Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Pa~h. u. Pharmak., Bd. 235, S. 351--353 (1959)

Aus den Pharmakologischen Instituten der Universitäten Marburg und Tübingen

Bestimmung von Nitrosobenzol im Blute Von

FRANZ HERR und MANFRED KIESE

(Eingegangen am 10. November 1958)

BAMBERG~~ hat gefunden, daß Nitrosobenzol in essigsaurer Lösung mi t salpetriger Säure Diazobenzol bildet. Diese Reaktion haben wir zur Best immung des Nitrosobenzols benutzt. Das Diazobenzol wurde mit ~-Naphthyläthylendiamin gekuppelt. Die Konzentrat ion des roten Farbstoffs wurde optisch gemessen.

Wenn im 0rganismus Nitrosobenzol vorkommt, dann ist auch Anilin vorhanden, sei es daß Nitrosobenzol im 0rganismus aus Anilin gebildet wird (KIEs~) oder Nitrosobenzol zu Anilin reduziert wird (HAAr, I~ES~ u. W~.m~E~). Das Nitrosobenzol mußte darum von diazotierbaren aromatischen Aminen vor der Best immung abgetrennt werden.

Zusammen mi t aromatischen Aminen wurde das I~itrosobenzol dem mi t Wasser verdünnten Blut durch Tetrachlorkohlenstoff entzogen. Aromatische Amine wurden aus dem Tetraehlorkohlenstoff durch Waschen mi t Schwefelsäure entfernt. Das im Tetrachlorkohlenstoff verbleibende l~itrosobenzol wurde durch Zugabe von Eisessig und wäßriger Nitrit-Lösung diazotiert, der Überschuß an salpetriger Säure mi t Ammoniumsulfamat zersetzt und das Diazobenzol mit «-Naphthyl- äthylendiamin gekuppelt. Der rote Farbstoff befand sich in der v o m

Tetrachlorkohlenstoff getrennten wäßrigen Essigsäure. Da Nitrosobenzol wie Sauerstoff und Kohlenoxyd reversibel an

Hämoglobin gebunden wird (Jv~G), wurde das Nitrosobenzol zur leichteren Extrakt ion vom Hämoglobin durch dessen Oxydation mit Ferricyanid zu Hämiglobin freigesetzt. Durch das Ferricyanid wurde auch etwa vorhandenes Phenylhydroxylamin zu Nitrosobenzol oxydiert und dadurch ebenfalls erfaßt. Für die in den folgenden Arbeiten (KI~SE; ItAAN, KI~s]~ u. W~~NER) beschriebenen Untersuchungen war die gemeinsame Best immung von Nitrosobenzol und Phenylhydroxylamin nicht nur kein Nachteil, sondern ein Vorteil, da Nitrosobenzol im Organismus zu Phenylhydroxylamin reduziert wird und dieses bei seiner wesentlichen Wirkung, der Hämiglobinbildung, wieder zu I~itroso- benzol oxydiert wird.

352 F. HEm~ und M. KIESE :

Dem Blu t zugesetztes Nitrosobenzol konn te n icht vollständig wieder- gewonnen werden. Auch wenn das Blu t unmi t t e lba r nach Zugabe des Nitrosobenzols extrahier t wurde, waren im Tetrachlorkohlenstoff nu r etwa 600/0 des Nitrosobenzols enthal ten. Durch nochmalige Ex t r ak t ion des Blutes mi t Tetrachlorkohlenstoff wurde kein Nitrosobenzol mehr erhalten.

Der Verbleib des n icht ex t rahierbaren Nitrosobenzols ist bisher nicht bekannt . Auch aus Serum wurde Nitrosobenzol nu r zu 700/0 wieder- gewonnen.

Der aus B lu t extrahierbare Antei l des zugesetzten Nitrosobenzols ist - - in Anbe t r ach t der kleinen Mengen - - befriedigend gleichmäßig. I n der Tabelle s ind die Ergebnisse einer Reihe von 40 Analysen an Blut- proben, denen 0,53--3,71 ~ Nitrosobenzol je Milliliter zugesetzt worden waren, wiedergegeben.

Tabelle Bestimmung von Nitrosobeuzol im Blut nach Zugabe von Nitrosobenzol zu de/ibriniertem

Rinderblut

Die Ergebnisse sind Mittel aus je 6--7 Analysen, a Streuung der Einzelwerte (a 2 mittlere quadratische Abweichung der Einzelwerte vom arithmetischcn Mittel)

Nitrosobenzol zugesetzt ~,/ml Blut

0,53 1,06 1,59 2,12 2,65 3,71

Nitrosobenzol im Blut gefunden

r /ml Blut

0,31 0,69 0,99 1,22 1,57 2,22

0,08 0,15 0,20 0,20 0,18 0,30

gefundenes Nitrosobenzol

zugesetztesNitrosobenzol

0,59 0,65 0,63 0,58 0,59 0,60

Methode Zu 8 ml Wasser, denen 3 Tropfen 10°/0ige Kaliumferricyanidlösung zugesetzt

waren (zur Spaltung der Nitrosobenzol-Hämoglobin-Verbindung durch Oxydation des Hämog]obins), wurden 2--3 ml Blut und 6 m] Tetrachlorkohlensteff gegeben. ])as Gemisch wurde sofort 10 min auf der Maschine stark geschüttelt und dann 10 min bei etwa 3200 g zentrffugiert. Danach wurde die wäßrige Schicht abgesaugt und der Tetrachlorkohlenstoff zur Entfernung von Anflm zweimal mit 10 ml 0,05 n Schwefelsäure durch Schütteln auf der Maschine gewaschen. Die Schwefel- säure wurde abgesaugt; danach wurde die Gefäßwand jedesmal mit Wasser abge- spült und das Wasser abgesaugt. Der gewaschene Tetrachlorkohlenstoff wurde in einen gradnier~en Schüttelzylinder gegeben, gemessen, mit 2 ml Eisessig und 0,1 ml 20°/oiger wäßriger Natriumnitritlösung versetzt und im Laufe von 15 min 3mal kräftig durchgeschüttelt. Zur Zerlegung überschüssiger salpetriger Säure wurden 0,2 ml 50°/oiger wäßriger AmmoniumsulfamatlÖsung zugesetzt und die AnsBtze wiederum mehrmals kräftig durchgeschüttelt. Nach 10 min wurden 3 Trop- fen 0,5°/0iger wäßrigcr a-Naphthyläthylendiamlnlösung zugesetzt. ]:)as Gemisch wurde nochmals kurz durchgeschüttelt und dann 2 Std lang im Dunkeln gehalten. Der Azofarbstoff befand sich in dem vom Tetrachlorkohlenstoff getrennten Gemisch aus Eisessig und Wasser. ])essen Menge wurde vor der Entuahme zur optischen

Bestimmung von Nitrosobenzol 353

Messung bestimmt. Die Extinktion der Lösung wurde bei 555 m/~ gemessen. War dies Eisessig-Wasser-Gemisch stark gefärbt, so wurde es zur einfacheren Hand- habung vor der Entnahme mit 80°/0iger Essigsäure auf ein bestimmtes Volumen aufgefüllt. Nach Ablauf der Kupplung im Dunkeln wurden alle weiteren Operatio- nen bei gedämpftem Licht durchgeführt.

Die Belichtung der Ansätze mußte vermieden werden, weil sie in dem Gemisch von Eisessig, Tetraehlorkohlenstoff und den zur Diazotierung und Kupplung angewandten Reagentien -- auch bei Abwesenheit von Nitrosobenzol - - die Bildung eines grünen Farbstoffs bewirkte. Der aus Nitrosobenzol gebildete rote Farbstoff blieb in dem Gemisch bei Ausschluß der Einwirkung von Licht unverändert.

Unter Berücksichtigung der Verluste an Tetrachlorkohlenstoff beim Waschen (Absangen der Schwefelsäure und des Wassers) und der endliehen Menge Elsessig- lösung wurde der Gehalt an Nitrosobenzol aus der Extinktion berechnet.

Die optischen Messungen wurden mit den Spektralphotometern von Beek- man und Zeiss durchgeführt. Wenn die Menge des erfaßten Nitrosobenzols eine Verdünnung der Farbstoff]ösung erlaubte oder erforderte, wurde in den üblichen Cuvetten von 1 cm Schichte gemessen. Zur Bestimmung sehr kleiner Mengen von l~itrosobenzol wurde das Eisessig-Wasser-Gemiseh unverdüunt entnommen und in einer Mikrocuvette mit 5 cm Schichte (Zeiss) gemessen.

Z u s a m m e n f a s s u n g

D u r c h E x t r a k t i o n m i t T e t r a c h l o r k o h l e n s t o f f , D i a z o t i e r u n g in E i sess ig

u n d K u p p l u n g m i t « - N a p h t h y l ä t h y l e n d i a m i n k o n n t e n k le ine M e n g e n

v o n I~ i t rosobenzo l i m B l u t p h o t o m e t r i s e h b e s t i m m t werden .

Fräulein RVTH-]~~IA VON WOL~F und ~BJ_~RIÆ~NE KEUP haben wir für Hilfe bei den Untersuchungen zu danken.

Die Untersuchungen wurden mit Unterstützung der Deutschen Forsehungs- gemeinschaft durchgeführt.

Literatur BAMBERGER, E. : Notiz über die Diazotierung des Nitrosobenzols, Ber. dtsch, chem.

Ges. 51, 634 (1918). ~-~AAN, J., M. KIESE U. A. WERI~ER: Reduktion von Nitrosobenzol zu Anilin in

roten BlutzeUen. l~aunyn-Sehmiedeberg's Arch. exp. Path. Pharmak. 235, 365 (1959).

Ju~o, F. : Hämoglobin und Oxydationsprodukte des ~fil ins. Biochem. Z. 305, 248 (1940).

Kx~.s~, M.: Oxydation von Anilin zu Nitrosobenzol im Hunde. Naunyn-Schmiede- berg's Areh. exp. Path. Pharmak. 285, 354, 360 (1959).

Prof. Dr. M. KIE8E, Pharmakologisehes Inst i tut der Universität Tübingen, Wilhelmstraße 56