsgruppen mit dieser Thematik. Alle Autoren, bis hin zu denen, die sich aktuell

damit auseinandersetzen, beurteilten die als Abfallprodukt aus der Industrie anfallenden Tomaten-

samen als gute Quelle für pflanzliches Speiseöl [5,33,107,132-134]. Es eignet sich in nativer oder

raffinierter Form sowohl als Salatöl [107] als auch zum Kochen [33]. SOGI & SIDDIQ (2011) berichteten,

dass es sogar bei der Margarine- und Mayonnaiseherstellung verwendet wurde [32].

Bevor eine Analyse der Fettinhaltsstoffe und speziell der Fettsäuren erfolgen konnte, musste das Öl

in einem ersten Arbeitsschritt aus den Samen extrahiert werden. Meist wird dafür die Lösungs-

mittelextraktion angewendet, die das gängigste Verfahren in der Industrie ist. Für die eigenen Unter-

suchungen wurden als Extraktionsmittel Methanol und Chloroform im Verhältnis 2:1 entsprechend

der Methode nach FOLCH et al. (1957) verwendet [94]. In der Literatur wurde meist eine Soxhlet-

Extraktion mit n-Hexan oder Petrolether durchgeführt [5,33,133,134], einige Arbeitsgruppen wählten

die traditionelle Pressmethode [83,132]. Tab. 13 fasst die damit erzielten Ausbeuten der Ölgehalte

zusammen. Auch wenn die eigenen Daten nur als Näherungswerte angesehen werden können, liegen

diese größtenteils innerhalb der Literaturwerte.

Tab. 13 Publizierte Gehalte an extrahierten Ölgehalten aus Tomatensamen

Quelle Ölgehalt (%)

eigene Daten Waltinger 25,8 20,2 Red Currant

TAKÁSOVÁ et al. 1995 [135] 20,0

LAZOS et al. 1998 [33] 21,8

SOGI & SIDDIQ 2011 [32] 20,5-29,6

SHAO et al. 2012 [9] 25,9

FAHIMDANESH & BAHRAMI 2013 [134] 33,6-37,4

DISKUSSION

40

LAZOS et al. (1998) beschrieben das gewonnene Öl bei Raumtemperatur als rötlich-gelbe Flüssigkeit,

die einen milden tomatig-fruchtigen Geruch aufwies [33]. Die Farbe des Öles nach der eigens durch-

geführten Extraktion wies keinen rötlichen Schimmer auf, es war nur gelblich.

Die Fettsäuren wurden in Form der Methylester gaschromatographisch bestimmt. Größtenteils

waren beide Samensorten vergleichbar. Bei beiden waren die Gehalte an ungesättigten Fettsäuren

mit 80 % viermal höher als die der gesättigten Fettsäuren mit 20 %. Minimale Abweichungen ergaben

sich zwischen den Werten für die einfach und mehrfach ungesättigten Verbindungen. Die Samen der

Sorte Waltinger wiesen etwas weniger Ölsäure und etwas mehr Linol- und α-Linolensäure als die der

Sorte Red Currant auf. Daraus ergab sich ein Anteil von 19,2 % einfach ungesättigten Fettsäuren für

die Waltinger-Samen im Gegensatz zu 20,8 % für die Red-Currant-Samen. Letztere besaßen einen

geringfügig niedrigeren Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Im Folgenden wird nicht zwi-

schen den zwei Samensorten unterschieden, sondern die Werte werden jeweils zusammengefasst.

Die bestimmten Anteile an gesättigten und ungesättigten Fettsäuren decken sich überwiegend mit

den Angaben aus der Literatur (Tab. 14). Allein bei CANTARELLI et al. (1993) lag der ungesättigte Anteil

um 10 % niedriger als bei den anderen publizierten Werten und den eigenen Daten [5]. Diese

Arbeitsgruppe untersuchte den Einfluss der Hot-Break und Cold-Break-Behandlung von Tomaten auf

die Öle, die aus deren Samen gewonnen wurden. In Übereinstimmung mit den Literaturwerten war

auch hier die Linolsäure die dominierende Fettsäure, gefolgt von der Ölsäure. Allerdings lagen die

Linolsäuregehalte mit Werten um 40 % unter den Werten der anderen Literaturdaten. In dem Hot-

Break-Öl betrug der Anteil an Linolsäure 42,8 %, in dem Cold-Break-Öl 37,6 %. Demgegenüber wies

das Cold-Break-Öl ca. 10 % mehr Ölsäure auf, sodass dieses Öl letztendlich auch einen minimal

höheren Gesamtwert für die ungesättigten Fettsäuren besaß (70,6 % gegenüber 68,6 %). Meist lagen

die Linolsäuregehalte von Tomatensaatöl zwischen 50 und 60 % [33]. α-Linolensäure war die einzige

omega-3-Fettsäure, die das Öl der Tomatensamen enthielt.

Tab. 14 Publizierte Fettsäurezusammensetzungen von Öl aus Tomatensamen im Vergleich mit den eigenen Daten

C16:0 C18:0 C20:0 C18:1 C18:2 C18:3 SFA UFA

eigene Daten Waltinger 13,4 4,0 0,5 18,1 59,2 2,5 19,1 80,9

Red Currant 13,4 4,7 0,6 19,9 57,0 2,3 19,8 80,2

EL-TAMIMI et al. 1979 [132]A 24,8 2,4 2,2 15,5 52,7 2,3

LAZOS & KALATHENOS 1988 [133] 13,8 3,4 0,5 21,4 55,0 4,0 19,1 80,9

CANTARELLI et al. 1993 [5]

Cold Break 16,9 9,5 0,8 29,7 37,6 n.n. 29,4 70,6

Hot Break 23,4 4,0 1,3 18,3 42,8 0,7 31,3 68,6

TAKÁSOVÁ et al. 1995 [135] 13,0 4,5 19,7 59,4 2,8 17,7 82,3

LAZOS et al. 1998 [33]B 14 6 0,3 22 54 2 20 80

BOTINEŞTEAN et al. 2012 [83] 17,2 9,2 48,2

FAHIMDANESH & BAHRAMI 2013 [134] 12,3 5,2 0,4 22,2 56,1 2,8

A Werte für Öl aus Abfallverwertung mit Lösungsmittelextraktion

B Werte für Rohöl

SFA - gesättigte Fettsäuren, UFA - ungesättigte Fettsäuren

Palmitinsäure war die dominierende gesättigte Fettsäure in beiden Samensorten mit einem Anteil

von 13,4 %, gefolgt von der Stearinsäure mit 4-5 %. Höhere Palmitinsäure-Anteile von 24,8 % wurden

von EL-TAMIMI et al. (1979) ermittelt [132]. Dieselbe Arbeitsgruppe berichtete über geringere Stearin-

säuregehalte und relativ hohe Arachinsäuregehalte von 2 %. Myristinsäure, Palmitoleinsäure,

DISKUSSION

41

Margarinsäure, C18:2 trans, Arachinsäure, C20:1, Behensäure und Lignocerinsäure wurden in

geringen Mengen bzw. nur in Spuren gefunden [33]. Mit Ausnahme der C18:2 trans deckt sich dies

mit den eigenen Daten. Nach LAZOS et al. (1998) fällt das Saatöl in die Kategorie der Linol- und

Ölsäure-reichen Öle und eignet sich daher sowohl für den Verzehr als auch für einige industrielle

Anwendungen wie z. B. Hydrierung oder Shortening [33]. Auch EL-TAMIMI et al. (1979) charak-

terisierten Tomatensaatöl als geeignet für die Fetthärtung [132]. Unterschiede einzelner Fettsäure-

gehalte beim Vergleich der Literaturwerte können u. a. auf die Verwendung unterschiedlicher Kultur-

sorten oder die Anbau- und Umweltbedingungen zurückgeführt werden [5].

Ein Vergleich des Fettsäuremusters des Öles beider Samensorten mit kommerziellen Pflanzenölen

zeigt, dass das Tomatensaatöl dem Sojaöl sehr ähnlich ist (Abb. 22). Allerdings weist Sojaöl höhere

Anteile an α-Linolensäure auf. Von MOUNTS et al. (1994) wurde ein Sojaöl mit geringem

α-Linolensäure-Anteil entwickelt [136]. Nach ELLER et al. (2010) ist Tomatensaatöl diesem sehr

ähnlich [107].

Abb. 22 Fettsäurezusammensetzung verschiedener Pflanzenöle (nach VACLAVIK & CHRISTIAN 2008 [137]) im Vergleich zu dem aus den zwei Samensorten gewonnenem Öl (normiert auf 100 %)

LAZOS et al. (1998) bestimmten einige weitere Fettkennzahlen von Tomatensaatöl, wie Verseifungs-

zahl, Iodzahl, Peroxidzahl, Dichte oder Brechungsindex, die Auskunft über die Zusammensetzung des

Tomatensaatöls geben können [33]. Die hohe Iodzahl von 105 deutet auf einen hohen Ungesättigt-

heitsgrad hin. Damit zählt es zu den halbtrocknenden Ölen [133]. Die Peroxidzahl als ein Maß für die

Verdorbenheit eines Fettes lag unter 20 meq/kg und damit in einem zufriedenstellenden Bereich.

Der Schmelzpunkt von kaltgepresstem Tomatensaatöl lag bei ca. - 4 °C [83]. Nach EL-TAMIMI et al.

(1979) betrug die Haltbarkeitsdauer von Tomatensaatöl etwa zwei Monate [132]. Außerdem hatte

eine Lagerung der Samen über zwei Jahre keinen Einfluss auf die Haltbarkeit des daraus gewonnen

Öles. Aus dieser Erkenntnis kann geschlussfolgert werden, dass die Samen mehrerer Saisons bei

Raumtemperatur gelagert werden können bevor die Ölextraktion stattfindet. Dies könnte von Be-

deutung sein, wenn die Samenmenge einer Saison nicht ausreichend für eine Extraktion ist.

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Palmöl

Rapsöl

Olivenöl

Sonnenblumenöl

Sojaöl

Waltinger

Red Currant

Fettsäuregehalt

SFA

MUFA

PUFA

α-Linolensäure

DISKUSSION

42

LAZOS et al. (1998) untersuchten außerdem, welchen Effekt eine Aufreinigung von Tomatensaatöl auf

diverse Eigenschaften hat [33]. Dafür verglichen sie das Rohöl und das gereinigte Öl, welches

entschleimt, entsäuert und gebleicht wurde. So wird beschrieben, dass die wesentlichen physika-

lischen und chemischen Eigenschaften durch die drei Raffinationsschritte nicht beeinflusst wurden.

Allerdings wird gleichzeitig von einer Abnahme des Säuregrades, der Farbintensität, der

unverseifbaren Bestandteile und der Oxidationsstabilität sowie von einem Anstieg des Rauchpunktes

und einer Veränderung der spezifischen Extinktionen bei 232 und 270 nm berichtet, sodass dass sehr

wohl von einer Beeinflussung einiger physikochemischer Eigenschaften gesprochen werden kann.

Bezüglich des Fettsäureprofils konnten allerdings tatsächlich keine Unterschiede zwischen den

beiden Ölen festgestellt werden. Die Aufreinigung führte lediglich zu höheren Werten bei der

Fettsäure C18:2 trans, die in den eigens untersuchten Ölen nicht detektiert wurde. Die Zunahme an

dieser trans-Fettsäure von 0,1 % auf 0,8 % wurde mit den hohen Temperaturen bei dem Bleich-

vorgang begründet, die zu einer cis/trans-Isomerisierung führten.

Außerdem untersuchten mehrere Arbeitsgruppen die Sterolgehalte von Tomatensaatöl. ELLER et al.

(2010) bestimmten in Abhängigkeit der Extraktionsmethode zwischen 10,6 und 12,3 mg/g Öl, LAZOS

et al. (1998) ermittelten 4,6 mg/g Öl [107,33]. Die meisten Pflanzenöle besitzen Phytosterolgehalte

zwischen 1 und 5 mg/g [138]. Die in dem Tomatensaatöl beschriebenen Hauptsterole waren β-Sito-

sterol, Cholesterol, Stigmasterol und Campesterol [33,107]. Der vergleichsweise hohe Cholesterol-

gehalt im Gegensatz zu anderen Pflanzenölen, die nur Spuren dieses Sterols aufweisen, ist charak-

teristisch für Samen der Familie der Solanaceae [139]. Im Allgemeinen herrscht die Ansicht, dass

Pflanzen kein Cholesterol enthalten. Allerdings handelt es sich hierbei um ein Irrtum, welches aus

den Tatsachen resultiert, dass Pflanzen generell nur sehr kleine Mengen an Cholesterol aufweisen

und dass die Analysenmethoden für den Nachweis von Cholesterol in diesem Bereich bis vor kurzem

noch nicht gut entwickelt waren [140]. Pflanzen enthalten sowohl freies als auch verestertes Choles-

terol, welches Bestandteil von Membranen ist und als Teil von den Oberflächenlipiden von Blättern

auftritt [140]. NODA et al. (1988) wiesen, neben dem dominierenden Sitosterol, geringfügige Mengen

an Cholesterol in Rapssamen nach, während in den Rapsblättern ein umgekehrtes Verhältnis auftrat

[141]. Auch wenn Cholesterol im Vergleich zu den anderen Sterolen nur geringe Gehalte aufwies,

kann es in Pflanzenölen einen Anteil an den Gesamtsterolen von 5 % ausmachen [142]. Bei Tomaten-

saatöl ergaben sich Cholesterolgehalte zwischen 60 und 70 mg/100 g [109]. Relativ hohe Cholesterol-

gehalte wurden z. B. auch in Leindotteröl gefunden (18,8 mg/100 g Öl) [143]. Verglichen mit den

Cholesterolgehalten tierischer Produkte, wie Butter (250 mg/100 g) oder Eigelb (1 260 mg/100 g)

[144], sind die Gehalte in pflanzlichen Ölen allerdings unbedeutend gering.

ZUSAMMENFASSUNG

43

6 ZUSAMMENFASSUNG

Die Tomate (Lycopersicon esculentum) wird als der Deutschen liebstes Gemüse betitelt. Der größte

Anteil an Tomaten wird in Form verarbeiteter Produkte, wie z. B. Tomatenmark, -sauce, -saft oder

Ketchup, verzehrt. Epidemiologische Studien zeigten, dass ein häufiger Verzehr von Tomaten oder

Tomatenprodukten das Risiko für verschiedene Krebsarten, wie Prostata-, Lungen- oder Darmkrebs,

und kardiovaskuläre Erkrankungen senkt. Die steigende Nachfrage nach diesen Produkten führte zu

einer enormen Entwicklung der tomatenverarbeitenden Industrie. Damit sind allerdings wirtschaft-

liche, technische und ökologische Probleme verbunden, da große Mengen an Reststoffen entstehen,

die entsorgt und verwertet werden müssen. Hauptbestandteil des sogenannten Tomatentresters

sind Tomatensamen, die im Hinblick auf eine sinnvolle Reststoffverwertung als Ausgangsmaterial für

neue Produkte dienen können. Aus diesem Grund besteht Interesse an der chemischen Zusammen-

setzung und besonders den bioaktiven Substanzen der Samen.

Die vorliegende Arbeit hatte daher folgende Zielstellungen:

1. Bestimmung und Beurteilung der Carotinoid- und Vitamin-E-Gehalte der Tomatensamen.

2. Ermittlung der antioxidativen Kapazität der Samen mit verschiedenen Testmethoden und Er-

fassung der Anteile an freien und gebundenen wasserlöslichen sowie an fettlöslichen

Antioxidantien.

3. Untersuchung des Fettsäuremusters der Samen.

Untersucht wurden Samen von den zwei Tomatensorten Waltingers Cocktail und Red Currant, wobei

letztere eine Wildform ist und auch rote Johannisbeertomate genannt wird.

Die Carotinoid- und Vitamin-E-Analyse erfolgte im Anschluss an eine kombinierte Extraktions-

methode mit Methanol/Tetrahydrofuran mit Hilfe der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC).

Der Carotinoid-Gehalt beider Samensorten bestand lediglich aus sehr geringen Mengen an den

Xanthophyllen (all-E)-Lutein und (all-E)-Zeaxanthin, wobei letzteres dominierte. In den Samen

wurden keine Carotine gefunden. Der Gesamtcarotinoid-Gehalt der Waltinger-Samen betrug

158,9 ± 10,8 µg/100 g und war signifikant höher als der der Red-Currant-Samen mit

38,0 ± 4,8 µg/100 g. Letztlich spielten die Carotinoidverbindungen bezüglich der Inhaltsstoffe von

den Tomatensamen nur eine untergeordnete Rolle.

Die flüssigchromatographische Trennung der Tocochromanole ergab, dass γ-Tocopherol mit einem

Anteil von 97-98 % in beiden Samensorten das Hauptvitamer war. Daneben wurden geringe Gehalte

an α-Tocopherol ermittelt. Die Waltinger-Samen wiesen mit 78,5 ± 4,0 µmol/100 g fast doppelt so

hohe Gesamt-Vitamin-E-Gehalte auf wie die Red-Currant-Samen mit 42,5 ± 1,3 µmol/100 g. Die

ermittelten Vitamin-E-Konzentrationen der eigenen Samen waren 72-85 % niedriger als die von

Tomatensaatöl aus publizierten Studien. Zum einen könnte die zweijährige Lagerdauer der Samen

einen Einfluss auf die Tocopherol-Gehalte gehabt haben, zum anderen könnten unterschiedliche

Extraktionsverfahren dafür verantwortlich gewesen sein. Im Vergleich mit den Vitamin-E-Gehalten

anderer kommerzieller Pflanzenöle, wie Oliven- oder Sonnenblumenöl, war der Vitamin-E-Gehalt der

Tomatensaatöle aus der Literatur signifikant höher. Die Red-Currant-Samen wiesen ähnliche

Tocopherol-Konzentrationen wie Leinsamen auf, die Waltinger-Samen waren mit Rapssamen ver-

gleichbar. Tomatensaatöl gilt ohne Zweifel als ausgezeichnete Vitamin-E-Quelle. Außerdem beein-

flusst dieses fettlösliche Vitamin maßgeblich die lipophile antioxidative Kapazität von Pflanzenölen.

ZUSAMMENFASSUNG

44

Aufgrund der Tatsache, dass bis heute kein universell anwendbares Verfahren zur Bestimmung der

antioxidativen Kapazität existiert, wurden hierfür verschiedene Testmethoden verwendet. Allerdings

konnte die antioxidative Kapazität immer nur in Relation zu dem verwendeten Radikal ermittelt wer-

den. Um die hydrophilen und lipophilen antioxidativen Verbindungen in den Samen separat erfassen

zu können, wurden diese nacheinander mit Lösungsmitteln verschiedener Polarität (zunächst mit

70 %igem Ethanol, anschließend mit n-Hexan) extrahiert. Zusätzlich wurde eine Hydrolyse durchge-

führt. Dadurch wurden die freien und gebundenen hydrophilen Antioxidantien separat erfasst. Zur

Bestimmung der hydrophilen antioxidativen Kapazität wurden der Gesamtphenoltest nach Folin-

Ciocalteu, der H-TEAC-III-Test und der H-ORACFl-Test angewandt. Mit Ausnahme des Gesamtphenol-

tests nach FC wurde bei diesen Testmethoden ein deutlicher Verdünnungseffekt festgestellt, dessen

Ursachen allerdings bislang unbekannt sind. Mit zunehmender Probenkonzentration sank die antioxi-

dative Kapazität. Beim Vergleich der beiden Samensorten wiesen die Red-Currant-Samen stets höhe-

re antioxidative Kapazitäten auf, was sortenbedingte Ursachen haben könnte. Literaturwerte lagen

deutlich unterhalb der eigenen Werte. Die Hydrolyse führte bei allen Testvarianten zu einer Frei-

setzung von gebundenen antioxidativen Substanzen. Bei den Gesamtphenolen war der Anteil an ge-

bundenen Verbindungen deutlich höher als der Anteil an freien Substanzen. So war der Gesamtphe-

nolgehalt der freien Verbindungen bei den Waltinger-Samen 167,6 ± 1,7 mg GAE/100 g, bei den Red-

Currant-Samen 204,8 ± 4,7 mg GAE/100 g, der Gehalt der gebundenen Substanzen betrug

entsprechend 203,2 ± 3,4 mg GAE/100 g und 309,4 ± 9,9 mg GAE/100 g. Des Weiteren maß der

ORAC-Test gegenüber dem H-TEAC-Test, wie erwartet, höhere gesamte antioxidative Kapazitäten

(ORAC: W 19,0 - 26,9 mmol TE/100 g, RC 28,8 - 37,7 mmol TE/100 g; H-TEAC: W 2,2 -

2,9 mmol TE/100 g, RC 2,9 - 4,3 mmol TE/100 g). Für beide Samen wurde eine mäßige Korrelation

zwischen dem Gesamtphenolgehalt und der antioxidativen Kapazität festgestellt.

Die lipophile antioxidative Kapazität wurde mittels αTEAC-Test bestimmt, bei dem ebenfalls ein Ver-

dünnungseffekt auftrat. Aufgrund einiger Schwierigkeiten bei der Versuchsdurchführung wiesen die

Ergebnisse hohe Streuungen auf, was eine präzise Auswertung erschwerte. Die lipophilen Extrakte

trugen zu 2-6 % zu der gesamten antioxidativen Kapazität bei, die hydrophilen Extrakte machten den

Hauptanteil aus. γ-Tocopherol trug aufgrund seines hohen Mengenanteils hauptsächlich zur lipophi-

len antioxidativen Kapazität bei. Grundsätzlich enthielten die Tomatensamen antioxidativ wirksame

Substanzen, die zusätzliche positive Effekte auf die aus der Reststoffverwertung gewonnenen

Produkte haben können.

Um das Fettsäuremuster der beiden Tomatensamensorten analysieren zu können, wurden diese

nach einer Mini-Folch-Methode extrahiert. Im Anschluss wurden die Fettsäuren in Form der Methyl-

ester gaschromatographisch bestimmt. Dabei wurde festgestellt, dass beide Samensorten vergleich-

bar waren. Die Gehalte an ungesättigten Fettsäuren waren mit 80 % viermal höher als die der ge-

sättigten Fettsäuren mit 20 %. Dabei wurde ein Anteil von 19,2 % einfach ungesättigten Fettsäuren

für die Waltinger-Samen im Gegensatz zu 20,8 % für die Red-Currant-Samen bestimmt. Letztere

besaßen dafür einen geringfügig niedrigeren Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Die domi-

nierende Fettsäure war Linolsäure mit 57-59 %, gefolgt von Ölsäure mit 18-20 %. α-Linolensäure war

die einzige ω-3-Fettsäure, die im Öl der Tomatensamen enthalten war. Palmitinsäure war die domi-

nierende gesättigte Fettsäure mit einem Anteil von 13 %, gefolgt von Stearinsäure mit 4-5 %. Das

extrahierte Öl war in seinem Fettsäuremuster Sojaöl sehr ähnlich. Aufgrund des hohen Gehaltes an

ungesättigten Fettsäuren und speziell der essentiellen Linolsäure eignet sich das Öl der Tomaten-

samen als pflanzliches Speiseöl. Die Verwertung der Samen zur Herstellung von Öl kann ein bedeu-

tender Beitrag zur Reduktion des Abfallentsorgungsproblems sein.

SUMMARY

45

7 SUMMARY

Tomatoes are the German’s favorite vegetable. The majority of tomatoes are consumed in form of

processed products like tomato pulp, sauce, juice or ketchup. Based on epidemiological studies there

is a positive link between higher dietary intake of tomatoes or tomato products and lower risk of

various types of cancer like prostate, lung or stomach cancer and cardiovascular diseases. The

increasing demand for those products resulted in a huge development of tomato processing

industries. But this is associated with economical, technical and ecological problems. Processing

operations generate huge amounts of waste, which have to be disposed or utilized. Main component

of tomato pomace are the seeds which could be the basic material for new products. For that reason

there is an increased interest in the chemical composition of the seeds and especially their bioactive

substances. Therefore, the aims of the present study were determination and evaluation of

carotenoid and vitamin E contents of tomato seeds, determination of the antioxidant capacity using

various assays and thereby the assessment of proportion of free und bound water-soluble and fat-

soluble antioxidants. Additionally, the fatty acid composition of tomato seeds were to be identified.

Seeds of two different tomato varieties were examined: Waltingers Cocktail and Red Currant. The

latter is a wild tomato variety.

Liquid chromatographic analysis of carotenoid and vitamin E contents followed a combined

extraction method with methanol/tetrahydrofuran. Carotenoid contents, determined in both seeds,

were composed of very little amounts of (all-E)-lutein and (all-E)-zeaxanthin, of which the latter

dominated. Total carotenoid content of Waltinger seeds was 158.9 ± 10.8 µg/100 g and therefore

significantly higher than the carotenoid content of Red Currant seeds with 38.0 ± 4.8 µg/100 g. In the

end, carotenoids played just a minor role concerning chemical constituents of tomato seeds.

Relating to vitamin E γ-tocopherol was the main vitamer in the seeds with a percentage of 97-98%.

Significantly lower amounts of α-tocopherol were found. Total vitamin E content of Waltinger seeds

(78.5 ± 4.0 µmol/100 g) was nearly twice as high as that of Red Currant seeds

(42.5 ± 1.3 µmol/100 g). Compared to tomato seed oil from published studies, the vitamin E contents

of the two seeds were 72-85% lower. One reason could be the duration of storage of the seeds for

two years, another reason could be the use of different extraction methods. Vitamin E contents of

tomato seed oils from the literature were significantly higher than those of other commercial plant

oils like olive oil or sunflower oil. Red Currant seeds had tocopherol contents similar to flaxseeds,

Waltinger seeds were comparable to rape seeds. Finally, tomato seed oil is considered to be an

excellent source of vitamin E and this lipid-soluble vitamin contributes essentially to the antioxidant

capacity of plant oils.

Until today there is no standardized method to determine the antioxidant capacity in foods. That’s

why several assays were used, but the measured antioxidant capacity could only be seen in relation

to the applied radicals. To investigate hydrophilic and lipophilic antioxidant capacity of the seeds

separately they were extracted consecutively with solvents of different polarities (starting with

ethanol (70 %), then using hexane). Additionally, a hydrolysis was performed to liberate bound

substances. Total phenolic assay, H-TEAC-III assay and H-ORACFl assay were used to determine

hydrophilic antioxidant capacity. Except for total phenolic assay an influence of the sample

concentration on the antioxidant capacity was observed. There was a decrease of the antioxidant

capacity with increasing sample concentration. The reasons for this effect are unknown up to now.

Comparing both seed varieties Red Currant seeds showed higher antioxidant capacities. Data from

SUMMARY

46

the literature were notably below the own data. Within all assays, hydrolysis led to a release of

bound antioxidants. Within total phenolics, the amount of bound compounds

(W 203.2 ± 3.4 mg GAE/100 g, RC 309.4 ± 9.9 mg GAE/100 g) was significantly higher than the

amount of free compounds (W 167.6 ± 1.7 mg GAE/100 g, RC 204.8 ± 4.7 mg GAE/100 g). As expec-

ted, the ORAC assay measured higher antioxidant capacities compared to the H-TEAC assay (H-TEAC:

W 2.2 – 2.9 mmol TE/100 g, RC 2.9 – 4.3 mmol TE/100 g; ORAC: W 19.0 – 26.9 mmol TE/100 g, RC

28.8 – 37.7 mmol TE/100 g). Furthermore, there was just a sligth correlation between total phenolics

and antioxidant capacity. Within lipophilic αTEAC assay, an influence of the sample concentration on

the antioxidant capacity was observed as well. Due to some problems within the test execution

results showed high standard deviations that aggravated a precise evaluation. But it became clear,

that lipophilic extracts contributed just slightly (2-6%) to the total antioxidant capacity compared to

hydrophilic extracts.

For analysis of the fatty acid composition the seeds were extracted on the basis of a mini Folch

method. Subsequently, the fatty acids were determined by gas chromatography of the fatty acid

methyl esters. The results for both seeds were comparable. Total unsaturated fatty acids were 80%

and with that four times higher than saturated fatty acids with 20%. The content of mono-

unsaturated fatty acids of the Waltinger seeds was 19.2%, that of the Red Currant seeds 20.8%. The

latter had a slightly lower percentage of polyunsaturated fatty acids. The major fatty acid was linoleic

acid with 57-59%, followed by oleic acid with 18-20%. α-Linolenic acid was the single ω-3 fatty acid.

Palmitic acid was found to be the dominant saturated fatty acid with 13%, followed by stearic acid

with 4-5%. Concerning the fatty acid profile the extracted oil from the tomato seeds was quite similar

to soybean oil. Because of the high amount of unsaturated fatty acids and especially because of the

essential linolenic acid, tomato seed oil is suitable as edible oil. Finally, the utilization of the seeds for

oil production can lead to a reduction of the waste management problem.

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ANHANG A: GERÄTE UND CHEMIKALIEN

VII


A.1 Verzeichnis der verwendeten Geräte

Allgemeine Laborgeräte

Analysenwaage AE 160 (Mettler, Gießen)

Analysenwaage AC 211 S (Sartorius, Göttingen)

Apparatur zur Probenaufkonzentrierung Dri-Block DB 3A (Techne, Staffordshire)

Apparatur zur Probenaufkonzentrierung (Jüke Systemtechnik, Altenberge)

pH-Meter CG 840 (Schott, Hofheim)

Reagenzglasschüttler IKA Vibrax VXR (IKA Labortechnik, Staufen)

Reagenzglasschüttler MS1 Minishaker (IKA Labortechnik, Staufen

Reagenzglasschüttler Vortex Genie 2 (Scientific Industries, Bohemia, NY, USA)

Rotationsverdampfer Rotavapor R-124 und Wasserbad B-480 (Büchi, Flavil, Schweiz) mit Membran-

vakuumpumpe MZ-2C (Vacuubrand, Wertheim)

Ultraschallbad Sonorex RK 100 (Bandelin, Berlin)

Ultra-Turrax T25 mit Dispergierstab S25KV-18G (IKA Labortechnik, Staufen)

Ultra-Turrax T 25 mit Dispergierstäben S25N-8G und S25N-10G (IKA Labortechnik, Staufen)

Wasserbad Sub 14 (Grant Instruments, Cambridge)

Zentrifuge Multifuge X1 (Thermo Fisher Scientific, Heraeus, Osterode)

Zentrifuge Rotina 46 (Hettich, Tuttlingen)

Zentrifuge 5702 R (Eppendorf, Hamburg)

Zentrifuge 5425 (Eppendorf, Hamburg)

Analytische HPLC - Carotinoide

HPLC-Bedingungen:

Säule: C30-Analysensäule; 250 x 4,6 mm; 5 µm mobile Phase: Gradient von MeOH (A) und MtBE (B) Säulentemperatur: 13 ± 1 °C Flussrate: 1,0 ml/min Injektionsvolumen: 50 µl Laufzeit: 75 min Detektor: Photodiodenarray; 450 nm

Merck-Hitachi, Darmstadt Jasco, Gross-Umstadt

Autosampler: L-7200

Pumpe: L-7100

Entgaser: L-7614

PDA-Detektor: L-7450

Interface: D-7000

Säulen-Thermostat: Jetstream plus

Software: D-7000 HPLC System Manager


VIII

Gradient:

Trennsäule: C30-Develosil RPAQUEOUS; 250 x 4,6 mm; 5 μm (Phenomenex, Aschaffenburg)

Vorsäule: C18 Security Guard4 x 3,0 mm (Phenomenex, Aschaffenburg)

Analytische HPLC - Vitamin E

HPLC-Bedingungen:

Säule: Eurospher 100 DIOL; 250 x 4,0 mm; 7 µm mobile Phase: n-Hexan/MtBE (98/2, v/m), isokratisch Säulentemperatur: 35 ± 1 °C Flussrate: 1,5 ml/min Injektionsvolumen: 20 µl Laufzeit: 45 min Detektor: Fluoreszenz-Detektor

Anregung: 292 nm; Emission: 330 nm

Trennsäule: Knauer Eurospher-100 DIOL; 250 × 4,0 mm; 7 μm (Knauer, Berlin)

Vorsäule: Knauer Eurospher-100 DIOL; 5 × 4,0 mm; 7 μm (Knauer, Berlin)

Antioxidative Tests

Mikrotiterplattenphotometer Fluostar Optima (BMG Labtech, Offenburg) Software: Optima Spektralphotometer V-530 (Jasco, Groß-Umstadt) Software: Spectra Manager

Zeit (min) A (%)

MeOH B (%) MtBE

0 90 10

40 50 50

42 40 60

60 40 50

70 90 10

75 90 10

Merck, Darmstadt

Autosampler: AS-2000A

Pumpe: L-6200A

Fluoreszenz-Detektor: F-1080

Interface: D-6000

Säulen-Thermostat: L-5025

Software: D-7000 HPLC System Manager


IX

Analytische GC - Fettsäuren

Chromatographieparameter von GC3 und GC4:

GC3 GC4

Gerät: SHIMADZU GC 17 A SHIMADZU 2010

Autosampler: AOC 5000, SHIMADZU AOC 5000, SHIMADZU

Software: GC Lab Solution GC Lab Solution

Säule: Durabond 225MS CP Select

Länge: 60 m 200 m

Innendurchmesser: 0,25 mm 0,25 mm

Filmdicke: 0,25 µm 0,25 µm

Trägergas: Helium Helium

vlin: 42,3 cm/s 35,2 cm/s

Brennergas: Wasserstoff, Luft Wasserstoff, Luft

Injektortemperatur: 260 °C 260 °C

Injektionsvolumen: 1,0 µl 1,0 µl

Injektionsmodus: Split Split

Split Ratio: 1:100 1:100

Detektor: FID FID

Detektortemperatur: 270 °C 270 °C

Programmdauer: 70 min 83 min

Temperaturprogramm - GC 3:

Druckprogramm - GC 3:

Temperaturprogramm - GC 4:

isotherm 176 °C

Druck - GC 4: isobar 495,1 kPa

Rate (°C/min) Temp. (°C) Hold Time (min)

- 70 2,0

10 180 0,0

2,0 220 5,0

2,0 230 27,0

Rate (kPa/min) Pressure (kPa) Hold Time (min)

- 136 2,0

10 166 0,0

0,5 176 5,0

0,5 178 27,0

Rate (°C/min) Temp. (°C) Hold Time (min)

- 171 60

25 250 20


X

A.2 Verzeichnis der verwendeten Arbeitsmittel

Pasteurpipetten (kurz, lang) Kolbenhubpipetten

Research (variable) 10-100 µl, 20-200 µl, 30-300 µl (Mehrkanal) (Eppendorf, Hamburg) Reference (variable) 100-1000 µl (Eppendorf, Hamburg)

Multipette plus (Eppendorf, Hamburg) Nichipet EX 1000-5000 µl (Nichiryo, Tokyo, Japan)

Carotinoid- und Vitamin-E-Analytik

Braunglas-Rundkolben (250 ml) Braunglas-Spitzkolben (50 ml) Braunglas-V-Vials Büchnertrichter Erlenmeyerkolben (50 ml) Quarzküvetten, 1 cm Schichtdicke (zur Konzentrationsbestimmung der Standards) (Suprasil QS,

Hellma Analytics, Müllheim) Maßkolben (5 ml) Reaktionsgefäße (1,5 ml) Rundfilter Nr. 390 (Munktell, Bärenstein) Vakuum-Saugflasche

Antioxidative Tests

Maßkolben (1 ml, 2 ml, 10 ml, 20 ml, 100 ml) Reaktionsgefäße (1,5 ml) Plastikschalen (100 ml) (Labcor Products)

Extraktion und Hydrolyse

Einmalspritzen Injekt® Luer Solo 2 ml (B. Braun, Melsungen) Glasperlen Maßkolben (5 ml) Membranfilter Phenex RC 0,2 µm, 15 mm Syringe Filters, non-sterile, PP-Housing, Luer/Slip

(Phenomenex, Aschaffenburg) Plastik-Zentrifugenröhrchen (15 ml)

a) Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu

Makroküvetten (2,5 ml)

b) H-TEAC-III-Test

Halbmikroküvetten (1,5 ml)

c) H-ORACFl-Test

96-Well-Mikrotiterplatten


XI

d) αTEAC-Test

Faltenfilter MN 615 ¼ (Macherey-Nagel, Düren) Rundfilter Nr. 390 (Munktell, Bärenstein) Vakuum-Saugflasche Halbmikroküvetten (1,5 ml)

Fettextraktion nach FOLCH und Methylierung

Pyrexröhrchen (15 ml) Schliffröhrchen (10 ml) Mikro-Weißglas-Vials mit 150 µl Insert


DC-Kammer DC-Kieselgelplatte 60 F254 (Merck, Darmstadt) UV-Gerät Typ HT (Helios Apparatebau, Jena)

A.3 Verzeichnis der verwendeten Chemikalien und Lösungen

Chloroform Ethanol Methanol Methyl-tert-Butyl-Ether (MtBE) n-Hexan Tetrahydrofuran HPLC-Wasser (Reinstwasser, 18 MΩ): MilliQ Synthesis A 10 (Millipore, Molsheim) Stickstoff

Carotinoid- und Vitamin-E-Analytik

Standardsubstanzen:

Carotinoide: CaroteNature (Lupsingen, Schweiz) β-apo-8‘-Carotinal: CaroteNature (Lupsingen, Schweiz) Tocopherole: Calbiochem (Darmstadt) Tocotrienole: Davos Life Science (Singapur) α-Tocopherolacetat: Sigma-Aldrich (Taufkirchen)

- Stammlösungen 50-100 μg/ml MeOH (Xanthophylle) bzw. Cyclohexan/Toluol (4/1, v/v)(Carotine), Stammlösung β-apo-8‘-Carotinal 16 mg/50 ml Cyclohexan/Toluol, Lagerung bei - 25 °C - Stammlösungen T und T3 ca. 1 mg/ml Ethanol, Stammlösung α-TAC ca. 5 mg/ml, Lagerung bei - 25 °C

Butylhydroxytoluol (BHT; 2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol) (Sigma-Aldrich)

Magnesiumhydroxidcarbonat (Sigma-Aldrich)

Methanol/Tetrahydrofuran (1/1, v/v, + 0,1 % BHT)

Natriumsulfat, entwässert (Acros)


XII

Antioxidative Tests

Extraktion und Hydrolyse

Ethanol (70 %) meta-Phosphorsäure (0,75 mol/l) Natriumhydroxid-Lösung (2,0 mol/l in 75 % MeOH) n-Hexan Salzsäure (1,0 mol/l)

a) Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu

Natriumcarbonat-Lösung

- 50,625 g Natriumcarbonat-Decahydrat (Na2CO3 · 10 H2O, Merck) oder 18,763 g Natriumcarbonat

(wasserfrei, Roth) in 250 ml HPLC-Wasser lösen

Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagenz

- Folin-Ciocalteu-Reagenz (Fluka) 1:10 mit HPLC-Wasser verdünnen (Volumen von Probenanzahl

abhängig)

- bei jeder Analyse frisch herstellen

2 mM (340,24 mg/l) Gallussäure-Stammlösung für Kalibrierung

- 37,63 mg Gallussäure · H2O (Fluka) in 100 ml HPLC-Wasser lösen

- je 1,25 ml der Stammlösung in 1,5 ml-Tubes füllen und bei - 25 °C einlagern

b) H-TEAC-III-Test

75 mM Phosphatpuffer (pH 7,4)

- 218 mg Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4, wasserfrei, Merck) oder 221 mg Natriumdihydrogen-

phosphat-Monohydrat (NaH2PO4 · H2O, Merck), 1,494 g Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 · 2 H2O, Fluka) und 8,766 g Natriumchlorid (Acros) in 1 l HPLC-Wasser lösen, auf pH ~ 7,4

einstellen

- im Kühlschrank aufbewahren

7 mM ABTS-Stammlösung

- 38,4 mg ABTS (Sigma-Aldrich) in 10 ml HPLC-Wasser lösen

2,45 mM Kaliumperoxodisulfat-Lösung

- 6,62 mg Kaliumperoxodisulfat (Fluka) in 10 ml HPLC-Wasser lösen

ABTS•+

-Arbeitslösung I

- 10 ml ABTS-Stammlösung mit 10 ml Kaliumperoxodisulfat-Lösung in einem Becherglas mischen,

Lösung bei RT in dunkler Flasche aufbewahren, ABTS•+ hat sich nach 24 h vollständig gebildet - im Kühlschrank aufbewahren

ABTS•+

-Arbeitslösung II

- ABTS•+-Arbeitslösung I mit Phosphatpuffer verdünnen bis E734 ≅ 0,70 ± 0,05 (in Küvette testen)

- ca. 2 h bei RT stehen lassen (in dunkler Flasche)

- zu Testbeginn nochmals Extinktion prüfen


2,5 mM Trolox-Stammlösung zur Kalibrierung

- 12,5 mg Trolox (Sigma-Aldrich) in 20 ml HPLC-Wasser lösen


- für Verdünnungsreihe Stammlösung 1:10 verdünnen, bei jeder Analyse frisch herstellen


XIII

c) H-ORACFl-Test 75 mM Phosphatpuffer (pH 7,4)

- siehe H-TEAC III

0,12 mM Fluoreszein-Arbeitslösung I

- 10 mg Fluoreszein (Riedel-de-Haën) in 250 ml Phosphatpuffer lösen - im Kühlschrank aufbewahre

1,2 µm Fluoreszein-Arbeitslösung II

- Fluoreszein-Arbeitslösung I 1:100 mit Phosphatpuffer verdünnen


129 mM AAPH-Stammlösung

- 705 mg AAPH (Acros) in 20 ml Phosphatpuffer lösen

- bei jeder Analyse frisch herstellen, im Kühlschrank aufbewahren

2,5 mM Trolox-Stammlösung zur Kalibrierung

- 12,5 mg Trolox in 20 ml HPLC-Wasser lösen


d) αTEAC-Test 75 mM Phosphatpuffer (pH 7,4)

- siehe H-TEAC III

ABTS-Stammlösung

- eine gute Spatelspitze ABTS in einigen ml Phosphatpuffer lösen

ABTS•+

-Arbeitslösung I

- einen Löffel Mangandioxid (Merck) in einen Faltenfilter geben, einige ml Phosphatpuffer

durchlaufen lassen und Puffer verwerfen

- ABTS-Stammlösung darüber laufen lassen und mit einigen ml Puffer nachwaschen (dabei bildet sich

grünes ABTS•+)

- Lösung Membran-filtrieren - mehrere Wochen haltbar

ABTS•+

-Arbeitslösung II

- ABTS•+-Arbeitslösung I mit Phosphatpuffer verdünnen bis E734 ≅ 0,70 ± 0,05 (in Küvette testen)

- ca. 2 h bei RT stehen lassen (in dunkler Flasche)

- zu Testbeginn nochmals Extinktion prüfen


α-Tocopherol-Stammlösung zur Kalibrierung

- 200 µl Stammlösung in 2 ml-Maßkolben pipettieren und unter Stickstoffstrom abblasen

- Kolben mit n-Hexan bis zur Marke auffüllen, schütteln

Fettextraktion nach FOLCH

Chloroform

Glaswolle

n-Hexan

Methanol

Natriumchlorid-Lösung 2 %ig Natriumsulfat wasserfrei


XIV

Methylierung nach Natriummethylat-Methode

n-Hexan

Natrium-Methylat (Acros organics)

Natrium-Hydrogensulfat-Monohydrat kristallin (Merck, Darmstadt)

Dünnschichtchromatografie

Laufmittel:

- n-Hexan/Diethylether/Eisessig (85/15/0,2, v/v/v)

Sprühreagenz:

- 2’,7’-Dichlorfluoreszein (Fluka,Buchs, Schweiz); 0,2 % in Ethanol

Mischstandard(PhL, Chol, FFs, TAG, FAME, CE):

- 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphatidylcholine (Larodon fine chemicals)

- Cholesterin (Sigma-Aldrich, Taufkirchen)

- Magaric acid (C17), 99 % (Sigma- Aldrich, Taufkirchen) - Tripalmitin, ca 90 % (Sigma- Aldrich, Taufkirchen)

- Palmitinsäuremethylester, 99 % (Sigma- Aldrich, Taufkirchen)

- Cholesterylpalmitat, 91 % (Sigma- Aldrich, Taufkirchen)

- Stammlösung: Standardgemisch mit 60 mg/ml in Chloroform, Lagerung im Kühlschrank

GC-Analyse

FAME-Mix Referenzstandards mit 99,99 % Reinheit:

- No. 463, 674 (NU-CHE PREP, INC., Elysian, U.S.)

- BR2, BR4, ME 93 (Larodan, Malmö, Sweden)

- Alpenmilch

ANHANG B: METHODEN

XV

ANHANG B: METHODEN

B.1 Bestimmung des Carotinoid- und Vitamin-E-Gehaltes

Kombinierte Extraktion von Carotinoiden und Vitamin E:

Jeweils 300 mg der gemahlenen Probensubstanz wurden in einer Dreifachbestimmung in 50-ml-Erlen-

meyerkolben mit Schliff eingewogen. Anschließend wurden zu jeder Probe 5 ml HPLC-Wasser gegeben,

gründlich gemischt und 5 min quellen gelassen. Dann wurden 200 mg Magnesiumhydroxidcarbonat,

200 mg Natriumsulfat, jeweils 100 µl der internen Standards (β-apo-8‘-Carotinal und α-Tocopherol-

acetat) sowie 40 ml MeOH/THF (1/1, v/v, + 0,1 % BHT) zugegeben. Natriumsulfat sollte das Wasser

binden und damit aus der Probe entfernen. Magnesiumhydroxidcarbonat hatte Pufferfunktion. Diese

Probenlösung wurde 5 min am Ultra-Turrax im Eisbad extrahiert. Der Überstand wurde über einen

Büchnertrichter durch einen Filter Nr. 390 unter Vakuum filtriert. Die Extraktion des Rückstandes mit ca.

40 ml Lösungsmittel und anschließender Filtration wurden zweimal wiederholt. Die vereinigten Filtrate

wurden in einen 250-ml-Braunglas-Rundkolben überführt und im Rotationsverdampfer unter reduzier-

tem Druck bei 30-35 °C bis auf ca. 10 ml eingeengt. Diese Lösung wurde in braune 50-ml-Spitzkolben

überführt und bis zur Trockne eingedampft. Am Ende des Einengens wurde 1 ml Ethanol in den Spitz-

kolben gegeben, um eventuell noch vorhandenes Wasser aus dem Extrakt zu entfernen und um den

Siedepunkt herabzusetzen. Der Rückstand wurde anschließend mehrere Male mit wenig Ethanol im

Ultraschallbad gelöst, in einen 5-ml-Maßkolben überführt und mit Ethanol auf 5 ml aufgefüllt. Diese

Lösung wurde in Zentrifugengläser umgefüllt und 5 min mit 4 400 U/min zentrifugiert. Für die

Carotinoid-Analyse wurde von dem Überstand 1 ml in Reaktionsgefäße abgefüllt und nochmals 2 min

mit 14 000 U/min zentrifugiert. Dieser Überstand wurde in Braunglas-Vials gefüllt. Für die Vitamin-E-

Analyse wurden von dem obigen Überstand aus den Zentrifugengläsern 200 µl in Reaktionsgefäße

abgefüllt. Das Lösungsmittel wurde mit Stickstoff abgeblasen und der Rückstand in 800 µl

n-Hexan/Methyl-tert-Butylether (MtBE) (98/2, v/m) im Ultraschallbad gelöst. Dieser Extrakt wurde

ebenfalls 2 min mit 14 000 U/min zentrifugiert und der Überstand in Braunglas-Vials gefüllt.

B.2 Bestimmung der antioxidativen Kapazität

Extraktionsmethoden zur Gewinnung von hydrophilen und lipophilen Extrakten:

a) Extraktion mit 70 %igem Ethanol

Es wurden in einer Dreifachbestimmung 75 mg der Samensubstanz in 15 ml-Falcontubes eingewogen

und etwa 8 Glasperlen sowie 1 ml 70 %iger Ethanol dazugegeben. Das Falcontube wurde daraufhin in-

tensiv geschüttelt und kurz ins Ultraschallbad getaucht. Es schloss sich eine Zentrifugation (4 400 U/min,

5 min) an. Der entstandene Überstand wurde mit einer Pasteurpipette abgenommen und in ein 5 ml-

Maßkolben überführt. Diese Extraktionsschritte wurden zweimal wiederholt. Am Ende wurde der Maß-

kolben mit 70 %iger Ethanol bis zur Marke aufgefüllt und nochmals geschüttelt. Diese hydrophile Lösung

wurde bei - 30 °C eingefroren und am nächsten Tag für die entsprechenden antioxidativen Tests

(H-ORACFl, H-TEAC, Gesamtphenoltest nach FC) verwendet.

ANHANG B: METHODEN

XVI

b) Hydrolyse und Extraktion mit 70 %igem Ethanol

Der Rückstand der 1. Extraktion wurde hydrolysiert, indem zunächst 0,5 ml Salzsäure (1,0 mol/l) in das

Falcontube zugegeben und 30 s geschüttelt wurde. Diese Lösung wurde für 30 min bei 37 °C im Wasser-

bad inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 0,5 ml Natriumhydroxid-Lösung (2,0 mol/l in 75 %

MeOH). Auch diese Lösung wurde 30 s geschüttelt und für 30 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert.

Anschließend wurde sie 30 s geschüttelt, mit 0,5 ml meta-Phosphorsäure (0,75 mol/l) versetzt,

nochmals 30 s geschüttelt und zentrifugiert (5 000 U/min, 5 min). Der Überstand wurde in einen 5 ml-

Maßkolben überführt, der Rückstand mit 0,5 ml 70 %igem Ethanol vermischt und zentrifugiert

(4 400 U/min, 5 min). Diese Extraktion wurde zweimal wiederholt. Letztendlich wurde der Maßkolben

mit 70 %igem Ethanol bis zur Marke aufgefüllt und nochmals geschüttelt. Diese hydrolysierte,

hydrophile Lösung wurde bei - 30 °C eingefroren und am nächsten Tag für die entsprechenden

antioxidativen Tests (H-ORACFl, H-TEAC, Gesamtphenoltest nach FC) verwendet.

c) Extraktion mit n-Hexan

Der erhaltene Rückstand der 2. Extraktion wurde vollständig getrocknet, indem er ein bis zwei Tage

untern dem Abzug an der Luft trocknete und mit Stickstoff abgeblasen wurde. Zu dem vollständig

trockenen Rückstand wurde 1 ml n-Hexan gegeben, geschüttelt und zentrifugiert (4 400 U/min, 5 min)

an. Der entstandene Überstand wurde mit einer Pasteurpipette abgenommen und in ein 5 ml-Maßkol-

ben überführt. Diese Extraktionsschritte wurden zweimal wiederholt. Am Ende wurde der Maßkolben

mit n-Hexan bis zur Marke aufgefüllt und nochmals geschüttelt. Dieser lipophile Extrakt wurde sogleich

für den entsprechenden antioxidativen Test (αTEAC) verwendet.

Gesamtphenoltest nach Folin-Ciocalteu:

Der Gesamtphenoltest wurde in Makroküvetten umgesetzt, in die jeweils 300 µl Probe, 1 500 µl Folin-

Ciocalteu-Phenol-Reagenz (1:10 mit HPLC-Wasser verdünnt) und 1 200 µl Natriumcarbonat-Lösung

gegeben wurden. Die Küvetten wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen gelassen.

Anschließend wurde deren Extinktion gegen Luft bei 750 nm gemessen. Mit Wasser (als Blindwert) und

den 5 Gallussäure-Kalibrierstandards wurde in derselben Weise verfahren. Zur Kalibrierung wurde aus

einer 2 mM Gallussäure-Stammlösung folgende Verdünnungsreihe erstellt:

Verdünnung Gallussäure-Konzentration

[mg/l] [µM]

1:40 8,51 50

1:20 17,01 100

1:10 34,02 200 1:5 68,05 400

1:4 85,06 500

Für die Bestimmung der Gesamtphenolkonzentrationen wurden die Blindwertabsorptionen von den

Standard- und Probenabsorptionen subtrahiert. Anhand der Gallussäure-Standardreihe wurden die die

Gesamtphenolmengen für die Proben berechnet. Die Angabe der Ergebnisse erfolgt als Gallussäure-

Äquivalente (GAE) in mg/100 g Probe.

ANHANG B: METHODEN

XVII

H-TEAC-Test:

Der H-TEAC-Test wurde in Halbmikroküvetten durchgeführt. Um das stabile Radikalkation ABTS•+ zu

erzeugen, wurden 10 ml einer 7 mM ABTS-Stammlösung mit 10 ml einer 2,45 mM Kaliumperoxodisulfat-

Lösung vermischt. Diese Lösung wurde bei Raumtemperatur in einer dunklen Flasche aufbewahrt.

Innerhalb von 24 h kam es zur vollständigen Bildung des ABTS-Radikals [145]. Das Radikal ist in dieser

Form für mehr als zwei Tage stabil, wenn es im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert wird [69]. Diese

sogenannte ABTS•+-Arbeitslösung I wurde anschließend im Kühlschrank aufbewahrt. Die ABTS•+-

Arbeitslösung II wurde für den Gebrauch täglich frisch hergestellt. Dafür wurde die Arbeitslösung I mit

Phosphatpuffer (75 mM, pH 7,4) verdünnt, bis eine Absorption von 0,7 ± 0,05 bei 730 nm erreicht war.

Diese Lösung wurde ca. 2 h bei Raumtemperatur in einer dunklen Flasche stehen gelassen und vor

Testbeginn nochmals auf ihre korrekte Extinktion überprüft. Für die Messung wurden 100 µl jeder Probe

in ein 1,5-ml-Tube pipettiert. Anschließend wurden 1000 µl ABTS•+-Arbeitslösung II zugegeben und der

Zeitmesser gestartet. Das Tube wurde kurz geschüttelt und die Lösung vollständig in Halbmikroküvetten

überführt. Nach insgesamt 2 min wurde die Extinktion bei 734 nm gemessen. In derselben Art und

Weise wurden Wasser (als Blindwert) und jeder Trolox-Kalibrierstandard gemessen. Zur Kalibrierung

wurde eine 2,5 mM Trolox-Stammlösung zunächst 1:10 mit HPLC-Wasser verdünnt und daraus folgende

Verdünnungsreihe erstellt:

Verdünnung Trolox-Konzentration (µM)

1:20 12,5

1:10 25

1:5 50

1:2 125

1:1 250

Für die Auswertung wurden zunächst die Standard- und Probenabsorptionen von den Blindwertabsorp-

tionen subtrahiert. Anhand der Trolox-Standardreihe wurden die TEAC-Werte für die Proben berechnet.

Die Angabe der TEAC-Werte der Proben erfolgt als Trolox-Äquivalente (TE) in µmol/100 g Probe.

H-ORACFl-Test:

Der ORAC-Test wurde auf einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt. Fluoreszein, welches in Phos-

phatpuffer (75 mM, pH 7,4) gelöst wurde, diente als fluoreszierender Indikatorfarbstoff. Eine 1,2 µM

Fluoreszein-Arbeitslösung II wurde für die Analysen stets frisch aus einer 120 µM Arbeitslösung I, die im

Kühlschrank aufbewahrt wurde, hergestellt. Im BMG FluoStar Optima wurden Fluoreszenzfilter mit einer

Wellenlänge von 490 nm (Anregung) und 520 nm (Emission) verwendet. Zunächst wurden jeweils 10 µl

Wasser (als Blindwert und Negativkontrolle), 10 µl jedes Trolox-Kalibrierstandards und 10 µl jeder Probe

in je vier Wells pipettiert. Anschließend wurden 25 µl Fluoreszein-Arbeitslösung II und 100 µl 75 mM

Phosphatpuffer (pH 7,4) zugegeben, sodass alle Reaktionen in dem Phosphatpuffer abliefen. Die Mikro-

titerplatte wurde für 10 min im Plattenlesegerät auf 37 °C temperiert. Durch die Zugabe von 150 µL

frisch hergestellter und eisgekühlter 129 mM AAPH-Stammlösung wurde die Reaktion gestartet. Die

Fluoreszenzintensität wurde jede Minute für 4 h bei 37 °C gemessen. Zur Kontrolle der Photostabilität

des Fluoreszeins wurden 2 Wells (Negativkontrolle) mit 150 µl Phosphatpuffer anstatt AAPH-Stamm-

lösung befüllt. Aus einer 2,5 mM Trolox-Stammlösung wurde folgende Verdünnungsreihe erstellt:

ANHANG B: METHODEN

XVIII

Verdünnung Trolox-Konzentration (µM)

1:25 0,1

1:5 0,5

1:2,5 1,0

1:1,5 1,5

1:1,25 2,0

Zur Berechnung der ORAC-Werte wurde zunächst die relative Fluoreszenz nach jeder Minute bestimmt.

Dabei wurde die Fluoreszenzintensität der Probe, der Standards und des Blindwertes durch die

Fluoreszenzintensität des Mittelwertes der Negativkontrolle dividiert. Im Anschluss wurde die Area

Under the Curve (AUC) der Proben, der Standards und des Blindwertes nach folgender Formel berech-

net:

AUC = 1 + �f1+ f2+ f3+ …. + fi

f0 (10)

Dabei entspricht f0 der relativen Fluoreszenz bei 0 min und fi der relativen Fluoreszenz bei dem Zeitpunkt

i. Daraus wurde die Netto-AUC berechnet, indem die AUC des Blindwertes von der AUC der jeweiligen

Probe bzw. des Standards abgezogen wurde.

AUCnet = AUCProbe/Standard - AUCBW (11)

Die Netto-AUC wurde gegen die Trolox-Konzentrationen aufgetragen und eine quadratische Regression

durchgeführt. Anhand dieser Trolox-Regression wurden die ORAC-Werte für die Proben errechnet und

als Trolox-Äquivalente (TE) in mmol/100 g Probe angegeben.

αTEAC-Test:

Für den αTEAC-Test wurde zunächst eine gute Spatelspitze ABTS in einigen ml Phosphatpuffer (75 mM,

pH 7,4) gelöst. Diese Stammlösung wurde über ein Filterpapier, auf dem sich ein Löffel Mangandioxid

befand, laufen gelassen und mit einigen ml Phosphatpuffer nachgewaschen. Dabei bildete sich das

grüne ABTS•+. Im Anschluss wurde diese sogenannte ABTS•+-Arbeitslösung I über einen Büchnertrichter

durch einen Filter Nr. 390 unter Vakuum filtriert. Für die ABTS•+-Arbeitslösung II, die für den Versuch

stets frisch hergestellt wurde, wurde die Arbeitslösung I mit Phosphatpuffer verdünnt bis eine Absorp-

tion von 0,7 ± 0,05 bei 730 nm erreicht war. Diese Lösung wurde ca. 2 h bei Raumtemperatur in einer

dunklen Flasche stehen gelassen und vor Testbeginn nochmals auf ihre korrekte Extinktion überprüft.

Für die Kalibrierung wurde eine α-Tocopherol-Stammlösung in einen 2-ml-Maßkolben pipettiert und

unter Stickstoffstrom abgeblasen. Anschließend wurde der Kolben mit n-Hexan bis zur Marke aufgefüllt

und geschüttelt. Von dieser Lösung wurde zur Erstellung einer Kalibriergerade eine Verdünnungsreihe

wie folgt hergestellt:

Verdünnung α-Tocopherol -Konzentration (µM)

1:100 2,42

1:50 4,85

1:25 9,70

1:10 24,24

1:5 48,48

ANHANG B: METHODEN

XIX

Die photometrische Konzentrationsbestimmung der α-Tocopherol-Stammlösung wurde an dem

entsprechenden Versuchstag durchgeführt. Die Extinktionsmessung erfolgte in Mikro-Quarzküvetten bei

dem Absorptionsmaximum λmax von 292 nm. Mit Hilfe des spezifischen Extinktionskoeffizienten

(E1%,1cm = 75,8) von α-Tocopherol wurde die Konzentration nach folgender Formel berechnet:

c [g/100 ml] = E

E1cm1% · VF (5)

VF: Verdünnungsfaktor

Für die Messungen wurden je 100 µl Probe, Blindwert (n-Hexan) bzw. α-Tocopherol-Standard in ein

Tube pipettiert, anschließend 1 000 µl der ABTS•+-Arbeitslösung II zugegeben und der Zeitmesser gestar-

tet. Das Tube wurde 30 s geschüttelt, dessen Inhalt in eine Halbmikroküvette überführt und diese 30 s

mit 1 200 U/min zur Trennung der Phasen zentrifugiert. Nach insgesamt 2 min wurde die Extinktion bei

734 nm gemessen.

Aus der linearen Regression der α-Tocopherol-Kalibrierung wurden die TEAC-Werte berechnet. Deren

Angabe erfolgte in µmol αTE/100 g Probe.

B.3 Ermittlung der Fettsäurezusammensetzung

Fettextraktion nach Folch:

Zu der gemahlenen Probensubstanz von 300 mg in einem Pyrexröhrchen wurden zunächst 3 ml

Methanol gegeben und 2 min am Ultra-Turrax homogenisiert. Anschließend wurde die zweifache Menge

Chloroform (6 ml) zugegeben und weitere 2 min homogenisiert. Das Pyrexröhrchen wurde 30 min

geschüttelt und mit 3 ml einer 2 %igen Natriumchlorid-Lösung versetzt. Diese Lösung wurde gründlich

mit einem Vortexer geschüttelt und mit 4 000 U/min für 5 min zentrifugiert. Dadurch entstanden zwei

Phasen. Dazwischen befand sich ein Pellet aus den Tomatensamen. Die obere Phase enthielt alle lipid-

unlöslichen, hydrophilen Substanzen während die untere Phase nahezu alle Lipide enthielt [94]. Nach

FOLCH et al. (1957) besteht die obere Phase aus Chloroform/Methanol/Wasser in dem ungefähren

Verhältnis 3:48:47 (v/v/v). Die Anteile in der unteren Phase betragen in etwa 86:14:1 (v/v/v) [94]. Die

untere Chloroformphase wurde abgenommen, mit Natriumsulfat vom Wasser befreit und in ein 10-ml-

Schliffröhrchen überführt. Diese Probenlösung wurde bei 30 °C unter Stickstoffstrom eingeengt. Die

resultierenden Fettmengen wurden zurückgewogen, sodass ein ungefährer Fettanteil in den

Tomatensamen abgeschätzt werden konnte. Dies ist allerdings keine exakte Methode zur quantitativen

Fettbestimmung. Für eine komplette Fettausbeute hätte ein Salzsäureaufschluss durchgeführt werden

müssen.

Methylierung:

Aus den extrahierten Fettmengen wurden mit n-Hexan 2 %ige Lösungen erstellt und diese 5 min auf

einem Reagenzglasschüttler vermischt. Anschließend wurden 0,5 ml Natriummethylat hinzugegeben

und weitere 5 min geschüttelt. Eine Zugabe von Natrium-Hydrogensulfat-Monohydrat neutralisierte das

Gemisch, welches nochmals 5 min geschüttelt und im Anschluss 5 min mit 4 000 U/min zentrifugiert

wurde. Von der oberen Phase wurden 2x150 µl abgenommen und in je ein Vial überführt.

ANHANG C: ANALYSENDATEN

XX


Tab. C1 Wassergehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung (a,b,c)

Wassergehalt (in %)

a b c Mw Stabw

Waltinger 7,53 8,17 8,02 7,91 0,34

Red Currant 6,52 7,12 7,38 7,01 0,44

Tab. C2 Absorptionsmaxima und spezifische Extinktionskoeffizienten der ermittelten Carotinoide in

Ethanol (nach BRITTON 1995 [146])

Carotinoid-Standardsustanzen λmax (nm) E1cm1%

(all-E)-Lutein 445 2550

(all-E)-Zeaxanthin 450 2540

Tab. C3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze für Lutein und Zeaxanthin für C30-Develosil RPAQUEOUS-

Analysensäule (250 x 4,6 mm; 5 μm)

Carotinoid-Standardsubstanzen Nachweisgrenze (µg/ml) Bestimmungsgrenze (µg/ml)

(all-E)-Lutein 0,0059 0,0197

(all-E)-Zeaxanthin 0,0063 0,0210

Tab. C4 Carotinoidgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung (a,b,c) (in

µg/100 g)

(all-E)-Lutein (all-E)-Zeaxanthin Gesamtcarotinoide

Waltinger

a 55,2 91,2 146,4

b 61,8 104,3 166,1

c 59,4 104,7 164,0

Mw 58,8 100,1 158,9

Stabw 3,4 7,7 10,8

Red Currant

a n.q. 41,3 41,3

b n.q. 40,1 40,1

c n.q. 32,5 32,5

Mw - 38,0 38,0

Stabw - 4,8 4,8

Tab. C5 Absorptionsmaxima und spezifische Extinktionskoeffizienten der Tocopherole und Tocotrienole

in Ethanol (nach WERNER 2010 [38], FRANKE et al. [147])

Vitamin-E-Standardsubstanzen λmax (nm) E1cm1%

α-Tocopherol 292 75,8

γ-Tocopherol 298 91,4


XXI

Tab. C6 Nachweis- und Bestimmungsgrenze für α- und γ-Tocopherol für Knauer Eurospher-100 DIOL-

Analysensäule (250 x 4,0 mm; 7 µm)

Vitamin-E-Standardsubstanzen Nachweisgrenze (µg/ml) Bestimmungsgrenze (µg/ml)

α-Tocopherol 0,0053 0,0177

γ-Tocopherol 0,0071 0,0238

Tab. C7 Tocopherolgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung (a,b,c)

α-Tocopherol (mg/100 g)

γ-Tocopherol (mg/100 g)

Gesamttocopherole (µmol/100 g)

Waltinger

a 0,68 30,9 74,4

b 0,68 34,4 82,5

c 0,67 32,7 78,7

Mw 0,68 32,7 78,5

Stabw 0,01 1,7 4,0

Red Currant

a 0,55 17,3 42,0

b 0,52 18,1 43,9

c 0,62 17,0 41,5

Mw 0,56 17,5 42,5

Stabw 0,05 0,6 1,3

Tab. C8 Vitamin-E-Aktivität der Tocopherole und Tocotrienole (nach FRANKE et al. 2010 [84])

Vitamin-E-Verbindung mg αTE/mg Substanz

α-Tocopherol 1,00

β-Tocopherol 0,40

γ-Tocopherol 0,10

δ-Tocopherol 0,01

α-Tocotrienol 0,30

β-Tocotrienol 0,05

γ-Tocotrienol 0,01

δ-Tocotrienol keine Angabe

Tab. C9 Gesamtphenolgehalte der zwei Samensorten, Angabe der Werte der Dreifachbestimmung

(a,b,c)

Gesamtphenolgehalt (mg GAE/100 g)

VF a b c Mw Stabw Mw aller

VF Stabw

Wal

tin

ger

vor

Hydrolyse

1 176,6 173,4 158,4 169,5 9,7

167,6 1,7 2 175,9 162,6 159,7 166,1 8,6

5 167,9 170,9 163,0 167,3 4,0

nach

Hydrolyse

1 196,7 202,3 200,3 199,8 2,8

203,2 3,4 2 204,0 201,9 203,8 203,2 1,2

5 206,5 199,4 213,9 206,6 7,3


XXII

gesamt

1 373,4 375,7 358,6 369,2 9,2

370,8 2,7 2 379,9 364,4 363,6 369,3 9,2

5 374,4 370,4 376,9 373,9 3,3 R

ed

Cu

rran

t

vor

Hydrolyse

1 212,9 194,7 206,2 204,6 9,2

204,8 4,7 2 213,5 204,8 210,7 209,7 4,5

5 206,1 196,3 198,2 200,2 5,2

nach

Hydrolyse

1 298,3 300,8 295,1 298,1 2,8

309,4 9,9 2 311,2 322,7 307,2 313,7 8,1

5 303,8 315,9 329,9 316,5 13,1

gesamt

1 511,2 495,4 501,4 502,7 8,0

514,3 10,6 2 524,7 527,5 517,9 523,4 4,9

5 509,9 512,2 528,2 516,7 10,0

Tab. C10 Hydrophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem H-TEAC-Test

Hydrophile AOC (µmol TE/100 g)

VF a b c Mw Stabw

Wal

tin

ger

vor Hydrolyse

1 1203,7 1154,9 1150,6 1169,7 29,5

2 1324,6 1287,9 1231,4 1281,3 46,9

5 1447,4 1429,1 1419,5 1432,0 14,2

nach

Hydrolyse

1 1005,2 1006,7 1009,1 1007,0 2,0

2 1242,9 1227,8 1289,4 1253,4 32,1

5 1473,4 1404,7 1470,1 1449,4 38,8

gesamt

1 2208,9 2161,6 2159,7 2176,7 27,9

2 2567,4 2515,7 2520,8 2534,7 28,5

5 2920,8 2833,8 2889,6 2881,4 44,1

Re

d C

urr

ant

vor

Hydrolyse

1 1502,7 1481,1 1502,7 1495,5 12,5

2 1811,0 1786,1 1820,6 1805,9 17,8

5 2064,2 2033,3 2031,8 2043,1 18,3

nach

Hydrolyse

1 1422,6 1437,7 1449,7 1436,7 13,6

2 1827,1 1820,6 1858,2 1835,3 20,1

5 2247,4 2240,0 2281,8 2256,4 22,3

gesamt

1 2925,4 2918,9 2952,4 2932,2 17,8

2 3638,2 3606,6 3678,8 3641,2 36,2

5 4311,6 4273,3 4313,6 4299,5 22,8


XXIII

Tab. C11 Hydrophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem ORAC-Test

Hydrophile AOC (mmol TE/100 g)

VF a b c Mw Stabw W

alti

nge

r

vor

Hydrolyse

1 6,27 7,39 7,76 7,14 0,77

2 8,09 8,96 9,00 8,68 0,52

5 12,45 13,91 13,88 13,41 0,83

nach

Hydrolyse

1 9,04 a.K. a.K. - -

2 10,32 9,31 11,18 10,27 0,93

5 12,92 14,24 13,25 13,47 0,69

gesamt

1 15,31 - - - -

2 18,41 18,27 20,18 18,95 1,07

5 25,37 28,15 27,13 26,88 1,41

Re

d C

urr

ant

vor

Hydrolyse

1 10,26 15,12 9,96 11,78 2,90

2 12,40 12,87 12,63 12,63 0,24

5 18,22 19,65 18,51 18,79 0,75

nach

Hydrolyse

1 a.K. a.K. a.K. - -

2 16,56 17,46 14,53 16,18 1,50

5 19,40 19,47 17,78 18,88 0,96

gesamt

1 - - - - -

2 28,95 30,33 27,16 28,81 1,59

5 37,62 39,12 36,28 37,67 1,42

a.K. Werte außerhalb der Kalibrierung

Tab. C12 Lipophile AOC der zwei Samensorten bestimmt mit dem αTEAC-Test

Lipophile AOC (µmol αTE/100 g)

VF a b c Mw Stabw

Waltinger

1 34,30 41,33 48,34 41,33 7,02

2 39,47 81,04 73,92 64,81 22,23

5 79,30 120,75 198,87 132,97 60,71

Red Currant

1 48,91 56,33 64,17 56,47 7,63

2 92,21 110,56 126,90 109,89 17,36

5 203,03 227,30 338,10 256,14 72,00


XXIV

Tab. C13 Summenformel, Trivialname, Abkürzung und Einordnung aller detektierten Fettsäuren

Summenformel chemische Bezeichnung Trivialname Klassifizierung

Sättigungsgrad Position der Doppelbindung

C-14:0 Tetradecansäure Myristinsäure SFA

C-15 aiso 12-Methyltetradecansäure SFA

C-15:0 Pentadecansäure SFA

C-16:0 iso 14-Methylpentadecansäure iso-Palmitinsäure SFA

C-16:0 Hexadecansäure Palmitinsäure SFA

C-16:1 c9 Delta-9-cis-Hexadecensäure Palmitoleinsäure MUFA

C-17:0 iso 15-Methylhexadecansäure 15-Methylpalmitinsäure SFA

C-16:2 c9,12 PUFA

C-17:0 aiso 14-Methylhexadecansäure 14-Methylpalmitinsäure SFA

C-17:0 Heptadecansäure Margarinsäure SFA

C-18:0 iso 16-Methylheptadecansäure SFA

C-18:0 Octadecansäure Stearinsäure SFA

C-18:1 t10 MUFA

C-18:1 c9 Delta-9-cis-Octadecensäure Ölsäure MUFA omega-9

C-18:1 c11 Delta-11-cis-Octadecensäure cis-Vaccensäure MUFA

C-18:1 c13 MUFA

C-18:2 c9,c12 Delta-9-cis, 12-cis-Octadecadiensäure Linolsäure PUFA omega-6

C-19:0 aiso 16-Methyloctadecansäure SFA

aC-18:3 c9,c12,c15 Delta-9-cis, 12-cis, 15-cis-Octadecatriensäure α-Linolensäure PUFA omega-3

C-20:0 Eicosansäure Arachinsäure SFA

C-20:1 c11 Delta-11-cis-Eicosensäure Gondosäure MUFA omega-9

C-20:2 c11,c14 Delta-11-cis, 14-cis-Eicosadiensäure PUFA omega-6

C-22:0 Docosansäure Behensäure SFA

C-22:1 c11 Delta-11-cis-Docosensäure Cetoleinsäure MUFA

C-22:2 c13,c16 Delta-13-cis, 16-cis-Docosadiensäure PUFA omega-6

C-23:0 Tricosansäure SFA

C-24:0 Tetracosansäure Lignocerinsäure SFA

C-25:0 Pentacosansäure SFA

C-26:0 Hexacosansäure Cerotinsäure SFA


XXV

Tab. C14 Fettsäureverteilung in den beiden Samensorten (in %)

Symbol Waltinger Red Currant

C-14:0 0,092 ± 0,002 * 0,062 ± 0,001

C-15:0 aiso) 0,005 ± 0,001 0,007 ± 0,001

C-15:0 0,012 ± 0,001 * 0,018 ± 0,001

C-16:0 iso 0,049 ± 0,002 * 0,025 ± 0,003

C-16:0 13,394 ± 0,013 13,37 ± 0,078

C-16:1 c9 0,226 ± 0,005 * 0,147 ± 0,006

C-17:0 iso 0,010 ± 0,001 * 0,006 ± 0,002

C-16:2 n4 0,017 ± 0,002 * 0,011 ± 0,002

C-17:0 aiso 0,136 ± 0,002 * 0,241 ± 0,003

C-17:0 0,081 ± 0,001 * 0,093 ± 0,001

C-18:0 iso 0,348 ± 0,004 * 0,167 ± 0,003

C-18:0 4,006 ± 0,036 * 4,665 ± 0,012

C-18:1 t10 0,014 ± 0,002 0,015 ± 0,002

C-18:1 c9 18,128 ± 0,049 * 19,858 ± 0,058

C-18:1 c11 0,748 ± 0,009 * 0,621 ± 0,002

C-18:1 c13 0,015 ± 0,002 * 0

C-18:2 c9,c12 59,180 ± 0,067 * 57,011 ± 0,062

C-19:0 aiso 0,040 ± 0,002 * 0,085 ± 0,002

aC-18:3 c9,c12,c15 2,451 ± 0,004 * 2,302 ± 0,009

C-20:0 0,480 ± 0,012 * 0,581 ± 0,004

C-20:1 c11 0,083 ± 0,004 * 0,103 ± 0,001

C-20:2 c11,c14 0,012 ± 0,003 0,011 ± 0,000

C-22:0 0,146 ± 0,011 * 0,184 ± 0,002

C-22:1 c11 0,016 ± 0,004 * 0,04 ± 0,002

C-22:2 c13,c16 0,012 ± 0,003 * 0,038 ± 0,005

C-23:0 0,018 ± 0,006 0,020 ± 0,004

C-24:0 0,171 ± 0,001 * 0,204 ± 0,003

C-25:0 0,033 ± 0,002 * 0,027 ± 0,002

C-26:0 0,077 ± 0,025 0,088 ± 0,025

∑ 100,0 100,0

Summe

SFA 19,099 ± 0,090 * 19,843 ± 0,082

MUFA 19,230 ± 0,0420 * 20,784 ± 0,051

PUFA 61,671 ± 0,067 * 59,373 ± 0,056

Summe C-18:1 t-FA 0,014 ± 0,002 0,015 ± 0,002

C-16:0/C-18:1cis9 0,739 ± 0,003 * 0,673 ± 0,006

C-16:0/C-18:1 ges. 0,738 ± 0,003 * 0,673 ± 0,006

Summe ω-3 2,451 ± 0,004 * 2,302 ± 0,009

Summe ω-6 59,203 ± 0,063 * 57,060 ± 0,058

ω6/ω3 24,154 ± 0,024 * 24,790 ± 0,115

SC-FA (C-4>C-8) 0,000 0,000

MC-FA (C-10>C-14) 0,092 ± 0,002 * 0,062 ± 0,001

* markiert signifikanten Unterschied zwischen beiden Samensorten (p < 0,05, t-Test)

Selbstständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt und keine anderen als die

angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Ich versichere, dass alle Ausführungen, die anderen Schriften entnommen wurden, kenntlich gemacht

sind und die Arbeit in gleicher oder ähnlicher Fassung noch nicht Bestandteil einer Studien- oder

Prüfungsleistung war.

Jena, September 2013 ……………....…….………………………..

Unterschrift

Danksagung

Mein persönlicher Dank gilt an erster Stelle PD Dr. Volker Böhm für die fachliche Unterstützung und

Betreuung meiner Arbeit. Ich bedanke mich außerdem für die Bereitstellung des Themas und damit

gleichzeitig bei Herrn Hoser, der die Tomatensamen für die Analysen zur Verfügung stellte.

Den Mitarbeitern sowie Doktoranden, Diplomanden und Master-Studenten der AG Bioaktive

Pflanzenstoffe möchte ich für die gute Zusammenarbeit und Unterstützung im Laboralltag danken.

Carsten Rohrer danke ich besonders für die Hilfe bei der Fettsäureanalyse. Christin Arnold danke ich für

die Beantwortung von einigen statistischen Fragestellungen.

Weiterhin gilt meiner Familie und nahen Freunden, die mich beim Schreiben der Arbeit stets

unterstützten und Geduld zeigten, ein großer Dank.

Documents

Bachelorarbeit-Endfassung neu bunt Westphal (Bachelorarbeit 2013).pdf · Friedrich-Schiller-Universität Jena Biologisch-Pharmazeutische Fakultät Institut für Ernährungswissenschaften