101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies Hiver 2015

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Bactériologie

L4. IDENTIFICATION BACTÉRIENNE

1. OBJECTIFS

Identifier une bactérie inconnue à l’aide de tests microscopiques, bactériologiques et enzymatiques.

Déterminer sa sensibilité à divers antibiotiques par un antibiogramme.

2. INTRODUCTION

2.1. Diversité des bactéries.

Il existe des milliers d’espèces bactériennes et probablement encore plus qui ne sont pas connues. Ce labo porte sur l’identification d’espèces fréquemment rencontrées en santé.

On les trouve dans la flore normale humaine ou dans notre environnement immédiat.

Elles peuvent causer des infections alimentaires ou nosocomiales (en cours de traitement médical).

2.2. Diversité des tests.

De nombreux tests et milieux de culture servent à leur identification. Cependant,

L’interprétation d’un test n’est pas toujours très nette et repose en partie sur l’expérience.

Les résultats ne sont pas toujours constants à 100%; une identification peut nécessiter de nombreux tests différents (>20) afin de compenser pour certains résultats parfois contradictoires.

L’identification repose sur un choix judicieux des tests, selon l’infection et les symptômes observés.

2.3. Types de tests.

Dans ce labo, nous utiliserons des techniques classiques répandues en microbiologie :

Tests microscopiques. La coloration de Gram permet de différencier les parois des bactéries «Gram +» et «Gram -» et permet d’orienter correctement le choix des autres tests.

Tests bactériologiques et biochimiques. Ces tests varient 1o Selon leur composition

o Milieu sélectif : favorise ou inhibe la croissance de certaines bactéries. o Milieu différentiel : distingue les bactéries qui y croissent (ex : par coloration spécifique).

2o Selon les conditions d’incubation : température variable, aérobie ou anaérobie (sans O2).

Tests enzymatiques. Mise en évidence d’enzymes spécifiques aux bactéries recherchées.

2.4. Antibiogramme.

L’antibiogramme est un test de croissance sur gélose servant à vérifier l’efficacité d’un antibiotique.

Sécurité au laboratoire

Sarrau Port du sarrau obligatoire.

Contamination

Bactéries : éviter de se contaminer ou de contaminer des objets ou le labo. En cas de doute, nettoyer soigneusement.

Asepsie

Nettoyer le plan de travail et les mains avant et après le labo.

Brûleur

Surveiller les becs de gaz. Ajuster le brûleur avec soin. Attacher les cheveux.

Rappel Comme toujours, il est interdit de manger ou de boire au labo.

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3. MANIPULATIONS. Consignes en démo suivant les Fiches techniques de bactériologie. [1]

3.1. Familiarisation avec les tests enzymatiques catalase et oxydase

Chaque équipe effectue les 2 tests avec chacune des bactéries fournies, de manière à observer des résultats + et -. Noter les observations à la section des résultats.

Tests enzymatiques Bactéries

Oxydase Pseudomonas fluorescens Escherichia coli

Catalase Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae

3.2. Identification d’une bactérie inconnue et antibiogramme.

Chaque équipe reçoit une culture pure d’une bactérie inconnue et tente de l’identifier en suivant la démarche proposée à l’Annexe 1. [2]

NB. Tous les tests sont effectués en équipe sauf la coloration de Gram qui est effectuée individuellement et approuvée par le professeur avant de poursuivre l’identification.

1. Bien noter le numéro de la bactérie inconnue.

2. Effectuer une coloration de Gram (2 lames par élève, au cas où) et observer à immersion (G: 1000X). Noter le Gram, la morphologie et les types d’arrangements observés. Faire valider par le professeur.

3. À l’aide d’une anse bactériologique stérile, ensemencer par la technique des 4 stries

Une gélose au sang; identifier, sceller au papier Parafilm et incuber à 37oC pendant 24 hres.

Une 1ère gélose nutritive; identifier et incuber à 37oC pendant 24 hres en anaérobie (sans Parafilm).

4. À l’aide d’un écouvillon stérile, ensemencer une 2e gélose nutritive pour réaliser un antibiogramme.

5. Selon les résultats obtenus avec la coloration de Gram, effectuer les tests d’identification suggérés à l’Annexe 1. Faire valider vos choix par le professeur ou la technicienne.

4. MÉDIAGRAPHIE

1. Collège Lionel-Groulx, Hiver 2014. Fiches techniques de bactériologie. Microbiologie et biotechnologies (101-NE2-LG).

2. Ikram M., (1994), Bacteriology for veterinary technicians, Amer. Vet. Pub., 150 p.

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5. RÉSULTATS NOMS : _________________________ _________________________

5.1. Tests enzymatiques sur bactéries connues.

Tests enzymatiques Bactéries

Oxydase Pseudomonas fluorescens Escherichia coli

Observation : Mauve ou incolore

Interprétation : +/ -

Catalase Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae

Observation : Avec ou sans bulles

Interprétation : +/ -

5.2. Bactérie inconnue.

No de l’inconnue : _____

Coloration de gram

Morphologie

Arrangements

Couleur

Interprétation (+/ -)

Test enzymatique :

Observation

Interprétation (+/ -)

Gélose sélective et différentielle:

Croissance (+/-)

Observation

Interprétation (+/-)

Gélose au sang

Apparence/colonies

Hémolyse

Gélose anaérobie

Croissance (+/-)

Interprétation

CONCLUSION :

5.3. Antibiogramme.

Antibiotique Zone d’inhibition (mm)

Sensibilité (résistante, limite, sensible)

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ANAÉROBIE

spécimen

nutritive

sang

grands bacilles +coques +

arrangementpetits bacilles + bacilles --

GRAM

CATALASE

+ -

S. faecalis

man+ man-

Staphylococcus

aureusStaphylococcus

epidermidis

MANNITOL-SEL

BSA

hém γ hém α hém β

S. pneumoniae S. agalactiae

+ -

Listeria sp.

Corynebacterium sp.

Erysipelothrix sp.

Actinomyces sp.

CATALASE

BACILLUS

croiss+

man -

lécit +

B. cereus

OXYDASE

+ -

Staphylococcus sp Streptococcus sp

Bacillus sp

Pseudomonas sp.

ex: P. fluorescens

Enterobacteriaceae

Ex: Escherichia coli

Ex: Proteus vulgaris

TSI

Hémolyse α,β,γ

Morphologie

Des colonies

Chartres d’interpretation

Annexe 1. DÉMARCHE D’IDENTIFICATION

BACTÉRIENNEP. Masse, modifié de Ikram M. 1994

4 stries

nutritiveANTIBIOGRAMME

croiss±

man +

lécit -

B. subtilis

strepstaph

Hiver 2014

Tapis/écouvillon

MANNITOL-SEL

ET/OU

man- man+

4 stries

MacConkey

Lac- Lac+

Pseudomonas

ProteusE. coli

ET/OU