BD Diagnostics Preanalytical Systems

Becton Dickinson ProteomicsMunich / Germany

Becton Dickinson ProteomicsMunich / Germany

Dipl. Biol. Monika HauptmannDipl. Biol. Monika Hauptmann

BD Diagnostics Preanalytical Systems

BD™ Free Flow Electrophoresis SystemBD™ Free Flow Electrophoresis System

Des particules aux molécules:Séparation en haute résolution dans un milieu

liquide

Des particules aux molécules:Séparation en haute résolution dans un milieu

liquide

3

Les paramètres de séparation

Les Les paramparam èètrestres de de ssééparationparation : : charge, dimension, charge, dimension, poidpoid molmol ééculaireculaire , , solubilitsolubilit éé

Gel de Gel de polyacrylamidepolyacrylamide

MatriceMatricede de chromatographiechromatographie

Sans Sans matricematrice

Cen

trifu

gatio

n

Sans Sans matricematrice

Chr

omat

ogra

phie

HPLCHPLC

Fre

e F

low

Ele

ctro

phor

èse

ZE ZE -- FFEFFEIEF IEF -- FFEFFEITP ITP -- FFEFFE

Gel

-É

lect

roph

orès

eIEF IEF –– PAGEPAGESDS SDS -- PAGEPAGE(2D (2D -- PAGE)PAGE)

4

� Electrophorèse dans un flotcontinu liquide sans matricesolide

� Conditions du flot

- Solutions aqueuses

- Flot continu

- Film fin / conditions laminaires

- Entre deux plaques parallèles

� Champ électrique perpendiculaireau flot laminaire

- Chambre de séparation encadréedes électrodes

� Séparation: déflexion des molécules chargésperpendiculairement au flot

Principe du FFE

5

ZE-FFE(charge)

Zone Electrophoresis

pH

Séparation des organelles et

protéines selon leursdensités de charge

pH

ITP-FFE(mobilité électrophoretique)Isotacho- Electrophoresis

Méthode spécifique pour protéines, peptides et

organelles

Les différents modes de separation du FFE

IEF-FFE (point isoélectrique) Isoelectric Focusing

Séparation des protéines et peptides

selon le pI

pH

6

Séparation des molécules chargées et chargeable

Protéines solublesProtéines complexesProtéines membranairesIsoformes de protéinesPeptidesOrganellesCellules/VirusParticules chargéesAutres

Échantillons complexes(liquides corporels, extraitscellulaires, tissus de toute

origine, protéinesrecombinées)

Séparation, purification,enrichissement

Une technologie à haute résolution: séparation des diverses molécules d’un échantillon complexe

Analyse(Compatibilité avec

les différentestechniques d’analyse)

Essai immunologique(ELISA)Essai enzymatiqueGel – ÉlectrophorèseChromatographieSpectroscopieSpectrométrie de masseCytrométrie en flux

7

Caractéristiques

• Séparation en vrai milieu liquide

• Fractionnement dans uneplaque de 96 puits

• Conditions natives oudénaturantes

• Application permanente de l’échantillon

• Séparation de toutesmolécules chargées et chargeable

• Conditions de séparationstables

Avantages

Pas d’interaction avec une matrice solide� pas de pertes non spécifiques� Gain de temps

Haute résolution(p.ex. pour séparation des isoformes)

Préservation des activités biologiques en utilisant des conditions natives

Échantillon en quantités analytiques et préparatives

Beaucoup d’applications possible:organites, protéines membranaires, phospho-peptides, complexes de protéines, etc…

Bonne reproductibilité

BD™ Free Flow Electrophoresis

8

The BD™ Free Flow Electrophoresis System

Application: Exemples et Résultats

1. Séparation des organelles (ZE – FFE)Amélioration de la pureté et de l’intégrité des mitochiondriesSéparation des sous-populations (mitochondries, peroxisomes)

2. Séparation des protéines (IEF – FFE / ZE – FFE)Séparation de mixture complexeDouble séparation par le FFE: 1) séparation des protéines (dépletion d’albumine),2) séparation des peptides (2D – FFE)Séparation des protéines membranairesSéparation des isoformes

3. Séparation des peptides (IEF – FFE)

9

1. Les avantages du FFE pour la séparation des organelles

FFE

Centrifugation

Extrait cellulaire

Le FFE permet la purification et l’enrichissement des organelles intactes et de leurs sous-populations donnant accès à une analyse des so us-protéomes

Enrichisse-ment

Purité Intégrité

Accès aux sous-populations

10

1. FFE – Amélioration de la pureté et de l’intégrité de s mitochiondries

contamination mitochondries purifiées

FFE

Résumé:� La séparation native maintient le contexte biologique et permet des recherches

fonctionelles� Haute pureté: Dépletion de protéines non-mitochondriales et tronquées� Reduction significative des protéines degradées grace à l’élimination des

protéases endogènes

� Enrichissement des organelles due à l’application continue de l’échantillon

Zischka et al., Proteomics 2003

Un concentré des mitochondriesaprès centrifugation

FFE fraction 41: organitespures, intactes et enrichies

F41

11

L’Hétérogénéité des mitochondries cardiaques

Traitement des mitochondriesintactes avec du calcium

Centrifugation

FFE

Professor Peipei Ping & Dr. Oliver DrewsCardiac Proteomics & Signaling Laboratory, David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA

Résumé: �Des sous-populations dont l’état physiologique est modifié sont séparées par

FFE�Une séparation en haute résolution des mitochondries intactes dont l’activité

biologique est préservée

EM 19,000x

FFE fraction I FFE fraction II

12

La composition protéique de la membraneextérieure détermine la migration des mitochondries

Fractionnement (Lac = Lactate, Glu = Glucose)

Zischka et al.; MCP 2006

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63

Glu

Lac

Glumitochondrie: respiration diminuée

Lac mitochondrie:respiration élevée

OD

260

nm

Résumé:� Le FFE sépare différentes populations mitochondriales

13

Séparation des sous-populations de peroxisome

FFE

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94

Fraction No.

Cat

alas

e as

say

BU

/ml

Résumé:� Séparation en haute résolution des sous-populations qui diffèrent en structure, en contenu protéique et en

activité biologique� Les conditions de séparation natives conservent la structure et la fonctionnalité des organelles� L’hétérogénéité des organelles pourrait être un marqueur de pathologies

peroxisomes du foie de rat après centrifugation

Deux sous-populations de peroxisome séparées et purifiées

Détection des sous-populations par l’utilisation de l’activité d’un marqueurendogène peroxisomal (catalase)

Sous-population I

Sous-population II

14

2. Les étapes essentielles de la protéomique

Prélèvement&

Préservation del‘échantillon

SéparationIdentification etCaractérisationdes Protéines

Analyses des données&

Bioinformatique

15

Séparation des mixtures complexes avec des gradients de pH linéaires: Accéder aux protéines peu abondantes

2D-PAGE (pH 3-10)

Extrait entier surun gelenv. 2000 spots

Extrait cellulaire

FFE

Analyse de 2D-PAGE des fractions acides du FFE (pH 3- 10)

F35 F37 F38 F39 F40F36

chaquechaque fraction fraction contientcontient envenv . 50 . 50 protéinesprotéines

16

MS

FFE "Dépletion d’albumine"

FFE Peptides

Le plasma d’origine humaine – séparation en 2D avec le FFE

0

2

4

6

8

10

12

14

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91

FFE fraction number

pH

Exp 1

Exp 2

Exp 3

Plasma

0

2

4

6

8

10

12

14

1 11 21 31 41 51 61 71 81 91

FFE fraction number

pH

Exp 1

Exp 2

Exp 3

Digestion

Albumine

17

Identification de protéines peu abondantes du plasma(pH 4 - 5)

17 ng/mL

30 ng/mL

94 ng/mL

18

IM enrichment

Enrichissement des protéines membranaires

Enrichissement des membranes de plaquettes selon leur c omposition en protéines membranaires

Comparaison de 3 methodes différentes pour enrichir les protéines membranaires

• Lectin affinity chromatography (WGA)

• Biotin/NA affinity chromatography

• Free Flow Electrophoresis

221

0

3515 5

352910

316520

PMIM

other

Total 23 55 190

Résumé:

� Le FFE permet l’identificationd’un plus grand nombre de protéinesmembranaires� La séparation des protéinesmembranaires plasmatiques et des protéines membranaires internes nepeut se faire que par l’utilisation du FFE

WCL: controlPM: plasma membraneIM: inner membrane

Senis et al. (2007) Mol. Cell Proteomics. Copyright by the Am Soc Biochem Mol Biol, Inc. Reproduced with permission

19

Séparation des complexes membranaires

Résumé: • La seule méthode pour séparer

des complexes membranairesen quantité suffisante et en étatintact en solution

• Compatibilité avec toutes les méthodes en aval due a des tampons sans détergent

• Nouvelle approche (ZE – FFE) pour une solubilité amélioréeet une résolution optimisée

• Flexibilité pour combiner diverses conditions de pH et garantir une isolation optimaledes complexes

S 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

I (1000)V (700)III (490)

IV (200)

II (130)

a-e

pH 7.6

I (1000)V (700)III (490)

IV (200)

II (130)

a-e

S 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66

pH 4.5

Legend:I (NAD Dehydrogenase), II (Succinate Dehydrogenase), III (Cytochrome bc 1), IV (Cytochrome c Oxidase), V (F0F1-ATP-Synthase), a-e (supercomplexes (I 1III2IV0-4))

II (Succinat Dehydrogenase)

V (FoF1 ATP-Synthase)

IV (Cytochrom c Oxidase)

Séparation des complexes de la chaîne respiratoire en pH 7.6 et 4.5� Les solutions natives permettent de conserver des complexes membranaires intactes� Les complexes qui ont différentes densités de charges migrent de façon distincte sous

deux conditions de pH

FFE Fractions

FFE Fractions

20

Résumé:

� La séparation en haute résolutiondes isoformes d’anticorps estfacilitée par un gradient de pH étroit

� Des gradients sont disponibles pour des applications spécifiques (acide, neutre et basique)

La Séparation des Isoformes

pH 6.89 pH 7.03

Fraction: 28 30 32 34 36 38 40 42 44

avantFF

E

Anticorps purifiés IEF-FFEpH- Gradient 6-8

IEF-Native-PAGE

-

+

Point isoélectrique

21

Enrichissement des Isoformes

6,0--

pI

5,3--

4,5--

4,2--

3,5--

M S 49 52 54 56 59

IEF-FFEGradient pH 3-4

Amyloglucosidase (90 kDa)

IEF-Native-PAGE

Amylogucosidaseisoformes

+

-

point isoélectrique

before FF

E

Résumé:

� Gradient de 1 unité de pH en région acide (pH 3 – 4)

� Séparation de plusieursisoformes d’une protéine acide

22

Les avantages du FFE pour la séparation des protéines

� Accès aux protéines peu abondantes (FFE: une dimension supplémentaire avant le 2D-PAGE et la chromatographie )

� Séparation en haute résolution de protéines en utilisa ntdivers gradients de pH étroits

� Séparation de protéines aux propriétés extrêmes:- protéines très acides et basiques- isoformes avec des points isoélectriques similaires- protéines avec des hauts poids moléculaires- protéines membranaires hydrophobes

23

3. Préfractionnement de peptides avec le FFE pour un emeilleure identification par MS

HPLC(IEX)

In-gel Digest

FFE

HPLC(RP)

HPLC(RP)

Digest

FFE HPLC(RP)

LC-MALDI

ElectrosprayDigest

Conventional workflowfor in-solution digest

FFE workflow forin-solution digest

FFE workflow forin-gel digest

HPLC(IEX)

In-gel Digest

FFE

HPLC(RP)

HPLC(RP)

Digest

FFE HPLC(RP)

LC-MALDI

ElectrosprayDigest

Conventional workflowfor in-solution digest

FFE workflow forin-solution digest

FFE workflow forin-gel digest

Protocole de pré-fractionnement

Le préfractionnement avec le FFE permet l’identificat ion de plus de peptides: ~ 10 000 peptides uniques

Malmström et al.; 2006

24

Conclusions

� La réduction de la complexitédes échantillons

� De creuser plus profondementdans le sous-protéome

� L‘enrichissement de protéinespeu abondantes

� La séparation et le maintien du contexte biologique

BD™ Free Flow Electrophoresis System permet:

BD and BD Logo are trademarks of Becton, Dickinson and Company. ©2006 BD

Le FFE est une méthode de séparation polyvalente

25

26

27

Versatility and Compatibility

PeptidesModified peptidesProteinsProtein complexesProtein isoformsOrganelles

Nanoparticlesetc……

pH rangeResolutionDenaturingNativeetc……

LC-MSMALDI-TOFELISAEnzyme assaysHPLCetc……

DifferentFFE Protocols

DifferentSamples

DifferentAnalyses

28

Compatibility – Native separations

• Native separations:• Media components

• Prolytes

• HPMC

• Glycerol

FFESample Preparation

Sample Preparation

Further Separation

orAnalysis

Further Separation

orAnalysis

• Directly compatible with:• Gel-based analysis

• ELISA assays

• Enzyme activity assays

• Flow cytometry

Sample types: protein complexes, protein purification, plasma, isoforms, etc.

29

Compatibility – Denaturing separations

• Denaturing separations:• Media components

• Prolytes• Mannitol• Urea/Thiourea

FFESample Preparation

Sample Preparation

Further Separation

orAnalysis

Further Separation

orAnalysis

• Compatible with:• LC-MS/MS

• MALDI-TOF

Sample types: peptides, plasma, cell lysates, complex protein mixtures, etc.

FFE Fractions Red/Alk Digestion Clean-up MS

30

Protein Concentration Range

Normally 1-5mg/ml, as low as 50µg/ml possible.

Normal Run Time

30 minutes per sample, as low as 5 minutes possible.

Minimum Sample Volume

50-100µl.

Dilution Factor

1 in 1, but dependent on set-up (pH range, sample load etc).

Technical Notes

31

Resolution (IEF mode)

0.1 pH units, 0.03 pH units possible.

Number of wells per protein

1 or 2, dependent on set-up.

Recovery Rate

Typically >90%, each protein has unique adsorption properties.

Technical Notes

32

The chemical and physical properties of the sample and separation media should be as similar as possible:

� Density

� Viscosity

� Conductivity

� Temperature

Solution:

Dissolve the sample in separation media

OR

Dilute the sample with separation media

Sample Preparation: General Considerations

33

Rule of thumb (IEF):

Total salt concentration of sample < 25mM

Solution:

Dilute or desalt your sample if the conductivity is too high!

Sample Preparation: Salt Concentration

34

Tolerable Additives:

� 8M Urea or 7M thiourea/2M urea

� Nonionic or zwitterionic detergents like CHAPS, CHAPSO, Digitonin, DDM, Octyl-β-D-glucoside, Triton-X-100

� Lower concentrations of salts

� Sucrose

� DTT

� ….. and many more….

Sample Preparation: Additives

35

Reproducibility

0

2

4

6

8

10

12

14

9686766656463626166

FFE fraction number

pH

4455p2

4455p3

4455p4

4455p5

4455p6

• 3 experiments at three different days (all within one week)• Gradient: pH 3-8 urea, mannitol• pI-marker test: 35 min, 2h, 3h, 4h, 5h• Liver lysate separated at: 35 min, 2h, 3h, 4h, 5h

36

M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S

188

98

6249

3828

1714

6

3

kDa

M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S

188

98

6249

38

28

1714

6

3

kDa

M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S

188

98

6249

3828

1714

6

3

kDa

M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S

188

98

6249

3828

1714

6

3

kDa

M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S

188

98

6249

3828

1714

6

3

kDa

4465 35min

4465 2h

4465 3h

4465 4h

4465 5h

Reproducibility (cont.)