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~aunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 272, 289--296 (1972) by Springer-Verlag 1972 Beeinflussung des reticulo-endothelialen Systems durch Chlorophyllin G. GARBE, N. COLD und K. D. FRI]~DB]~O Institut fiir Pharmakologie und Toxikologie der Universitat G6ttingen Eingegangen am 16. August 1971 Effect of Chlorophyllin on the Function of the Retieulo-Endotbelial- System Summary. 1. The phagocytic activity of the reticulo-endothelial system in mice (earbon-clearance test) is depressed after intravenous injection of Cu-ehlorophyllin. Both extent and duration of this reduction are dose-dependent and followed by a stimulation. The weights of liver and spleen are unchanged. 2. Cu-chlorophyllin depresses the endor (1 tzg/kg i.v.) stimulated RES too. The first peak 3 h after endotoxin application is more affected by Cu-chloro- phyllin than the second one, which is accompanied by an increased weight of the spleen. 3. The earbon-suspension itself, which is used during the carbon-clearance test, stimulates the phagocytic activity from 8 h until 8 days. It increases the weight of the liver and spleen. 4. From these results it is concluded that the reduction in phagocytic activity is due to a specific, direct action of Cu-chlorophyllin on the phagocyting ceils. Key words: Reticulo-Endothelial System -- Phagocytosis -- Chlorophyllin -- Endotoxin. In der Litera?mr wurde das Problem der pharmakologischen Wirksam- keit yon Chlorophyll- bzw. Chlorophy]lin-Pr/iparaten immer wieder auf- gegriffen, ohne dab es bislang gelungen w~re, eine einheitliehe Erkl~rung fiir die verschiedenartigen Reaktionen aufzuzeigen. Im Rahmen unserer Untersuehungen fiber die hemmende Wirkung des Cu-Chlorophyllins sowohl auf den anaphylaktischen Schock des Meersehweinchens (Fried- berg u. Mitarb., 1969) als aueh die Lyse von Erythroeyten (Garbe u. Friedberg, 1970) ergaben sich versehiedene Hinweise darauf, dab ein Angriffspunkt des Cu-Chlorophyllins an den Membranen gesucht werden kann. Demnaeh vermuteten wir, Cu-Chlorophyllin wfirde auch an den phagoeytierenden Zellen des RES eine hemmende Wirkung entfalten. Methodik Zur Messung der Speicherf~higkeit der Organe des reticulo-endothelialen Systems an der Maus haben wir nach der Methode yon Biozzi u. Mitarb. (1953) gearbeitet, wie es ausfiihrlich bei Friedberg u. Mitarb. (1971) beschrieben ist. Als

Beeinflussung des reticulo-endothelialen Systems durch Chlorophyllin

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~aunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 272, 289--296 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Beeinflussung des reticulo-endothelialen Systems durch Chlorophyllin

G. GARBE, N. COLD und K. D. FRI]~DB]~O

Institut fiir Pharmakologie und Toxikologie der Universitat G6ttingen

Eingegangen am 16. August 1971

Effect of Chlorophyllin on the Func t ion of the Retieulo-Endotbelial- System

Summary. 1. The phagocytic activity of the reticulo-endothelial system in mice (earbon-clearance test) is depressed after intravenous injection of Cu-ehlorophyllin. Both extent and duration of this reduction are dose-dependent and followed by a stimulation. The weights of liver and spleen are unchanged.

2. Cu-chlorophyllin depresses the endor (1 tzg/kg i.v.) stimulated RES too. The first peak 3 h after endotoxin application is more affected by Cu-chloro- phyllin than the second one, which is accompanied by an increased weight of the spleen.

3. The earbon-suspension itself, which is used during the carbon-clearance test, stimulates the phagocytic activity from 8 h until 8 days. I t increases the weight of the liver and spleen.

4. From these results it is concluded that the reduction in phagocytic activity is due to a specific, direct action of Cu-chlorophyllin on the phagocyting ceils.

Key words: Reticulo-Endothelial System -- Phagocytosis -- Chlorophyllin -- Endotoxin.

I n der Litera?mr wurde das Problem der pharmakologischen Wirksam- keit yon Chlorophyll- bzw. Chlorophy]lin-Pr/iparaten immer wieder auf- gegriffen, ohne dab es bislang gelungen w~re, eine einheitliehe Erkl~rung fiir die verschiedenartigen Reakt ionen aufzuzeigen. I m Rahmen unserer Untersuehungen fiber die hemmende Wirkung des Cu-Chlorophyllins sowohl au f den anaphylakt ischen Schock des Meersehweinchens (Fried- berg u. Mitarb., 1969) als aueh die Lyse von E ry th roey t en (Garbe u. Friedberg, 1970) ergaben sich versehiedene Hinweise darauf, dab ein Angriffspunkt des Cu-Chlorophyllins an den Membranen gesucht werden kann. Demnaeh vermute ten wir, Cu-Chlorophyllin wfirde auch an den phagoeyt ierenden Zellen des R E S eine hemmende Wirkung entfalten.

Methodik

Zur Messung der Speicherf~higkeit der Organe des reticulo-endothelialen Systems an der Maus haben wir nach der Methode yon Biozzi u. Mitarb. (1953) gearbeitet, wie es ausfiihrlich bei Friedberg u. Mitarb. (1971) beschrieben ist. Als

290 G. Garbe, N. Cold und K. D. Friedberg:

k.1000 20~

10

5mg/kg

K 7 15 30rain I 2 4 8Std

k. 1000 26

k. 1000 20

I0

20mg/kg

V V V

K 1 15 30rain 1

80mg/kg

2 4

K I 15 30rain I 2 4

8 5td i

n = 0 85td

H 2 ~ e

t 2 4 8 Tage

Abb. 1. Einflu]~ yon Cu-Chlorophyllin (5, 20 bzw. 80 mg/kg i.v.) auf den Phago- cytoseindex k (~ =~ s~); sofern signifikante Ver~nderungen gegeniiber den Kontroll-

werten (K) auftreten, ist der/0-Wert angegeben

wesentliche Pr~zisierung der ~ethode betrachten wir die Berechnung des Phago- cytoseindex mit Hilfe der Regressionsanalyse anstelle einer graphischen Aus- wertung. - - Die in dieser Arbeit aufgefiihrten Signifikanzangaben beziehen sich -- wenn niehts anderes angegeben ist -- auf den Vergleich mit den Kontrollwerten (t-Test und modifizierter t-Test). Die Versuchszahlen sind und ~/iittelwert und Standardabweichung der Einzelwerte (.~ =~ ax) aufgefdhrt. Eine ausfiihrliehe Dar- stellung finder sich bei Cold (1970).

Ergebnisse 1. Cu-Chlorophyllin

Zun&chst un te r sueh ten wir den Einflul~ yon Cu-Chlorophyl l in al lein in einer n iedr igen Dosierung yon 5 mg/kg au f die Akt iv i t&t des R E S fiber e inen l&ngeren Zei t raum. Bere i t s 15 rain nach der i.v. I n j e k t i o n des

Beeinflussung des RES dureh Chlorophyllin 291

k . 100(2

30

20

o n = K CuC~ E3 E3+ E24

CuChl

I E24 +

CuChl

t-Test / K :<

t - TestlCuChl

"r v "4 "r V

V V V V

< QO01 < O, OOS

< 0.001 ~

Abb.2. Depression des dureh Endotoxin erh6hten Phagocytoseindex k dutch Cu- Chlorophyllin (~ J: ~x). K ~ Kontrollwert; UuChl-~ Cu-Chlorophyllin (80 mg/kg i.v.) 15 rain vor dem Carbon-Clearance-Test; E 3, E2~ -~ Endotoxin (1 ~g/kg i.v.) 3 bzw. 24 Std vor dem Test; die erste Reihe gibt den statistischen Vergleich mit den Kontrollwerten wieder, die zweite Reihe zeigt die Unterschiede zur Cu-Chloro- phyllinbehandlung; in der dritten Reihe sind die Anderungen dureh kombinierte

Behandlung gegeniiber a]leiniger Endotoxinbehandlung aufgeffihrt

Wirkstoffs war eine signifikante Hemmung der Phagocytoserate nach- weisbar, w~hrend nach 60 und 120 rain eine Steigerung auftrat . Bei einer ErhShung der Cu-Chlorophyllin-Dosis auf 20 und 80 mg/kg ergaben sich prinzipiell die gleichen Befunde, nur war die Dauer der Hemmung und der sich anschlieBenden Stimulierung stark verl~ngert (Abb. 1). Die maximale Hemmung t ra t jewefls 15 rain nach der Injektion auf und war in ihrer Intensi~gt dosisabhgngig, wghrend die ~nschlieBende Stimu- lierung mit steigender Dosis nur spgter auftrat , in ihrer Stgrke aber von der Dosis unabh~ngig war (Abb. 1). Zusgtzlich prfiften wir, ob sich dieser biphasische Effekt des Cu-Chiorophyllins wiederholen lie/L 24 S~d nach der Erstinjektion (20 mg/kg) war sowohl die Hemmung nach 15 rain wie auch die Stimulierung nach 2 Std in unverminderter S~grke nachweisbar.

20 Naungn-Schmiedeberg'~ Arch. PharmacoL, Vol, 272

292 G. Garbe, N. Cold und K. D. l~riedberg:

k- 1000

40

30

20

I0

K

t

I

Cught E3 E3+ E24 E24+ CuChl CuChl

t-Te.~t / K .'< ~ ~ ~ V V V V V

t -Test / CuChl :< 1 ~ I I V

i J I i

<0,05 <0,02

Abb.3. Stimulierung des durch Endotoxin erh6hten PhagocyCoseindex k durch Cu-Chlorophyllin (~ ~- sx) ; K = Kontrollwert; CuOhl = Cu-Chlorophyllin (80 mg/ kg i.v.) 24 Std vor dem Carbon-Clearance-Test; E a, E2, = Endotoxin (1 ~tg/kg i.v.) 3 bzw. 24 Std vor dem Test; die erste Reihe gibt den statistischen Vergleich mit den Kontrollwerten wieder, die zweite l~eihe zeigt die Unterschiede zur Cu-Chloro- phyllinbehandlung; in der dritten Reihe sind die Anderungen durch kombiniert~

Behandlung gegenfiber alleiniger Endotoxinbehandlung aufgefiihrt

Ein Einflul~ auf das relative Milz- und Lebergewieht konnte in keinem Versuch festgestellt werden.

2. Cu-Chlorophyllin und Endotoxin

I~ach Friedberg u. Mitarb. (1971) zeigt das RES der Maus nach i.v. Gabe yon Endotoxin (1 Exg/kg) zwei Aktivit/~tsmaxima naeh 2 und 24 Std.

a) Im vorhegenden Zusammenhang wollten ~ wissen, ob die phago- cytosehemmende Eigenschaft des Cu-Chlorophyllins stark genug ist, die Endotoxin-bedingten Steigerungen zu unterdriieken. 80 mg/kg Cu- Chlorophyl[in 15 min vor dem Carbon-Clearance-Teat verringerte die Phagocytosesteigerung naeh Endotoxin betr/~chtlich, wenn aueh nicht vollstiindig (Abb. 2).

Beeinflussung des RES durch Chlorophyllin 293

k. 1000 =

40

3C

26

0 n= K

re/. Milz - Gew.

N 0 n = H

K

1 4

v ~

I 4

V V V V V

I

I 6 85td

V V

6 6 8~d I

2 4 8 Tage

V v V

4 8 Tage I 2

re/. Leber - Gew.

5

0 K

V V V V V

iiHHiiH 1 4 8Std I 2 4 8 Toge

Abb.4. EinfluB einer Kohlensuspension (160 mg C/kg i.v.) auf den Phagocytose- index k und das relative Milz- und Lebergewicht (s ~ sx)

b) Zum anderen sollte gepriift werden, ob die stimulierenden Wirkun- gen yon Cu-Chtorophyllin und Endotoxin sieh addieren. Lediglieh 80 mg/kg Cu-Chlorophyllin 24 Std vor dem Test waren in der Lage die Endotoxin-Ma~ima (nach 3 und 24 Std) signifikant zu erhShen (Abb. 3).

Das relative Milzgewicht verhielt sich bei kombinierter Anwendung yon Cu-Chlorophyllin und Endotoxin genauso wie naeh alleiniger Gabe

2 0 *

294 G. Garbe, N. Cold und K. D. Friedberg:

yon Endotoxin. •ach 3 Std war keine Milzgewichts~nderung, nach 24 Std dagegen eine starke Zunahme zu verzeichnen.

3. Kohle

Unsere Untersuchungen ffihrten zu der Frage, ob durch die Speiche- rung eines unspezifischen Kolloids bereits eine Aktivit~tserh6hung des RES ausl6sbar ist. Flemming u. Graack (1967) hatten die Wirkung yon Chlorophyll in der gleichen Versuehsanordnung geprfift und eine Phago- cytosesteigerung gefunden, ebenso auch nach Applikation anderer pflanzlicher Stoffe, die nur in Suspension angewendet werden konnten (u. a. Cellulose, verschiedene Lignine). Als Testkolloid verwendeten ~:r die zur Carbon-Clearance-Bestimmung hergestellte Kohlesuspension selbst, yon der wir 80 mg C/kg i.v. verabreieh~en. Die erste Prfifung der RES-Aktivit~t erfolgte 60 min nach dieser Vorbehandlung, da sich die Sehwanzvenen vor dieser Zeit nicht deutlich genug abzeichneten und eine erneute i.v. Injektion nicht einwandfrei durchffihrbar war. Der Phago- eytoseindex war 1 mud 4 Std nach Kohleanwendung unver~nderb, 8 Std sparer signifikant erhSht und das Maximum dieser Wirkung wurde naeh 24 Std gefunden. 8 Tage nach Vorbehandlung war der k-Wert immer noch sigrdfikant gesteigert (Abb.4). Das Milz- und Lebergewieht war -- im Gegensatz zu den Versuehen mit Cu-Chlorophfllin -- fiber den gesamten Untersuchungszeitraum erhSht.

Diskussion

Cu-Chlorophyllin zeigte bei der Maus an den Speieherzellen des RES eine phagocytosehemmende Wirkung, die sich sofort nach der Injektion naehweisen lielL Sie war in ihrer St~rke dosisabh~ngig und schon nach 15 min maximal. Auch die erste Phase einer Phagocytosesteigerung nach Endotoxinapplikation konnte dutch Cu-Chlorophyllin fast vollst~ndig anfgehoben werden. Dabei ist zu beaehten, dal~ diese Aktivierung der Phagoeytose 3 Std nach Endotoxin ohne Veriinderungen des relativen )r verl~t~ft, also anf eine Stimulierung der einzeinen Speicher- zelle zurfickzuffihren ist. In der zweiten Phase der Phagocytosesteige- rung 24 Std nach Endotoxin mul~ mit einer Zellvermehrung gerechnet werden, da das Milzgewicht inzwischen stark zunimmt (Friedberg u. Mitarb., 1971). Cu-ChlorophyUin unterdrtickt die erste Phase der Stimu- lierung nach 3 St4 wesentlich starker als die zweite. Es erseheint daher der Sehlu$ berechtigt, dal~ Cu-Chlorophyllin seine Wirkung an den Spei- eherzellen selbst enSfaltet und so die Depression der Phagocytoserate verursacht.

Es wurde noch geprfift, ob die hemmende Wirkung des Cu-Chloro- phyUins auf das RES eventuell dadureh zu erkl~ren ist, da$ die Zellen nach intensiver Speieherung irgendeines Stoffes nieht mehr in der Lage

Beeiixttussung des RES durch Chlorophyllin 295

sind, weitere Substanzen zu phagocytieren, wie es yon Biozzi u. Mitarb. (1953) diskutiert wurde. Zu diesem Zweck wurden die Versuche mit der Kohlevorbehandlung unternommen. Dabei konnte aber kurze Zei$ (60 rain) nach Beladtmg der Speicherzellen mit rein verteilten Tusche- partikeln keine Reduzierung der Phagocytoserate nachgewiesen werden. Dagegen wnrde nach einigen Stunden deutlich, dab das RES auf diesen Reiz mit einer Vermehrung des phagocytierenden Gewebes antwortet, so dal] es zu langdauernder ErhShung der Phagocytoserate kommt. Da sich das RES nach Applikation von Cu-Chlorophyllin vSllig anders ver- h/tlt als nach Kohleinjektion, ist zu folgern, dab es sieh bei der Phago- cytosehemmung durch Cu-Chlorophyllin um eine speziilsehe Eigen- schaft dieser Substanz handelt und dab der Angriffspunk~ dieser Wirkung an der Einzelzelle gesueht werden mul~.

th)rigens sollten aufgrund unserer Befunde mit der Kohlevorbehandlung die Ergebnisse yon Flemming u. Graack (1967) neu disku~iert werden. Diese Autoren hatten 24 Std n~ch i.v. Anwendung yon Suspensionen verschiedener Stoffe pflanz- licher Herkunft eine Aktivititssteigerung des RES gefunden und als spezifische Effekte gedeutet. Wir finden eine en~sprechende Aktivit~tssteigerung n&ch In- jek~ion yon Kohlesuspensionen und gtauben daher, daft es sich bei der yon Flem- ruing u. Graack beobachteten l~ES-Aktivitgtssteigerung eher um einen unspezi- fisehen Suspensionseffekt als um eine spezifische Wirkung der verwendelben Stoffe h~ndelt.

Im Vergleieh zu unseren frfiheren Befunden fiber den EinftuB yon Cu-Chlorophyllin auf den Ablauf anaphylaktiseher Reaktionen des Meersehweinehens (Friedberg u. Mitarb., 1969) f&llt hier besonders auf, dab die gefundene Wirkung auf das RES sehon naeh 15 rain ihr Maximum erreichte. Dagegen t ra t die optima]e Hemmung der Anaphylaxie mit einer erheblichen zeitlichen Latenz yon 2--8 Std auf.

Im Hinbliek auf die MSgliehkeit, dab beide Reaktionen dureh eine direkte Wirkung auf die Zellen des RES bzw. auf die tIistaminspeieher zustande kommen, kSnnten diese Unterschiede ein reines Verteflungs- problem sein. Die phagocytierenden RES-Zellen in Leber und i~ilz werden naeh der Injektion sofort erreieht und die naehgewiesene Hem- mung der Phagoeytose kSnnte als ein ersehwerter Eintr i t t yon Kohle- partikeln dureh die Membran der Zellen aufgefa~t werden. Dagegen wird ffir die Reaktion des Cu-Chlorophyllhls mit den Histamin-speiehernden Zellen wahrsehein]ieh eine l&ngere Anflutungszeit ben6tigt~ Auf alle F~lle spricht die Gewichtskonstanz yon Milz und Leber unter dem Ein- flul~ yon Cu-Chlorophyllin daffir, dab seine Wirkungen am RES Mlein fiber eine Beeinflussung der Einzelzellen zustande kommen. So inter- pretiert ergibt sieh zweifellos aueh eine Parallele zu unseren in vitro- Befunden fiber die Stabilisierung yon Erythrocyten durch Cu-Chloro. phyllin gegenfiber versehiedenen hgmolytischen Einflfissen (Garbe u. Friedberg, 1970).

296 G. Garbe et al.: Beeinflussung des RES durch Chlorophyllin

L i t e r a t u r

Biozzi, G., Benacerraf, B., Halpern, B.N." Quantitative study of the granulo- pectic activity of the reticulo-endothelial system. II. A study of the kinetics of the granulopectie activity of the R.E.S. in relation to the dose of carbon injected. Relationship between the weight of the organs and their activity. Brit. J. exp. Path. 84, 441--457 (1953).

Cold, N. : Die Wirkung yon Cu-Chiorophyllin auf das reticulo-endotheliale System der Maus. Diss., reed., GSttingen 1970.

Flemming, K., Graack, B.: Zur Steigerung der PhagozyCoseaktivit~t des reticulo- endothelialen Systems durch Stoffe pflanzlicher Herkunft. Arzneimittel-l%rsch. 17, 1541--1543 (1967).

Friedberg, K.D., Garbe, G., Grfitzmacher, J.: Untersuchungen fiber die anti- anaphylaktische Wirlrung des Chlorophyllins. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmak. 265, 287--300 (1969).

- - -- Westermann, M.: Beeinflussung des reticulo-endothelialen Systems durch Cyclophosphamid, Endotoxin und Polyvinylpyridin-~-oxid. I~aunyn-Schmiede- bergs Arch. Pharmak. 269, 57--66 (1971).

Garbe, G., Friedberg, K. D. : Stabilisierung und Labilisierung der EryChrocyten- membran durch Chlorophyllin. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Pharmak. 266, 331 (1970).

K. D. Friedberg Institut fiir Pharmakologie und Toxikologie der Universit~t D-3400 G6ttingen, Geiststr. 9 Deutschland