101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies - ESP Hiver 2015

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Bactériologie

L2. MORPHOLOGIE ET GRAM

1. OBJECTIFS

Observer des colonies bactériennes isolées sur gélose.

Distinguer les types morphologiques des bactéries.

Utiliser un microscope à immersion à G: 1000X.

Réaliser une coloration de Gram.

2. INTRODUCTION

2.1. Aux limites de la microscopie photonique. La puissance d’un microscope dépend de son pouvoir de résolution et de sa capacité de grossissement.

Le pouvoir de résolution. Il correspond à la plus petite distance que l’on peut distinguer entre 2 points. L’œil humain ne peut distinguer deux points séparés de moins de 100µ (0,1mm). Les meilleurs microscopes ont un pouvoir de résolution d’environ 500 fois supérieur, soit de 0,2µ (0,0002mm), ce qui représente la taille des plus petites bactéries ou des mitochondries [1; p.98]. Il dépend de trois variables : λ, α et n.

λ. Un bon microscope utilise un filtre bleu, couleur dont la longueur d’onde est la plus petite. Les microscopes électroniques utilisent des électrons dont la longueur d’onde est de beaucoup inférieure à celle de la lumière, et leur pouvoir de résolution est de 0,2 nm (0,0000002mm).

α. L’objectif le plus puissant maximise l’angle α en s’approchant le plus possible de l’objet! Cet objectif est muni d’un ressort qui prévient le bri de la lamelle.

n. L’objectif 100X peut être immergé dans une goutte d’huile minérale placée sur la lamelle; on l’appelle «objectif à immersion». L’indice de réfraction de l’huile (n=1,51) est identique à celui du verre et la lumière provenant de l’objet n’est donc pas réfractée et perdue, comme ce serait le cas en passant dans l’air (n = 1).

La capacité de grossissement. La limite physique du microscope se situe autour de 1200 fois, mais les meilleurs microscopes grossissent efficacement jusqu’à 1000 fois; au-delà, les images deviennent brouillées.

Sécurité au laboratoire

Sarrau Port du sarrau obligatoire.

Contamination

Bactéries : éviter de se contaminer ou de contaminer des objets ou le labo. En cas de doute, nettoyer soigneusement.

Asepsie

Nettoyer le plan de travail et les mains avant et après le labo.

Brûleur

Surveiller les becs de gaz. Ajuster le brûleur avec soin. Attacher les cheveux.

Rappel Comme toujours, il est interdit de manger ou de boire au labo.

Pouvoir de résolution «d» = 0,5 λ = 0,5 λ_ O.N. (n sin α) λ = longueur d’onde de la lumière utilisée O.N. = ouverture numérique de l’objectif = n sin α n = indice de réfraction du milieu sous l’objectif (air) α = angle limite de la lumière avec l’axe optique

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2.2. Observer des bactéries.

Des cultures pures. Dans ce labo, nous utilisons des cultures pures, commandées auprès d’institutions certifiées telles le Laboratoire de Santé Publique du Québec.

La coloration de Gram. En bactériologie, on utilise couramment la coloration de Gram, mise au point au XIXe siècle par un physicien danois. C’est une coloration différentielle utilisant 2 colorants. En plus de permettre de visualiser la morphologie, elle oriente l’identification en permettant de distinguer les bactéries «Gram+» en mauve et les «Gram-» en rose, qui diffèrent par leur paroi [1; p.645].

Morphologie bactérienne. Les bactéries présentent une morphologie variée, mais certaines formes sont plus répandues : coques (rondes), bacilles (bâtons) et spirilles (ondulées). On observe aussi divers types d’arrangements : 2 par 2 (diplo-), en chaîne (strepto-), en grappe (staphylo-). Parfois, la morphologie observée confère le nom scientifique (ex : Staphylococcus sp. ou Bacillus sp).

Colonies sur gélose. L’apparence d’une colonie isolée peut varier d’une espèce à l’autre et elle constitue, avec la coloration de Gram, un des 1ers indices permettant l’identification d’une bactérie.

3. MANIPULATIONS

Utiliser les Fiches techniques de bactériologie [2].

3.1. Observation de colonies sur gélose.

Cultures pures de E. coli, Staphylococcus sp et Bacillus sp. En utilisant une loupe binoculaire au besoin, représenter une colonie isolée et noter ses caractéristiques distinctives (couleur, forme, bordure, transparence)

Culture inconnue. Identifier la (ou les) bactérie(s) observée(s).

3.2. Frottis bactérien, coloration de Gram et microscopie (1 / personne).

Chaque élève effectue un frottis bactérien suivi d’une coloration de Gram pour une des 3 bactéries: ▪Escherichia coli ▪Bacillus sp. ▪Staphylococcus sp

Les 3 types bactériens sont répartis entre les élèves d’une même table.

Chaque élève effectue la mise au point microscopique à immersion (G : 1000X) et la montre au professeur pour validation; le montage est ensuite partagé avec les élèves de la table pour observation.

NB Trucs pour faciliter l’observation

Les bactéries ne deviennent souvent discernables qu’à G : 400X. Pour faire la mise au point avec les plus petits objectifs, on se servira de taches de colorant.

Après l’utilisation de l’objectif à immersion, il est difficile de revenir aux objectifs plus petits ; on doit donc choisir au préalable une image d’intérêt à G : 400X.

La morphologie et le Gram doivent être déterminés à partir de bactéries isolées (dispersées) et non pas à partir d’amoncellements importants.

Une culture contient une variété d’arrangements; l’espèce porte souvent le nom de l’arrangement le plus complexe ou fréquent (ici staphylocoque).

Staphylococcus

bacille

diplobacille

streptobacille

coque

diplocoque

staphylocoque

streptocoque

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4. RÉSULTATS NOMS : _________________________ _________________________

4.1. Colonies isolées sur gélose.

Escherichia coli Staphylococcus sp. Bacillus sp

Illustration d’une colonie isolée

Caractéristiques distinctives

(couleur forme bordure transparence)

Espèce(s) présente(s) sur la gélose inconnue :

4.2. Observations microscopiques à immersion G: 1000X.

Représenter à l’échelle quelques spécimens de chacun des types de bactéries.

Indiquer la morphologie (coque ou bacille), la couleur (violet ou rose), le Gram (+ ou -).

Identifier précisément par des traits droits tous les arrangements observés.

Arrangements Escherichia coli

Forme : ____________ Couleur : _________ Gram : ____

Staphylococcus sp

Forme : ____________ Couleur : _________ Gram : ____

Bacillus sp

Forme : ____________ Couleur : _________ Gram : ____

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5. QUESTIONS.

5.1. D’après la littérature [1,2,3], les bactéries observées au labo sont-elles Gram (+) ou Gram (-)?

Bactérie Gram Référence précise (Auteur, titre et page)

Escherichia coli

Bacillus sp.

Staphylococcus sp.

5.2. Quel type de bactérie (Gram + ou Gram -) possède les caractéristiques suivantes :

Présence de beaucoup plus de peptidoglycane dans la paroi : Gram : ___

Plus grande sensibilité à la pénicilline : Gram : ___

5.3. Quelle serait la couleur observée pour chaque type de bactérie si on arrêtait la coloration de Gram après chacune des étapes suivantes :

Étape Gram (+) Gram (-)

Coloration au violet cristal

Décoloration à l’alcool

Coloration à la safranine

5.4. Plusieurs liquides de notre organisme (dont les larmes et la salive) contiennent un enzyme antibactérien le lysozyme. À quelle structure bactérienne s’attaque cet enzyme ?

____________________

5.5. Laquelle des 3 bactéries étudiées au labo se retrouve principalement

a. sur la peau? ______________ b. dans l’intestin? ______________ c. dans le sol ? ______________

5.6. L’huile à immersion utilisée avec l’objectif 100X sert à minimiser quel phénomène physique?

a. diffraction b. réflexion c. réfraction

5.7. Gélose nutritive

A) Quelle substance constitue 98% d’une gélose nutritive? _________________________

B) Pour quelle propriété utilise-t-on l’agar au lieu de la gélatine dans les géloses ? _________________________

C) Pour quelle propriété utilise-t-on des boîtes de Pétri au lieu d’une éprouvette ? _________________________

D) Quel phénomène nous amène à incuber et conserver les géloses à l’envers ? _________________________

6. MÉDIAGRAPHIE

1. Reece, J.B. et coll. (2012). Campbell Biologie. 4e éd., ERPI, 1458 p. 2. Collège Lionel-Groulx, Hiver 2014. Fiches techniques de bactériologie. Microbiologie et biotechnologies

(101-NE2-LG). 3. Agence Santé Pub. Can., en ligne le 15/01/2014. Fiches signalétiques de pathogènes, URL :

http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/index-fra.php#menu