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Aus dem
Institut für Veterinär-Pathologie
der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
und
der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Beurteilung von nativen und aufgetauten Spermatozoen
fertiler und subfertiler Hengste mit Hilfe der
Phasenkontrast- und
Transmissionselektronenmikroskopie
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Grades eines
Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
durch die Veterinärmedizinische Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von
Ellen Smedts
aus Rumst, Belgien
Leipzig 2012
Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Dekan: Prof. Dr. Uwe Truyen
Betreuer: Prof. Dr. Heinz-Adolf Schoon
Prof. Dr. Harald Sieme
Gutachter: Prof. Dr. Heinz-Adolf Schoon
Institut für Veterinär-Pathologie
der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig
Prof. Dr. Harald Sieme
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. Heinrich Bollwein
Klinik für Rinder
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der Verteidigung: 13. Dezember 2011
Meiner Familie
und
der Familie Huesmann
Inhaltsverzeichnis
2.1 METHODEN ZUR QUALITATIVEN BEURTEILUNG VON SPERMIEN ...................................2
2.1.1 Beurteilung des Kernes .............................................................................3
2.1.2 Beurteilung des Akrosoms ........................................................................3
2.1.3 Beurteilung der Mitochondrien .................................................................5
2.1.4 Beurteilung der Plasmamembran ...............................................................6
2.1.5 Sonstige Methoden für die Spermienbeurteilung .......................................8
2.2 MORPHOLOGIE, ULTRASTRUKTUR, PHYSIOLOGIE UND PATHOLOGIE ...........................9
2.2.1 Der Kopf ................................................................................................. 10
2.2.1.1 Anatomie ................................................................................................ 10
2.2.1.2 Pathologie ............................................................................................... 13
2.2.2 Der Hals.................................................................................................. 15
2.2.2.1 Anatomie ................................................................................................ 15
2.2.2.2 Pathologie ............................................................................................... 17
2.2.3 Die Geißel............................................................................................... 19
2.2.3.1 Hauptstrukturen der Geißel ..................................................................... 19
2.2.3.2 Die Mitochondrien .................................................................................. 20
2.2.3.3 Das Axonema ......................................................................................... 22
2.2.3.4 Die Mantelfasern oder „Outer Dense Fibers“ .......................................... 27
2.2.3.5 Die Ringfasern oder „Fibrous Sheath“..................................................... 27
3.2.3.6 Die Plasmamembran ............................................................................... 28
3.1 PROBANDEN ................................................................................................................. 31
3.2 PROBENGEWINNUNG, -UNTERSUCHUNG UND -VERARBEITUNG .................................... 32
3.2.1 Probenaufbereitung für die Phasenkontrastmikroskopie .......................... 33
3.2.2 Probenaufbereitung für die TEM ............................................................. 33
3.2.3 Einfrieren des restlichen nativen Sperma ................................................. 34
3.2.4 Weitere Probenaufbereitung im Institut für Veterinär-Pathologie der
Universität Leipzig.................................................................................. 34
3.2.5 Elektronenmikroskopische Beurteilung ................................................... 38
3.3 STATISTIK .................................................................................................................... 39
1 EINLEITUNG ...................................................................................................................1
2 LITERATUR .....................................................................................................................2
3 MATERIAL UND METHODEN .................................................................................... 31
4 ERGEBNISSE ................................................................................................................. 41
4.1 MOTILITÄT .................................................................................................................. 41
4.2 MORPHOLOGISCHE BEURTEILUNG MITTELS PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE .......... 43
4.3 MORPHOLOGISCHE BEURTEILUNG MITTELS TEM ..................................................... 48
4.3.1 Die Plasmamembran ............................................................................... 48
4.3.1.1 Spermienköpfe ........................................................................................ 48
4.3.1.2 Geißelquerschnitte .................................................................................. 50
4.3.2 Das Akrosom .......................................................................................... 51
4.3.3 Der Kern ................................................................................................. 55
4.3.4 Der Hals.................................................................................................. 56
4.3.5 Plasmatropfen ......................................................................................... 57
4.3.6 Mikrotubuläre Masse (MM) ................................................................... 58
4.3.7 Mitochondrien, Ringfasern, Mantelfasern und Axonemastruktur ............. 60
4.3.8 Doppelgeißel und Doppelköpfe ............................................................... 63
4.3.9 Längsschnitte .......................................................................................... 65
4.3.10 Sonstige Beobachtungen / andere Zellen oder Zellpartikeln im Ejakulat .. 66
4.4 STATISTISCHE ZUSAMMENFASSUNG DER QUANTITATIVEN TEM-ERGEBNISSE ........... 69
4.4.1 Vergleich der nativen und der aufgetauten Proben ................................... 69
4.4.2 Einfluss der Fertilität auf die TEM-Befunde ............................................ 71
4.4.3 Vergleich der Untersuchungsmethoden ................................................... 74
4.4.4 Einfluss des Alters auf die Spermienqualität ........................................... 75
5.1 MORPHOLOGISCHE BEURTEILUNG VON HENGSTSPERMIEN MITTELS
PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE UND TEM .............................................................. 77
5.2 EINFLUSS DES EINFRIER- UND AUFTAUPROZESSES AUF DIE
SPERMIENMORPHOLOGIE ........................................................................................... 85
9.1 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN ............................................................................. 109
9.2 FERTILITÄT DER PROBANDEN .................................................................................... 110
9.3 REZEPTUREN ............................................................................................................. 113
9.4 PROTOKOLL FÜR DIE MORPHOLOGISCHE BEURTEILUNG FIXIERTER SPERMIEN DER
REPRODUKTIONSMEDIZINISCHEN EINHEIT DER KLINIKEN – TIERÄRZTLICHE
HOCHSCHULE HANNOVER ........................................................................................ 116
5 DISKUSSION .................................................................................................................. 77
6 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................. 94
7 SUMMARY ..................................................................................................................... 96
8 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................ 98
9 ANHANG ....................................................................................................................... 109
9.5 PROTOKOLL FÜR DIE TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPISCHE BEURTEILUNG
VON SPERMIEN .......................................................................................................... 117
9.5.1 Standardprotokoll für die Beurteilung von Spermienköpfen .................. 117
9.5.2 Standardprotokoll für die Beurteilung von Geißelquerschnitten ............. 118
9.5.3 Standardprotokoll für die Beurteilung von Geißellängsschnitten ........... 119
DANKSAGUNG ............................................................................................................... 120
Verzeichnis der Abkürzungen
% Prozent
°C Grad Celcius
Abb. Abbildung
ADP Adenosindiphospat
AO Akridinorange
Aqua bidest. Aqua bidestillata <lat> doppelt destilliertes Wasser
ARA Acrosome Responsiveness Assay <engl>
ATP Adenosintriphospat
BDMA Benzyldimethylamine
bzw. beziehungsweise
CFDA Carboxyfluoreszein-Diazetat
CGSA Computer-gestützte Spermaanalyse
CTC Chlortetracyclin-Färbung
DNS Desoxyribonukleinsäure
et al. et alii <lat> und andere
Fa. Firma
FITC Fluoreszein-Isothiocyanat
g Gramm
h hora <lat> Stunde
HOST Hyperosmotischer Schwelltest
INRA 82 ´Institut National de la Recherche Agronomique´ - Verdünner
JC-1 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolyl-
carbocyanin-iodid
kV Kilovolt
LM Lichtmikroskopie
ln logarithmisch normal-verteilte Parameter
M Molar
M540 Merocyanin-540
min Minute
ml Milliliter
m Anzahl der Ejakulate pro Proband
mm Millimeter
MM Mikrotubuläre Masse
MTG MitoTracker Green-Farbstoff
n Anzahl der Probanden
nm Nanometer
nn nicht normal-verteilte Parameter
no normal-verteilte Parameter
NRR33 Non return rate on day 33 <engl> keine weitere Belegung bis
Tag 33
p < 0,05 Irrtumswahrscheinlichkeit <5%
PE Phykoerythrin
pH Pondus hydrogenii <lat> negativer dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
PI Propidiumiodid
PIPES Piperazine-1,4-bis-(2-ethansulfonsäure)
PMOT Progressive Motilität = Vorwärtsbeweglichkeit
PNA Peanut Agglutinin <engl> Erdnuss (Arachis hypogea)
Agglutinin
PSA Erbsen (Pisum sativum)-Agglutinin
R123 Rhodamin 123
REM Rasterelektronenmikroskopie
RNS Ribonukleinsäure
rpm Umdrehungen pro Minute
s Sekunde
s. siehe
S. Seite
SAS®
Statistical Analysis System
SCGE Single-cell gel electrophoresis <engl>
Einzelzellgelelektrophorese
SCSA Spermienchromatinstrukturanalyse
SD Standard deviation <engl> Standardabweichung
sog. sogenannt
Stat. Vert. Statistische Verteilung
TEM Transmissionselektronenmikroskopie
TG Tiefgefrierung
t-RNS transfer-Ribonukleinsäure
Tr/R Trächtigkeitsrate pro Rosse am Ende der Saison
usw und so weiter
Arithmetischer Mittelwert
geom Geometrischer Mittelwert
z.B. zum Beispiel
μg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
ZTU Zuchttauglichkeitsuntersuchung
Einleitung 1
1 Einleitung
Hengste werden in erster Linie aufgrund ihrer sportlichen Leistungen selektiert und nur selten
aufgrund ihrer Fertilität. Gerade bei jungen Hengsten wäre es jedoch sinnvoll, die Befruch-
tungsfähigkeit prognostizieren zu können. Eine gute Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien
und normale morphologische Befunde sind jedoch keine Garantie für ausreichende Fertilität.
Die Fertilität steht für die Fähigkeit eines Hengstes sein genetisches Material zu vererben. Es
bleibt die Frage, welche Labortests präzise genug sind, um korrekte Aussagen zur Fertilität
machen zu können (COLENBRANDER et al. 2003; KUISMA et al. 2006). In den letzten
Jahrzehnten hat man immer speziellere Methoden entwickelt, um die Ultrastruktur, die Bio-
chemie und den bioenergetischen Status vitaler Zellorganellen zu bestimmen. Die Verbesse-
rung der Aufbereitungsmethoden für die Transmissions- (TEM) und Rasterelektronenmikro-
skopie (REM) eröffneten völlig neue Einblicke in die Spermienultrastruktur.
Aus der Verwendung von Tiefgefriersamen resultiert eine im Vergleich zu Frischsamen nied-
rigere Trächtigkeitsrate. Sein Einsatz bietet allerdings Vorteile für die Besamung von Stuten
im Ausland oder den Deckeinsatz von Hengsten im Turniersport, die nicht regelmäßig
abgesamt werden können. In zahlreichen Studien wurden unterschiedliche Einfrierprotokolle
und Verdünner untersucht, die jedoch die Spermienqualität nach dem Auftauen bisher nicht
maßgeblich verbessern konnten (CRABO 2001; HOFFMANN 2007). Nur bei genauer
Kenntnis der biochemischen und ultrastrukturellen Änderungen während des Einfrierprozes-
ses ist es möglich, durch Entwicklung angepasster Protokolle und das Hinzufügen
kryoprotektiver Stoffe, eine bessere Vitalität aufgetauter Spermien zu erreichen.
Das Ziel dieser Studie ist das Beschreiben der morphologischen Veränderungen in Ejakulaten
von fertilen und subfertilen Hengsten vor und nach dem Einfrieren mit Hilfe der TEM, sowie
die Erstellung eines Standardprotokolls für die transmissionselektronenmikroskopische Beur-
teilung equiner Spermien.
Literatur 2
2 Literatur
2.1 Methoden zur qualitativen Beurteilung von Spermien
In den letzten Jahrzehnten hat man immer speziellere Methoden entwickelt, um die Vitalität
der Spermien zu bestimmen. Manche dieser Methoden beurteilen den morphologischen Auf-
bau des Spermiums, während andere eine Aussage zur Funktionalität spezifischer Organellen
liefern.
Für eine routinemäßige Beurteilung der Spermienmorphologie ist die Phasenkontrastmikro-
skopie die meist verwendete Methode. Mit Hilfe eines Standardprotokolls werden die Abwei-
chungen von 200 Spermien aufgelistet (DOWSETT et al. 1984; CROSS und MEIZEL 1989;
JASKO et al. 1990; KAVAK et al. 2004; CARD 2005). Zusätzlich kann die Größe verschie-
dener Spermienteile oder der Kreisumfang der Köpfe mittels Morphometrie gemessen werden
(BALL und MOHAMMED 1995; ARRUDA et al. 2002; COLENBRANDER et al. 2003).
Laut GRAVANCE et al. 1996 haben subfertile Hengste oft abweichende Messwerte,
ARRUDA et al. (2002) weisen jedoch darauf hin, dass zudem Verdünner einen Einfluss auf
die Morphometrieergebnisse haben. Außerdem stellten BALL und MOHAMMED (1995)
auch bei fertilen Hengsten große Unterschiede der Spermienumfänge fest. Detaillierte Bilder
des Spermienaufbaus, sowohl der oberflächlichen als auch der inneren Ultrastrukturen können
mittels der Elektronenmikroskopie erfasst werden (DOWSETT et al. 1984; VARNER et al.
1987; CROSS und MEIZEL 1989; GRØNDAL et al. 1994).
Färbungen erlauben eine Beurteilung der Integrität der Plasmamembran (Eosin-Nigrosin), des
Kerns (Feulgen-DNS, Akridinorange), des Akrosoms (Coomassie-blau) und der
Mitochondrien (Methylen-blau) (TEJADA et al. 1984; GRAHAM 1996; CARD 1998;
GOPALKRISHNAN et al. 1999; CHANDLER et al. 2000; MERKIES et al. 2000; BRUM et
al. 2006). Flowzytometrischen Verfahren ermöglichen dem Untersucher die Funktionalität
einer oder mehrerer Zellorganellen vieler Spermien in einigen Minuten zu bewerten. Einige
dieser Färbungen sowie auch einige andere organellenspezifische Beurteilungsmethoden sind
in den folgenden Kapiteln weiter erläutert.
Literatur 3
2.1.1 Beurteilung des Kernes
Die Beurteilung des Kernes kann sowohl mit Hilfe von Licht- und Elektronenmikroskopie, als
auch mittels flowzytometrischer Färbungen erfolgen (ROYERE et al. 1996).
Die Feulgen-DNS-Färbung eignet sich für die Darstellung von Vakuolen, Chromatindefekten
und anormalen Kopfformen. Normale Spermien sind uniform magenta bis dunkellila gefärbt
(CARD 1998). Akridinorange (AO)-Ausstriche färben doppelsträngige DNS grün und
einzelsträngige DNS und RNS rot, wobei Spermien mit grünen Köpfen als fertile Zellen be-
zeichnet werden (TEJADA et al. 1984).
Der Spermienchromatinstrukturanalyse (SCSA) überprüft die Denaturierungsempfindlichkeit
der DNS. Nach einer Inkubation der Spermien in einem sauren Milieu werden die DNS-
Änderungen mittels der AO-Färbung erfasst. Dieser Test liefert zusätzliche Information über
die Chromatinstabilität der Spermien und ist auch beim Hengst beschrieben worden (LOVE
und KENNEY 1998; LOVE et al. 2001; GIWERCMAN et al. 2003; BARRELET 2005;
LOVE 2005; TURNER 2005).
Eine andere Technik ist die Einzelzellgelelektrophorese (single-cell gel electrophoresis oder
SCGE). Spermien mit DNS-Schäden zeigen fragmentierte DNS-Teile (FAIRBAIRN et al.
1995; COLLINS et al. 1997; LINFOR und MEYERS 2002; NEILD et al. 2005).
2.1.2 Beurteilung des Akrosoms
Die Funktionalität des Akrosoms kann mit dem ´Acrosome Responsiveness Assay´ (ARA)
gemessen werden. Dieser Test untersucht die Fähigkeit der Spermien, in einem artefiziellen
Medium mit einem Calciumionophor eine Akrosomreaktion einzugehen. Da das Akrosom des
Hengstes sehr dünn ist, ist es schwierig mittels Phasenkontrastmikroskopie zu beurteilen.
Deswegen wird der Akrosomzustand nach dem ARA mittels TEM oder mittels Färbungsme-
thoden interpretiert (VARNER et al. 2000; VARNER et al.2002; TURNER 2005).
Literatur 4
Die Spermac®-Färbung färbt das Akrosom, das Mittelstück und die Geißel grün, die
Äquatorialregion blaß-grün und den postakrosomalen Bereich rot. Je kleiner die Intensität der
grünen Komponente, desto größer ist der akrosomale Schaden (HEFFE 1993). Die Dual-
Stain-Färbung nutzt als ersten Farbstoff Trypanblau und macht eine Differenzierung zwi-
schen lebenden (ungefärbt) und toten Spermien (blau) möglich. Der zweite Farbstoff ist eine
Giemsalösung, die eine violette Farbe im Akrosombereich verursacht. Fehlt die violette Far-
be, dann ist das Akrosom vollständig abgelöst (HEFFE 1993). Die Kombination Trypanblau,
Bismark-braun und Bengalrosa (Triple-Stain) ermöglicht eine Beurteilung der
Akrosomreaktion (NEILD et al. 2005). Mittels der Coomassie-blau-Färbung zeigen intakte
Akrosome im ganzen Akrosombereich eine hellblaue Färbung, während beschädigte
Akrosome nicht oder nur teilweise angefärbt sind (BRUM et al. 2006).
Fluoreszein-Isothiocyanat-konjugiertes Erbsen (Pisum sativum)-Agglutinin (FITC-PSA) wird
oft zusammen mit Propidiumiodid (PI) angewendet. PI evaluiert die Plasmamembranintegrität
und FITC-PSA die Akrosomintegrität. Das PSA-Lektin bindet die Glykokonjugate der
akrosomalen Matrix oder der äußeren akrosomalen Membran und wird sichtbar gemacht
durch das an das Lectin gebundene Fluoreszein. Das PSA kann die intakte Membran weder
binden noch durchdringen, sodass intakte Spermien keine Fluoreszenz zeigen. Beschädigte
Akrosome sind grün, doch bei einem totalen Verlust der akrosomalen Matrix sind die
Spermienköpfe nicht angefärbt, da wahrscheinlich auch die Bindungsstellen des PSA nicht
mehr vorhanden sind (FARLIN et al. 1992). Diese Methode ermöglicht die Einteilung der
Spermien in akrosomintakte Spermien (helle Fluoreszenz im proximalen Akrosombereich
durch die Bindung des Lektin an die intakte äußere akrosomale Membran), Spermien mit be-
ginnender Akrosomreaktion (fluoreszierende Teile im proximalen Akrosombereich, da die
äußere akrosomale Membran an manchen Stellen unterbrochen ist) und Spermien mit voll-
ständiger Akrosomreaktion (keine Fluoreszenz oder nur im Bereich des Äquatorialsegmentes)
(CHENG et al. 1996). Bei Tiefgefriersamen sollte der Eidotterverdünner zuerst entfernt wer-
den, da er einige Affinität zu PSA hat. Eine Färbung mit Phykoerythrin-konjugiertem Erdnuss
(Arachis hypogea)-Agglutinin (PE-PNA) ist der FITC-PSA-Färbung ähnlich, aber PNA hat
keine Eidotteraffinität und färbt das Hengstakrosom deutlicher an. PE-Fluoreszenz kann un-
abhängig von PI oder SYBR-14 gemessen werden (GRAHAM 1996; NAGY et al. 2003). Die
Literatur 5
Akrosomreaktion findet nur statt, wenn eine erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentration in
den kapazitierten Spermien vorhanden ist. Da FITC-PNA nur dann die Epitope der äußeren
akrosomalen Membran binden kann, ist die FITC-PNA-Färbung, genau so wie die
Chlortetracyclin(CTC)-Färbung, kalziumabhängig (RATHI et al. 2001B).
Die Elektronenmikroskopie ist die Methode der Wahl, um das Akrosom zu beurteilen. Sper-
mien mit einer Vesikelbildung der äußeren akrosomalen Membran und der Plasmamembran,
zusammen mit einem intakten Äquatorialsegment, werden in der Elektronenmikroskopie als
akrosomreagiert angesehen. Spontane Akrosomreaktionen oder Akrosomreaktionen induziert
mittels A23187 zeigen keine ultrastrukturellen Unterschiede (VARNER et al. 1987). Außer-
dem sind echte Akrosomreaktionen, die nach der Kapazitation auftreten, nicht von den fal-
schen Akrosomreaktionen, die auf Zelldegeneration hinweisen, zu unterscheiden (ZAMBONI
1987; CHENG et al. 1996).
2.1.3 Beurteilung der Mitochondrien
Für die optische Darstellung der Mitochondrien kann MitoTracker Green-Farbstoff (MTG)
verwendet werden. MTG ist nicht fluoreszierend in wässrigen Lösungen, färbt aber die Mito-
chondrien grün und ermöglicht so die Beurteilung ihrer Größe und Position (GARNER et al.
1997). Da diese Färbung keine zusätzliche Information über das Membranpotential liefert, ist
sie für die Beurteilung der Mitochondrienfunktion nicht geeignet (HALLAP et all. 2005).
Rhodamin 123 (R123) dagegen lagert sich in den Mitochondrien, abhängig vom
transmembranösen Potential, als grüner Farbstoff ab. In Kombination mit Ethidiumbromid
oder Propidiumbromid erhält man zusätzliche Informationen über die Vitalität der Spermien,
da nur tote Spermien diese Bromide aufnehmen (GARNER et al. 1997; MAGISTRINI et al.
1997; TURNER 2005). Für die Untersuchung von Gefrierschäden empfehlen THOMAS et al.
(1998) die Farbstoffe 5,5’,6,6’-tetrachloro1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanin-
iodid (JC-1). HALLAP et al. (2005) bestätigten die Brauchbarkeit dieser Farbstoffe, jedoch
nur bei nicht eingefrorenen Rinderspermien. Bei einer Wellenlänge von 488 nm kann eine
grüne (Bildung von JC-1-Aggregaten bei mäßigem bis niedrigem Membranpotential) und eine
rot-orange (JC-1-Monomere bei höherem Membranpotential) Spermienpopulation unterschie-
Literatur 6
den werden. In einigen Fällen kommt es zu einem progressiven Gradienten zwischen beiden
Populationen. Diese zusätzliche Information macht dieses Verfahren aussagekraftiger als
andere mitochondriale Färbungen. GRAVANCE et al. (2000) stellten fest, dass die JC-1-
Färbetechnik nicht nur für Rinderspermien, sondern auch für die Beurteilung von Hengst-
spermien sehr sinnvoll ist. Bei aufgetauten Spermienproben ist allerdings eine Interferenz mit
den Verdünnerkomponenten möglich (MARTINEZ-PASTOR et al. 2004; TURNER 2005).
Das Cytochrom c2+
ist Teil des Elektronentransportsystems und ermöglicht die Beurteilung
der Membranintegrität. Es kann nicht durch die äußere mitochondriale Membran hindurchtre-
ten, so dass die Oxidation dieses Cytochroms nach dem Hinzufügen eines Oxidationsmittels
in vitro nur bei einer Beschädigung der äußeren mitochondrialen Membran und der Plasma-
membran auftreten kann (SCHOBER et al. 2007).
Bioenergetische Parameter ermöglichen eine Beurteilung des Krebs-Zyklus und des Elektro-
nentransportsystems in den Mitochondrien. Die Sauerstoff-Verbrauchsrate kann in einem
Glukosepuffer, in einem Puffer mit 15 µM Oligomycin (gehemmte Atmungskette) und in
einem Puffer mit 60 µM Dinitrophenol (entkoppelte Atmungskette) bestimmt werden
(SCHOBER et al. 2007). Die Konzentration des Endmoleküls der oxidativen Phosphorylie-
rung (ATP), kann mittels der Biolumineszenz-Technik bestimmt werden (VIDAMENT et al.
1998).
2.1.4 Beurteilung der Plasmamembran
Die TEM ermöglicht die Darstellung der Plasmamembran, doch die Aufbereitungsmethode
der Proben und die Fixierung können die Intaktheit der Membran beeinflussen (PESCH
2005).
Die Eosin-Nigrosin-Färbung und die Färbung mit Trypanblau sind einfache Methoden, um
lebende und tote Spermien zu unterscheiden. Da diese Farbstoffe nur durch defekte Membra-
nen penetrieren, werden teilweise oder vollständig angefärbte Spermien als tot bezeichnet.
Die Ergebnisse beider Färbungen korrelieren gut, doch die Anzahl der Spermien mit intakter
Literatur 7
Plasmamembran wird im Vergleich zu den fluoreszierenden Färbungen manchmal überschätzt
(BRITO et al. 2003).
Die Chlortetracyclin-Färbung (CTC) nutzt ein fluoreszierendes Antibiotikum und differen-
ziert fixierte Spermien in nicht-kapazitierte Spermien, kapazitierte und akrosomintakte Sper-
mien und kapazitierte, akrosomreagierte Spermien (TURNER 2005).
Sowohl PI/SYBR-14 und PI/CFDA (Carboxyfluoreszein-Diazetat) als auch PI/Kalzein mes-
sen die Intaktheit der Plasmamembran und liefern die gleichen Ergebnisse (BRITO et al.
2003). SYBR-14 kann die Membran penetrieren und färbt die Nukleinsäure aller Zellen grün.
PI ist ein nicht membranpermeabler Farbstoff, der die DNS membrangeschädigter Zellen rot
anfärbt, wobei die grüne Farbe von SYBR-14 verdrängt wird (GARNER et al. 1994; GAR-
NER und JOHNSON 1995; GARNER et al. 1997; MAGISTRINI et al. 1997; GRAVANCE
et al. 2001; BRITO et al. 2003; NAGY et al. 2003; TURNER 2005; HALLAP et al. 2006).
Merocyanin-540 (M540)/Yo-Pro-1/Hoechst 33342 ist bei Bullen wertvoll für die Beurteilung
der Plasmamembranstabilität von TG-Sperma. M540 detektiert Membranveränderungen, die
als Lipidumordnung zu bezeichnen sind. Während der Kapazitation wird Cholesterol aus der
Membran entfernt, was eine Umordnung der Phospholipide verursacht und mit einer Erhö-
hung der Membranflüssigkeit und einer Steigerung der Permeabilität einhergeht. Lebende und
stabile Membranen (nicht kapazitierte Spermien) sind Yo-Pro-1-negativ und M540-negativ,
lebende und unstabile Membranen (kapazitierte Spermien) sind Yo-Pro-1-negativ und M540-
positiv und tote Spermien sind in beiden Färbungen positiv (TURNER 2005; HALLAP et al
2006). Da M540 in nicht fixierten, und deswegen weniger beschädigten, Spermien den
Kapazitationszustand der Spermien zeigen kann, ist diese Färbung besser als die CTC-
Färbung, die fixierte Proben braucht und keine flowzytometrische Beurteilung ermöglicht.
Auch die Kombination Merocyanine-540 mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) - Erdnuss
(Arachis hypogea)-Agglutinin (PNA) ist einfacher, schneller, objektiver und genauer als die
konventionelle CTC-Färbung (RATHI et al. 2001B). Die Viadent Färbung (Hoechst 33258
oder Bisbenzimid) färbt nur Zellen mit beschädigten Membranen an und kann mittels eines
Literatur 8
computergesteuerten Systems die Viabilität während der routinemäßigen Motilitätsmessung
bestimmen (WESSEL und ALTHOUSE 2006).
Der hypo-osmotische Schwelltest beurteilt die funktionelle Intaktheit der Membran. Bei Zel-
len mit intakten Membranen kommt es in einem hypo-osmotischen Medium zu einem Was-
sereinstrom. Dies äußert sich am deutlichsten im Geißelbereich durch eine Schwellung und
Biegung der Geißel. Man sollte aber vorsichtig sein bei der Interpretation dieses Tests, denn
der Unterschied zwischen gebogener Geißel durch Geißeldefekte und Biegung durch osmoti-
sche Prozesse ist nicht klar definiert (VAN DER VEN 1986; LIN et al. 1998; NEILD et al.
1999; NEILD et al. 2000; BRITO et al 2003; COLENBRANDER et al. 2003; TURNER
2005; KUISMA et al. 2006; VARNER und JOHNSON 2007).
2.1.5 Sonstige Methoden für die Spermienbeurteilung
Eine gute Spermienmotilität und die Integrität der verschiedenen Organellen ist jedoch nicht
ausreichend um die Befruchtungsfähigkeit der Spermien vorauszusagen. HESSELINK (1998)
und COLENBRANDER (2003) beschrieben einen in vitro Labortest um die Bindungsfähig-
keit von Spermien an der Oozyte zu beurteilen. Bei diesem sogenannte Hemizon-
Bindungstest wird eine Oozyte halbiert. Danach wird jeder Oozytenteil mit angefärbten
Spermien inkubiert, um das Bindungsvermögen der Spermien an die Oozyte zu vergleichen.
Die Analyse des Seminalplasmas erlaubt eine differenzierte Aussage über die
Ejakulatqualität. Insbesondere zeigt die Aktivität der Enzyme Laktat-Dehydrogenase, alkali-
sche Phosphatase und saure Phosphatase eine positive Korrelation zu den Motilitätsbefunden
(PESCH 2005).
Obwohl zahlreiche Testmethoden zur Verfügung stehen, ist die Fertilität eines Hengstes
hiermit nicht eindeutig vorauszusagen. Die Befruchtung der Eizelle ist ein Zufallsprozess. Die
eigentliche Frage ist deswegen, wieviele Spermien alle Schritte, die für die Befruchtung not-
wendig sind, vollständig und zum richtigen Zeitpunkt durchlaufen. Außerdem sind die Fertili-
tätsdaten in Studien wegen der geringen Probandenanzahl und des Einflusses externer Fakto-
Literatur 9
ren (Besamungsdosis, Fertilität der Stute usw.) selten aussagekräftig (AMANN und
HAMMERSTEDT 1993; DEN DAAS et al. 1998; AMANN und HAMMERSTEDT 2002).
2.2 Morphologie, Ultrastruktur, Physiologie und Pathologie
Die Spermazelle ist eine hoch differenzierte somatische Zelle, deren Funktion sich ausschließ-
lich auf die Befruchtung der Eizelle beschränkt. Die ausgeprägte Differenzierung dieser Zelle
bedingt einen reduzierten Zellreparationsmechanismus und damit eine erhöhte Sensibilität
gegenüber Umgebungsveränderungen (MOREL 1999).
Die Spermazelle hat drei funktionelle Regionen: das kondensierte Kernmaterial (Kopf), die
energieproduzierende Region (Mittelstück) und die propulsive Region (Hauptstück). Anato-
misch sind aber 5 Teile zu unterscheiden (Abb. 1): Kopf, Hals, Mittelstück, Hauptstück und
Endstück (FAWCETT, 1965; FAWCETT, 1970; MOREL 1999).
Abbildung 1: Morphologischer Aufbau des Spermiums. Anatomisch sind 5 Teile zu unterscheiden: der Kopf (1) mit dem Akrosom (1a), dem Kern (1b) und der Plasma-
membran (1c), der Hals (2), das Mittelstück (3) mit den Mitochondrien (3a) und dem Anulus (3b), das Haupt-
stück (4) und das Endstück (5) (MOREL 1999).
Literatur 10
2.2.1 Der Kopf
2.2.1.1 Anatomie
Während der Entwickelung des Spermiums wird das Zytoplasma aus dem Kopfbereich ge-
drückt und legt sich an die Geißel entlang. Nur ein kleiner Zytoplasmasaum umgibt den Kern
(MOREL 1999). Der Kopf enthält mehrere Regionen (Abb. 2, S. 12): die akrosomale Region,
das Äquatorialsegment, die postakrosomale Region und den hinteren Ring (VARNER und
JOHNSON 2007). Die Länge des Kopfes beträgt 5,33 – 6,62 µm bei einer maximalen Breite
von 2,79 – 3,26 µm, die Größen können jedoch von Hengst zu Hengst stark variieren (BRITO
2007).
2.2.1.1.1 Der Zellkern
Der Kern ist der größte Teil des Kopfes und wird umgeben von einer Kernmembran, die ihn
vom Zytoplasma trennt. Sie besteht aus zwei Membranen, die im postakrosomalen Bereich an
mehreren Stellen konfluieren und so Kernporen für den Austausch von Zytoplasma- und
Nukleoplasmamolekülen formen (PESCH und BERGMANN 2006).
Junge Spermatiden enthalten granuläres Chromatin, das sich als globuläres Chromatin und
hoch kondensiertes, extrem elektronendichtes und strukturloses Chromatin darstellt
(ZAMBONI 1987). Dieser hohe Kondensierungsgrad der inaktiven DNS braucht ein Mini-
mum an Platz und die zahlreichen Disulfidbrücken zwischen den Zysteingruppen bieten der
DNS einen effizienten Schutz vor Brüchen (LIVOLANT 1984; WARD und COFFEY 1991).
Im Halsbereich ist ein kleiner Teil des Chromatins nach wie vor unkondensiert. In diesem
Bereich könnte die Transkription und Translation von DNS und die Eiweißbiosynthese noch
stattfinden. Auch der Austauch von Kern-DNS und mitochondrialer DNS via Kernporen ist
möglich. Im restlichen Kopfbereich trifft man teilweise kleine, optisch leere, chromatinfreie
Gebiete von unregelmäßiger Form und ohne Membranabgrenzung an, die sogenannten Va-
kuolen (ROVAN 2001). Diese Vakuolen entstehen durch ungleichmäßige Prozesse während
der Kondensation (ZAMBONI 1987). Bei humanen Spermien sind diese Vakuolen häufig und
Literatur 11
gut im Lichtmikroskop zu sehen, während sie im Sperma des Hengstes eher selten und nur
mittels Elektronenmikroskop deutlich darstellbar sind (PESCH und BERGMANN 2006).
2.2.1.1.2 Das Akrosom oder die Kopfkappe
Am Akrosom sind drei Teile zu unterscheiden: der apikale Teil, der Hauptteil und das
Äquatorialsegment. Das Akrosom wird von einer Membran umgeben. Der der Kernmembran
anliegende Teil wird als innere akrosomale Membran bezeichnet, der der Plasmamembran
anliegende als äußere akrosomale Membran. Die Dicke des Akrosoms variiert in Abhängig-
keit von der Lokalisation im Kopfbereich. Im apikalen Bereich des Akrosoms ist der Abstand
zwischen den beiden akrosomalen Membranen am größten. Der Hauptteil des Akrosoms hat
allgemein eine mittlere Dicke, doch im Vergleich mit dem Akrosom anderer Säugetiere ist
das des Hengstes dünner und uniformer (MOREL 1999). Im meist distalen Teil des Akrosoms
verschmelzen die beiden akrosomalen Membranen und das Akrosom ist sehr eng. Da der
Kern in diesem Bereich am breitesten ist, wird es als Äquatorialsegment bezeichnet
(ZAMBONI 1987).
Der Akrosominhalt hat eine mittlere Elektronendichte und erscheint feinkörnig (ZAMBONI
1987; ROVAN 2001). Nur im Äquatorialsegment stellt das dünne Akrosom sich sehr dicht
da. Zwischen dem Akrosom und dem Kern befindet sich zytoplasmatisches Material, das sich
als ein schmaler, subakrosomaler Raum darstellt. Dieser Raum hat eine niedrigere elektro-
nenmikroskopische Dichte als die angrenzenden Akrosom-und Kernstrukturen (PESCH
2005).
2.2.1.1.3 Die post-akrosomale Region
Der Teil des Kopfes, der nicht durch das Akrosom bedeckt ist, wird als post-akrosomale Re-
gion bezeichnet. Diese Region besteht aus der postakrosomalen Lamina, die vom Ende des
Akrosoms bis zum Halsbereich verläuft und elektronendichte Lamellen enthält (BRITO
2007). Im Übergangsbereich Kopf-Hals sind teilweise kleine Protrusionen der Kernmembran
zu beobachten. Hierbei handelt es sich um Kernmembranreste, die nach der Kontraktion und
Kondensation des Kernes übrig geblieben sind (MOREL 1999).
Literatur 12
2.2.1.1.4 Das Zytosol und andere Strukturen im Kopfbereich
Das Zytosol ist ein dünner Saum zwischen der Plasmamembran und dem Akrosom, bzw. zwi-
schen dem Akrosom und dem Kern. Es enthält Zytoplasma und Proteine des Zytoskeletts,
jedoch kaum Organellen, da diese während der Spermiogenese aus dem Kopfbereich ver-
drängt werden (ROVAN 2001). Der posteriore Ring ist der Teil der Plasmamembran, der die
Zytoplasmakomponenten des Kopfes von den Zytoplasmakomponenten im restlichen
Spermienkörper trennt. Am kaudalen Ende des Kopfes ist die konkave Implantationsfossa
lokalisiert, die mit dem Capitulum des Halses artikuliert und so die Verbindung zwischen
Kopf- und Halsstück herstellt (VARNER und JOHNSON 2007). Abb. 2 zeigt die schemati-
sche Darstellung eines Hengstspermiums im Kopf- und Halsbereich.
2.3.1.2. Pathologie
2.3.1.2.1. Kopfdeformationen und Doppelbildungen
Kopfdeformationen gehören zu den häufigsten pathologischen Befunden bei der lichtmikro
Abbildung 2: Schematische Darstellung eines Hengstspermiums im Kopf- und Halsbereich.
Im Kopf unterscheidet man die Plasmamembran (a) den Kern (e), die Kernmembran (d), das Akrosom (c) und
das Perforatorium (b). Im Äquatorialsegment (f) ist das Akrosom sehr dünn. Die post-akrosomale Region besteht
aus elektronendichten Lamellen, die die postakrosomale Lamina (g) bilden. Im Halsbereich sind das Capitulum
(h), die Zentriole (j) und die segmentierten Säulen (i) zu erkennen. Im Bereich der proximalen Geißel sind die
Mitochondrien (l), die Mantelfasern (k) und das Axonema (m) angeschnitten (BRITO 2007).
Literatur 13
2.2.1.2 Pathologie
2.2.1.2.1 Kopfdeformationen und Doppelbildungen
Kopfdeformationen gehören zu den häufstigsten pathologischen Befunden bei der lichtmikro-
skopischen morphologischen Beurteilung der Spermien. Die Deformationen variieren von
Riesen- über Zwergköpfe bis zu schmalen, sich verjüngenden, birnenförmigen oder total de-
formierten Köpfen. Doppel- und Mehrfachbildungen können ebenfalls in Hengstejakulaten
beobachtet werden (BRITO 2007).
2.2.1.2.2 Kernpathologie
Die Kernmembran ist in elektronenmikroskopischen Aufnahmen oft vom Karyoplasma abge-
hoben, was auf ein Fixationsartefakt hindeutet (PESCH 2005). Andere Kernbefunde sind als
eindeutig pathologisch zu bezeichnen und beeinflussen die Fertilität wesentlich. Spermien
infertiler Männer haben häufig intranukleäre Vakuolen. Die Vakuolen können optisch leer
sein oder pleomorphe Einschlüsse wie Membranfragmente, Vesikel, Lipidtropfen, Mito-
chondrien oder andere zytoplasmatische Organellen enthalten. Manchmal sind die Defekte so
groß, dass sie eine Deformation des Kopfbereiches verursachen. Oft gehen sie mit Abwei-
chungen der Chromatinkondensation und mit Akrosomhypoplasien einher (ZAMBONI 1987).
Unreifes Chromatin, meistens granuläres Chromatin, ist fast immer kombiniert mit anderen
Kopfdefekten. Dazu zählen multiple Kerne, Akrosomhypoplasien und Kerneinschlüsse. Da
auch Akrosomhypoplasien die Fertilität negativ beeinflussen, ist der Einfluss des unreifen
Chromatins nicht eindeutig zu beurteilen. Man kann aber davon ausgehen, dass die
einzelsträngigen DNS-Moleküle dieser immaturen Spermien zerbrechlicher sind als die nor-
male doppelsträngige DNS reifer Spermien (ZAMBONI 1987).
Mittels Elektronenmikroskopie sind verschiedene Kernabweichungen, z.B. eine gestörte
Chromatinkondensation und die Anwesenheit zahlreichen kleiner Kernvakuolen, beim Hengst
festgestellt worden. Große Kernvakuolen und taschenförmige Kerndefekte sind auch licht-
mikroskopisch nachweisbar. Die letztgenannte Abweichung entsteht durch eine Invagination
Literatur 14
der Kernmembran, die meistens am hinteren Rand des Akrosoms beginnt. Später vertiefen
sich diese Höhlen. Diese Störung der Spermiogenese verursacht bei mehreren Tierarten eine
verminderte Fertilität (PESCH et al. 2006). Bei einem 9-jährigen subfertilen Hengst in einer
Studie von HELD et al. (1991) wurden tiefe Taschenbildungen (57% der Spermien) sowie
andere Kopfanomalien und Mittelstückdeformationen beobachtet.
2.2.1.2.3 „Microtubular Mass Defekt“ oder Mikrotubuläre Masse (MM) im Kopfbereich
Während der Akrosomphase der Spermiogenese wird aus im Zytoplasma vorhandenen
Mikrotubuli eine Manschette gebildet. Diese umgibt das Ende des Kernes in der Nähe der
Geißel (MOREL 1999). Die restlichen Mikrotubuli, die nicht als Bausteine der Manschette
genutzt werden, bleiben im Zytoplasma, das in einer späteren Phase durch Sertolizellen
phagozytiert wird (GOODROWE und HEATH 1983; HEATH et al. 1985). BIELANSKI und
KACZMARSKI (1979) fanden jedoch, dass die restlichen Mikrotubuli bei Hengstspermien
nicht vollständig phagozytiert wurden und dass eine kleine Anzahl Mikrotubuli im Halsbe-
reich auch bei reifen Spermien als normal zu bezeichnen ist. Falls viele Mikrotubuli im reifen
Spermium persistieren, wird das als eine Abweichung (= Microtubular Mass Defekt) angese-
hen.
Viele Autoren glauben aber, dass die Manschette nur vorübergehend in den
Spermienvorstufen anzutreffen ist. Die Anwesenheit der Manschettenmikrotubuli in ejakulier-
ten Spermien sollte deswegen als Restkörper nicht vollständig gereifter Spermien interpretiert
werden (GOODROWE und HEATH 1983; ALVARENGA und BORTOLLOZI 1994;
MOREL 1999).
Die Ultrastruktur dieser zusätzlichen Mikrotubuli unterscheidet sich von der der physiologi-
schen Mikrotubuli des Axonemas. Axonemale Mikrotubuli sind elektronenmikroskopisch als
gerade Zylinder zu erkennen, die mittels Brücken miteinander in Verbindung stehen. Die
MM-Mikrotubuli dagegen schlängeln sich umeinander und werden nicht durch Brücken, son-
dern durch ihre gewundene Struktur zusammengehalten. Sie umfassen nur 11 Protofilamente,
sodass ihr Durchmesser, im Vergleich zu dem der axonemalen Mikrotubuli, kleiner ist, 18-19
Literatur 15
nm anstelle von 24 nm als Durchmesser der peripheren axonemalen Mikrotubuli (HEATH et
al. 1985).
2.2.1.2.4 Akrosomanomalien
Auffällig bei der elektronenmikroskopischen Beurteilung ist die hohe Zahl abweichender
Spermienkopfkappen bei Hengsten mit normaler Fertilität. Abgelöste Kopfkappe, eine Dege-
neration der Kopfkappe, eine Invagination der akrosomalen Membran in den Kern, amorphe
Akrosomeinschlüsse oder akrosomreagierte Spermien sind als pathologisch zu bezeichnen.
Abgehobene Akrosome könnten dagegen auf die Fixierung zurückzuführen sein (PESCH
2005; PESCH et al. 2006). Spermienköpfe ohne Akrosomstruktur sind immer in Kombination
mit unreifem Chromatin und einer sphärischen Form des Kernes anzutreffen. Darum wird
dieser Defekt bei lichtmikroskopischen Untersuchungen als „Round Head Defekt“ beschrie-
ben. Ob die sphärische Form des Kopfes allerdings wirklich durch eine Akrosomagenesie
verursacht wird, kann nur mit Hilfe der Elektronenmikroskopie bestätigt werden (WEIS-
SENBERG et al. 1983; ZAMBONI 1987).
Bei Männern sind sehr dünne Akrosome, bei denen der Unterschied zwischen den verschie-
denen Akrosombereichen nicht mehr feststellbar war, beschrieben worden. Diese sog.
hypoplastischen Akrosome hatten oft auch anormale Formen und waren vom darunterliegen-
den Kern abgehoben. Die akrosomale Matrix hatte eine niedrigere Dichte und war missgebil-
det oder aufgelöst. Da die Plasmamembran in diesen Fällen intakt war, war ein Fixierungsar-
tefakt auszuschließen (ZAMBONI 1987).
2.2.2 Der Hals
2.2.2.1 Anatomie
Der Hals ist ein kurzer, sich verjüngender (0,8 µm Durchmesser) Teil des Spermiums, der den
Kopf mit der Geißel verbindet. Bei der Hälfte der Hengste liegt der Halsansatz abaxial. Er ist
im Vergleich zu dem Halsansatz des Spermiums anderer Säugetiere sehr fragil, was die hohe
Anzahl an Kopf- und Geißelbrüchen erklärt. Im Halsbereich kann man das Capitulum, das
Literatur 16
proximale Zentriol, Reste des distalen Zentriols und einige kleine Mitochondrien unterschei-
den (ZAMBONI 1987; MOREL 1999; PESCH und BERGMANN 2006; BRITO 2007).
Der kraniale Teil des Halses ist das Capitulum. Es hat eine konvexe Struktur, die mit der Ba-
salplatte artikuliert (ZAMBONI 1987). Das Capitulum wird gestützt durch ein zirkuläres Sys-
tem von 9 segmentierten Säulen, die aus fibrillären Proteinen bestehen.
Die Zentriolen sind paarig und senkrecht zueinander orientiert anzutreffen. Auch in
Spermienvorstufen sind sie als Diplosom vorhanden (KÖPF-MAIER und MERKER 1989;
GHADIALLY 1997). In reifen Spermien ist nur noch ein Zentriol komplett vorhanden. Es
liegt zwischen den zwei segmentierten Hauptsäulen des Capitulums und steht in einem Win-
kel von 45-60° zum Mittelstück (JOHNSON et al. 1997; MOREL 1999).
Das Zentriol hat die Form eines Zylinders (0,2 µm Durchmesser; 0,4 µm Länge). In seiner
Wand befinden sich 9 Gruppen von jeweils drei Mikrotubuli, die ein Triplett bilden. Jedes
Triplett besteht von innen nach außen gesehen aus den Mikrotubuli A, B und C. Mikrotubulus
A ist aus 13 Tubulin-Protofilamenten aufgebaut und kreisförmig im Querschnitt. Mikrotubuli
B und C haben nur 10 oder 11 Tubulin-Protofilamente und sind C-förmig, da sie einen Teil
mit dem anliegenden Mikrotubulus gemeinsam haben. Nachbartripletts stehen in einem Win-
kel von 30° zwischen dem vorangehenden und dem folgenden Triplett und sind durch Prote-
inbrücken miteinander und mit dem Zentrum verbunden (PEDERSEN 1972; GHADIALLY
1997; ROVAN 2001). Mittels TEM lassen sich diese Ultrastrukturen in
Zentriolenquerschnitten beurteilen, jedoch verhindert der geschraubte Verlauf des Tripletts
ein vollständig scharfes Bild (KÖPF-MAIER und MERKER 1989; GHADIALLY 1997). Bei
den Querschnitten kann man von proximal oder von distal aus das Zentriol sehen. Wenn die
Tripletts auf dem elektronenmikroskopischen Bild im Uhrzeigersinn rotieren, sieht man es
von proximal aus. Eine Rotation gegen den Uhrzeigersinn deutet auf eine Beobachtung von
distal nach proximal hin. Das Innere des Zentriols enthält Zytoplasma-ähnliches Material und
stellt sich hell dar. Nur in manchen A-Mikrotubuli kann das Lumen elektronendicht sein
(AFZELIUS et al. 1995; GHADIALLY 1997).
Literatur 17
Die Faserproteine, die das proximale Zentriol umgeben, differenzieren sich in 5 kleine Säulen
und zwei Hauptsäulen. Letztere teilen sich später in zwei Teile, sodass 9 gleiche Säulen ent-
stehen. Im Bereich zwischen Hals und Mittelstück werden sie von 9 Mantelfasern begleitet
(PESCH und BERGMANN 2006).
2.2.2.2 Pathologie
2.2.2.2.1 Halsbrüche
Halsbrüche sind lichtmikroskopisch sehr eindeutig zu erkennen. Eine defekte Verbindung
zwischen Kopf und Geißel oder eine anormale Lokalisation des proximalen Zentriols ist eine
kongenitale Anomalie, die bei Männern als „Decapitated Sperm Defekt“ beschrieben wurde.
Die Ultrastrukturen der Geißel und des Halsbereiches sind normal, doch das proximale Zent-
riol ist häufig von einem großen Plasmatropfen mit verschiedenen Zellorganellen umgeben
(ZAMBONI 1987).
Bei zwei infertilen Brüdern wurden Halsbrüche und Brüche im Bereich oder am Ende des
Mittelstückes festgestellt. Die Halsbrüche endeten entweder gleich hinter der
postakrosomalen Region oder in einem schmalen zytoplasmatischen Zylinder. Die Ursache
war eine Überproduktion von membranösen Vesikeln in der Zentriolengegend während der
Spermatogenese (BACCETTI et al. 1989). Auch bei Schweinen (CISALE et al. 2001) und
Rindern (WILLIAMS 1987) sind Halsbrüche bei infertilen Tieren beschrieben worden.
2.2.2.2.2 Persistierende proximale Zytoplasmatropfen
Die Zytoplasmareste der Spermienvorstufen befinden sich zuerst im Halsbereich (bei Sper-
mien im Caput epididymidis) und bewegen sich später entlang des Mittelstückes bis zum
Anulus (bei Spermien in der Cauda epididymidis). Hier werden die restlichen
Zytoplasmatropfen von Sertolizellen phagozytiert, sodass sie in ejakulierten Spermien nicht
mehr anzutreffen sind (OKO et al. 1993; COOPER und YEUNG 2003). Bei
Spermienvorstufen, die nicht vollständig ausdifferenzieren, bleibt das Zytoplasma auch in den
Literatur 18
reifen Spermien bestehen, was aber nur einen geringen Einfluß auf die Fertilität hat (COO-
PER 2005).
Die Darstellung von Plasmatropfen variiert in Abhängigkeit von dem Fixierungs- und
Färbungssprozess der Proben. Eine Fixierung humaner Spermien mit Glutaraldehyd ergibt die
gleiche Anzahl Zytoplasmatropfen wie in nativen Präparaten. Angefärbte Ausstriche dagegen
zeigen bedeutend weniger Zytoplasmatropfen, was auf einen Kollaps dieser osmotisch emp-
findlichen Partikel zurückzuführen ist (COOPER et al. 2004).
Dem akrosomalen Bereich des Kopfes oder dem Mittelstückbereich der Geißel assoziierte
Vesikel (1,6 – 4,0 µm Durchmesser) wurden sowohl beim Hengst, als auch beim Mann und
beim Bullen beschrieben. Diese vesikulären Körper werden als physiologische Strukturen
angesehen und unterscheiden sich von Zytoplasmatropfen insofern, als sie transparent sind
und weder innere Strukturen noch Organellen oder Organellenreste besitzen. Lichtmikrosko-
pisch fällt auf, dass sie sich entweder lateral der Geißel befinden, oder eine mediale Position
im Bereich des Mittelstücks einnehmen (ABRAHAM-PESKIR et al. 2000).
2.2.2.2.3 „Microtubular Mass-Defekt“ oder MM im Halsbereich
Die eigentliche Diagnose der Plasmatropfen basiert auf der elektronenmikroskopischen Beur-
teilung des Tropfeninhalts. Manchmal besteht der Inhalt nicht nur aus Zytoplasma, sondern
auch aus Mikrotubuli. Lichtmikroskopisch sind Plasmatropfen und Mikrotubuli-
Ansammlungen im Halsbereich nicht zu unterscheiden. Außerdem sind Mikrotubuli oft kom-
biniert mit anderen Spermiendefekten, sodass bei der üblichen morphologischen Beurteilung
diese Spermien unter anderen pathologischen Befunden aufgelistet werden und die Anzahl
Spermien mit MM eher gering scheint. Die Mikrotubuli befinden sich meistens in der Nähe
einer Membran und sie umgeben andere Strukturen, z.B. Mitochondrien. Manche Autoren
nehmen an, dass sie Reste der Manschettenmikrotubuli sind (HEATH et al. 1985). Sie unter-
scheiden sich jedoch von den normalen Manschettenmikrotubuli und werden möglicherweise
erst nach der Kernkondensation gebildet (ALVARENGA und ALVARENGA 1997).
Literatur 19
BIELANSKI und KACZMARSKI (1979) entdeckten bei drei Hengsten verschiedener Rassen
Mikrotubuli im Halsbereich. Ein Jahr später untersuchten sie Ejakulate von 14 weiteren
Hengsten und fanden bei der Hälfte der Probanden Mikrotubuli. Es herrscht noch Unklarheit
über den möglichen pathologischen Einfluss dieser zusätzlichen Mikrotubuli. HEATH et al.
(1985) fanden bei 7 von 9 untersuchten Hengsten Mikrotubuli-Ansammlungen. Drei dieser
Hengste hatten denselben Vater und vier waren subfertil. Doch die Fertilität verbesserte sich
mit der Zeit und einer niedrigeren Absamungsfrequenz. Auch PESCH et al. (2006) fanden
keine Korrelation zwischen MM im Kopf- und Mittelstückbereich und der Fertilität.
2.2.3 Die Geißel
2.2.3.1 Hauptstrukturen der Geißel
Die A- und B-Mikrotubuli des Zentriols laufen im Geißelbereich weiter und bilden das
Axonema, das die ganze Geißel entlang anzutreffen ist. Im Mittelstück (8 – 10,5 µm lang und
0,6 µm breit) ist das Axonema von Mantelfasern und Mitochondrien umgeben (PESCH und
BERGMANN 2006; BRITO 2007). Der Anulus besteht aus zirkulären Aktinfilamenten und
bildet einen Ring, der das Mittelstück vom Hauptstück trennt und das Verschieben der Mito-
chondrien nach kaudal beim Geißelschlag verhindert (FAWCETT 1965; FAWCETT 1975;
MOREL 1999; ROVAN 2001).
Das Hauptstück ist der längste Teil des Spermiums (30 – 44 µm lang) und schmaler als das
Mittelstück, da die Mitochondrien des Mittelstückes durch eine dünnere Schicht von Protei-
nen, die Ringfasern, ersetzt werden. Im Verlauf des Hauptstückes liegen die Ringfasern im-
mer näher am Axonema, wodurch der Geißeldurchmesser abnimmt (FAWCETT 1965;
MOREL 1999).
Das Endstück ist ungefähr 2,79 µm lang. In diesem Bereich fehlen die Mantel- und Ringfa-
sern, sodass das Axonema nur von der Plasmamembran umgeben ist (HUNTER und
KRETZER 1986).
Abbildung 3 und 4 (S. 20) zeigen die schematische Darstellung der Geißel.
Literatur 20
Abbildung 3-4: Abb. 3 (linkes Bild): Schematische Darstellung einer proximalen Geißel (Mittelstück):
Querschnitt (links) und Längsschnitt (rechts). Plasmamembran (a), Mitochondrien (b), Mantelfasern (c),
Dublettmikrotubuli (d), zentrale Mikrotubuli (e), zentrale Scheide (f), Radiärspeiche (g) (VARNER und JOHN-
SON 2007) ; Abb. 4 (rechtes Bild): Schematische Darstellung einer distalen Geißel (Hauptstück): Quer-
schnitt (links) und Längsschnitt (rechts). Plasmamembran (a), Ringfasern (h), äußere Dynein-Arme (i), innere
Dynein-Arme (j), longitudinale Säule der Ringfasern (k), Verbindungsbrücke zwischen den zentralen
Mikrotubuli (l), Nexinbrücke (m), Anulus (n) (VARNER und JOHNSON 2007).
2.2.3.2 Die Mitochondrien
2.2.3.2.1 Der Aufbau des Mitochondriums
Die Anzahl und Größe der Mitochondrien ist abhängig vom Energieverbrauch der Zelle. In
der Spermazelle befinden sich einige Mitochondrien im Halsbereich, die meisten jedoch be-
finden sich im Mittelstück der Geißel. Sie liegen Kopf-an-Geißel und bilden eine
Helixstruktur (PESCH und BERGMANN 2006). Die Länge eines Mitochondriums entspricht
der Hälfte des Umfanges der Geißel. Der Bindungspunkt zweier nebeneinander liegender Mi-
tochondrien befindet sich ober- und unterhalb des Mittelpunktes des oben- beziehungsweise
untenliegenden Mitochondriums (MOREL 1999).
Das Mitochondrium ist eine sphärische bis ovoide Organelle, die sich teilt, fusioniert, bewegt
und ständig seine Form verändert. Es besteht aus zwei Membranen: der inneren und der äuße-
ren mitochondrialen Membran. Zwischen den beiden Membranen gibt es einen 8 nm breiten
Spalt, die sog. äußere Matrix (UDE und KOCH 1982).
Literatur 21
Die äußere mitochondriale Membran ist 7 nm dick und relativ permeabel. Die innere Memb-
ran (5 nm) umschließt die mitochondriale Matrix und ist wenig durchlässig, so dass der Stoff-
austausch durch aktiven Transport stattfinden muss. Die innere Membran läuft parallel zu der
äußeren mitochondrialen Membran, mit Ausnahme der Stellen, wo sie fingerähnliche Struktu-
ren, die Cristae, zum Lumen des Mitochondriums hin projiziert. In der inneren Membran lie-
gen Enzyme der Elektronentransportkette. An der inneren Seite der inneren Membran gibt es
dünne (20 – 50 nm), unregelmäßige, elektronendichte Komplexe (intramitochondriale
Granula), die die Enzyme für die Elektronentransportkette enthalten. In der inneren Matrix
befinden sich die Enzyme des Krebs- und Fettsäurezyklus. Diese Enzyme bilden Multien-
zymkomplexe, die verantwortlich sind für die feine Granulierung der Matrix. Ebenfalls in der
inneren Matrix enthalten sind die DNS als ein ringförmiges, geschlossenes Molekül und die
RNS (t-RNS und Ribosomen) auf ribosomenähnlichen Partikeln, den Mitoribosomen. Die
Mitoribosomen sind wahrscheinlich zuständig für die Regulierung des inneren Milieus und
können Kalzium und Magnesium speichern (UDE und KOCH 1982; KÖPF-MAIER und
MERKER 1989; DELLMANN und CARITHERS 1996; GHADIALLY 1997).
2.2.3.2.2 Die Energieproduktion: der Krebs-Zyklus, das Elektronentransportsystem und
die gekoppelte Phosphorylierung
Seminalplasma und kommerzielle Verdünner enthalten Zucker als Energiesubstrat für die
Spermien. Glukose wird im Zytoplasma in Pyruvat umgewandelt, das als Oxalessigsäure in
den Mitochondrien das Anfangsmolekül des Krebs-Zyklus bildet. Während dieses Zyklus
entstehen NADH und FADH2, die ihre Elektronen auf Sauerstoffmoleküle übertragen und so
Wassermoleküle entstehen lassen. Um den Gewinn dieses Elektronentransfers zu erhöhen,
werden die Elektronen zuerst auf verschiedene Multienzymkomplexe (Komplexe I bis IV) der
inneren mitochondrialen Membran übertragen. Dieser Elektronentransport setzt H+-Moleküle
in der intermembranären mitochondrialen Matrix frei, die beim Zurückfließen zur inneren
mitochondrialen Matrix ADP und P zu ATP umsetzen. Dieses energiereiche Molekül wird
dann via ATP-ADP Translokase zum Zytoplasma transportiert (DECLEIR und DE COEN
2000).
Literatur 22
2.2.3.2.3 Pathologie
Alte oder geschädigte Mitochondrien können regressive Veränderungen zeigen. Oft sieht man
durch eingedrungenes Wasser geschwollene Mitochondrien. Meistens wird erst die innere
Matrix mit Wasser gefüllt, was eine leichte Umfangsvermehrung und eine Verdünnung des
Matrixinhaltes verursacht. Die Dichte der inneren Matrix ist niedriger, wodurch sie sich heller
darstellt, die Homogenität bleibt aber erhalten. Eine weitere Hydratation erhöht den Verdün-
nungseffekt durch einen Verlust von Matrixinhalt. Wassereinstrom in die äußere Matrix ergibt
selten eine Trennung der inneren von der äußeren mitochondrialen Membran, stellt sich aber
häufig als eine Schwellung in den Cristae da. Die innere Matrix kann dann sehr dicht sein,
vielleicht durch die Diffusion von Wasser aus der inneren Matrix zu den Cristae
(GHADIALLY 1997).
In einer Studie von BERG et al. (1996) zeigten späte Spermienvorstufen im Hodenepithel
eine defekte Entwicklung der Mitochondrienscheide. Auffällig war eine Verzögerung der
mitochondrialen Kondensation vor der Spermienfreigabe in das Lumen der Hodenkanälchen.
Die Ursache dieser Anomalien könnte auf einen genetischen Defekt zurückzuführen sein.
2.2.3.3 Das Axonema
2.2.3.3.1 Die Axonemastruktur
Das Axonema entsteht aus dem A- und B-Tubulus des Zentriols. Die 9 Triplets des Zentriols
setzen sich im Bereich des Mittelstückes als 9 Dubletten fort. Nebenbei entstehen im Mittel-
stück noch zwei zentrale Mikrotubuli (MOREL 1999). Im Übergangsbereich vom Mittelstück
zum Hals sind sie aber noch nicht vorhanden (HUNTER und KRETZER 1986).
Für die Nummerierung der Dubletten verbindet man die beiden Punkte, die der jeweiligen
Mitte der zwei zentralen Mikrotubuli entsprechen, mit einer Gerade. Die Gerade, die senk-
recht zu dieser Linie steht und zwischen den zwei zentralen Mikrotubuli verläuft, ist die
Symmetrieebene. Sie verläuft auch durch eine der peripheren Dubletten, die laut Konvention
als Dublette 1 bezeichnet wird. Der Rest der Nummerierung ist von der Betrachtungsweise
Literatur 23
abhängig. Bei einer Ansicht vom Basalkörper zum Geißelende nummeriert man die Dubletten
im Uhrzeigersinn. Bei der umgekehrten Betrachtungsweise nummeriert man sie gegen den
Uhrzeigersinn (UDE und KOCH 1982).
Die Mikrotubuli sind hohle Zylinder mit einem äußeren Durchmesser von 20 nm. Die 13 Pro-
tofilamente sind um einen Zentralbereich angeordnet, der im Elektronenmikroskop leer er-
scheint (ROVAN 2001). Die beiden zentralen Mikrotubuli sind aus 13 Filamenten, sowie dem
A-Mikrotubulus von jeder Dublette, aufgebaut. Die B-Mikrotubuli der Dubletten sind C-
förmig und kleiner, da sie einen Teil mit dem A-Mikrotubulus gemeinsam haben und deswe-
gen nur 10 oder 11 Tubulinfilamente enthalten. Der A-Mikrotubulus liegt näher zur Mitte des
Axonema als der B-Mikrotubulus (MOREL 1999; PESCH und BERGMANN 2006).
In der ersten Hälfte des Endstückes ist das Axonema vollständig entwickelt und hat die typi-
sche (9×2)+2-Struktur. Im weiteren Bereich verschwinden die Dubletten sehr schnell, aber
nicht gleichzeitig. Manchmal fehlen auch die inneren und/oder äußeren Dynein-Arme der
Dubletten (MOREL 1999). Weiter distal bleiben nur noch 18 Einzelstränge übrig; jeder
Mikrotubulus enthält dann 13 Protofilamente. Die Elektronendichte des Lumens dieser
Mikrotubuli ist unterschiedlich. Noch weiter distal verschwinden manche Einzelstränge. In
diesem Bereich ist die Zellmembran von einer Glykokalyx umgeben. Am Geißelende verlau-
fen die restlichen Mikrotubuli ungeordnet (AFZELIUS et al. 1995; ROVAN 2001).
2.2.3.3.2 Die Dynein- und Nexin-Brücken
Der A-Mikrotubulus jeder Dublette hat 4 Ansatzpunkte. Die zwei Dynein-Arme (innere und
äußere) verbinden den A-Mikrotubulus mit dem B-Mikrotubulus der Nachbardublette
(ROVAN 2001). Die Radiärspeiche verbindet den A-Mikrotubulus mit der Zentralhülle, wel-
che die zentralen Mikrotubuli umgibt. Sie enthält auch Dynein und liefert der Geißel Unter-
stützung und Stabilität. Die Nexinverbindung verbindet den A-Mikrotubulus mit dem B-
Mikrotubulus der Nachbardubletten. Sie liefert wahrscheinlich den Widerstand gegen das
Gleiten der Mikrotubuli, sodass die Symmetrie während der Bewegung der Dublette erhalten
bleibt (UDE und KOCH 1982; ZAMBONI 1987; MOREL 1999; ROVAN 2001).
Literatur 24
2.2.3.3.3 Der Einfluss der Fixierung und der Probenaufbereitung auf die Darstellung der
Axonemakomponenten
Die Mikrotubuli spielen nur eine geringe Rolle bei der Erhaltung der Zellform, doch sie sind
sehr wichtig für die Entwicklung der Zellform, da sie den Hauptbestandteil der Manschette
bilden. Im Zytoplasma besteht ein Gleichgewicht zwischen der polymerisierten Form (die
Mikrotubuli) und der monomeren Form (die Tubulinmoleküle). Man kennt noch nicht alle
Parameter die dieses Gleichgewicht beeinflussen. Es steht aber fest, dass sowohl eine niedrige
Temperatur, ein erhöhter Druck als auch die Anwesenheit antimitotischer Alkaloide die
monomere Form fördern, so dass die Bildung der Mikrotubuli gehemmt wird. Die wichtigste
Voraussetzung für eine gute Fixierung ist daher eine stabile Temperatur, vorzugsweise Zim-
mer- oder Körpertemperatur (GHADIALLY 1997).
Die Fixierung beeinflusst ferner den Durchmesser der Mikrotubuli. VATER et al. (1995) be-
stimmten die Durchmesser der Mikrotubuli mittels REM. Die mit Glutaraldehyd fixierten
Proben hatten längere Mikrotubuli (14 nm) als nicht fixierte Proben (9,5 nm), da die Fixie-
rung ein Eiweiß-Crosslinking verursacht und so das Verschränken der Mikrotubuli verhindert.
Auch die Wanddicke blieb nach der Fixierung erhalten, obwohl die Rohrstruktur kollabierte.
2.2.3.3.4 Abweichungen der normalen Axonemastruktur
2.2.3.3.4.1 Atypische Zilien
Atypische Zilien sind sowohl im Epithel des Atmungssystems als auch im Axonema der
Spermien anzutreffen. Hierzu gehören verschmolzene Zilien (= compound cilia), die zwei
oder mehrere Axonemastrukturen in einer gemeinsamen Matrix haben und von derselben
Membran umgeben sind. Geschwollene Zilien mit zu viel Matrix, eine Desorganisation von
Mikrotubuli, der Verlust von Mikrotubuli, Basalkörperanomalien und Riesenzentriolen wer-
den auch dieser Gruppe zugeordnet (GHADIALLY 1997).
Literatur 25
2.2.3.3.4.2 Geringe Motilität der Spermien und immobile Spermien
Die Motilität kann durch verschiedene Faktoren wie z.B. genitale Infektionen, Sperma-
Antikörper oder die Anwesenheit von Leukozyten im Ejakulat herabgesetzt sein. Eine totale
Unbeweglichkeit lebender Spermien ist meistens auf strukturelle Abweichungen („Ciliary-
Dysfunction-Syndrome“) zurückzuführen (WILLIAMSON 1984). MCCLURE et al. (1983)
beschrieben einen infertilen Mann, dessen Ejakulat nur unreife Spermienvorstufen und defek-
te Spermien enthielt. Die Geißeln stellten sich entweder als sehr rudimentäre
Zytoplasmatropfen mit Mantelfasern und Axonemabestandteilen oder als größere, desorgani-
sierte Strukturen dar.
2.2.3.3.4.3 „Ciliary-Dysfunction-Syndrome“, „Ciliary Dyskinesis“ oder „Dyskinetic Cilia
Syndrome“
Dieses Syndrom, bei dem der Zilienschlag stark reduziert oder defekt ist, ist bei Männern in
der Literatur öfter beschrieben worden (WILLIAMSON 1984; GHADIALLY 1997). Die ers-
ten elektronenmikroskopischen Studien zeigten, dass ein Axonemadefekt diese Geißelläh-
mung verursachte. Bei diesen lebenden, jedoch unbeweglichen Spermien fehlten die Dynein-
Arme des A-Mikrotubulus der peripheren Dubletten. Dieser Befund wurde zuerst als
„Immotile Ciliary Syndrom“ beschrieben. Später konnte man auch in den Zilien des At-
mungssystems diese Erkrankung feststellen, doch diese Zilien waren eher funktionell unbe-
weglich, sodass die Terminologie „Dyskinesis“ bevorzugt wurde.
Ultrastrukturelle Bilder ergaben verschiedene mögliche Ursachen dieser Ziliendysfunktion.
Das Fehlen der inneren oder äußeren Dynein-Arme und defekte Radiärspeichen schienen eine
Transposition der zentralen Mikrotubuli zu verursachen, was manchmal auch eine Transposi-
tion einer peripheren Dublette zur Folge hatte. Auch Abweichungen der Basalkörper könnten
eine unphysiologische Orientierung der Zilien und deswegen eine ähnliche Fehlfunktion ver-
ursachen (AFZELIUS et al. 1995; GHADIALLY 1997).
Auch beim Hengst sind ähnliche Zilienanomalien beschrieben worden (HRUDKA at al.
1991). Sowohl die Spermien als auch die Atmungsepithelzellen hatten eine abweichende
Literatur 26
Zilienstruktur. Lichtmikroskopisch fand man bei der Hälfte der Spermien eine rudimentäre
oder gar keine Geißel. Die übrigen Spermien hatten Geißeln unterschiedlicher Länge und
Form. Bei allen Spermien fehlten die zentralen Mikrotubuli. Andere ultrastrukturelle Befunde
waren defekte Mantelfasern und anormale Ringfasern. Im Atmungsepithel waren die Abwei-
chungen weniger ausgeprägt. Hauptbefund war eine ungewöhnliche Orientierung der Zilien.
2.2.3.3.4.4 Das Fehlen der Mikrotubuli
Der Verlust aller Mikrotubuli ist selten. Meistens fehlen die zentralen Mikrotubuli oder eine
periphere Dublette. Wenn die zentralen Mikrotubuli fehlen, trifft man manchmal eine Trans-
position einer Dublette an. Hierbei verschieben sich zwei periphere Mikrotubuli von der Peri-
pherie zur Mitte des Axonemas und nehmen den Platz der zentralen Mikrotubuli ein. Diese
Transposition ergibt dann die sogenannte (8×2)+2 Axonemastruktur (ZAMBONI 1987).
Funktionell ändert sich die Richtung des Zilienschlags (GHADIALLY 1997). HELLANDER
et al. (1991) beschrieben Geißelabweichungen bei einem 8-jährigen Hengst. Die Motilität war
maximal 10% und morphologische Untersuchungen zeigten einen Knick am Übergang vom
Mittelstück zum Hauptstück. Elektronenmikroskopisch konnten Defekte des Axonemas (Feh-
len der zentralen Mikrotubuli oder der Mikrotubuli mit Position 4 bis 7 und die Anwesenheit
von Mikrotubuli außerhalb der Ringfasernstruktur), der Mantelfasern und der Ringfasern als
Ursache der niedrigen Fertilität nachgewiesen werden.
2.2.3.3.4.5 Einfluss von Axonemadefekten auf die Fertilität
Bei Männern mit normaler Fertilität wurde bei 24,4% der Hauptstücke eine anormale
Axonemastruktur angetroffen. Eine kleine Anzahl der anormalen Axonemata (5%) wies einen
Verlust der zentralen Mikrotubuli auf. Die übrigen anormalen Axonemata waren sogenannte
Typ-A Axonemata mit zu viel peripheren Mikrotubuli oder Typ-B Mikrotubuli, wobei einige
Mikrotubuli fehlten. Diese zwei Typen könnten darauf hinweisen, dass ein Mikrotubulus im
distalen Bereich der Geißel sich umbiegt und in die gegenüberliegende Richtung weiterläuft.
Das könnte erklären, warum im Mittelstück und im proximalen Bereich des Hauptstückes
häufig Typ-A Mikrotubuli zu erkennen waren und im distalen Bereich der Geißel hauptsäch-
lich Typ-B Mikrotubuli auftraten (HUNTER und KRETZER 1986). Auch WILTON et al.
Literatur 27
(1985) fanden mehrere anormale Axonemastrukturen bei fertilen Männern, sodass der Ein-
fluss auf die Fertiltät nicht eindeutig ist.
2.2.3.4 Die Mantelfasern oder „Outer Dense Fibers“
Die Mantelfasern sind elektronendichte Proteinstrukturen, die mittels feiner mikrofibrillärer
Strukturen mit den Dubletten verbunden sind. Viele dieser Proteine sind wichtige Enzyme im
Energiestoffwechsel. Die Mantelfasern haben keratinähnliche Eigenschaften, viele
Disulfidbrücken, eine hohe Menge an Cystein und ein ganz anderes Aminosäureprofil als die
kontraktilen Proteine. Sie werden als Strukturen angesehen, die eine elastische Unterstützung
liefern und das Axonema vor Schäden schützen. Sie umgeben das Axonema und bilden im
Bereich des Mittelsücks 9 elektronendichte Säulen, von der jede zu einer Dublette gehört. Im
Bereich des Hauptstückes gibt es nur noch 7 Säulen, die im distalen Bereich kleiner und dün-
ner werden. Die Mantelfasern Nummer 1, 5 und 6 sind relativ groß, die neunte Mantelfaser
hat eine mittlere Größe und die restlichen Mantelfasern enden proximaler und sind eher dünn.
Am proximalen Ende der Mantelfasern fusionieren die Mantelfasern mit den Halssäulen. Die-
se letzten keratinähnlichen Strukturen geben Stabilität und reduzieren so das Zittern, das
durch die Geißelbewegung generiert wird, ohne Verlust der Flexibilität (FAWCETT 1965;
ZAMBONI 1987; MOREL 1999; ROVAN 2001; PESCH und BERGMANN 2006).
Die Abweichungen der Mantelfasern sind geringer als die des Axonemas. Doch manchmal
können Spermien zu viel oder zu wenig Mantelfasern besitzen, eine Desorganisation oder
strukturelle Missbildungen dieser Mantelfasern zeigen. Diese Mantelfaserdefekte ergeben
dyskinetische Spermien, so dass die progressive Motilität der Spermien negativ beeinflusst
wird (ZAMBONI 1987).
2.2.3.5 Die Ringfasern oder „Fibrous Sheath“
Das Hauptstück ist durch seine typischen fibrillären Fasern gekennzeichnet, die sogenannten
Ringfasern. Sie sind aufgebaut aus Eiweißmolekülen, die an den sich gegenüberliegenden
Seiten der Geißel in der Nähe von Dublette 3 und 8 längsorientierte Säulen bilden. Im Bereich
dieser Säulen werden die Mantelfasern des Mittelstückes in diese Ringfasersäulen aufge-
Literatur 28
nommen, so dass man anstelle von 9 nur noch 7 getrennte Mantelfasern feststellen kann. Die
zwei in Längsrichtung verlaufenden Ringfasersäulen sind mittels Querrippen mit einander
verbunden (ROVAN 2001; EDDY et al. 2003). Wo die Querrippen die Säulen kreuzen, gibt
es eine optische Verdickung der Ringfasern. Die Ringfasern enden abrupt 9 bis 10 µm vor
dem Ende der Geißel, genau an der Stelle, wo das Hauptstück in das Endstück übergeht
(PESCH und BERGMANN 2006). Die Ringfasern liefern der Geißel Stabilität, ohne die für
die Bewegung der Mikrotubuli notwendige Flexibilität zu hemmen (MOREL 1999). Darüber
hinaus sind sie eine potentielle Energiequelle für das Spermium (ROVAN 2001). Bei Säuge-
tieren wird die Energie auf verschiedenen Wegen in ATP umgewandelt. Die anaerobe Glyko-
lyse im Zytosol liefert als Endmolekül das Pyruvat, das als Zitronensäure und Azetylkoenzym
A in dem aeroben Krebs-Zyklus verwendet werden kann (DECLEIR und DE COEN 2000).
Die Enzyme der Glykolyse befinden sich im Hauptstück der Geißel und sind dort an die Ring-
fasern gebunden (ROVAN 2001). Ohne Ringfasern sind die Spermien nicht beweglich. In
einer Studie von BACCETTI (2004) war die Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien eines infer-
tilen Mannes maximal 1%, obwohl 72% der Spermien lebten. Manche Spermien hatten
Axonema- und Mitochondriendefekte, doch bei allen Spermien fehlten die Ringfasern.
2.2.3.6 Die Plasmamembran
Die Plasmamembran, die das Spermium umgibt, bildet eine Schutzbarriere gegen das äußere
Milieu. Sie hat den Aufbau einer typischen Einheitsmembran, beschrieben durch SINGER
und NICOLSON (1972). Zwischen der 5 nm dicken Doppelschicht aus Phospholipiden befin-
den sich zahlreiche Proteine, so dass die Plasmamembran eine mosaikartige Struktur von Pro-
teinen und Lipiden aufweist (MOREL 1999). Abbildung 5 (S. 30) zeigt eine schematische
Darstellung der Plasmamembran.
Die Phospholipide betragen 57% der Membranlipide in Hengstspermien und sind in
Phosphocholinglyzerid, Phosphoethanolaminglyzerid, Sphingomyelin, Phosphatidylserin,
Cardiolipin, Phosphatidylglyzerol und Phosphatidylinositol einzuteilen (GADELLA et al.
2001). Die polaren, hydrophilen Köpfe dieser amphipatischen Moleküle richten sich nach
Literatur 29
dem extrazellulären Milieu aus, während sich die hydrophoben Fettsäureketten zur inneren
Seite der Membran ausrichten (UDE und KOCH 1982). In Bezug auf die anderen
Lipidmoleküle ist der Anteil an Glycolipiden (Seminolipid; 6%) und Cholesterol (37%), im
Vergleich zu den Spermien anderer Tierarten relativ hoch (GADELLA et al. 2001). Das Ver-
hältnis von Cholesterol zu Phospholipiden in den Spermien bestimmt die Konsistenz der
Membran und ist ein Indikator für die Fertilität des Hengstes. BRINSKO et al. (2007) fanden
bei den subfertilen Hengsten eine deutlich erhöhte Cholesterolkonzentration. Die stabilisie-
rende Wirkung des Cholesterols erklärt den niedrigeren Wert von akrosomreagierten Sper-
mien bei diesen Probanden nach einer in-vitro-Inkubation in einem Kalzium-Ionophor.
Zahlreiche Proteine stellen 50% der Masse der Plasmamembran. Je nach der Lokalisation der
Proteine teilt das Fluid-Mosaik-Modell von SINGER und NICOLSON (1972) diese in drei
Subtypen ein. Strukturelle Proteine oder nicht penetrierende integrale Proteine liegen zwi-
schen den zwei Schichten der Lipiddoppelschicht. Oberflächliche oder periphere Proteine
haben eine negativ geladene Kohlenstoffkette und sind Rezeptoren, die als Anheftungspunkt
für andere Proteine dienen. Die Proteine, die durch die Membran laufen, die sog. penetrieren-
den Proteine, fungieren als Poren oder Kanäle. Sowohl die integralen als auch die penetrie-
renden Proteine sind in der Phospholipiddoppelschicht zu einer lateralen Bewegung fähig,
was die dynamischen Aspekte der Membran erklärt (UDE und KOCH 1982; MOREL 1999).
Die Glykokalix bildet die äußere Schicht der Membran und besteht aus Polysacchariden. In
der Glykokalix gibt es Anknüpfungspunkte für periphere Proteine. Diese Proteine befinden
sich im Seminalplasma und stabilisieren so das Spermium während der Passage durch den
männlichen und weiblichen Genitaltrakt. Außerdem könnten sie bei der Kapazitation eine
Rolle spielen (MOREL 1999).
Literatur 30
Die ungefähr 8 nm dicken Membranen sind mit dem Transmissionselektronenmikroskop
deutlich zu unterscheiden. Bei Querschnitten, die die Membran senkrecht anschneiden, sind
zwei elektronendichte Linien, getrennt durch eine hellere Substanz in der Mitte, zu erkennen.
Die elektronendichten Linien repräsentieren den hydrophilen Teil der Lipide und der dazwi-
schenliegenden Proteine. Die Substanz zwischen den beiden Linien ist der hydrophobe Teil
der Lipidmoleküle (UDE und KOCH 1982).
Die Zusammensetzung der Biomembran variiert abhängig vom Bereich des Spermiums
(ENGELMAN 2005). Die höchste Cholesterolkonzentration befindet sich im akrosomalen
Bereich, sodass die Membran in dieser Region relativ rigid ist. Während der Kapazitation
wird Cholesterol jedoch teilweise entfernt wodurch sich der Flüssigkeitsgrad der Membran
ändert (GADELLA et al. 2001).
Die vielen ungesättigten Fettsäureketten sind notwendig, um der Membran einen ausreichen-
den Flüssigkeitsgrad für die Spermienmotilität zu geben. Sie machen die Membran aber auch
sehr empfindlich für Peroxidationsprozesse, was den Verlust der Membranintegrität und eine
Steigerung der Membranpermeabilität zur Folge haben kann (BAUMBER et al. 2000).
Abbildung 5: Eine 2-D schematische Darstellung einer Plasmamembran. Die intrinsischen und
extrinsischen Proteine befinden sich zwischen den Phospholipiden, die die Doppelschicht der Membran
bilden. Die Zuckermoleküle der Membran sind an die Lipide oder an die Proteine gebunden und sind als
Glykolipide, beziehungsweise Glykoproteine vorhanden (RATHI 2001A).
Material und Methoden 31
3 Material und Methoden
3.1 Probanden
Für die Versuche standen drei Ejakulate von 50 Hengsten unterschiedlichen Lebensalters und
mit bekannter Fertilität des Landgestüts Celle zur Verfügung. Alle Pferde waren beim Hanno-
veraner Warmblutzüchtverband anerkannte Zuchthengste (davon 46 Hannoveraner Hengste
und 4 Englische Vollblüter). Während der letzten Decksaison waren sie alle für die künstliche
Besamung eingesetzt worden, wobei sie täglich abgesamt wurden.
Alle Probanden waren regelmäßig geimpft und entwurmt worden. Sie wurden in Boxen auf
Stroh oder Spänen gehalten und täglich bewegt. Als Futter bekamen sie zweimal täglich Heu
oder Silage und dreimal täglich Hafer und Kraftfutterpellets. Wasser stand ad libidum zu ihrer
Verfügung.
Als Fertilitätsparameter wurden für jeden Hengst die Trächtigkeit pro Rosse am Ende der
Saison (Tr/R) und die Non-Return Rate am 33. Tag nach der Besamung (NRR33) berechnet.
Dem Parameter Tr/R entspricht die Anzahl der Rossen mit positivem Trächtigkeitsergebnis,
geteilt durch die Anzahl der genutzten Rossen. Die NRR33 ist der Prozentsatz Stuten, die bis
zum 33. Tag nach der Besamung nicht wieder zur Besamung vorgestellt wurden.
Die Einteilung der 50 Hengste in drei Fertilitätsgruppen erfolgte auf Basis der Fertilitätspara-
meter Tr/R oder NRR33: die erste Gruppe umfasste die sehr fertilen Hengste (Gruppe A –
25% der Probanden mit den höchsten Werten für Tr/R oder NRR33), die zweite Gruppe be-
stand aus den normal fertilen Hengsten (Gruppe B – 50% der Probanden mit mittleren Werten
für Tr/R oder NRR33) und die dritte Gruppe umfasste die subfertilen Hengste (Gruppe C –
25% der Probanden mit den niedrigsten Werten für Tr/R oder NRR33).
Die Fertilitätsdaten der Probanden sind im Anhang (9.2 Fertilität der Probanden, S.110-112)
numerisch und grafisch dargestellt.
Material und Methoden 32
3.2 Probengewinnung, -untersuchung und -verarbeitung
Am Ende der Decksaison wurde jeder Hengst zwei- bis dreimal pro Woche abgesamt. Die
Samengewinnung erfolgte an einem Phantom (Modell „Celle“; Klug 1990) mittels künstlicher
Scheide (Modell „Hannover“, Klug 1990) und in Anwesenheit einer rossigen Stute. Die In-
nenseite der künstlichen Scheide wurde mit einer Einmalschlauchfolie (Fa. Minitüb, Tiefen-
bach) bedeckt und endete in einer angeschraubten sterilen Glasflasche mit vorgeschaltetem
Gazefilter (Fa. Minitüb, Tiefenbach). Der Samen wurde in dieser Glasflasche aufgefangen;
Beimengungen von Gel und große Schmutzpartikel wurden durch den Filter entfernt.
Zuerst erfolgte eine routinemäßige andrologische Untersuchung, wobei sowohl die Anzahl der
Aufsprünge auf das Phantom, die Libido sexualis, als auch makroskopische und mikroskopi-
sche Parameter des Spermas beurteilt wurden. Anschließend erfolgte eine Bestimmung des
Gel-freien Volumens, der Farbe (grau, weiß, gelb) und der Konsistenz (wässerig, molkig, mil-
chig, rahmig) des Ejakulats. Bei der mikroskopischen Untersuchung (Olympus BX40F-3, Fa.,
Olympus Optical Co., Japan) wurde von einem Tropfen nativem Sperma der Anteil (in Pro-
zent) an vorwärtsbeweglichen (progressive Motilität), ortsbeweglichen und unbeweglichen
Spermien bei 200-facher Vergrößerung (Objektivlinse Plan 20/0,50 Ph 2BM) geschätzt und
zusätzlich mittels CGSA (Computer-gestützte Spermaanalyse von 5 Feldern pro Ejakulat;
MIKA Motion Analyser, Version 1.1, Fa. Mika Medical GmBH, Montréux, Schweiz) bei der
gleichen Vergrößerung gemessen. Die Bestimmung der optischen Dichte erfolgte mit Hilfe
eines Photometers (SpermaCue, Fa. Minitüb, Colorado, Missouri). Ausgehend von der Dich-
te, dem Volumen und dem Anteil progressiv motiler Spermien konnte die
Gesamtspermienzahl und die Gesamtanzahl vorwärtsbeweglicher Spermien im Ejakulat be-
rechnet werden.
Danach wurden von jedem Ejakulat 2,0 ml natives Sperma für die morphologische Beurtei-
lung der Spermien mittels Phasenkontrastmikroskopie und TEM verwendet, der Rest wurde
eingefroren (s. 3.2.3.).
Material und Methoden 33
3.2.1 Probenaufbereitung für die Phasenkontrastmikroskopie
Die morphologische Beurteilung (Phasenkontrastmikroskop Modell CHT, Fa. Olympus Opti-
cal Co., Ltd., Japan) des nativen Sperma erfolgte bei einer Vergrößerung von 10 × 100 unter
Verwendung eines Öl-Immersionsobjektives.
Das native Sperma (200 µl in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß (Fa. Eppendorf AG, Ham-
burg) wurde mit 300 µl Formolzitrat (Rezeptur s. Anhang, S. 113) fixiert und bei 5°C gela-
gert. Von jedem Ejakulat wurden 200 Spermien beurteilt. Pathologisch veränderte Spermien
wurden je nach Abweichung aufgelistet (Protokoll s. Anhang, S. 116). Falls mehrere patholo-
gische Befunde bei einer Spermazelle auftraten, wurde das Spermium bei der im Protokoll als
erstes aufgeführten Abweichung gelistet.
3.2.2 Probenaufbereitung für die TEM
Für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden 1800 µl natives Sperma aufbe-
reitet. Dieses native Sperma wurde 30 s in einer Tischzentrifuge (Hettich Mikroliter Zentrifu-
ge, Fa. Hettich, Tuttlingen) bei 15000 rpm zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten. Vom
Überstand wurden 1350 µl abpipettiert und verworfen. Zu dem Spermienpellet wurden 350 µl
einer 5%igen Glutaraldehydlösung in einem 0,1 M Kakodylatpuffer (pH 7,2) hinzugefügt
(Rezepturen s. Anhang, S. 113). Nachdem das Pellet durch Schütteln wieder suspendiert wur-
de, konnten die restlichen 1000 µl Fixierungslösung hinzugefügt werden. Die Suspension
wurde eine Viertelstunde in den Schüttler gestellt und danach 30 s bei 15000 rpm zentrifu-
giert. Nach dem Zentrifugieren wurde 1350 µl des Überstandes abpipettiert und durch Fixie-
rungslösung ersetzt, die die Spermien unter Schütteln wieder suspendieren sollte. Die Probe
wurde während des dritten Waschvorgangs noch einmal zentrifugiert, der Überstand
abpipettiert und das Pellet in der Fixierungslösung resuspendiert. Die Eppendorf-Gefäße wur-
den vollständig befüllt (um die Wahrscheinlichkeit einer Oxidation der Spermien durch O2 zu
minimieren) und bei 5°C gelagert und transportiert. Die weitere Probenaufbereitung erfolgte
am Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität
Leipzig (wie unter 3.2.4. beschrieben).
Material und Methoden 34
3.2.3 Einfrieren des restlichen nativen Sperma
Das native Sperma wurde mit dem Magermilchverdünner INRA 82 (MAGISTRINI et al.
1992, Zusammensetzung s. Anhang, S.114) 1:2 verdünnt und dann für 10 min bei 1000 × g
(Hettich Tischzentrifuge Universal 32, Ausschwingrotor 4-fach, Kapazität 4 × 100 ml) zentri-
fugiert. Nach dem Zentrifugieren wurden der Verdünner und das Seminalplasma dekantiert
und das Samenpellet nach Zugabe eines Einfrierverdünners (INRA 82 mit 4% Eidotter und
2,5% Glyzerol) auf einem Schüttler resuspendiert. Die Spermakonzentration im Pellet wurde
in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt und das Pellet mit einem Einfrierverdünner trop-
fenweise bis zu einer Konzentration von 1,0 × 108 Spermien/ml verdünnt. Die Kühlung des
verdünnten Spermas auf 5°C erfolgte innerhalb von 4 Stunden. Danach wurden die 0,5 ml-
Pailletten befüllt, innerhalb von einer Minute von 5°C auf -140°C gebracht (Minidigitcool
TM, Fa. Instruments Medecine Veterinaire, l`Aigle, France) und in flüssigem Stickstoff bei
-196°C gelagert.
Die Pailletten von 12 Hengsten wurden aufgetaut (30 s in einem Wasserbad von 37°C) und es
wurden Motilitätsmessungen durchgeführt. Die morphologischen Veränderungen, entstanden
durch die Einfrier- und Auftauprozesse, wurden sowohl mit dem Phasenkontrastmikroskop
als auch mit dem Elektronenmikroskop beobachtet. Die Probenaufbereitung verlief so, wie
vorher beschrieben (3.2.2.).
3.2.4 Weitere Probenaufbereitung im Institut für Veterinär-Pathologie der Universität
Leipzig
Das mit Spermien und Fixierungslösung gefüllte Eppendorf Gefäß (1800 µl) wurde eine Mi-
nute in einer Tischzentrifuge (neoLab Tischzentrifuge, Heidelberg, 6000 rpm) zentrifugiert,
der Überstand abpipettiert und das Pellet drei Mal gewaschen, um das Fixans zu entfernen.
Dafür wurde 1 ml 0,1 M Kakodylat-Puffer (pH 7,2) bei 4°C mit dem Pellet gemischt, gefolgt
durch eine Zentrifugation und Entfernung der Fixierungslösung.
Flüssige Gelatine (Rezeptur s. Anhang, S. 113) wurde in das Eppendorftube im Verhältnis 1:2
hinzugefügt und mit dem Pellet gemischt. Nach 30 min bei 4°C war die Probe erstarrt. An-
schließend wurde das Eppendorf-Gefäß mit Glutaraldehyd gefüllt. Nach 30 min war das
Material und Methoden 35
Glutaraldehyd bis unter das Pellet diffundiert. Das Pellet wurde dann mittels einer kleinen
Kanüle vom Rand des Eppendorf-Gefässes gelöst und heraus geholt. Die spermienreichen
Stellen (trüb, weiß oder gelblich) wurden aus der Gelatine (durchsichtig) herausgeschnitten
und in einem Glasröhrchen mit Glutaraldehyd bis zum nächsten Tag aufbewahrt.
Die Probe wurde dann zwei Stunden in 1 ml einer 1%igen OsO4-Lösung (Fa. Chem Pur,
Karlsruhe, Rezeptur s. Anhang, S. 114) bei 4°C nachfixiert, wobei die OsO4-Lösung nach 30
min ein Mal gewechselt wurde. Das OsO4 wurde danach mit Kakodylat-Puffer (1 ml 0,1 M
Kakodylat-Puffer pH 7,2) ausgewaschen.
Die Entwässerung der Probe erfolgte durch Zusatz von steigenden Ethanolkonzentrationen
(Rezeptur s. Anhang, S. 113). Die Probe wurde 10 min in einer 25%ige Ethanol-Lösung bei
Zimmertemperatur inkubiert, gefolgt von je 10 min in 50%igem und 75%igem Ethanol. In der
letzten Lösung wurde die Probe bei 4°C über Nacht gelagert.
Am nächsten Tag erfolgte eine weitere Entwässerung der Probe bei Zimmertemperatur durch
Inkubation in verschiedenen Medien, jeweils gefolgt von einer Zentrifugation und
Resuspension des Pellets in der nächsten Lösung. Die folgenden Medien wurden hintereinan-
der eingesetzt:
- 15 min in 80%igem Ethanol
- 30 min in 90%igem Ethanol
- zwei Stunden in 100%igem Ethanol (zwei mal gewechselt)
- 30 min in Propylenoxid (zwei Mal gewechselt)
- 45 min in einem Propylenoxid/Epongemisch mit dem Polymerisationsbeschleuniger
BDMA (Benzyldimethylamine ) im Verhältnis 1:2 (Rezeptur s. Anhang, S. 115)
- 1,5 Stunden in einem Propylenoxid/Epongemisch mit BDMA im Verhältnis 1:4.
Schließlich wurde die Probe mit einer reinen Eponmischung zuzüglich BDMA versetzt und
über Nacht bei 4°C gelagert.
Danach erfolgte eine weitere Probenaufbereitung bei Zimmertemperatur. Die in der
Eponmischung zuzüglich BDMA suspendierde Probe wurde zentrifugiert und das Pellet in
einer frischen Eponmischung mit BDMA resuspendiert. Eine Stunde später wurden die Pro-
Material und Methoden 36
ben in trockene Einbettungsformen verbracht, wobei die Formen mit Epongemisch bis oben
befüllt wurden (Einbettung).
Nach einer Polymerisation von 5 Tagen (24 Stunden bei 35°C, 24 Stunden bei 45°C und 3
Tage bei 60°C) wurden die eingebetteten Eponblöckchen aus den Gelatinekapseln genommen
(Abb. 6). Von den 4 bis 5 Blöckchen pro Probe wurden zwei angetrimmt. Die Gelatinekap-
seln dieser Blöckchen wurden mit einem Trimmer (TM60, Fa. Reichert-Jung, Nussloch) weg-
getrimmt, sodass die auf dem Boden liegende und durch OsO4 schwarz angefärbte
spermienreiche Fläche frei zu liegen kam.
Abbildung 6: In Gelatinekapseln eingebettete Eponblöckchen. Rechts oben: Eponblöckchen vor und nach
dem Antrimmen der spermienreichen Fläche.
Die Anfertigung von Semidünnschnitten (350-400 nm Dicke) der getrimmten Blöckchen er-
folgte mit einem Diamantmesser (Leica Ultracut UCT, Wetzlar). Diese Schnitte wurden in
einem kleinen Wasserbad, befüllt mit Aqua bidest., aufgefangen. Das Schneiden wurde mik-
roskopisch verfolgt, sodass die Farbe und indirekt auch die Dicke der Schnitte beurteilt wer-
den konnte. Die an der Wasseroberfläche flotierenden Schnitte wurden mit einer Öse auf ei-
nen Objektträger verbracht und mit 70°C-warmer Toluidinblaulösung (Rezeptur s. Anhang, S.
115) 1 min gefärbt. Der überflüssige Farbstoff wurde mit steriler Kochsalzlösung abgespült.
Schließlich wurden die Semidünnschnitte auf einen frischen Objektträger gelegt und auf der
Wärmeplatte getrocknet.
Material und Methoden 37
Die dunkelblau gefärbten spermienreichen (= chromatinreichen) Bereiche der Semidünn-
schnitte waren mit einem Mikroskop bei 400facher Vergrößerung zu sehen (Abb. 7). Basie-
rend auf der Form des Semidünnschnittes und der Lokalisation der spermienreichen Bereiche
konnten übereinstimmende Stellen der Blöckchen zur Anfertigung von Ultradünnschnitten
ausgesucht werden.
4.3.2. Die Plasmamembran
Diese Ultradünnschnitte wurden auf ein mit Alzianblau hydrophilisiertes Kupfergrid von 200
Mesh gelegt und mit Uranylazetat und Bleizitrat (Rezeptur s. Anhang, S. 113-115) kontras-
tiert. Für diese Doppelkontrastierung wurde das Grid zuerst mit den Schnitten nach unten auf
einen Tropfen Uranylazetat gelegt (7 min im Dunkeln), dann in Aqua bidest. gespült und an-
schließend 4 min in einen Tropfen Bleizitrat mit NaOH gebracht, mit den Schnitten an der
Oberseite. Hierbei verhindert NaOH die Umsetzung von Bleizitrat in Bleikarbonat, was
schwarze Niederschläge auf dem Grid verursachen würde.
Danach wurde das Grid auf Fließpapier getrocknet und mit dem Elektronenmikroskop (Zeiss
Abbildung 7: Semidünnschnitt eines Eponblöckchen bei verschiedener Vergrößerung.
Material und Methoden 38
EM 900
, Oberkochen) bei 80 kV analysiert.
3.2.5 Elektronenmikroskopische Beurteilung
Von den 12 ausgewählten Hengsten (3 fertile, 6 Hengste mit mittlerer Fertilität, 3 subfertile)
wurden zuerst die Schnitte von den nativen Spermaproben mittels Elektronenmikroskopie
beurteilt.
Pro Ejakulat wurden zwei Eponblöckchen für die Anfertigung von Semidünnschnitten
angetrimmt. Das Blöckchen, welches die meisten Spermien enthielt, wurde für die Ultradünn-
schnitte verwendet. Die elektronenmikroskopische morphologische Beurteilung nahm auf 120
Spermien pro Ejakulat Bezug; jeweils 34 Köpfe, 34 proximale Geißelquerschnitte, 34 distale
Geißelquerschnitte und 18 Geißellängsschnitte. Da von jedem Hengst drei native
Spermienproben vorhanden waren, resultierte das in einer Standarduntersuchung von insge-
samt 360 Spermien pro Hengst (Protokoll im Anhang: S.117 - 119).
Von den 12 Hengsten wurden Pailletten aufgetaut und analog für die Elektronenmikroskopie
aufbereitet. Auch hier sollte die Aussage keine quantitative, sondern eher eine qualitative sein.
Wichtig war zu erkennen, welche Parameter durch den Einfrier- und Auftauprozess beein-
flusst werden und ob die Spermien der fertilen Hengste diesen Prozess besser überstehen als
die der subfertilen Hengste.
Die elektronenmikroskopischen Beurteilungskriterien waren für alle Proben gleich. Bei allen
120 Spermien wurde die Membran beurteilt. Die normale Membran sollte glatt anliegend an
Kopf, Hals und Geißel sein. Gefranste und gewellte Membranen wurden auch noch als physi-
ologisch angesehen. Aufgerollte, teilweise oder vollständig abgehobene Membranen und gra-
nulierte Membranen wurden als pathologisch bezeichnet. Bei den Köpfen wurden oft unter-
schiedliche Veränderungen im apikalen und / oder mittleren Bereich beziehungsweise im Be-
reich des Äquatorialsegmentes festgestellt. Falls mehrere pathologische Befunde bei einer
Spermazelle auftraten, wurde die Abweichung, die als erste im Protokoll stand, aufgelistet.
Die Beurteilung der Köpfe umfasste die Akrosom- und Kernveränderungen. Das Akrosom
sollte dem Kern glatt anliegen. Teilweise oder vollständig abgelöste Akrosome, gewellte oder
Material und Methoden 39
abgehobene Akrosome, Vesikelbildung im Akrosombereich, aufgequollene Akrosome im
proximalen Bereich des Kopfes, Akrosomaplasie, akrosomale Höhlen, die eventuell mit
amorphem Material gefüllt waren, sowie eine Invagination von der akrosomalen Matrix im
Kern wurden als pathologisch beurteilt. Zu den Kernveränderungen gehören große Kernva-
kuolen, Vakuolen mit amorphen Material und Kondensationsstörungen.
Bei den Geißelquerschnitten und den Geißellängsschnitten wurden das Tubulusmuster, die
Mantelfasern, die Mitochondrienscheide im proximalen Geißelbereich und die Ringfasern im
distalen Bereich beurteilt.
Aufgelistet wurden ebenfalls proximale und distale Zytoplasmatropfen im Geißelbereich, die
Anwesenheit von Zytoplasma direkt unter der Zellmembran, Zytoplasmaschichten zwischen
dem Kern und dem Akrosom, die Anwesenheit von Mikrotubuli-Ansammlungen, deformierte
Köpfe und Geißeln, Missbildungen wie Doppel- oder Mehrfachköpfe, Doppel- oder Mehr-
fachgeißeln, mehrere Geißelanschnitte in einer Membran, geknickte Geißeln, sowie begin-
nende oder vollständige Halsbrüche.
Auch auf die Anwesenheit von unreifen Spermatiden, prostasomähnlichen Partikeln, Harn-
kristallen, Blutzellen und Bakterien wurde geachtet.
3.3 Statistik
Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte am Institut für Biometrie und Epidemio-
logie der Tierärztlichen Hochschule Hannover mittels des statistischen Software Programms
SAS® (Statistical Analysis System, Cary, North Carolina, USA).
Zuerst wurde die Verteilung der Parameter (progressive Motilität oder PMOT, Phasenkon-
trast- und TEM-Parameter) mit dem Shapiro-Wilk-Test analysiert.
Von allen Parametern wurden der Minimalwert, der Maximalwert und der Median bestimmt.
Für die normal und logarithmisch normal verteilten Parameter wurde der arithmetische ( )
bzw. der geometrische Mittelwert ( geom.) berechnet. Die Variabilität der normal und loga-
rithmisch normal verteilten Parameter wurde durch die Standardabweichung (±SD) beschrie-
Material und Methoden 40
ben. Für die nicht normal verteilten Parameter wurde die Streuung mittels Box Plots visuell
dargestellt.
Die Ergebnisse der unterschiedlichen Untersuchungsmethoden (Phasenkontrastmikroskopie
und TEM) und der Einfluss des Spermienzustandes (nativ oder tiefgefroren) auf die Ergebnis-
se wurde mittels t-Test für die normal und logarithmisch normal verteilten Parameter und mit-
tels Wilcoxon Two-Sample-Test für die anderen Parameter geprüft.
Die Probanden wurden, basierend auf ihren Fertilitätsdaten (NRR33 und Tr/R), in 4 Quartile
eingeteilt. Die Quartilmittelwerte der untersuchten Parameter wurden bei normal- oder loga-
rithmisch normalverteilten Parametern mittels t-Test oder mittels Kruskal-Wallis-Test bei
nicht normal verteilten Parametern verglichen. Der Zusammenhang zwischen den Fertilitäts-
daten und den untersuchten Parametern wurde berechnet.
Auch die Korrelation zwischen dem Hengstalter und den mikroskopischen Ergebnissen wurde
mit dieser Methode ausgewertet. Für die Korrelationsanalysen der normal oder logarithmisch
normal verteilten Parameter wurde der Korrelationskoeffizient nach Pearson verwendet. Für
die anderen Parameter wurde der Korrelationskoeffizient nach Spearman eingesetzt.
In der statistischen Auswertung wurden alle Werte mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von
weniger als 5% (p < 0,05) als signifikant angesprochen.
Ergebnisse 41
4 Ergebnisse
4.1 Motilität
Zwischen den Hengsten und zwischen den Ejakulaten eines Hengstes gab es große Unter-
schiede bezüglich der Motilitätswerte. Auffällig waren die extrem schlechten Motilitätswerte
des dritten Ejakulats bei verschiedenen Hengsten die am gleichen Tag abgesamt wurden.
Bei 78% der Hengste betrug die progressive Motilität (PMOT) in den Nativ-Proben mehr als
70%; 14% der Hengste zeigten eine PMOT zwischen 50 und 70%. Bei allen Hengsten war die
Zahl der unbeweglichen Spermien größer als die der ortsbeweglichen. Sowohl basierend auf
dem Parameter NRR33 als auch auf der Einteilung der Hengste mittels des Parameters Tr/R
konnte in den Nativ-Proben ein signifikanter Unterschied zwischen den drei Hengstgruppen
(Gruppe A – 25% der Probanden mit den höchsten Werten für Tr/R, Gruppe B – 50% der
Probanden mit mittleren Werten für Tr/R und Gruppe C – 25% der Probanden mit den nied-
rigsten Werten für Tr/R) bezüglich der Anzahl vorwärtsbeweglichen Spermien festgestellt
werden.
Nach dem Einfrier- und Auftauprozess war die PMOT signifikant, jedoch sehr hengstabhän-
gig, herabgesetzt. Die Hengste mit den besten und schlechtesten Motilitätswerten in den Na-
tiv-Proben, zeigten auch nach dem Auftauen die besten (69,9% bei Hengst 15), beziehungs-
weise schlechtesten (0% bei Hengst 38) Werte. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwi-
schen den drei Fertilitätsgruppen. Die TG-Proben der fertilen Hengste zeigten alle eine
PMOT über 50% (ausgenommen Hengst 3 mit einer PMOT von 43,2%). Bei den subfertilen
Hengsten dagegen war die PMOT der TG-Proben immer niedriger als 25%.
Abbildung 8 (S. 42) zeigt eine graphische Darstellung der PMOT (in %) pro Fertilitätsgruppe.
Ergebnisse 42
Abbildung 8: Graphische Darstellung der PMOT (in %) pro Fertilitätsgruppe (A, B und C) der ersten
zwei Nativ-Proben aller Hengste (Abb. a: n = 50 Hengste; m = 2 Ejakulate) und der ausgewählten Hengste
(Abb. b: n = 12 Hengste ; m = 2 Ejakulate ) sowie der ersten TG-Probe dieser ausgewählten Hengste (Abb.
c: n = 12 Hengste ; m = 1 Ejakulat).
* Ausreißer a, b, c Werte mit unterschiedlicher Buchstabenkombination unterscheiden sich signifikant zwischen den
Fertilitätsgruppen
n Anzahl der Probanden
m Anzahl der Ejakulate pro Proband
Ergebnisse 43
4.2 Morphologische Beurteilung mittels Phasenkontrastmikroskopie
Bei der morphologischen Beurteilung der Spermien wurde jedes Spermium einer Kategorie
zugeteilt (Tabelle 1). Wenn mehrere Abweichungen in einem Spermien auftraten, wurde das
Spermium der ersten zutreffenden Kategorie zugeordnet.
Die Gesamtzahl morphologisch abweichender Spermien ermöglichte einen Vergleich der
Hengste. Der Durchschnittswert morphologisch abweichender Spermien in der gesamten
Stichprobe lag bei 49,46% und der Median bei 46,8%. Dies bedeutet, dass durchschnittlich
die Hälfte der Spermien pathologisch verändert war.
Tabelle 1: Vergleich der phasenkontrastmikroskopischen Parameter zwischen den Fertilitätsgruppen
(Tr/R) für Nativ- und TG-Proben. Die statistisch signifikanten Unterschiede sind fett gedruckt.
Phasenkontrastmikroskopische
Parameter
Statistische
Verteilung
p-Wert Nativ n = 50 Hengste
m = 3 Ejakulate
p-Wert TG n = 12 Hengste
m = 1 Ejakulat
Akrosomveränderungen ln 0,4334 0,9770
Kopfveränderungen ln 0,3452 0,0157
Halsveränderungen nn 0,4693 0,1406
Proximale Zytoplasmatropfen nn 0,3648 0,2246
Distale Zytoplasmatropfen ln 0,0833 0,6834
Verbindungsstückveränderungen nn 0,3126 0,9824
Sonstige Mittelstückabweichungen nn 0,5189 0,9873
Haupt- und Endstückveränderungen ln 0,1034 0,5827
m Anzahl der Ejakulate pro Proband
n Anzahl der Probanden
ln logarithmisch normal-verteilte Parameter
nn nicht normal-verteilte Parameter
Die häufigsten Hals- und Mittelstückveränderungen (Abb. 9 und 10, S. 44) waren persistie-
rende Plasmatropfen, die wegen ihrer Lokalisation als proximale, beziehungsweise distale
Plasmatropfen beschrieben wurden. Sie waren viel häufiger in den Nativ- als in den TG-
Proben anzutreffen. Die distalen Zytoplasmatropfen konnten häufiger bei den subfertilen als
bei den fertilen Hengsten festgestellt werden.
Die im Protokoll mit “Sonstige Mittelstückabweichungen” bezeichneten Abweichungen kann
man noch weiter in geknickte oder gebogene Mittelstücke und deformierte Mittelstücke diffe-
renzieren. Viele dieser Abweichungen befanden sich am Übergang zwischen Mittelstück und
Hauptstück.
Ergebnisse 44
Abbildung 9: Halsveränderungen. a) paraxialer Geißelansatz (Spermium oben im Bild) und Knick im
Anulusbereich (Spermium unten im Bild), b) persistierender proximalen Plasmatropfen, c) Halsbruch, d) proxi-
maler Plasmatropfen oder Beschädigung der Plasmamembran und der mitochondrialen Scheide und e) retroaxia-
ler Geißelansatz (Phasenkontrastmikroskopie).
Abbildung 10: Mittelstückabweichungen. a) Defekt der mitochondrialen Scheide, b) korkenzieherähnliches
Mittelstück, c) geknicktes Mittelstück im Anulusbereich, umgeben von einem Plasmatropfen, d) gebogenes
Mittelstück, e) persistierender distaler Plasmatropfen, f) defektes Mittelstück und g) gebrochenes Mittelstück
(Phasenkontrastmikroskopie).
Die Anzahl der Akrosomveränderungen (Abb. 11 S. 45) nahm nach dem Auftauen deutlich
zu. Normale Akrosome zeigten sich als feiner, dunkler Rand, der den Kern in den proximalen
zwei Dritteln des Kopfes umgab. Geschwollene Akrosome stellten sich oft sehr dunkel da, da
die proximale Hälfte des Akrosom zurückgefaltet war. Bei teilweise abgelösten Akrosomen
lag das Akrosom dem Kern nicht mehr an, während bei vollständig abgelösten Akrosomen im
proximalen Bereich des Kopfes kein dunkler Rand mehr zu erkennen war. Auch
Akrosomdeformationen und persistierende Akrosomgranulome konnten festgestellt werden.
Ergebnisse 45
Abbildung 11: Akrosomabweichungen: a) normales Spermium (oberes Spermium) und Spermium mit
geschwollenem Akrosom (unteres Spermium), b) vollständig abgelöstes Akrosom, c) geschwollenes Akrosom,
d) Akrosom fast vollständig abgelöst und e) Akrosom mit persistierendem Akrosomgranulom (Phasenkontrast-
mikroskopie).
Die häufigste Kopfveränderung (Abb. 12) war eine Kopfdeformation. Sie konnte sehr unter-
schiedliche Formen annehmen; manche Köpfe waren eckig, andere birnenförmig. Schmale,
verjüngte, Zwerg- und Riesenköpfe wurden selten angetroffen. Bei den letzten zwei Abwei-
chungen zeigte die Größe des Spermiums eine Abweichung, die Kopfform blieb jedoch erhal-
ten.
Abbildung 12: Kopfabweichungen. a) deformierter Zwergkopf, b) Riesenkopf (linkes Spermium) und schmaler
Kopf (rechtes Spermium), c) deformierter Kopf, d) schmaler Kopf und proximaler Plasmatropfen, e) deutlich
begrenzte Vakuole im Kern- und Akrosombereich, f) umrandete Kernvakuole, g) birnenförmiger Kopf und h) deformierter Kopf mit umrandeter Vakuole (Phasenkontrastmikroskopie).
Ergebnisse 46
Hauptstück- und Endstückveränderungen (Abb. 13) umfassten schleifenförmige, aufgerollte
oder um den Kopf gerollte Spermien und rudimentäre Schwänze. Doppel- und Mehrfachmiß-
bildungen waren kaum anzutreffen.
Abbildung 13: Haupt- und Endstückabweichungen: a) rudimentäre Geißel, b) aufgerollte Geißel,
c) schleifenförmige Geißel und d) Doppelköpfe (Phasenkontrastmikroskopie).
Die Häufigkeit verschiedener Abweichungen in den Nativ- und den TG-Proben ist in Tabelle
2 zusammengefasst, während die Häufigkeit dieser Abweichungen in den drei Fertilitätsgrup-
pen in Abbildung 14 (S. 47) grafisch dargestellt ist.
Tabelle 2: Vergleich der phasenkontrastmikroskopischen Parameter zwischen den Nativ- (n = 50 Hengste;
m = 3 Ejakulate) und den TG-Proben (n = 12 Hengste; m = 1 Ejakulat). Die statistisch signifikanten Un-
terschiede sind fett gedruckt und die Zu- oder Abnahme dieser Parameter nach dem Auftauen wird in der
letzten Zeile angezeigt.
Phasenkontrastmikroskopische
Parameter
Statistische
Verteilung p-Wert Nativ --> TG
1 Akrosomveränderungen ln <0,000 ↑
2 Kopfveränderungen ln 0,409
3 Halsveränderungen nn 0,006 ↓
4 Proximale Zytoplasmatropfen nn <0,000 ↓
5 Distale Zytoplasmatropfen ln <0,000 ↓
6 Verbindungsstückveränderungen nn 0,007 ↓
7 Übrige Mittelstückabweichungen nn 0,527
8 Haupt- und Endstückveränderungen ln 0,019 ↑ m Anzahl der Ejakulate pro Proband
n Anzahl der Probanden
ln logarithmisch normal-verteilte Parameter
nn nicht normal-verteilte Parameter
Ergebnisse 47
Abbildung 14: Morphologische Abweichungen (%) in den Nativ- (m = 3 Ejakulate) und TG-Proben (m = 1 Ejakulat) der ausgewählten Hengste (n = 12 Hengste): (1)
Akrosomveränderungen, (2) Kopfveränderungen, (3) Halsveränderungen, (4) proximale Zytoplasmatropfen, (5) Verbindungsstückveränderungen, (6) distale Zytoplasmatropfen,
(7) übrige Mittelstückabweichungen, (8) Haupt- und Endstückveränderungen. Die Hengste wurden, basierend auf dem Fertilitätsparameter Tr/R, in drei Fertilitätsgruppen einge-
teilt (A, B, C).
* Ausreißer
a, b, c Werte mit unterschiedlicher Buchstabenkombination unterscheiden sich signifikant zwischen den Fertilitätsgruppen
1, 2 Werte mit unterschiedlicher Zahlenkombination unterscheiden sich signifikant zwischen den Nativ- und TG-Proben
n Anzahl der Probanden
m Anzahl der Ejakulate pro Proband
Ergebnisse 48
4.3 Morphologische Beurteilung mittels TEM
4.3.1 Die Plasmamembran
4.3.1.1 Spermienköpfe
Die Plasmamembranen der Spermienköpfe zeigten zahlreiche Veränderungen. In den Nativ-
Proben konnte bei maximal 24% der Spermien eine vollständig intakte, dem Akrosom glatt
anliegende Plasmamembran festgestellt werden (Abb. 15). Gewellte und gefranste Membra-
nen wurden noch als physiologisch angesehen. Gefranste Membranen konnten jedoch kaum
beobachtet werden.
Abbildung 15: Ein physiologischer Spermiumkopf eines fertilen Hengstes. Der Kern (A) hat viele kleine und
eine größere Vakuole. Das Akrosom (B) liegt dem Kern im proximalen und im mittleren Bereich des Kopfes
glatt an. Die Plasmamembran (C) befindet sich im proximalen Bereich in Ablösung und im mittleren Bereich
stellt sie sich gewellt dar (TEM).
Zu den Membranveränderungen, die sowohl in den nativen als auch in den aufgetauten Pro-
ben zu beobachten waren, gehörten abgehobene Membranen, Membranen, die teilweise oder
vollständig abgelöst waren, aufgerollte Membranen und Granulabildung (Abb. 16).
Abbildung 16: Spermium mit Akrosomreaktion (deutliche Granulabildung) (TEM).
C
A B
Ergebnisse 49
Abbildung 17 - 18: Spermienkopf mit einer großen Kernvakuole, die mit granulärem Inhalt (weißer Pfeil)
gefüllt ist (Abb. 17: linkes Bild). Das Akrosom (A) und die Plasmamembran (B) sind abgehoben. Die Plasma-
membran ist teilweise abgelöst (C). Spermienkopf mit intaktem Akrosom (Abb. 18: rechtes Bild). Die Plas-
mamembran ist teilweise abgehoben (unterer Bereich im Bild) und teilweise aufgerollt (schwarzer Pfeil). Die
kleinen Kernvakuolen (weißer Pfeil) sind als physiologisch zu bezeichnen (TEM).
Bei den meisten Hengsten zeigten im Mittel zwischen 19% und 25% der Spermien in den
Nativ-Proben abgehobene Membranen (Abb. 17). Nur zwei Hengste (Hengst 20 und Hengst
21) hatten extrem niedrige Werte, da die meisten Spermien dieser Hengste eine teilweise oder
vollständig abgelöste Membran aufwiesen. Es fiel auch auf, dass die Ergebnisse zwischen den
Ejakulaten stark schwankten.
Bei der Beurteilung der Spermien mit teilweise abgelösten und vollständig abgelösten Mem-
branen in den Nativ-Proben waren wiederum deutliche Schwankungen zwischen den drei
Ejakulaten und keine deutlichen Unterschiede zwischen den Hengstgruppen zu erkennen. Bei
den Spermien der fertilen Hengste war der Anteil der Membranen, die sich in Ablösung be-
fanden, immer größer als der Anteil der abgelösten Membranen. Bei den meisten infertilen
Hengsten waren beide Befunde ungefähr gleich häufig oder der Anteil der abgelösten Memb-
ranen größer. Aufgerollte Membranen (Abb. 18) wurden in den Nativ-Proben angetroffen,
waren jedoch selten in den TG-Proben zu beobachten.
A B
C
Ergebnisse 50
4.3.1.2 Geißelquerschnitte
Die Membran im Geißelbereich sollte glatt anliegend sein (Abb. 19 und 20). Auch gewellte
Membranen wurden noch als normal bezeichnet. Abgehobene (Abb. 21) und teilweise oder
vollständig abgelöste Membranen (Abb. 22) wurden als pathologisch angesehen. Gefranste
und aufgerollte Membranen im Kopfbereich waren sehr selten, in den Geißelquerschnitten
wurden diese gar nicht gefunden.
Abbildung 19-20: Physiologischer proximaler Querschnitt (Abb. 19: linkes Bild). Im Zentrum befinden sich
die zwei zentralen Mikrotubuli (A), umgeben von 9 Mikrotubulipaaren (B) und 9 Mantelfasern (C). Die Mito-
chondrien (D) und die glatt anliegende Plasmamembran (E) umgeben die ganze Struktur. Querschnitt aus dem
Hauptstück einer Geißel (Abb. 20: rechtes Bild). Das Tubulusmuster (A) ist normal, die Mantelfasern fehlen.
Die Ringfasern (B) und die glatt anliegende, intakte Plasmamembran (C) umgeben die Axonemastruktur (TEM).
Abbildung 21-22-23: Distaler Geißelquerschnitt (Abb. 21: linkes Bild). Das Axonema ist umgeben von 9
Mantelfasern. Zwei dieser Mantelfasern verschmelzen mit den Ringfasersäulen (A). Die Plasmamembran (B)
stellt sich gewellt bis abgehoben dar. Distaler Geißelquerschnitt (Abb. 22: mittleres Bild) mit unterbrochenen
Ringfasern (A) und vollständig abgelöster Plasmamembran. Geißelquerschnitt im Mittelstückbereich (Abb.
23: rechtes Bild). Der Bereich zwischen den Mitochondrien und der Plasmamembran wird einerseits von Zyto-
plasma (A) und andererseits hauptsächlich von Mikrotubuli ausgefüllt (B) (TEM).
A B
C
B D
E
A
B
C
A
B A
A
B
Ergebnisse 51
Allgemein fiel auf, dass die Membran im Geißelbereich öfter intakt war als im Kopfbereich.
Vor dem Einfrieren gab es bei den fertilen Hengsten deutlich mehr intakte Geißelmembranen
als bei den subfertilen Hengsten. Nach dem Einfrieren war der Unterschied zwischen den
Hengstgruppen nicht mehr festzustellen.
In den proximalen Geißelquerschnitten waren die normalen Membranen in den meisten Fällen
den Mitochondrien glatt anliegend. Nur bei einem Hengst (Hengst 15) waren auch gewellte
Membranen zu sehen. In den distalen Geißelquerschnitten der Nativ-Proben war der Anteil
gewellter Membranen jedoch erheblich.
Der Anteil der abgehobenen und teilweise oder vollständig abgelösten Membranen war in
Abhängigkeit vom untersuchten Hengst und dem beurteilten Ejakulat sehr variabel. Abgeho-
bene Membranen im proximalen Bereich waren oft im Zusammenhang mit persistierenden
Plasmatropfen oder Mikrotubulärer Masse zu beobachten (Abb. 23, S. 50).
4.3.2 Das Akrosom
Die Akrosombeurteilung zeigte eine unterschiedliche Tendenz zwischen den fertilen und den
subfertilen Hengsten: der Hengstmittelwert für Akrosomabweichungen bei den fertilen
Hengsten betrug in den Nativ-Proben maximal 50%, während er bei den subfertilen Hengsten
immer höher lag. Nach dem Auftauen waren in beiden Hengstgruppen deutlich mehr
Akrosomanomalien zu sehen, doch die Unterschiede zwischen den Fertilitätsgruppen waren
bei der Akrosombeurteilung nicht mehr zu erkennen.
Abbildung 15 (S. 48) zeigt ein Akrosom, das dem Kern glatt anliegt und eine intakte innere
und äußere akrosomale Membran hat. An der Akrosomspitze der untersuchten Spermien be-
fand sich, wie auf diesem Bild, häufig die äußere akrosomale Membran in Ablösung. Dieser
Befund wurde noch als “normales Akrosom” eingetragen, da er bei sehr vielen Spermien beo-
bachtet wurde und deswegen als ein Fixierungsartefakt zu bezeichnen war.
Oft war die äußere akrosomale Membran teilweise oder vollständig abgelöst. In dem defekten
Bereich war die Plasmamembran fast immer unterbrochen.
Ergebnisse 52
Manchmal lag das Akrosom dem Kern nicht mehr glatt an und stellte sich dann gewellt oder
abgehoben dar (Abb. 25). Wenn die Plasmamembran noch nicht vollständig abgelöst war,
bekam man entweder den Eindruck, das Akrosom wäre abgehoben und die Plasmamembran
wäre deswegen ebenfalls abgehoben worden (Abb. 26), oder dass beide unabhängig vonei-
nander abgehoben worden waren (Abb. 17, S. 49).
Abbildung 24- 25: Spermienkopf mit Taschenbildung im Kern und einem Verlust akrosomaler Matrix in
diesem Bereich (Abb. 24: linkes Bild). Die akrosomale Matrix ist teilweise abgelöst und die Abgrenzung des
Kopfes ist undeutlich, da die Plasmamembran vollständig abgelöst ist. Spermienkopf mit leicht deformierter
Spitze (Abb. 25: rechtes Bild). Das Akrosom ist teilweise gewellt (A) und teilweise abgehoben (B) und an der Kernspitze verdickt (C). Die Plasmamembran ist abgehoben und teilweise abgelöst. Zwischen dem Akrosom und
der Plasmamembran ist eine größere Anzahl von Mikrotubuli zu erkennen (D) (TEM).
Abbildung 26: Spermienkopf mit abgehobenem Akrosom. Die Plasmamembran liegt noch ziemlich gut dem
Akrosom an, ist jedoch an mehreren Stellen in Ablösung (TEM).
Granulabildung deutet auf eine Akrosomreaktion hin. Hierbei fließen die Plasmamembran
und die äußere akrosomale Membran unter Vesikelbildung zu sogenannten Granula zusam-
men. Deswegen befindet sich diese Veränderung nicht nur im Bereich der Plasmamembran,
sondern auch im Akrosombereich.
Abbildung 27 (S. 53) zeigt den Anfang einer Akrosomreaktion: die Plasmamembran ist ge-
wellt bis abgehoben und in Ablösung, mit Vesikelbildung im proximalen Kopfbereich.
A
B C
D
Ergebnisse 53
Granula können den gesamten Spermiumkopf umgeben, doch viele Spermien hatten diese
Vesikel nur im proximalen Kopfbereich.
Abbildung 27: Drei Spermienköpfe mit verschiedenen abweichenden Befunden in einer TG-Probe. Das
obere Spermium hat eine intakte akrosomale Matrix, doch die äußere akrosomale Membran ist an mehreren
Stellen unterbrochen und die Plasmamembran ist abgelöst (A). Das mittlere Spermium zeigt eine gewellte bis
abgehobene Plasmamembran und Vesikelbildung im ersten Drittel des Kopfes (B). Die akrosomale Matrix ist
sehr dünn und undeutlich abgegrenzt (in Ablösung). Das untere Spermium zeigt ein intaktes Akrosom mit einer
intakten und sehr deutlichen äußeren akrosomalen Membran. Die Plasmamembran ist abgehoben (C) (TEM).
Manche Spermien mit Akrosomreaktion hatten noch eine teilweise intakte akrosomale Matrix.
Bei den meisten aber war nur noch wenig von dieser Matrix zu erkennen. Die Matrixreste
waren vor allem im distalen Kopfbereich zu sehen (Abb. 16, S. 48). Um diesen Unterschied
darzustellen, wurden diese akrosomreagierten Spermien bei der Beurteilung unterschiedlich
aufgelistet. Spermien der ersten Gruppe wurden unter “Akrosom in Ablösung” eingetragen.
Spermien, die der zweiten Gruppe angehörten, wurden unter “Granula” aufgelistet.
Bei den beobachteten, akrosomreagierten Spermien der zweiten Gruppe gab es einige, bei
denen sehr wenig Granula zu sehen waren und somit die Akrosomreaktion kaum noch nach-
zuweisen war (Abb. 28 und 29, S. 54). Deswegen wäre es auch möglich, dass Spermien mit
abgelöstem Akrosom, doch ohne Granula, als akrosomreagiert zu bezeichnen wären. Da auch
die Plasmamembran abgelöst ist, geht es hier um Spermienköpfe, die nur aus dem Kern be-
stehen und nur wenig akrosomale Matrixreste besitzen.
A
B
C
Ergebnisse 54
Abbildung 28 - 29: Spermien mit Akrosomreaktion in einer aufgetauten Probe (Abb. 28: linkes Bild). Der
linke Kopf zeigt eine rudimentäre akrosomale Matrix (A) und kaum Granula. In dem rechten Kopf befindet sich
die akrosomale Matrix in Ablösung und ist an mehreren Stellen bereits vollständig abgelöst. Genau an diesen Stellen ist eine Granulabildung (B) zu sehen. Ein Spermienkopf, bei dem die Plasmamembran und die äuße-
re akrosomale Membran vollständig abgelöst sind (Abb. 29: rechtes Bild). Von der akrosomalen Matrix
(schwarzer Pfeil) ist kaum noch etwas zu erkennen (TEM).
Deutliche Unterschiede zwischen den Hengstgruppen gab es nicht. Hengst 42 fiel jedoch
wegen der hohen Anzahl an Kernen ohne Akrosom in den drei Nativ-Proben auf. In der TG-
Probe von diesem Hengst war die Anzahl an Kernen ohne Akrosom noch höher.
Einige Akrosomanomalien traten nur sporadisch auf. So gab es einige dünne Akrosome, wo-
bei die äußere akrosomale Membran meistens abgelöst war. Das Akrosom, das nur noch die
Hälfte der Dicke eines normalen Akrosoms hatte, zeigte im TEM-Bild die gleiche Elektro-
nendichte wie eine physiologische Akrosommatrix und lag entweder dem Kern glatt an oder
war abgehoben. Einzelne Akrosomen waren im proximalen Bereich verdickt (Abb. 25, S. 52),
wobei oft die äußere akrosomale Membran und die Plasmamembran in diesem Bereich abge-
löst waren und manche Akrosome noch zusätzlich Deformationen aufwiesen (Abb. 30). In
seltenen Fällen waren im Zuge der Deformation Vakuolen -mit oder ohne Inhalt- gebildet
worden (Abb. 31).
Abbildung 30 - 31: Spermienkopf in einer TG-Probe mit stark deformiertem Akrosom (Abb. 30: linkes
Bild). Die akrosomale Matrix ist durch eine intakte innere und äußere akrosomale Membran abgegrenzt. Die
Plasmamembran ist abgehoben. Spermienkopf mit deformiertem Akrosom und mehreren
Akrosomvakuolen (A) (Abb. 31: rechtes Bild). Auch im Kern ist eine große Vakuole (B) zu sehen. Die
akrosomale Matrix ist intakt und an den meisten Stellen deutlich begrenzt durch die akrosomalen Membranen.
Die Plasmamembran ist gewellt bis abgehoben. Zwischen dem Akrosom und dem abgehobenen Teil der Plas-
mamembran befinden sich kleine membranumhüllte Partikel (C) (TEM).
A
B
A
B
C
Ergebnisse 55
Viele Spermien in den TG-Proben hatten eine hellere akrosomale Matrix. Durch den etwas
größeren Kontrast zwischen der helleren Matrix und den akrosomalen Membranen waren De-
fekte der äußeren akrosomalen Membran sehr deutlich zu sehen. Manche Spermien hatten
eine viel zu helle, breitere aber wenig kompakte Matrix (Abb. 32). Bei anderen war keine
Matrix mehr nachzuweisen. In diesen Fällen waren dann nur zwei membranähnliche Struktu-
ren zu erkennen (Abb. 33). Das Akrosom konnte auch getrennt sein, wobei ein Teil dem Kern
anlag und der andere Teil abgehoben war.
Abbildung 32 - 33: Spermienkopf einer TG-Probe (Abb. 32: linkes Bild). Der Kern zeigt viele kleine und
eine größere Vakuole (A). Die akrosomale Matrix (B) ist nicht uniform, hat wenig Kontrast und wirkt zweige-
teilt. Spermienkopf einer TG-Probe (Abb. 33: rechtes Bild). Der Kern zeigt viele kleine Vakuolen. Die
akrosomale Matrix (A) ist hell und ungeordnet. Der Kopf wird begrenzt durch zwei gewellte und abgehobene
Membranen (B) (TEM).
4.3.3 Der Kern
Der Anteil an veränderten Kernen lag im Durchschnitt zwischen 3 und 38% der untersuchten
Köpfe in den Nativ-Proben, mit großen individuellen Unterschieden.
Bei allen Hengsten waren kleine Kernvakuolen zu sehen. Nur große Vakuolen oder Vakuolen
mit Inhalt wurden im Protokoll berücksichtigt. Bei dieser letzten Abweichung war maximal
ein Spermium pro Ejakulat betroffen.
Kerne mit Kondensationsstörungen waren fast immer in kleinen Gruppen anzutreffen. Es
handelte sich dabei um unreife Spermienvorstadien (Abb. 34, S. 56), wobei das Chromatin
des Kernes noch nicht ganz kondensiert war und die Spermienvorstufen über
Zytoplasmabrücken miteinander in Verbindung standen.
Ab und zu waren Kerndefekte mit sehr spezifischem Aussehen zu beobachten. Die taschen-
förmigen Ausschnitte des Kernes (Abb. 24, S. 52 und Abb. 35, S. 56) waren elektronenmikro-
A B
A
B
Ergebnisse 56
skopisch gut zu erkennen und enthielten meistens eine geringe Menge unorganisierter
akrosomaler Matrix.
Abbildung 34 - 35: Drei Spermienköpfe mit unvollständig kondensiertem Chromatin im Kern (Abb. 34: linkes Bild). Es handelt sich hier um unreife Spermienvorstufen im Ejakulat. Kopf mit anormaler Kernform
(Abb. 35: rechtes Bild). Das Akrosom ist sehr dünn, liegt dem Kern jedoch auch im Bereich der Taschenbil-
dung (Pfeil) glatt an. Die Plasmamembran ist vollständig abgelöst (TEM).
4.3.4 Der Hals
Wegen der niedrigen Zahl der verfügbaren Längsschnitte in den Ultradünnschnitten, war die
Beurteilung des Halses mittels Elektronenmikroskopie sehr ungenau. Nur bei zwei Spermien
war das proximale Zentriol senkrecht zur Längsachse des Zentriols angeschnitten, sodass die
9x3-Mikrotubulistruktur deutlich sichtbar war (Abb. 36, S. 57). Halsbrüche konnten oft nur
vermutet werden. Anomalien, bei denen der Kopf geknickt von der Geißel stand, wurden als
beginnende Halsbrüche eingestuft (Abb. 37, S. 57). Der abaxiale Geißelansatz, der typisch ist
für Hengstspermien, konnte durch die verschiedenen Schnittebenen selten gesehen werden.
Ergebnisse 57
Abbildung 36 - 37: Spermienlängsschnitt (Abb. 36: linkes Bild). Der Zentriolquerschnitt (Pfeil) besteht aus 9
Gruppen von jeweils drei Mikrotubuli, die ein Triplett bilden. Längschnitt mit anormalem Halsansatz (A) und
Defekt in der Mitochondrienscheide (B) (Abb. 37: rechtes Bild) (TEM).
4.3.5 Plasmatropfen
Mit der Elektronenmikroskopie waren Plasmatropfen auf den Längsschnitten (Abb. 38, S. 58)
im Halsbereich und auf den Geißelquerschnitten zu sehen (Abb. 39, S. 58). Distale Quer-
schnitte wiesen kaum Plasmatropfen auf. Nur zwei distale Querschnitte mit einer
Zytoplasmastruktur zwischen den Ringfasern und der abgehobenen Plasmamembran waren
bei einem Hengst zu sehen. Die Anzahl der proximalen Querschnitte mit Plasmatropfen in
den Nativ-Proben, bestimmt mittels Elektronenmikroskopie, entsprach sehr gut den Ergebnis-
sen der Phasenkontrastmikroskopie. In den TG-Proben trat bei mehreren subfertilen Hengsten
eine Verringerung der Plasmatropfenzahl auf, genauso wie in der Phasenkontrastmikroskopie.
Auch in den Längsschnitten fiel bei den gleichen Hengsten eine niedrigere Plasmatropfenzahl
nach dem Einfrierprozess auf.
A
B
Ergebnisse 58
Abbildung 38 - 39: Längsschnitt eines Spermiums mit proximalem Plasmatropfen (Abb. 38: linkes Bild). Die Plasmamembran ist intakt, im Halsbereich aber abgehoben. Der Inhalt dieser Halsverbreiterung besteht aus
Zytoplasma (Pfeil). Der Halsansatz ist nicht zu beurteilen da das Spermium in diesem Bereich zu oberflächlich
angeschnitten ist, sodass nur die oberflächlich liegenden Strukturen der Geißel, nämlich die Mitochondrien, zu
sehen sind. Mehr distal ist der Schnitt tiefer, sodass auch die Mantelfasern und Mikrotubuli des Mittelstückes
sichtbar sind. Pathologischer proximaler Geißelquerschnitt (Abb. 39: rechtes Bild). Eines der peripheren
Tubuluspaare fehlt, die Mantelfasern (A) liegen ungeordnet und die zu hellen Mitochondrien (B) formen keine
regelmäßige Ringstruktur. Die Plasmamembran ist abgehoben und im Raum zwischen der Membran und den
Mitochondrien befindet sich Zytoplasma und eine Gruppe frei liegender Mantelfasern (C) (TEM).
4.3.6 Mikrotubuläre Masse (MM)
Mikrotubuläre Masse wurde im Kopfbereich (Abb. 40), in proximalen Querschnitten (Abb.
23, S. 50) und Längsschnitten (Abb. 41, S. 59) im Halsbereich angetroffen. Sie war häufiger
in Längsschnitten als in Querschnitten zu sehen und lag sehr verdrillt im Zytoplasma vor.
Abbildung 40: Kopf mit MM (linkes Bild). Die Plasmamembran ist abgelöst und das Akrosom abgehoben,
wobei der Raum zwischen Kern und Akrosom mit MM gefüllt ist. Vergrößerung der MM (rechtes Bild)
(TEM).
B
A
C
Ergebnisse 59
Abbildung 41: Längsschnitt eines anormalen Halsansatzes (linkes Bild). Die ganze Geißelstruktur dieses
Bereiches ist betroffen: Sowohl Mantelfasern als auch Mikrotubuli und Mitochondrien zeigen abweichende Befunde (A). Die Verbreiterung am Hals enthält viele Mikrotubuli (B). Das schwarze Artefakt auf dem Bild ist
Bleiniederschlag. Vergrößerung der Mikrotubuli (rechtes Bild) (TEM).
Obwohl der Unterschied zwischen Mikrotubuli und Zytoplasma mittels Elektronenmikrosko-
pie klar war, war die Klassifizierung von proximalen Geißelquerschnitten und -längsschnitten
in eine der beiden Kategorien nicht immer möglich. Einerseits waren Zytoplasmatropfen mit
einigen Mikrotubulistrukturen vorhanden und andererseits waren MM, die in einer nicht un-
bedeutenden Menge an Zytoplasmastrukturen gebunden waren zu beobachten. Bei einem
Spermiumquerschnitt wurden Mikrotubuli und Zytoplasma in gleichen Anteilen und räumlich
voneinander getrennt beobachtet (Abb. 23, S. 50). Nur ein Spermium verfügte im Bereich der
distalen Geißel über MM.
Bei nur einem Hengst (Hengst 20) zeigten die untersuchten Spermien der drei Ejakulate keine
MM. Die anderen Hengste hatten alle einen niedrigen Spermienanteil mit
Mikrotubulistrukturen, wobei das Maximum bei 7 Spermien mit Mikrotubuli-Ansammlungen
pro Ejakulat bei der Beurteilung der Köpfe und bei 6 Spermien mit Mikrotubuli-
Ansammlungen pro Ejakulat bei der Beurteilung der proximalen Geißelquerschnitte lag.
A
B
Ergebnisse 60
4.3.7 Mitochondrien, Ringfasern, Mantelfasern und Axonemastruktur
Abbildung 42 und 43 zeigen physiologische Geißellängsschnitte im Hals-, Mittelstück- und
Hauptstückbereich, während Abbildung 44 und 45 physiologische Geißelquerschnitte im Be-
reich des distalen Geißelendes zeigen.
Abbildung 42-43: Physiologischer Geißellängsschnitt im Hals- und Mittelstückbereich (Abb. 42: linkes
Bild) mit von Innen nach Außen folgenden Strukturen: zentrale Mikrotubuli (A), periphere Mikrotubuli (B),
Mantelfasern (C), Mitochondrien (D) und Plasmamembran (E). Im Halsbereich sind viele Mikrotubuli zu be-
obachten (F). Physiologischer Geißellängsschnitt im Bereich des Hauptstückes (Abb. 43: rechtes Bild). In
der Mitte befinden sich die zwei zentralen Mikrotubuli (A). Oberhalb und unterhalb der zentralen Mikrotubuli ist
jeweils 1 Mikrotubulus der 9 peripheren Mikrotubuluspaare angeschnitten (B). Die etwas dunkleren Strukturen,
die diesen beiden Mikrotubuli an der äußeren Seite anliegen, sind zwei der 9 Mantelfasern (C). Noch weiter
seitlich befinden sich die Ringfasern (D), umgeben von der Plasmamembran (E) (TEM).
Abbildung 44-45: Distales Geißelendstück mit einer intakten Plasmamembran (Abb. 44: linkes Bild). Die
Axonemastruktur ist noch zu erkennen, doch manche Mantel- und die Ringfasern fehlen. Distales Geißelend-
stück (Abb. 45: rechtes Bild): die Mikrotubulizahl und –anordnung variiert in diesem Bereich. Mantelfasern
und Ringfasern sind nicht mehr vorhanden (TEM).
A
B
C
D
E
F
Ergebnisse 61
Sowohl in proximalen Querschnitten als auch in Längsschnitten wurde häufig eine Unterbre-
chung der Mitochondrienscheide (Abb. 46) festgestellt. Diese Anomalie wurde öfter in Ver-
bindung mit Abweichungen der Mantelfasern- und der Tubulizahl gesehen. Manchmal be-
stand die Mitochondrienscheide aus zu vielen Mitochondrien (Abb. 47), die ungeordnet das
Axonema umgaben.
Abbildung 46 - 47: Die Mitochondrienscheide des Spermiums ist unterbrochen (Abb. 46: linkes Bild).
Längsschnitt einer proximalen Geißel (Abb. 47: rechtes Bild). Die Plasmamembran ist abgelöst und die
Mitochondrienscheide ungeordnet (Pfeil). Auffällig sind der große Raum zwischen den Membranen und die
dunkle Matrix der Mitochondrien (TEM).
Die innere mitochondriale Matrix sollte heller als der Zwischenmembranraum sein. Kontra-
hierte Mitochondrien mit einer zu dunklen Matrixstruktur waren selten, eine sehr helle
Mitochondrienmatrix (Abb. 48 und 49, S. 62) war fast nur nach dem Auftauen in TG-Proben
häufig wahrzunehmen.
Ergebnisse 62
Abbildung 48 - 49: Proximale Geißelquerschnitte einer TG-Probe (Abb. 48: linkes Bild). In dem oberen
proximalen Querrschnitt ist der Raum zwischen den mitochondrialen Membranen (A) verbreitert und die Matrix
(B) stellt sich heller dar. In dem unteren proximalen Querrschnitt haben die Mitochondrien eine normale Dichte.
Querschnitt aus dem Mittelstück der Geißel (Abb. 49: rechtes Bild). Die Anzahl der Mikrotubuli und Man-
telfasern ist erhöht (Pfeile), während ein Teil der Mitochondrien fehlt. Die Plasmamembran stellt sich gewellt
dar (TEM).
In distalen Querschnitten waren die Ringfasern manchmal unterbrochen (Abb. 22, S. 50).
Dieser Befund war häufiger bei den TG-Proben als bei den Nativ-Proben. Abweichungen der
Mantelfasern und der Mikrotubuli kamen oft zusammen vor. Hierbei handelte es sich um das
Fehlen von einigen Mikrotubuli/Mantelfasern (Abb. 50, S. 63) oder das Vorhandensein von
zu vielen Mikrotubuli/Mantelfasern (Abb. 49). Manchmal war die innere Geißelstruktur un-
geordnet und es lagen Mikrotubuli und Mantelfasern durcheinander. Wenn gleichzeitig eine
Unterbrechung der Mitochondrienscheide auftrat, wurden auch Mikrotubuli, Mantelfasern
und Mitochondrienteile außerhalb der Mitochondrienscheide (Abb. 39, S. 58) angetroffen.
Querschnitte ganz ohne Mikrotubuli wurden in den Längschnitten nicht angetroffen und in
den Querschnitten nur bei 7 Spermien: Ein Spermium in der TG-Probe, eines in einem dista-
len Geißelquerschnitt einer Nativ-Probe und 5 in proximalen Querschnitten der Nativ-Proben
von 4 verschiedenen Hengsten. Ein proximaler Querschnitt ohne Mitochondrien konnte nur
bei einer Spermienzelle angetroffen werden (Abb. 51, S. 63).
A
B
Ergebnisse 63
Abbildung 50-51: Der distale Geißelquerschnitt (Abb. 50: linkes Bild) hat nur 5 Mikrotubulipaare. Die
Ringfasern sind umgeben von einer intakten Plasmamembran. Der Geißelquerschnitt (Abb. 51: rechtes Bild)
hat ein intaktes Mikrotubulusmuster, umgeben von 9 Mantelfasern (TEM).
4.3.8 Doppelgeißel und Doppelköpfe
In Geißellängsschnitten wurde manchmal ein zusätzlicher Geißelquerschnitt, meistens im
proximalen Bereich der Geißel, angetroffen (Abb. 52, S. 64). Aber auch zwei Längschnitte in
einer Membran wurden ab und zu gesehen (Abb. 53, S. 64). Die zwei Geißeln standen also
meistens senkrecht oder parallel zu einander. Diese parallel verlaufenden Doppelgeißeln wa-
ren ebenfalls als Querschnitte in einer Membran zu sehen, wobei fast immer bei einem der
Querschnitte eine ultrastrukturelle Anomalie nachzuweisen war (Abb. 54, S. 64). Da oft pro-
ximale und distale Geißelquerschnitte zusammen in einer Membran lagen, wurde diese Ano-
malie meistens bei den proximalen Querschnitten aufgelistet. Das erklärt auch den höheren
Anteil an Doppelgeißeln bei den proximalen Querschnitten verglichen mit den distalen. Der
Gesamtanteil der Doppelgeißeln in Querschnitten betrug zwischen 3 (Hengst 15) und 20%
(Hengst 20).
Doppelköpfe konnten nur bei einem Spermium beobachtet werden (Abb. 55, S. 64).
Ergebnisse 64
Abbildung 52 - 53: Geißellängsschnitt mit Geißelquerschnitt (Abb. 52: linkes Bild). Die Plasmamembran
des Kopfes ist vollständig abgelöst. Im proximalen Bereich des Kopfes ist auch die äußere akrosomale Membran
abgelöst und die akrosomale Matrix befindet sich ebenfalls in Ablösung. Der Halsansatz ist physiologisch aus-gebildet, doch die Anwesenheit einer zweiten Geißel (Pfeil) in derselben Membran ist pathologisch (ein distaler
Geißelquerschnitt). Zwei Geißellängsschnitte in einer Membran (Abb. 53: rechtes Bild). In der Bildmitte
befindet sich ein Spermium mit einem Kopf, doch die Membran im Geißelbereich schließt zwei Geißellängs-
schnitte (A) ein. Der Halsansatz (B) ist anormal durch das Fehlen des Zentriols (TEM).
Abbildung 54 - 55: Vier Geißelquerschnitte in einer Membran (Abb. 54: linkes Bild). Der untere proximale
Querschnitt hat ein normales Tubulusmuster, intakte Mantelfasern und Mitochondrien. In dem oberen proxima-len Querschnitt fehlen drei periphere Tubuluspaare und zwei Mantelfasern. Die zwei distalen Geißelquerschnitte
sind nicht senkrecht zu der Geißellängsachse getroffen, sodass man die einzelnen Mikrotubuli nicht deutlich
unterscheiden kann. Dennoch kann man sehen, dass mehrere Mikrotubuli und Mantelfasern fehlen. Zwischen
den Querschnitten befindet sich Zytoplasma mit darin verteilten Organellen. Neben dem oberen proximalen
Querschnitt liegen einige quer getroffene Mikrotubuli (A), neben dem unteren proximalen Querschnitt befinden
sich Mitochondrienstrukturen (B) und zwischen den unteren Querschnitten kann man längs getroffen
Mikrotubuli erkennen (C). Spermium mit zwei Köpfen (Abb. 55: rechtes Bild) (TEM).
A
B
A
B
C
Ergebnisse 65
4.3.9 Längsschnitte
Die Schnittebenen der Geißellängschnitte verliefen selten parallel zu der Geißelachse, sodass
nur ein kleiner Teil der Geißel beurteilt werden konnte. Abbildung 42 (S. 60) zeigt ein parallel
zur Achse getroffenes Mittelstück, wobei die Plasmamembran, die Mitochondrienscheide, die
Mantelfasern, zwei der peripheren Mikrotubuli und ein zentraler Mikrotubulus zu sehen sind.
In Abbildung 57 lässt sich das Mittelstück und der Übergang zwischen Mittel- und Haupt-
stück beurteilen. Das Hauptstück ist im letztgenannten Bereich deutlich schmaler und die
Mitochondrienscheide durch Ringfasern ersetzt.
Spermien, die durch das Phasenkontrastmikroskop betrachtet, aufgerollte, geknickte oder
schleifenförmige Geißeln, deformierte Köpfe oder andere Missbildungen aufwiesen, waren
mittels Elektronenmikroskopie selten zu beobachten (Abb. 56).
Abbildung 56 - 57: Spermium mit einer geknickten Geißel (Abb. 56: linkes Bild). Längsschnitt eines
Spermiums mit physiologischer Geißelstruktur (Abb. 57: rechtes Bild). Die Beugung der Geißel (Pfeil) in
der Membran ist anormal (TEM).
Ergebnisse 66
4.3.10 Sonstige Beobachtungen / andere Zellen oder Zellpartikeln im Ejakulat
Von allen untersuchten Spermien zeigte nur der Kopf eines Spermiums einen amorphen Ein-
schluss zwischen dem Akrosom und der abgehobenen Plasmamembran (Abb. 58, S. 67).
Der Zytoplasmasaum zwischen dem Kern und dem Akrosom war manchmal etwas verbrei-
tert, entweder im ganzen Kopfbereich, oder nur im Bereich des Übergangs vom mittleren
Kopfteil zum Äquatorialsegment. Im letzten Fall stellte sich das Akrosom genau an dieser
Stelle unterbrochen oder gewellt dar. Auch zwischen dem Akrosom und der Plasmamembran
war ab und zu ein schmaler Zytoplasmasaum zu sehen.
In einigen Ejakulaten waren viele runde Zellen zu sehen. Meistens war die Plasmamembran
abgelöst und der Zellkern nicht angeschnitten. Die vielen Lysosomen im Zytoplasma wiesen
auf die phagozytierende Aktivität dieser Zellen hin. Abbildung 59 (S. 67) zeigt eine solche
Zelle mit stark kondensiertem, runden Kern und vielen Lysosomen im Zytoplasma. Die
Membran ist intakt und hat keine Zellausläufer. Einerseits könnte das auf die Schnittebene
zurückzuführen sein, wobei zufällig keine Ausläufer angeschnitten wurden, andererseits
könnte es sich um eine inaktive phagozytierende Zelle handeln. Diese letzte Möglichkeit ist
wahrscheinlicher, da auch der Golgi-Komplex und das granuläre endoplasmatische Retikulum
nicht deutlich zu sehen sind.
Zellen der Hodenkanälchen können durch Traumata in das Ejakulat gelangen. Abbildung 61
(S. 68) zeigt einen wenig differenzierten Zellbestandteil mit mehreren gefüllten Vakuolen.
Diese Zellpartikel waren bei einigen Hengsten in jedem Ejakulat vorhanden.
Auch die Anwesenheit von Bakterien im Ejakulat war hengstabhängig. Das genetische Mate-
rial des Bakteriums in Abbildung 60 (S. 68) ist umgeben von einer Plasmamembran und einer
Kapsel, worauf zylinderförmige Strukturen gleichen Durchmessers, jedoch von unterschiedli-
cher Länge aufgesetzt sind. Letzteres spricht dafür, dass es sich um Fimbriae oder Pili han-
delt.
Es gab auch runde Partikel mit einem Durchmesser von ungefähr 0,3 µm, umschlossen durch
eine oder durch zwei Membranen (Abb. 62, S. 68). Wahrscheinlich sind diese Strukturen
Lysosomen. Die doppelte Membran kann auf ein frühes Stadium der Autolysosombildung
Ergebnisse 67
hindeuten, wobei ein frei im Zytoplasma liegendes Körperchen das zelleigene abzubrechende
Material umschließt. Auch die Phagozytose von einem durch eine Membran umgebenen Par-
tikel könnte ein solches Bild ergeben. Eine dritte Möglichkeit ist, dass es sich hier um zwei
nebeneinander liegende Zellen handelt, wobei die erste Zelle einen fingerförmigen Ausläufer
in die zweite Zelle gebildet hat und genau diese Stelle angeschnitten wurde.
Noch kleinere membranumschlossene Partikel mit einem Durchmesser von ungefähr 0,15 µm
sind nicht eindeutig zu klassifizieren. Die Größe stimmt überein mit prostasomähnlichen Par-
tikeln. Der größte Teil des Seminalplasmas wurde aber abzentrifugiert. Diese Partikel könnten
auch als “Dense Bodies”, die manchmal nach Autophagozytose entstehen, angesehen werden.
Wenn das Zytoplasma Teil eines neutrophilen Granulozyten wäre, könnte es sich bei diesen
kleinen Partikeln auch um elektronendichte primäre Granula, die bei der Reifung eine kristal-
loide Struktur erhalten, handeln.
Abbildung 58 - 59: Amorpher Einschluss im Kopfbereich zwischen der Plasmamembran und der äußeren
akrosomalen Membran (Abb. 58: linkes Bild). Phagozytierende Zelle im Ejakulat (Abb. 59: rechtes Bild)
(TEM).
Ergebnisse 68
Abbildung 60: Bakterium im Ejakulat (TEM).
Abbildung 61 - 62: Spermienköpfe, umgeben durch wenig differenzierte Zellpartikel mit mehreren gefüll-
ten Vakuolen (Pfeil) (Abb. 61: linkes Bild). Lysosomen (A) und prostasomähnliche Partikel (B) (Abb. 62:
rechtes Bild) (TEM).
A B
Ergebnisse 69
4.4 Statistische Zusammenfassung der quantitativen TEM-Ergebnisse
4.4.1 Vergleich der nativen und der aufgetauten Proben
Nach dem Auftauen traten eine Steigerung der Plasmamembranveränderungen im Kopfbe-
reich und der Akrosomabweichungen auf. Letzteres war auf eine Zunahme der Anzahl an
Spermien mit vollständig abgelöstem Akrosom und an akrosomreagierten Spermien mit
Granulabildung zurückzuführen. Auffällig in den TG-Proben waren Spermien mit verbreiter-
ten Akrosomen, bei denen die akrosomale Matrix eine niedrigere Dichte aufwies.
Tiefgefrorene Spermien zeigten in den Geißelquerschnitten im Vergleich zu den Nativ-Proben
mehr Membranen die sich in Ablösung befanden oder vollständig abgelöst waren. Ebenfalls
wurde in den TG-Proben eine Zunahme an Mantel- und Ringfaseranomalien festgestellt. Ein
typischer Befund in den aufgetauten Proben waren Mitochondrien mit einer sehr hellen Mat-
rix.
Die beschriebenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 (S. 70) zusammengefasst und in Abbildung
63 (S. 71) grafisch dargestellt.
Ergebnisse 70
Tabelle 3: Vergleich der TEM-Parameter zwischen den Nativ- (n = 12 Hengste; m = 3 Ejakulate) und den
TG-Proben (n = 12 Hengste; m = 1 Ejakulat). Die Zu- oder Abnahme dieser Parameter nach dem Auftau-
en wird für die statistisch signifikanten Ergebnisse in der letzten Spalte angezeigt.
TEM-Parameter
Stat.
Vert. p-Wert
Nativ
TG
Gesamtzahl Plasmamembranveränderungen im Kopfbereich no 0,000 ↑
Plasmamembran abgehoben no 0,258
Plasmamembran in Ablösung no <0,000 ↓
Plasmamembran abgelöst no 0,000 ↑
Gesamtzahl Akrosomveränderungen ln <0,000 ↑
Äußere akrosomale Membran abgelöst und akrosomale Matrix in Ablösung ln 0,514
Akrosom vollständig abgelöst ln 0,034 ↑
Akrosom gewellt ln 0,351
Akrosom abgehoben ln 0,994
Akrosomgranula (Akrosomreaktion) nn 0,015 ↑
Dünnes Akrosom ln 0,157
Verdicktes Akrosom mit normaler Dichte der akrosomalen Matrix nn 1,000
Verdicktes Akrosom mit niedrigerer Dichte der akrosomalen Matrix nn <0,000 ↑
Akrosomvakuole ln 0,182
Gesamtzahl Kernveränderungen no 0,022 ↓
Kernvakuole mit amorpher Masse nn 0,027 ↓
Kern mit Kondensationsstörungen no 0,040 ↓
Kern mit Akrosominhalt ln 0,373
Veränderungen der proximalen Geißel ln 0,003 ↑
Plasmamembranveränderungen ln 0,006 ↑
Plasmembran gewellt no 0,012 ↓
Plasmamembran abgehoben ln 0,001 ↓
Plasmamembran in Ablösung no 0,007 ↑
Plasmamembran abgelöst ln 0,000 ↑
Abweichungen der Mitochondrienstruktur no 0,785
Mitochondrienmatrix zu hell no 0,001 ↑
Abweichungen der Mantelfasern no 0,237
Abweichung des Tubulusmusters ln 0,004 ↑
Mehrere Geißelanschnitte in einer Membran no 0,766
Proximale Zytoplasmatropfen mit Zytoplasma- oder Mikrotubuli-Inhalt nn <0,000 ↓
Veränderungen der distalen Geißel ln 0,015 ↑
Plasmamembranveränderungen ln 0,011 ↑
Plasmembran gewellt no 0,014 ↓
Plasmamembran abgehoben ln 0,022 ↓
Plasmamembran in Ablösung no 0,001 ↑
Plasmamembran abgelöst no 0,416
Abweichungen der Mantel- und Ringfasern nn 0,000 ↑
Abweichung des Tubulusmusters nn 0,885
Mehrere Geißelanschnitte in einer Membran nn 0,444
m Anzahl der Ejakulate pro Proband
n Anzahl der Probanden
ln logarithmisch normal-verteilte Parameter
nn nicht normal-verteilte Parameter
no normal-verteilte Parameter
Ergebnisse 71
Abbildung 63: Graphische Darstellung der Anzahl morphologisch veränderter Spermien (in %) der Na-
tiv- (n = 12 Hengste; m = 3 Ejakulate) und TG-Proben (n = 12 Hengste; m = 1 Ejakulat) bei der fertilen
Gruppe (A), der Gruppe mittlerer Fertilität (B) und der subfertilen Gruppe (C) von Hengsten:
Plasmamembranveränderungen im Kopfbereich (1), Akrosomveränderungen (2), Kernveränderungen (3), Ver-
änderungen der proximalen (4) und der distalen Geißel (5).
* Ausreißer
a, b, c Werte mit unterschiedlicher Buchstabenkombination unterscheiden sich signifikant zwischen den
Fertilitätsgruppen
1, 2 Werte mit unterschiedlicher Zahlenkombination unterscheiden sich signifikant zwischen den Nativ- und
TG-Proben
n Anzahl der Probanden
m Anzahl Ejakulate pro Proband
4.4.2 Einfluss der Fertilität auf die TEM-Befunde
Zwischen den drei Fertilitätsgruppen waren nur wenige signifikante Unterschiede bezüglich
der TEM-Befunde festzustellen (Tabelle 4, S. 72). Abweichungen der inneren Geißelstruktur
(bestehend aus dem Axonema, den Mantelfasern und den Mitochondrien) konnten in den Na-
tiv-Proben häufiger in Ejakulaten der subfertilen Hengste angetroffen werden. Auch in den
aufgetauten Proben waren Mitochondrienschäden (hellere innere Matrix der Mitochondrien)
häufiger bei den subfertilen Hengsten nachzuweisen.
Die zahlreichen negativen Korrelationen (NRR33, Tr/R) in Tabelle 5 (S. 73) weisen auf einen
Zusammenhang zwischen der Anzahl morphologisch veränderter Spermien im Ejakulat und
der Fertilität des Hengstes hin. Die einzige signifikante positive Korrelation wurde bei dem
Parameter „gewellte Plasmamembran“ beobachtet.
Ergebnisse 72
Tabelle 4: Vergleich der TEM-Parameter in nativ- und TG-Spermien zwischen den Fertilitätsgruppen
(Tr/R). Die statistisch signifikanten Unterschiede sind fett gedruckt.
TEM-Parameter (n = 12 Hengste)
Stat.
Vert.
p-Wert
Nativ m = 3
Ejakulate
p-Wert
TG m = 1
Ejakulat
Gesamtzahl Plasmamembranveränderungen im Kopfbereich no 0,154 0,364
Plasmamembran abgehoben no 0,908 0,716
Plasmamembran in Ablösung no 0,673 0,964
Plasmamembran abgelöst no 0,096 0,414
Gesamtzahl Akrosomveränderungen ln 0,139 0,202
Außere akrosomale Membran abgelöst und akrosomale Matrix in Ablösung ln 0,043 0,220
Akrosom vollständig abgelöst ln 0,253 0,061
Akrosom gewellt ln 0,841 0,124
Akrosom abgehoben ln 0,318 0,836
Akrosomgranula (Akrosomreaktion) nn 0,370 0,884
Dünnes Akrosom ln 0,554 0,497
Verdicktes Akrosom mit normaler Dichte der akrosomalen Matrix nn 0,119 0,070
Verdicktes Akrosom mit niedrigerer Dichte der akrosomalen Matrix nn - 0,314
Akrosomvakuole ln 0,129 0,569
Gesamtzahl Kernveränderungen no 0,885 0,093
Kernvakuole mit amorpher Masse nn 0,649 0,607
Kern mit Kondensationsstörungen no 0,869 0,018
Kern mit Akrosominhalt ln 0,031 0,945
Veränderungen der proximalen Geißel ln 0,027 0,189
Plasmamembranveränderungen ln 0,051 0,362
Plasmembran gewellt no 0,662 0,405
Plasmamembran abgehoben ln 0,005 0,250
Plasmamembran in Ablösung no 0,078 0,698
Plasmamembran abgelöst ln 0,332 0,457
Abweichungen der Mitochondrienstruktur no 0,005 0,280
Mitochondrienmatrix zu hell no - 0,041
Abweichungen der Mantelfasern no 0,015 0,219
Abweichung des Tubulusmusters ln 0,003 0,092
Mehrere Geißelanschnitte in einer Membran no 0,452 0,374
Proximale Zytoplasmatropfen mit Zytoplasma- oder Mikrotubuli-Inhalt nn 0,157 0,093
Veränderungen der distalen Geißel ln 0,166 0,019
Plasmamembranveränderungen ln 0,141 0,020
Plasmembran gewellt no 0,001 0,325
Plasmamembran abgehoben ln 0,355 0,200
Plasmamembran in Ablösung no 0,066 0,504
Plasmamembran abgelöst no 0,454 0,722
Abweichungen der Mantel- und Ringfasern nn 0,057 0,478
Abweichung des Tubulusmusters nn 0,062 0,763
Mehrere Geißelanschnitte in einer Membran nn 0,227 0,463
m Anzahl der Ejakulate pro Proband n Anzahl der Probanden
ln logarithmisch normal-verteilte Parameter nn nicht normal-verteilte Parameter
no normal-verteilte Parameter
Ergebnisse 73
Tabelle 5: Korrelation der Fertilität (Tr/R) mit den untersuchten Parametern in nativ- und TG-Spermien.
Die statistisch signifikanten Korrelationen sind fett gedruckt.
TEM-Parameter (n = 12 Hengste)
Stat.
Vert.
Nativ
m = 3 Ejakulate
TG
m = 1 Ejakulat
r p-Wert r p-Wert
Gesamtzahl Plasmamembranveränderungen im Kopfbereich no -0,55 0,067 -0,39 0,206
Plasmamembran abgehoben no 0,20 0,541 0,01 0,976
Plasmamembran in Ablösung no 0,10 0,757 -0,11 0,738
Plasmamembran abgelöst no -0,60 0,039 -0,02 0,946
Gesamtzahl Akrosomveränderungen ln -0,51 0,093 -0,21 0,519
Äußere akrosomale Membran abgelöst und akrosomale Matrix in Ablö-
sung ln -0,53 0,078 0,52 0,081
Akrosom vollständig abgelöst ln -0,11 0,732 -0,43 0,165
Akrosom gewellt ln 0,00 0,988 -0,42 0,173
Akrosom abgehoben ln 0,31 0,326 -0,22 0,487
Akrosomgranula (Akrosomreaktion) nn -0,21 0,517 0,01 0,974
Dünnes Akrosom ln -0,36 0,255 0,22 0,485
Verdicktes Akrosom mit normaler Dichte der akrosomalen Matrix nn -0,57 0,055 -0,18 0,585
Verdicktes Akrosom mit niedrigerer Dichte der akrosomalen Matrix nn - - -0,28 0,373
Akrosomvakuole ln -0,59 0,044 0,10 0,762
Gesamtzahl Kernveränderungen no -0,30 0,350 -0,69 0,013
Kernvakuole mit amorpher Masse nn -0,47 0,125 -0,13 0,685
Kern mit Kondensationsstörungen no -0,25 0,438 -0,72 0,008
Kern mit Akrosominhalt ln -0,57 0,052 0,18 0,575
Veränderungen der proximalen Geißel ln -0,73 0,007 -0,31 0,335
Plasmamembranveränderungen ln -0,67 0,017 -0,39 0,215
Plasmembran gewellt no 0,21 0,505 0,23 0,480
Plasmamembran abgehoben ln -0,67 0,018 -0,49 0,103
Plasmamembran in Ablösung no -0,58 0,046 0,11 0,723
Plasmamembran abgelöst ln -0,17 0,605 -0,24 0,445
Abweichungen der Mitochondrienstruktur no -0,80 0,002 -0,22 0,502
Mitochondrienmatrix zu hell no - - -0,48 0,114
Abweichungen der Mantelfasern no -0,65 0,021 -0,33 0,301
Abweichung des Tubulusmusters ln -0,74 0,006 -0,59 0,042
Mehrere Geißelanschnitte in einer Membran no -0,38 0,225 -0,48 0,110
Proximale Zytoplasmatropfen mit Zytoplasma- oder Mikrotubuli-Inhalt nn -0,56 0,059 -0,33 0,301
Veränderungen der distalen Geißel ln -0,60 0,038 -0,53 0,077
Plasmamembranveränderungen ln -0,60 0,040 -0,48 0,116
Plasmembran gewellt no 0,71 0,010 -0,05 0,875
Plasmamembran abgehoben ln 0,10 0,763 -0,22 0,491
Plasmamembran in Ablösung no -0,58 0,046 -0,32 0,311
Plasmamembran abgelöst no -0,37 0,238 -0,12 0,721
Ergebnisse 74
Abweichungen der Mantel- und Ringfasern nn -0,77 0,003 -0,42 0,170
Abweichung des Tubulusmusters nn -0,73 0,007 -0,42 0,176
Mehrere Geißelanschnitte in einer Membran nn -0,08 0,799 0,02 0,955
m Anzahl Ejakulate pro Proband
n Anzahl der Probanden
ln logarithmisch normal-verteilte Parameter
nn nicht normal-verteilte Parameter
no normal-verteilte Parameter
4.4.3 Vergleich der Untersuchungsmethoden
Im Vergleich zur Phasenkontrastmikroskopie ermöglichte die TEM eine detailliertere Unter-
suchung des Akrosoms. Distale Zytoplasmatropfen wurden dagegen häufiger mittels Licht-
mikroskopie als in den TEM-Schnitten angetroffen (Abb. 64).
54321
TEMLMTEMLMTEMLMTEMLMTEMLM
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Mo
rph
olo
gis
ch
verä
nd
ert
e S
perm
ien
(%
)
Morphologische Beurteilung der Spermien mittels LM und TEM
Art der Veränderung
#
#
#
#
Abbildung 64: Graphische Darstellung der Anzahl morphologisch veränderter Spermien (in %) in allen
untersuchten Proben (Nativ-Proben: n = 50 Hengste und m = 3 Ejakulate; Proben: n = 12 Hengste und m = 1
Ejakulat), bestimmt mittels Phasenkontrastmikroskopie und TEM: (1) Gesamtzahl Akrosomveränderungen,
(2) Akrosom in Ablösung, (3) abgelöstes Akrosom, (4) proximale Zytoplasmatropfen und (5) distale
Zytoplasmatropfen.
* Ausreißer
# signifikanter Unterschied zwischen den Untersuchungsmethoden
n Anzahl der Probanden
m Anzahl Ejakulate pro Proband
Ergebnisse 75
4.4.4 Einfluss des Alters auf die Spermienqualität
Mit zunehmendem Alter der Hengste nahm die Anzahl an Spermienanomalien zu, was sich in
den vielen positiven Korrelationen äußerte (Tabelle 6). Ein Zusammenhang zwischen man-
chen Parametern und dem Alter war hauptsächlich in den Nativ-Proben nachzuweisen. Mit
zunehmendem Alter nahm die Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien ab und lichtmikrosko-
pisch trat eine Zunahme an distalen Zytoplasmatropfen sowie Haupt- und Endstückverände-
rungen auf. Die TEM-Aufnahmen bestätigten, dass Plasmamembranabweichungen im Kopf-
bereich, Akrosomveränderungen (überwiegend vollständig abgelöste Akrosome), proximale
Zytoplasmatropfen mit oder ohne Mikrotubuli-Ansammlungen und Anomalien der inneren
Geißelstruktur (Tubulusmuster, Mantel- und Ringfasern) häufiger bei älteren Probanden fest-
zustellen waren.
Tabelle 6: Korrelation des Hengstalters mit den untersuchten Parametern beider Spermienzustände (na-
tiv und TG). Die statistisch signifikanten Korrelationen sind fett gedruckt.
Parameter Stat.
Vert.
Nativ m = 3 Ejakulate
TG m = 1 Ejakulat
r p-Wert r p-Wert
PMOT nn -0,40 0,0036 -0,55480 0,0612
Phasenkontrastmikroskopie (n = 50 Hengste)
Akrosomveränderungen ln 0,17 0,236 -0,08 0,812
Kopfveränderungen ln 0,08 0,603 0,34 0,281
Halsveränderungen nn -0,01 0,965 0,51 0,094
Proximale Zytoplasmatropfen nn -0,01 0,921 0,44 0,151
Distale Zytoplasmatropfen ln 0,29 0,044 0,44 0,150
Verbindungsstückveränderungen nn 0,21 0,139 0,41 0,180
Übrige Mittelstückabweichungen nn 0,01 0,933 0,19 0,553
Haupt- und Endstückveränderungen ln 0,33 0,020 0,42 0,174
TEM (n = 12 Hengste)
Gesamtzahl Plasmamembranveränderungen im Kopfbereich no 0,73 0,007 0,21 0,520
Plasmamembran abgehoben no -0,46 0,134 -0,32 0,312
Plasmamembran in Ablösung no 0,10 0,762 -0,05 0,870
Plasmamembran abgelöst no 0,81 0,001 0,33 0,294
Gesamtzahl Akrosomveränderungen ln 0,67 0,018 0,37 0,239
Außere akrosomale Membran abgelöst und akrosomale Matrix in Ablösung ln 0,38 0,221 -0,11 0,725
Akrosom vollständig abgelöst ln 0,60 0,037 0,72 0,009
Akrosom gewellt ln -0,16 0,623 0,19 0,544
Akrosom abgehoben ln -0,28 0,379 -0,12 0,699
Akrosomgranula (Akrosomreaktion) nn 0,30 0,342 -0,02 0,961
Dünnes Akrosom ln 0,06 0,851 -0,55 0,064
Ergebnisse 76
Verdicktes Akrosom mit normaler Dichte der akrosomalen Matrix nn 0,33 0,294 -0,04 0,898
Verdicktes Akrosom mit niedrigerer Dichte der akrosomalen Matrix nn - - 0,18 0,575
Akrosomvakuole ln 0,17 0,601 -0,14 0,675
Gesamtzahl Kernveränderungen no 0,47 0,122 0,28 0,380
Kernvakuole mit amorpher Masse nn 0,18 0,582 0,04 0,892
Kern mit Kondensationsstörungen no 0,28 0,374 0,11 0,743
Kern mit Akrosominhalt ln 0,47 0,124 0,38 0,223
Veränderungen der proximalen Geißel ln 0,50 0,102 0,38 0,218
Plasmamembranveränderungen ln 0,49 0,106 0,41 0,190
Plasmembran gewellt no -0,35 0,269 -0,08 0,799
Plasmamembran abgehoben ln 0,72 0,008 0,40 0,203
Plasmamembran in Ablösung no 0,21 0,518 -0,28 0,375
Plasmamembran abgelöst ln 0,40 0,193 0,36 0,250
Abweichungen der Mitochondrienstruktur no 0,34 0,276 0,03 0,922
Mitochondrienmatrix zu hell no - - 0,35 0,260
Abweichungen der Mantelfasern no 0,78 0,003 0,45 0,137
Abweichung des Tubulusmusters ln 0,75 0,005 0,51 0,092
Mehrere Geißelanschnitte in einer Membran no 0,27 0,402 -0,05 0,888
Proximale Zytoplasmatropfen mit Zytoplasma- oder Mikrotubuli-Inhalt nn 0,67 0,017 0,49 0,110
Veränderungen der distalen Geißel ln 0,43 0,159 0,30 0,346
Plasmamembranveränderungen ln 0,41 0,184 0,26 0,420
Plasmembran gewellt no -0,38 0,229 0,25 0,439
Plasmamembran abgehoben ln 0,01 0,980 0,14 0,660
Plasmamembran in Ablösung no 0,20 0,541 0,10 0,767
Plasmamembran abgelöst no 0,53 0,074 0,13 0,694
Abweichungen der Mantel- und Ringfasern nn 0,60 0,038 0,65 0,021
Abweichung des Tubulusmusters nn 0,70 0,011 0,13 0,698
Mehrere Geißelanschnitte in einer Membran nn 0,60 0,041 0,47 0,122
m Anzahl Ejakulate pro Proband
n Anzahl der Probanden
ln logarithmisch normal-verteilte Parameter
nn nicht normal-verteilte Parameter
no normal-verteilte Parameter
Diskussion 77
5 Diskussion
5.1 Morphologische Beurteilung von Hengstspermien mittels Phasenkontrastmikro-
skopie und TEM
In dieser Arbeit wurde die Spermienqualität von 50 Hannoveraner Hengsten des Celler Land-
gestütes beurteilt. Jeder Hengst wurde innerhalb von zwei Wochen dreimal abgesamt, sodass
insgesamt 150 Ejakulate für die Beurteilung der Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien und
der Spermienmorphologie zur Verfügung standen.
Diese Art der routinemäßigen Spermienbeurteilung wird auch von der Society of
Theriogenology im Rahmen der Zuchttauglichkeitsuntersuchung (ZTU) beschrieben
(COLENBRANDER et al. 2003). Die ZTU beurteilt die Fähigkeit eines Hengstes, durch
künstliche Besamung mittels Frischsamen 120 Stuten pro Jahr zu befruchten. Die ZTU
stammt aus dem Jahr 1983 und wird den Anforderungen und Verfahren der heutigen Zuchtin-
dustrie nicht mehr gerecht. Zuchthengste werden heute oft zur Besamung von mehr als 120
Stuten pro Jahr herangezogen. Außerdem ist zu berücksichtigen, dass der Spermientransport
zur Besamung ausländischer Stuten und die Anwendung von Gefriersamen zugenommen ha-
ben (TURNER 2005). Je komplexer die Anforderungen sind, die an die Qualität der Sper-
mien gestellt werden, umso besser sollten auch die Beurteilungsmethoden sein, um die
Hengste in Fertilitätskategorien einteilen zu können.
Flowzytometrische Tests, die biochemische Untersuchung des Seminalplasmas, HOST und
die Beurteilung der ultrastrukturellen Spermienmorphologie ermöglichen eine Aussage über
spezifische Teile des Spermiums (FAWCETT 1970; MOREL 1999; GRAHAM 2001). In
dieser Arbeit wurden die Ejakulate von 12 Hengsten unterschiedlicher Fertilitätsgruppen mit-
tels TEM untersucht. Sowohl Nativ-Proben als auch aufgetaute Proben wurden beurteilt und
die morphologischen Ergebnisse der Phasenkontrastmikroskopie und der TEM miteinander
verglichen.
Die Phasenkontrastmikroskopie ermöglicht eine Einteilung defekter Spermien in solche mit
primären, sekundären und tertiären Defekten. Die primären Defekte entstehen während der
Diskussion 78
Spermatogenese, die sekundären während des Spermientransports und die tertiären werden
durch Fehler in dem Absamungs- und Spermienaufbereitungsprozess verursacht
(BARRELET 2005). Eine andere Einteilung ist die in „Major-“ und „Minor-Defekte“, wobei
die ersten einen bedeutenden und die letzten einen unbedeutenden Einfluss auf die Fertilität
haben (CARD 2005). Hierbei können die Spermiendefekte, die nur in einer Subpopulation der
Spermien auftreten, durch höhere Spermienzahlen in der Besamungsdosis kompensiert wer-
den. Diese kompersierbaren Defekte unterscheiden sich von den nicht kompensierbaren De-
fekten, z.B. Chromatinschäden, die immer zu Subfertilität führen (WEITZE 2001;
BARRELET 2005; CARD 2005). Da viele morphologische Abweichungen nicht eindeutig in
eine dieser Gruppen einzuordnen sind, wurde in dieser Arbeit der am meisten proximal lokali-
sierte Defekt des Spermiums als Beurteilungskriterium herangezogen. Dieses Standardverfah-
ren (Protokoll für die morphologische Beurteilung fixierter Spermien der Reproduktionsme-
dizinischen Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover) ermöglicht eine
Ejakulatbeurteilung basierend auf der Gesamtzahl morphologisch normaler Spermien. CARD
(2005) und BRITO (2007) dagegen bevorzugen ein Standardprotokoll, das alle morphologi-
schen Abweichungen eines Spermiums registriert. Ein derartiges Spermiogramm würde auch
die Assoziation mehrerer Anomalien sichtbar machen.
Da das Akrosom als erster Parameter im Phasenkontrastmikroskopieprotokoll beurteilt wird,
ist ein Vergleich der Akrosomabweichungen verschiedener Hengste möglich. Wegen der
kompakten Kopfform des Hengstspermiums ist das relativ kleine Akrosom viel schwieriger
zu beurteilen als das Akrosom anderer Tiere (WEITZE 2001). Es fiel auf, dass die lichtmikro-
skopische Darstellung des Akrosoms von Hengst zu Hengst stark variierte und sich die Beur-
teilung des Akrosoms bei manchen Hengsten schwieriger darstellte als bei anderen.
Die häufigsten lichtmikroskopischen Befunde in dieser Studie waren eine Schwellung des
Akrosoms am apikalen Rand und ein teilweise oder vollständig abgelöstes Akrosom. Auch
BRITO (2007) beschrieb als häufigsten Defekt das geschwollene Akrosom, das durch eine
übermäßige akrosomale Matrix gekennzeichnet ist. Lichtmikroskopisch hat das geschwollene
Akrosom zwei verschiedene Erscheinungsformen. Entweder stellt es sich als eine Verdickung
der Kopfspitze dar, oder die Kopfspitze wird durch Faltung des geschwollenen Teils abge-
flacht. Diese Akrosomveränderungen sind in ungefärbten Ausstrichen fixierter Spermien rela-
Diskussion 79
tiv gut festzustellen. Spermac®
und Dual-Stain Färbungen machen die Beurteilung geschwol-
lener apikaler Ränder schwieriger. Abgelöste Akrosome sind mittels dieser Färbungen aller-
dings einfacher als bei Formolzitrat fixierten Spermien zu diagnostizieren (HEFFE 1993).
In den Proben der 12 Hengste, die sowohl für die phasenkontrastmikroskopische als auch für
die transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung aufbereitet wurden, fiel auf, dass
die Anzahl der Akrosomabweichungen bei der lichtmikroskopischen Beurteilung viel niedri-
ger war als bei der Beurteilung mittels TEM. Die TEM, die als Goldstandard für die
Akrosombeurteilung gilt (CROSS und MEIZEL 1989), ermöglicht eine genaue Beurteilung
der verschiedenen Akrosomregionen und eine exakte Differenzierung subtiler
Akrosombeschädigungen. Auffällig war der hohe Anteil an Akrosomabweichungen bei
Hengsten mit normaler Fertilität. Dies bestätigt die Befunde von PESCH (2005), die mittels
TEM in 82,0% der Spermien ein abweichendes Akrosom in Kombination mit einer defekten
Plasmamembran feststellen konnte. Die Anzahl der Akrosomabweichungen bei den sehr ferti-
len Hengsten und normal fertiler Hengsten unterschied sich in dieser Arbeit nicht signifikant
von der Anzahl der Akrosomanomalien bei den subfertilen Hengsten. Vorsicht ist geboten bei
einem summarischen Vergleich der Akrosomdefekte, da zum Beispiel abgehobene Akrosome
auf die Fixierung zurückzuführen sein können (PESCH et al. 2006).
Elektronenmikroskopische Bilder in einer Studie von PESCH und BERGMANN (2006) zeig-
ten Spermien mit geschwollenem Akrosom, die auch in dieser Arbeit angetroffen wurden.
Noch auffälliger waren einige Spermien mit stark vergrößertem, deformiertem Akrosom, in
denen vereinzelt Vakuolen angetroffen wurden. CARD (2005) wies darauf hin, dass die
Akrosombildung gleichzeitig mit der Reifung des Kernes stattfindet und dass Spermien mit
Akrosommißbildungen möglicherweise dann auch Kerndefekte enthalten.
Sehr dünne Akrosome waren eher selten anzutreffen und hauptsächlich nach dem Auftauen zu
diagnostizieren. Dieser Befund ist auch von VEERAMACHANENI et al. (1993) und PESCH
und BERGMANN (2006) bei Hengsten beschrieben worden. Akrosomagenesis (ZAMBONI
1987; WEISSENBERG et al. 1983) wurde bei humanen Spermien, jedoch nicht bei Hengst-
spermien beschrieben und in den Ejakulaten der Probanden auch nicht angetroffen. Die An-
wesenheit von MM, assoziiert mit dem Akrosom, konnte nur in einzelnen Spermien angetrof-
Diskussion 80
fen werden. Das Aussehen dieser Mikrotubuli war verdrillt und den Befunden einer Studie
von VEERAMACHANENI et al. (1993) sehr ähnlich.
Der zweithäufigste Befund der routinemäßigen morphologischen Beurteilung sind gemäß
BRITO (2007) die Kopfdefekte. DOWSETT et al. (1984) untersuchten 590 Ejakulate mittels
der William´s Färbung (Karbolfuchsin-Eosin) zur Beurteilung des Kopfes. Sie konnten im
Mittel bei 7,47% der Spermien anormale Spermienköpfe antreffen. JASKO et al. (1990)
konnten in einer Studie mit 66 Hengsten 6,4% Kopfanomalien feststellen. Mittels Phasenkon-
trastmikroskopie sind Kopfdefekte möglicherweise einfacher festzustellen, sodass KAVAK et
al. (2004) bei 12,6% und 13,3% der Spermien der Torizuchthengste bzw. Estonischer Hengste
Kopfdefekte nachweisen konnten. Obwohl in dieser Studie die morphologische
Spermienbeurteilung ebenfalls mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie durchgeführt wurde,
lag der geometrische Mittelwert der Kopfabweichungen nur bei 5,6%. Deformierte Köpfe
wurden als häufigste aller Kopfdefekte angetroffen. Sie zeigten oft einen eckigen Kopfrand
und Kondensationsstörungen im Kernbereich. Verjüngte, schmale, Zwerg- und Riesenköpfe
wurden vereinzelt wahrgenommen. Der negative Einfluss dieser abweichenden Kopfformen
auf die Fertilität wird durch eine verminderte Hydrodynamik erklärt. Rinderspermien mit bir-
nenförmigen Köpfen können im Vergleich zu normalen Spermien die Zona pellucida schwie-
riger erreichen und daran binden. Außerdem werden die ersten Teilungen der Zygote negativ
beeinflusst (THUNDATHIL et al. 1999).
In manchen Proben verschiedener Hengste waren mittels Phasenkontrastmikroskopie in fast
allen Spermienköpfen kleine Vakuolen anzutreffen. Nur die Vakuolen mit deutlicher Abgren-
zung und zystösem Aussehen, vorwiegend in deformierten Köpfen vorhanden, wurden regis-
triert. Der Unterschied zwischen akrosomalen Vakuolen und Kernvakuolen war nur mittels
TEM deutlich zu sehen. Nur große Vakuolen, die oft eine Deformation des Kopfes verursach-
ten und häufig im Zusammenhang mit einer Kondensationsstörung auftraten, wurden berück-
sichtigt. In einigen Spermien waren Vakuolen am Kopfrand als taschenförmige Kerndeforma-
tionen zu erkennen.
Die Anzahl an Spermien mit Kernvakuolen (Median = 10,05%) und Spermien mit Kondensa-
tionsstörungen ( x = 9,24%) war in den Nativ-Proben niedriger als in der Arbeit von PESCH
Diskussion 81
et al. (2006), die 23,3% bzw. 17,1% nachwiesen. Vielleicht ist hier die Frage angebracht, ab
welcher Größe die Vakuolen als anormal bezeichnet werden müssen und ab wann das Chro-
matin als unkondensiert definiert werden sollte.
Die Halsveränderungen sind lichtmikroskopisch sehr deutlich wahrzunehmen. Auffällig sind
die Halsbrüche, die in geringer Anzahl im Ejakulat anzutreffen sind (BRITO 2007).
DOWSETT et al. (1984) und JASKO (1990) fanden bei 3,81% beziehungsweise 1,3% der
Spermien Halsbrüche. Bei den 50 Probanden dieser Studie waren sie zumeist bei 1 bis 3% der
Spermien zu beobachten. Ein älterer Hengst wies im Ejakulat einen geometrischen Mittelwert
von 24,8% Halsbrüchen zusammen mit auffällig vielen Kernvakuolen und sowohl proximalen
als auch distalen Zytoplasmatropfen auf. Wegen der normalen Kopfform der Spermien dieses
älteren Hengstes war die Fertilitätsprognose jedoch noch relativ günstig (BRITO 2007). Dies
könnte die relativ hohe NRR33 von 0,5221 erklären. Eine mögliche Ursache für diesen Be-
fund wäre eine Spermiostase (CARD 2005).
Die häufigsten Halsveränderungen sind persistierende proximale Plasmatropfen. Die Anzahl
an Plasmatropfen ist in verschiedenen Studien sehr unterschiedlich. DOWSETT et al. (1984)
fanden bei 9,74% der Spermien Plasmatropfen, eine Zahl, die sich den Befunden der fertilen
Gruppe in dieser Arbeit nähert. Die Ergebnisse von JASKO et al (1990) nähern sich mit ei-
nem Mittelwert von 15,5% eher dem Wert der subfertilen Probanden dieser Studie an. Die
Werte, die KAVAK et al. (2004) für die Tori- und die Estonischen Hengste publizierten, la-
gen sehr weit auseinander: 17,3% der Spermien von Tori-Hengsten aber nur 2,9% der Sper-
mien von Estonischen Hengsten zeigten Plasmatropfen.
Nur mittels TEM ist der Inhalt der beobachteten Tropfen zu beurteilen. CORTADELLAS und
DURFORT (1994) stellten fest, dass sich der Tropfeninhalt während des Spermientransits in
den Nebenhoden verändert. Die TEM ist deswegen eine zuverlässige Methode, um das Rei-
fungsstadium des Spermiums zu erkennen und echte Zytoplasmatropfen von den Tropfen mit
mikrotubulären Strukturen zu unterscheiden.
Die mittels Phasenkontrastmikroskopie beobachteten distalen Plasmatropfen, machten unge-
fähr die Hälfte der Mittelstückveränderungen aus und variierten hengstabhängig von 1 bis
Diskussion 82
33,8%. DOWSETT et al. (1984) fanden bei 7,55% der Spermien distale Plasmatropfen und
JASKO et al. (1990) bei 13,5% der Spermien. Der Studie von CARD (2005) zufolge hat Kor-
tisol einen Einfluss auf die Reifung des Spermiums, so könnten Stressfaktoren die Resorption
der Plasmatropfen hemmen.
Die Häufigkeit der Mittelstückabweichungen wird in der Literatur sehr unterschiedlich ange-
geben. DOWSETT et al. (1984) bestätigen die Werte von KAVAK et al. (2004) mit 1,07%
Mittelstückveränderungen. Die Ergebnisse von JASKO et al. (1990) mit 7,4 % Mittelstück-
abweichungen stimmen überein mit dem Median von 6,75% in den Nativ-Proben dieser Stu-
die. Die Anzahl an Mittelstückabweichungen weist eine negative Korrelation mit der Fertilität
auf. Im Bereich des Anulus gebogene oder geknickte Mittelstücke zeigen oft einen distalen
Zytoplasmatropfen. Strukturen, die lichtmikroskopisch den Zytoplasmatropfen ähnlich sind,
die sich aber nicht im Bereich des Halsansatzes oder Anulus befanden, wurden bei Rindern
als Pseudotropfen definiert. Sie zeigen eine typische lokale Verdickung vom Mittelstück und
wurden auch bei einem sterilen Hengst beschrieben (CHENOWETH 2005). Gebogene Mittel-
stücke mit einer unvollständigen mitochondrialen Scheide, die oft zu Mittelstückbrüchen füh-
ren, werden bei Rindern als „Dag-Like Defekt“ beschrieben. In dieser Studie wurden auch bei
Hengsten Pseudotropfen, korkenzieherähnliche Mittelstücke und gebogene Mittelstücke mit
einer unvollständigen mitochondrialen Scheide angetroffen. Laut BRITO (2007) entspricht
dieser Defekt bei Hengsten nicht dem „Dag-Like Defekt“ der Rinderspermien. Elekt-
ronenmikroskopisch äußern sich Mittelstückdefekte häufig in einem Verlust oder der Desor-
ganisation von Mitochondrien (VEERAMACHANENI et al. 1993). Die TEM-Längsschnitte
gebogener Geißeln zeigen häufig einen Verlust an Mitochondrien im Bereich der Biegung
(PESCH et al. 2006). Die Ultrastruktur der Mitochondrienscheide ist nur auf den Geißellängs-
schnitten vollständig zu beurteilen. Auf Grund der niedrigen Anzahl an Längsschnitten in
dieser Studie, war eine quantitative Beurteilung dieses Defekts mittels TEM nicht möglich. In
den Geißelquerschnitten konnten jedoch häufig partielle Defekte der Mitochondrienscheide
festgestellt werden. Hierbei konnten manchmal Mitochondrien zwischen der mitochondrialen
Scheide und der Plasmamembran, genauso wie bei Schweinespermien beschrieben (BONET
et al. 1993), beobachtet werden. Gebogene Geißeln können durch Kälteschock oder eine zu
Diskussion 83
niedrige Testosteronkonzentration verursacht werden. Letzteres ist von KAWAKAMI et al.
(2005) bei einem Beagle beschrieben worden.
Haupt- und Endstückveränderungen sind sehr selten und maximal bei 0-3,2% der Spermien
vorhanden. DOWSETT et al. (1984) fanden bei 10,1% der Spermien Geißelabweichungen.
KAVAK et al. (2004) und JASKO et al. (1990) beschrieben im Mittel bei 6,5% bzw. 2,4%
der Spermien einen Geißeldefekt. In dieser Studie waren die Geißelabweichungen niedriger
( geom = 0,7%), da Spermien mit Geißelveränderungen nur registriert wurden, wenn alle an-
deren Zellteile (Akrosom, Kopf, Hals und Mittelstück) intakt waren. Diese Beurteilungsme-
thode erklärt teilweise den großen Unterschied an morphologischen Abweichungen der Sper-
mien in den verschiedenen Ejakulaten eines Hengstes. Beim Vergleich von zwei Ejakulaten,
in denen die Spermien die gleiche Anzahl an Zytoplasmatropfen, jedoch eine unterschiedliche
Zahl an Kopfabweichungen haben, weist das Ejakulat mit den meisten Kopfabweichungen
scheinbar eine niedrigere Anzahl an Zytoplasmatropfen auf.
Doppel-und Mehrfachbildungen waren lichtmikroskopisch eher selten festzustellen, außer bei
einem Hengst, dessen Ejakulat bei 3,3% der Spermien Doppelbildungen aufwies. Mehrfach-
köpfe, wie von BRITO (2007) beschrieben, konnten nicht nachgewiesen werden. Mehrere
Geißelanschnitte, von derselben Membran umgeben, waren mittels TEM im Mittel bei 10%
der Geißelquerschnitte festzustellen, womit dieser Anteil näherungsweise den Ergebnissen
von PESCH (2005) entspricht.
Die Gesamtzahl morphologisch abweichender Spermien liegt bei Hengsten bei 50% (JASKO
et al. 1990; CARD 2005; BRITO 2007) und ist saison- und ejakulatabhängig. In der Tori-
Population lag die Anzahl abweichender Spermien im Mittel bei 57,7% während sie mit ei-
nem Mittelwert von 74,4% in der Estonischen Population auffällig höher lag (KAVAK et al.
2004). Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass der Mittelwert morphologisch abweichender
Spermien in der Hannoveraner Population bei 50% liegt.
Finden sich mehr als 60-70% morphopathologische Spermien, mehr als 30% Kopfdefekte
oder mehr als 25% proximale Zytoplasmatropfen bei Wiederholungsuntersuchungen in meh-
reren Ejakulaten eines Hengstes, ist die Fertilitätsprognose mäßig (CARD 2005; BRITO
Diskussion 84
2007). CARD (2005) führt weiter aus, dass Mittelstückdefekte (>30%) und unreife
Spermienvorstufen im Ejakulat (>10%) die Fertilität negativ beeinflussen. BRITO (2007)
weist darauf hin, dass die Anwesenheit von Keimzellen immer als pathologisch anzusehen ist.
Hierauf basierend konnten in dieser Studie drei Hengste mit einer voraussichtlich mäßigen
Fertilität identifiziert werden. Der erste Hengst mit mehr als 30% Mittelstückveränderungen
und insgesamt mehr als 70% abweichenden Spermien zeigte eine niedrige Fertilität (Tr/R).
Der zweite Hengst wies 78,7% abweichende Spermien, mehr als 25% Spermien mit proxima-
len Zytoplasmatropfen und Kernvakuolen in fast allen Spermien auf. Der dritte Hengst hatte
mit 35% Spermien mit proximalen Zytoplasmatropfen eine schlechte Fertilitätsprognose. Die
beiden letzten Hengste gehörten zu der subfertilen Gruppe.
Weitere Zellen können im Ejakulat angetroffen werden. Mittels einer Diff-Quick Färbung
sind Erythrozyten und Leukozyten zu unterscheiden. Die Erythrozyten stellen sich als runde,
blass-graue Zellen ohne Zellkern dar, während die Leukozyten eine runde oder unregelmäßige
Zellabgrenzung besitzen und ein basophiles Zytoplasma mit einem eosinophilen lobulierten
Kern zeigen. Sie sind eineinhalb Mal größer als die Spermienzellen (BRITO 2007).
Die Kennzeichen unreifer Schweinespermien variieren, abhängig von ihrem Entwicklungssta-
dium. Im Caput epididymidis umfassen 99% der Spermien proximale Plasmatropfen. Im Cor-
pus epididymidis sind nur 1% proximale und 99% distale Plasmatropfen anzutreffen. Das
unreife Akrosom zeigt oft eine Volumenzunahme im proximalen Bereich, während die Dichte
der akrosomalen Matrix in diesem Bereich dann niedriger ist. Die Plasmamembran dieser
unreifen Spermien weist im Mittelstückbereich Einschnitte der mitochondrialen Helix auf,
während sie in reifen Spermien als glatte Membran die Zellstruktur begrenzt. Proximal von
den Zytoplasmatropfen gelegen, bilden die Mitochondrien eine organisierte Scheide. In den
Zytoplasmatropfen liegen sie eher ungeordnet, da ihre Entwicklung ungleichmäßig verläuft
und somit kleine und große Mitochondrien nebeneinander anzutreffen sind (BRIZ et al.
1995). VEERAMACHANENI et al. (1993) untersuchten Ejakulate zweier subfertiler Hengste
mit degenerierten Spermien, die durch einen Sertolizellmantel umgeben waren. Diese Sper-
mien sind Kennzeichen einer Hodendegeneration und sind sowohl zusammen mit Kern- und
Akrosomabweichungen als auch mit Mikrotubuli-Ansammlungen anzutreffen. Bei pubertären
Hengsten läuft die Spermatogenese noch nicht effizient ab, so dass in ihren Ejakulaten viele
Diskussion 85
Keimzellen und anormale Spermien mit Kopf- und Mittelstückdefekten vorkommen (CARD
2005). In dieser Phase entwickelt sich das Hodenepithel sehr stark (AMANN 1981), verbun-
den mit einer Zunahme der Fertilität. Bei älteren Probanden wird die Fertilität wieder niedri-
ger (DOWSETT und KNOTT 1996; PLAS et al. 2000). In dieser Studie konnten Halsbrüche
als mögliche Ursache der verminderten Fertilität eines älteren Hengstes vermutet werden.
In den TEM-Aufnahmen fielen runde, phagozytierende Zellen und streptokokkenähnliche
Keime auf. Da die Ejakulate nicht mikrobiologisch untersucht wurden, war eine eindeutige
Identifizierung der Bakterien nicht möglich. Die TEM-Aufnahmen waren jedoch den Bildern
von Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis (AURICH und SPERGSER 2006) und
Streptococcus suis (VANIER et al. 2004) sehr ähnlich. Auch VEERAMACHANENI und
SAWYER (1996) konnten Bakterien, eingebettet in Zelldebris, nachweisen.
Membranumhüllte Vesikel mit unterschiedlichem Durchmesser (15-670 nm), die von
GHAOUI (2004) als Seminalplasmakomponenten der spermienreichen Fraktion des Ejakula-
tes beim Hengst beschrieben wurden, waren auch in dieser Studie vorhanden.
Spermienzellagglomerate auf einem eiweißartigen Kern (VEERAMACHANENI et al. 2006)
und Harnkristalle (PESCH 2005) wurden in den Ejakulaten dieser Probanden nicht angetrof-
fen.
5.2 Einfluss des Einfrier- und Auftauprozesses auf die Spermienmorphologie
Das Einfrieren von Spermien hat einen negativen Einfluss auf die verschiedenen
Spermienparameter. Die Motilität und weitere kinetische Parameter zeigen niedrigere Werte
nach dem Auftauen und auch die morphologische Beurteilung mittels Phasenkontrastmikro-
skopie, TEM oder REM zeigt eine niedrigere Spermienqualität durch den Einfrierprozess.
Flowzytometrische Färbungen ermöglichen die Beurteilung der funktionellen Intaktheit ein-
zelner Spermienstrukturen und liefern so eine Erklärung der kinetischen und morphologischen
Befunde.
Mittels Phasenkontrastmikroskopie fiel hauptsächlich eine Abnahme der Anzahl an Plasma-
tropfen auf. Dies ließe sich teilweise durch die erhöhten Beschädigungen im Akrosombereich
erklären, wodurch diese Spermien in der Kategorie „Akrosomabweichungen“ und nicht in der
Diskussion 86
Kategorie „Plasmatropfen“ aufgelistet wurden. Der wichtigste Faktor für die zahlenmäßige
Abnahme der Plasmatropfen ist wahrscheinlich die durch das Einfrieren verursachte
Membranschädigung: kleine Defekte der Zellmembran im Bereich des Tropfens ermöglichen
den Übergang des Tropfeninhaltes in den extrazellulären Raum.
Die TEM-Bilder aufgetauter Spermien zeigten in dieser Studie weniger Kontrast als die Bil-
der der Nativ-Proben. Auffällig war die veränderte Darstellung der Mitochondrien. Die innere
mitochondriale Matrix sollte heller als der Zwischenmembranraum sein. Kontrahierte Mito-
chondrien mit einer dunklen Matrixstruktur waren in dieser Studie selten anzutreffen. Eine zu
helle Mitochondrienmatrix dagegen war fast ausschließlich in den TG-Proben wahrzunehmen.
Außerdem wiesen aufgetauten Proben eine negative Korrelation zwischen der Anwesenheit
einer zu hellen Mitochondrienmatrix und der Fertilität des Hengstes auf. Eine ähnliche
Schwellung der Mitochondrien im proximalen Teil des Mittelstückes ist in nativen Spermien
von Schweinen beschrieben worden und weist auf einen ersten Schritt im Degenerationspro-
zess der Geißel hin (BONET et al. 1993).
Die bedeutende Auswirkung dieser Mitochondrienschäden auf die Fertilität ist wahrscheinlich
auf ihre Rolle in der ATP-Produktion zurückzuführen, da die chemische Energie der ATP-
Moleküle in mechanische Energie des Geißelschlages umgesetzt wird. Deswegen ist es
selbstverständlich, dass mitochondriale Defekte, welche die ATP-Produktion herabsetzen, die
Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien negativ beeinträchtigen. Das erklärt einerseits die posi-
tive Korrelation (r = 0,31) der Anzahl zu heller Mitochondrien in den TG-Proben mit der An-
zahl unbeweglicher Spermien im Ejakulat und andererseits die negative Korrelation
(r = - 0,43) der Anzahl zu heller Mitochondrien mit der Zahl vorwärtsbeweglicher Spermien.
Auch RUIZ-PESINI et al. (1998) fanden bei Menschen eine signifikante Korrelation zwi-
schen Mitochondrienschäden und der Vorwärtsbeweglichkeit der Spermien. Die niedrigere
enzymatische Aktivität des Elektronentransportsystems bei Männern mit Asthenozoospermie
(< 50% vorwärtsbewegliche Spermien im Ejakulat) war auf ein kleineres mitochondriales
Volumen im Mittelstückbereich des Spermiums zurückzuführen.
Die Beschädigung der Mitochondrien durch den Einfrierprozess ist auch von anderen Autoren
beschrieben worden. SCHOBER et al. (2007) stellten ein Protokoll für die Messung bioener-
Diskussion 87
getischer Parameter von Mitochondrien in Hengstspermien auf. Nach der Schockgefrierung
von Spermienproben konnten sie eine deutliche Senkung der mitochondrialen Respiration, ein
niedrigeres Membranpotential und eine erhöhte cyt2+
-Oxidation in den Spermiensuspensionen
nachweisen. Dieser letzte Parameter deutet auf eine Beschädigung der äußeren
mitochondrialen Membran und der Zellplasmamembran hin. Da dies deutlich mit der
Spermienmotilität korrelierte, ergibt sich, dass die Intaktheit dieser Membranen essentiell für
einen adäquaten Geißelschlag ist. Auch VIDAMENT et al. (1998) stellten eine intakte Gei-
ßelplasmamembran als Voraussetzung für den Verbleib der ATP-Moleküle in der Zelle fest,
da eine intakte Plasmamembran in nativen Spermien mit der Spermienmotilität aufgetauter
Spermien positiv korrelierte. Auch in Spermien von Hähnen war der ATP-Verlust nach dem
Auftauen signifikant, wobei die Größe des Verlustes abhängig von den genetischen Linien
stark variierte (LONG 2005).
Die Ursachen der Mitochondrienschäden können vielfältig sein, z.B. genetische Abweichun-
gen, mechanische Schäden durch den Aufbereitungsprozess, Verdünnereinfluss oder
oxidativer und osmotischer Stress. TURNER (2005) jedoch weist darauf hin, dass es unwahr-
scheinlich ist, dass die Mitochondrien alle Energie, die für die Geißelbewegung notwendig ist,
liefern. Die Rolle der glykolytischen Enzyme der Ringfasern in der Energieproduktion ist
noch nicht vollständig geklärt.
Die Spermienkerne der Säugetiere sind sehr stabil, hoch kondensiert und stabilisiert durch
inter- und intramolekuläre kovalente Disulfid-Brücken zwischen den Protaminen. Das gekühl-
te Aufbewahren von verdünntem Sperma und der Einfrierprozess verursachen eine Vitalitäts-
senkung der Spermien und eine Steigerung der fragmentierten DNS (LINFOR und MEYERS
2002; BAUMBER et al. 2003).
LOVE und KENNEY (1998) fanden nur eine niedrige positive Korrelation zwischen SCSA-
Befunden und der Fertilität ihrer 84 fertilen Probanden. Die Stuten waren alle mit Frisch- oder
gekühltem Sperma besamt worden. Hierdurch konnte die Spermienzahl pro Besamungsdosis
die vielleicht etwas erhöhte Anzahl chromatinbeschädigter Spermien kompensieren. Studien,
die sowohl mit fertilen als auch mit subfertilen Hengsten durchgeführt wurden, konnten den
Einfluss der DNS-Schäden auf die Fertilität besser belegen. Außerdem könnte die zusätzliche
Diskussion 88
Verwendungen des Einzelzellgelelektrophorese-Tests, der zurzeit als die sensitivste Technik
für die Messung der DNS-Brüche gilt (COLLINS et al. 1997), die Hengstunterschiede noch
deutlicher darstellen. Brüche in einzelsträngiger DNS sind nicht letal, doch je größer sie sind,
desto schwieriger ist es für die Oozyte, diese Brüche zu reparieren (SAKKAS et al. 1999).
In dieser Studie waren die Veränderungen des Kernes nach dem Einfrieren sehr hengstabhän-
gig. Nur bei einigen Hengsten trat eine Zunahme der Kernveränderungen nach dem Auftauen
auf. Ausschließlich in den TG-Proben gab es signifikante Unterschiede zwischen dem Para-
meter „Kondensationsstörungen“ und der Fertilitätsgruppe: bei den sehr fertilen Hengsten
konnten nach dem Auftauen keine Spermien mit Kondensationsstörungen festgestellt werden.
Die Kondensationsstörungen könnten auf eine Denaturierung der DNS hinweisen, was laut
LOVE et al. (2001) möglicherweise auf einen gestörten Apoptoseprozess während der Sper-
matogenese hinweist. In den Ejakulaten subfertiler Männer konnten Fas-positive Spermatiden
beobachtet werden. Diese Zellen waren zum Zelltod bestimmt, doch durch einen Fehler im
Apoptoseprozess persistieren diese Zellen mit anormaler DNS noch im Ejakulat (SAKKAS et
al. 1999).
Der Flüssigkeitsgrad der Membran in nativen Spermien bestimmt die Spermienqualität nach
dem Einfrieren. Je flüssiger die Spermienmembran in der Nativ-Probe ist, desto besser ist
auch die Motilität und Lebensfähigkeit der aufgetauten Spermien (GIRAUD et al. 2000). Die
Häufigkeit pathologisch veränderter Spermienmembranen lag in dieser Studie, mit einem Mi-
nimum von 72%, sehr hoch. Nach dem Auftauen änderte sich die Zahl der abgehobenen
Membranen stark hengstabhängig. Die Zahl der teilweise oder vollständig abgelösten Mem-
branen nahm bei den meisten Hengsten in den TG-Proben deutlich zu und Allgemein konnte
man eine Verschiebung von Spermien aus der Kategorie “Membran in Ablösung” zu der Ka-
tegorie “abgelöste Membran” feststellen. Auch bei Hengst 38, bei dem die Nativ- und TG-
Werte für die Summe der teilweise abgelösten und vollständig abgelösten Membranen die
gleichen waren, gab es diese Verschiebung. Außerdem war die Zahl der akrosomreagierten
Spermien mit Granulabildung bei diesem Hengst deutlich erhöht. Bei den Hengsten 11 und 21
war die Verringerung an Spermien mit teilweise oder vollständig abgelösten Membranen zwar
minimal, stimmte aber genau mit der leichten Zunahme an Spermien, die Granula besitzen,
Diskussion 89
überein. Die Steigerung der teilweise oder vollständig abgelösten Membranen nach dem Ein-
frieren war sowohl im Kopf- als auch im Geißelbereich signifikant.
Die Zunahme an Membranschäden nach dem Gefrieren bestätigt die Befunde von
REINSTORF (2003). Sie konnte mittels flowzytometrischer Verfahren eine niedrigere Vor-
wärtsmotilität und zerstörte Zellmembranen in den TG-Proben feststellen. Die durch
HAMMERSTEDT et al. (1990) beschriebenen osmotischen Veränderungen, die beim Ein-
frierprozess auftreten, könnten diese Befunde erklären. MEYERS (2005) fand jedoch, dass
erst bei einer Osmolalität von +100 mOsm gegenüber dem isoosmolaren Zustand signifikante
Effekte auf die Motilität und Lebensfähigkeit der Spermien auftraten.
Der Kryoverdünner hat ebenfalls einen bedeutenden Einfluss auf die Vitalität der Spermien.
Glycerol z.B. ist ein sehr effektives Kryoprotektans, verursacht aber relativ viel osmotischen
Stress. Spermien in einem Verdünner mit DMSO, Propylenglykol und insbesondere
Ethylenglykol zeigen eine große Resistenz gegen Osmolaritätsveränderungen (ROYERE et al.
1996). Aus diesen Gründen ist damit nicht deutlich abzugrenzen, ob manche
Membranveränderungen, wie z.B. das Erstarren der Membran, durch den Einfrierprozess oder
durch das Kryoprotektans verursacht werden (AURICH et al. 1997; GARNER und THOMAS
1999; GIRAUD et al. 2000).
Nicht nur osmotische Faktoren, sondern auch oxidativer Stress beeinträchtigen die
Spermienfunktion. Oxidative Stoffe entstehen sowohl durch den normalen
Spermienmetabolismus als auch durch die Anwesenheit beschädigter Spermien und Leukozy-
ten im Ejakulat. Gefrierbeschädigungen der Spermien induzieren eine Zunahme der NO-
Produktion. Ein Kryoverdünner mit Anti-Oxidantien ist deswegen zu empfehlen (BELL et al.
1993; BALL et al. 2002). Ein Zusatz von Glutamin zu dem Verdünner erhöht die
Spermienmotilität nach dem Auftauen. Möglicherweise schützt Glutamin den enzymatischen
Apparat des Spermiums und hemmt auf diese Weise die Lipidperoxidation in den Membranen
(RENARD et al. 1996).
Die erhöhte Anzahl an Membranschäden, die man nach dem Einfrieren mit dem Elektronen-
mikroskop beobachten kann, wird durch die Aufbereitungsmethode noch akzentuiert.
Diskussion 90
Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid sind sehr gute Fixierungsmittel, doch die Fixierung ist
abhängig von der Intaktheit der Membranstruktur. Der Prozess des Einfrierens und Auftauens
hat den Bruch der Eiweißschicht zur Folge, so dass die unterhalb dieser Schicht liegenden
Lipide frei an die Oberfläche treten. Lipide sind anfälliger für eine Azetondehydratation als
die Eiweißkomponenten, so dass mit dieser Aufbereitungsmethode ein größerer Teil der
Lipide extrahiert wird. Dies stellt sich elektronenmikroskopisch als kleine Höhlen in der
Membranstruktur dar (GRØNDAL et al. 1994).
Am gravierendsten waren die Membranabweichungen in dieser Studie im Kopfbereich. Es ist
bewiesen, dass der Einfrierprozess die Lipidzusammensetzung der Kopfplasmamembran und
die dynamischen Wechselwirkungen dieser Membranlipide verändert (BUHR et al. 1994).
Der Cholesterolverlust der Membran nach dem Auftauen ist durch MALDJIAN et al. (2005)
bei Schweinen beschrieben worden. Dieser Cholesterolverlust wird auch bei der Kapazitation
angetroffen. Man könnte deswegen davon ausgehen, dass der Einfrierprozess die Kapazitation
auslöst. CORMIER et al. (1997) postulierten, dass die Ca2+
-Kanäle der Plasmamembran beim
Einfrieren beschädigt oder durch die veränderte Lipideverteilung beeinflusst werden, wodurch
ein erhöhter Ca2+
-Einstrom in die Zelle die Kapazitation stimuliert. THOMAS et al. (2006)
weisen aber darauf hin, dass die kapazitationsähnlichen Veränderungen, verursacht durch den
osmotischen und oxidativen Stress beim Einfrieren, auf andere Weise entstehen als die
Kapazitation in vitro.
Die meisten kapazitations- oder akrosomreaktionsähnlichen Veränderungen der Spermien
finden in der ersten Phase der Abkühlung (von Zimmertemperatur bis -15°C) statt. In dieser
Phase nimmt die Anzahl lebender, nicht akrosomreagierter Spermien deutlich ab. Dagegen
bleibt die Zahl lebender, kapazitierter Spermien im gesamten Abkühlungsprozess konstant
und der Anteil lebender, akrosomreagierter Spermien nimmt progressiv zu (NEILD et al.
2003). Hieraus kann man folgern, dass ein Teil der kapazitierten Spermien in den
akrosomreagierten Zustand übergehen. In aufgetauten Proben kann man mittels CTC oder
anderen flowzytometrischen Färbungen diesen Übergangszustand häufiger als in gekühlten
Proben antreffen (PARKER et al. 2000; REINSTORF 2003).
Diskussion 91
GRØNDAL et al. (1994) fanden in den aufgetauten Proben subfertiler Hengste mehr
akrosomreagierte Spermien als in den Proben der fertilen Gruppe. Die Akrosomreaktion
konnte in mehrere Stadien oder Gruppen eingeteilt werden. Gruppe 1 und 2 umfassen Sper-
mien, in welchen die Plasma- und äußere akrosomale Membran kleine Löcher (möglicherwei-
se durch die Aufbereitungsmethode), beziehungsweise größere Löcher (durch eine Malforma-
tion) zeigen. Auch Gruppe 3-Spermien, die eine Vesikelbildung im ganzen akrosomalen Be-
reich zeigen, sind in Frischsamen anzutreffen. Andere Abweichungen sind nur in TG-Samen
vorhanden. Es handelt sich um Spermien mit vielen, großen Löchern in der äußeren
akrosomalen Membran und in der Plasmamembran oder Spermien ohne Akrosom und ohne
Vesikel.
Bei Bullen sind die Akrosomläsionen nach dem Auftauen geringer als beim Hengst. Die meis-
ten Spermien behalten bei den Bullen eine intakte Plasmamembran und weniger als 10% zei-
gen deutliche akrosomale Defekte. Der Typ der Akrosomabweichungen bei den Bullen
stimmt mit denen beim Hengst überein. Ein Verlust der Plasmamembran im Akrosombereich
mit einer intakten äußeren akrosomalen Membran oder Spermien mit ausgeprägten
Vesikelbildungen entstanden durch die Akrosomreaktion sind von KROGENAES et al.
(1994) beschrieben worden. Am häufigsten fanden sie eine Verlängerung des proximalen
Teils der äußeren akrosomalen Membran. Die Plasmamembran war in diesem Bereich meist
noch teilweise intakt. Diese Verlängerung vom proximalen akrosomalen Teil konnte in dieser
Studie auch beim Hengst bestätigt werden, sie war nur in den TG-Proben anzutreffen.
Membranbeschädigungen und Akrosomreaktionen waren schon in den Nativ-Proben präsent
und traten nach dem Einfrieren viel zahlreicher auf. Auch wurde eine zahlenmäßige Ver-
schiebung von Spermien aus der Kategorie “Membran in Ablösung” zu der Kategorie “abge-
löste Membran” festgestellt. Außerdem war die Zahl der akrosomreagierten Spermien mit
Granulabildung nach dem Auftauen bei mehreren Hengsten erhöht. Manche akrosomreagierte
Spermien hatten noch eine teilweise intakte akrosomale Matrix. Bei den meisten Spermien
war jedoch diese Matrix nur noch rudimentär vorhanden. In Einzelfällen waren weder Matrix
noch Granula zu erkennen und deswegen konnte die Akrosomreaktion nur noch vermutet aber
nicht bewiesen werden. Einige Abweichungen, wie zB. dünne, verdickte und deformierte
Akrosome waren fast nur in den TG-Proben anzutreffen. Typisch für die TG-Spermien war
Diskussion 92
die hellere akrosomale Matrix. Durch den etwas größeren Kontrast zwischen der helleren
Matrix und den akrosomalen Membranen, waren Defekte der äußeren akrosomalen Membran
in den TG-Proben sehr deutlich zu sehen. Manche Spermien wiesen ein geschwollenes
Akrosom mit einer viel zu hellen, breiteren aber wenig kompakten Matrix auf. Bei anderen
Spermien war keine Matrix mehr nachzuweisen, lediglich zwei oder drei membranähnliche
Strukturen waren zu erkennen. Das Akrosom stellte sich in den TG-Proben manchmal auch
getrennt dar, wobei ein Teil dem Kern anlag und der andere Teil abgehoben war.
Die Elektronenmikroskopie ermöglicht uns leider nicht, „echte“, physiologische
Akrosomreaktionen von „falschen“, pathologischen Akrosomreaktionen, die bei einem Zell-
tod auftreten, zu unterscheiden. Eine zusätzliche TEM-Beurteilung nach einer Inkubation von
Spermien in einem Akrosom-reaktionsauslösenden Medium wäre sehr sinnvoll, um die Fä-
higkeit der Spermien, den physiologischen Kapazitations- und Akrosomreaktionsprozess zu
durchlaufen, zu bestimmen (KROGENAES et al. 1994; VARNER et al. 2001).
Alle diese morphologischen, biochemischen oder bioenergetischen Änderungen, die während
des Einfrierprozesses ablaufen, resultieren in einer niedrigeren Spermienvitalität. KAVAK et
al. (2003) fanden eine Vitalität von 21% (Triple Färbung: FITC-Erbsen (Pisum sativum)-
Agglutinin (PSA) / SNARF / Propidiumiodid (PI)) bis 38% (Eosin-Nigrosin Färbung) bei
aufgetauten Proben von Tori- und Estonischen Hengsten. Von den lebenden Spermien zeigten
79,3% (Tori-Hengste) bis 84,5% (Estonische Hengste) intakte Akrosome.
Für die routinemäßige Beurteilung von Tiefgefrierschäden eignen sich die kinetischen Para-
meter, die mittels CGSA bestimmt werden. Bei humanen Spermien konnte eine Korrelation
zwischen dem kinetischen Status der Spermien vor und nach der Tiefgefrierung bestätigt wer-
den (LIU et al. 2004). Die Beurteilung der Spermien mittels HOST ermöglicht aber keine
Aussage über die Spermienqualität nach dem Auftauen (LIN et al. 1998). Die TEM ist der
Goldstandard für die Beurteilung des Akrosoms. Doch diese Methode ist sehr zeitaufwändig,
teuer und ermöglicht wegen der kleinen Anzahl korrekt getroffener Längsschnitte nur eine
qualitative und keine quantitative Aussage. Die Schnittebene der Geißellängsschnitte verlief
selten parallel zu der Geißelachse, so dass nur ein kleiner Teil der Geißel beurteilt werden
konnte. Die Kopflängsschnitte und Geißelquerschnitte waren in größeren Zahlen vorhanden
Diskussion 93
und ermöglichten für jeden morphologischen Parameter eine Einteilung der Hengste in Grup-
pen mit keinen, wenigen, mäßigen und vielen veränderten Spermien. Die
Spermienbeurteilung nach der Studie von PESCH (2005), in welcher für jedes Ejakulat 200
Spermienköpfe, 200 proximale Geißelquerschnitte, 200 distale Geißelquerschnitte und 100
Geißellängsschnitte beurteilt wurden, führte zu Ergebnissen mit einer niedrigeren Standard-
abweichung als in dieser Arbeit. Da die Spermienzahlen in den Semidünnschnitten dieser
Studie nicht ausreichend waren, wurden von jedem Ejakulat nur 34 Köpfe, 34 proximale und
34 distale Geißelquerschnitte beurteilt, was insgesamt in den Nativ-Proben zu einer Anzahl
von 306 Spermien pro Hengst führte. Von den TG-Proben wurde nur das erste Ejakulat
aufgetaut, um die wichtigsten ultrastrukturellen Veränderungen nach dem Auftauen
festzustellen.
Das in dieser Arbeit entwickelte Standardprotokoll für die TEM umfasst alle Veränderungen
die in den Nativ- und TG-Proben beobachtet wurden. Es bietet dem Untersucher einen Leitfa-
den für eine schnelle Beurteilung der Spermienultrastruktur und ermöglicht den Zusammen-
hang verschiedener Abweichungen eines Spermiums genau zu erfassen.
Schlussbetrachtung:
Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigten nach dem Auftauen eine Zunahme an
Akrosomdefekten, akrosomreagierten Spermien und Beschädigungen der Mitochondrien und
der Plasmamembran. Dieser Defekt der Plasmamembran hatte eine Senkung der Anzahl pro-
ximaler und distaler Zytoplasmatropfen zur Folge. Geschwollene Akrosome mit einer niedri-
geren Dichte der akrosomalen Matrix waren ein typischer Befund in den TG-Proben. Diese
Studie der ultrastrukturellen Defekte führte zu Erstellung eines Standardprotokolles für die
transmissionselektronenmikroskopische Beurteilung von Hengstspermien.
Zusammenfassung 94
6 Zusammenfassung
Ellen Smedts
Beurteilung von nativen und aufgetauten Spermatozoen fertiler und subfertiler Hengste
mit Hilfe der Phasenkontrast- und Transmissionselektronenmikroskopie.
Institut für Veterinär-Pathologie der Veterinärmedizinischen Fakultät, Universität Leipzig
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover
(97 Seiten, 64 Abbildungen, 6 Tabellen, 154 Literaturangaben, 11 Seiten Anhang)
In dieser Arbeit wurde die Ultrastruktur von nativen und tiefgefrorenen Spermien mittels Pha-
senkontrast- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Für die Beurteilung
der Spermienmotilität und der Morphologie von in Formolzitrat fixierten Spermien standen
jeweils drei Ejakulate von 50 Hannoveraner Hengsten des Niedersächsischen Landgestüts
Celle zur Verfügung. Aus dieser Gruppe wurden drei fertile, drei subfertile Hengste und 6
Hengste mittlerer Fertilität ausgewählt, von denen sowohl die Nativ-Proben als auch eine
Tiefgefrierprobe (TG-Probe) für die TEM im Institut für Veterinär-Pathologie der Universität
Leipzig gemäß des Standardprotokolls des Institutes aufbereitet wurden. Die Spermien wur-
den gewaschen und das Seminalplasma der nativen Proben oder der Verdünner der TG-
Proben abpipettiert und durch eine 5%-ige Glutaraldehydlösung in einem 0,1 M
Kakodylatpuffer (pH 7,2) ersetzt. Die Fixierungslösung wurde anschließend entfernt und das
Pellet gewaschen und danach mit Gelatine gemischt. Die spermienreichen Stellen wurden aus
der Gelatine herausgeschnitten und in Glutaraldehyd aufbewahrt. Nach einer Nachfixierung in
OsO4 und einer Entwässerung in Ethanollösungen erfolgte eine Einbettung in einer
Eponmischung. Nach einer Polymerisation von 5 Tagen wurden die eingebetteten
Eponblöckchen angetrimmt und die Semi- und Ultradünnschnitte angefertigt. Die Ultradünn-
schnitte wurden auf ein Kupfergrid gelegt, mit Uranylazetat und Bleizitrat kontrastiert und mit
dem Transmissionselektronenmikroskop (Zeiss EM 900
, Oberkochem) bei 80 kV analysiert.
In den nativen Proben wurden insgesamt 360 Spermien pro Hengst beurteilt, in den TG-
Proben 120 Spermien pro Hengst.
Zusammenfassung 95
Die Qualität der elektronenmikroskopischen Aufnahmen war sehr gut, doch die Plasmamemb-
ran zeigte fixierungsbedingte Artefakte. Nach dem Auftauen waren die Bilder heller und der
Kontrast etwas geringer. Es gab eine Zunahme an Akrosomdefekten, akrosomreagierten
Spermien und Beschädigungen der Plasmamembran, der Mitochondrien, sowie der Mantel-
und Ringfasern. Durch die Membranbeschädigungen trat auch eine Verringerung der Anzahl
proximaler und distaler Zytoplasmatropfen auf. Sowohl geschwollene Akrosome mit einer
niedrigeren Dichte der akrosomalen Matrix als auch Mitochondrien mit einer zu hellen
mitochondrialen Matrix waren typische Befunde in den TG-Proben.
Die Studie der Ultrastruktur und die wahrgenommenen Defekte führten zur Erstellung eines
Standardprotokolls für die transmissionselektronenmikroskopische Beurteilung von Hengst-
spermien. Die Beurteilung mittels TEM sollte aber nicht zu einer quantitativen, sondern zu
einer qualitativen Aussage führen. Sie ermöglicht die Diagnose von Kern- (Kerndeformatio-
nen und Taschenbildung im Kern) und Akrosomabweichungen (deformierte Akrosome mit
oder ohne Vakuolenbildung, abgehobene Akrosome und akrosomreagierte Spermien), Ano-
malien der Mitochondrien (Unterbrechung der Mitochondrienscheide, zu viele Mitochond-
rien, anormale Dichte der mitochondrialen Matrix), Defekten des Axonemas (Ordnung oder
Anzahl der Mikrotubuli, Mantel- und Ringfasern) und der Anwesenheit immaturer
Spermienvorstufen. Diese Methode eignet sich für die Diagnostik subfertiler Hengste mit
normalen Spermienparametern bei der routinemäßige Spermienbeurteilung und kann sowohl
in nativen als auch in TG-Proben angewendet werden.
Im Vergleich zur Phasenkontrastmikroskopie waren die elektronenmikroskopischen Bilder
wegen ihrer stärkeren Vergrößerung und der Darstellung innerer Spermienstrukturen viel aus-
sagekräftiger. Für die Beurteilung von Halsansatzdefekten, abweichende Geißelformen und
Mehrfachmißbildungen ist die Phasenkontrastmikroskopie die am besten geeignete Methode.
Summary 96
7 Summary
Ellen Smedts
Evaluation of fresh and frozen-thawed semen samples of fertile and subfertile stallions
by light microscopy and transmission electron microscopy.
Institut of Pathology of the Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover
(97 pages, 64 figures, 6 tables, 154 references, 11 pages appendix)
In this study the ultrastructure of fresh and frozen-thawed semen samples of 50 stallions from
the National Stud of Lower Saxony (Celle, Germany) were evaluated by light microscopy and
transmission electron microscopy (TEM). Three ejaculates of each stallion were available for
the motility analysis and the morphological analysis by lightmicroscopy after fixation in for-
mol citrate. Based on the fertility data, the ejaculates of 12 stallions (3 fertile stallions, 3 sub-
fertile stallions and 6 stallions of average fertility) were selected for the morphological analy-
sis by TEM. The native samples and one frozen-thawed sample from these stallions were pre-
pared for the TEM at the Institute of Pathology of the Faculty of Veterinary Medicine, Uni-
versity of Leipzig. The sperm cells were washed and the seminal plasma from the native sam-
ples and the diluents of the frozen-thawed samples were replaced by a 5%-glutaraldehyde
solution in a 0,1 M cacodylate buffer pH 7,2. The fixative was removed, the pellet was
washed again and mixed with gelatin. The sperm rich fraction in the gelatin mass was excised
and stored in glutaraldehyde. A second fixation in OsO4 was followed by a dehydratation in
ethanol and a polymerization phase in epon. After 5 days of polymerization the starred sam-
ples were used for semi- and ultratight cuts. The latter were placed on a copper grid, con-
trasted with uranyl acetate and lead citrate and analyzed with the transmission electron micro-
scope (EM 900
) by 80 kV. In the fresh samples, 360 sperm cells were examined per stallion,
whereas in the frozen-thawed samples only 120 sperm cells per stallion were evaluated.
The microscopic pictures were of a high quality. However, the sperm plasma membrane
Summary 97
showed some fixation artifacts. In the thawed samples a lower contrast was noticed than in the
fresh samples. The sperm cells in the frozen-thawed samples showed an increase in acrosome
defects, acrosome reactions, damage of the cell plasma membrane, mitochondria, fibrous
sheet and outer dense fibers. The latter defect was associated with a decrease in proximal and
distal cytoplasmatic droplets. Swollen acrosomes with a lower matrix density and a bright
mitochondrial matrix were typically present in the cryopreserved samples.
The ultrastructural defects in these samples, examined by TEM, have led to the development
of a standard evaluation protocol with the most common sperm defects in stallion semen.
TEM is an expensive and time consuming technique, which cannot be used to obtain quantita-
tive results, but is considered as an accurate method for the qualitative examination of semen
samples in cases of unexplained subfertility. TEM can especially be recommended for the
diagnosis of nuclear (nuclear malformations and pouches) and acrosomal defects (acrosome
deformations, acrosome vacuoles, detached acrosomes and acrosome reactions), mitochondri-
al (mitochondrial sheet defects, mitochondrial proliferation, decrease in mitochondrial matrix
density) and axonema malformations (anormal position or quantity of microtubules and fibr-
ous sheet or outer dense fibers defects) and the detection of immature sperm cells in ejacu-
lates. The results of this study state that TEM can be useful for the evaluation of both fresh
and frozen-thawed semen samples.
Compared to the light microscopic evaluation of stallion sperm, the TEM images give more
precise information because of their higher magnification rate and the ability to reveal internal
sperm structures. However, light microscopy remains the best method to detect sperm neck
defects, deformed tailes and sperm cells with multiple heads or tails.
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Anhang 109
9 Anhang
9.1 Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 1: Morphologischer Aufbau des Spermiums
Morel MCGD. Equine artificial insemination. CABI Publishing Spermatozoa 1999:88-125
und 202-233.
Abbildung 2: Schematische Darstellung eines Hengstspermiums im Kopf- und Halsbereich.
Brito LFC. Evaluation of stallion sperm morphology. Equine-Pract. 2007;6:249-264.
Abbildung 3: Schematische Darstellung einer proximalen Geißel (Mittelstück): Querschnitt
(links) und Längsschnitt (rechts).
Varner DD, Johnson L. From a sperm’s eye view-Revisting our perception of this intriguing
cell. Proceedings of the 53th annual convention of the American Association of Equine Prac-
titioners. Orlando, Florida; 2007.
Abbildung 4: Schematische Darstellung einer distalen Geißel (Hauptstück): Querschnitt
(links) und Längsschnitt (rechts).
Varner DD Johnson L. From a sperm’s eye view-Revisting our perception of this intriguing
cell. Proceedings of the 53th annual convention of the American Association of Equine Prac-
titioners. Orlando, Florida; 2007.
Abbildung 5: Eine 2-D schematische Darstellung einer Plasmamembran.
Rathi R. Capacitation and acrosome reaction in stallion spermatozoa: functional and clinical
aspects. Utrecht: Proefschrift Universiteit Utrecht; 2001A.
Anhang 110
9.2 Fertilität der Probanden
Tabelle 1: Alter und Fertilitätsdaten der Probanden
Hengst Alter
(Jahr)
Fertilität Hengst
Alter
(Jahr)
Fertilität
Tr/R NRR33 Tr/R NRR33
1 15 0,4686 0,5919 26 16 0,4529 0,5702
2 6 0,4444 0,6067 27 9 0,5470 0,6425
3 5 0,5879 0,6404 28 11 0,5280 0,6533
4 11 0,4091 0,5473 29 6 0,4832 0,6159
5 9 0,5396 0,6412 30 23 0,4414 0,5812
6 8 0,3258 0,5266 31 18 0,4383 0,5615
7 5 0,5294 0,6465 32 19 0,5008 0,5787
8 4 0,3945 0,4805 33 6 0,4651 0,5738
9 7 0,5279 0,6200 34 9 0,4615 0,5664
10 5 0,5075 0,5917 35 16 0,4412 0,5706
11 11 0,4828 0,5952 36 7 0,5712 0,6710
12 4 0,5194 0,6268 37 10 0,4802 0,5484
13 7 0,5432 0,7321 38 9 0,4337 0,5682
14 5 0,5091 0,6585 39 13 0,5099 0,6551
15 8 0,4772 0,6291 40 7 0,5326 0,6520
16 5 0,5932 0,7391 41 17 0,4423 0,5856
17 6 0,5471 0,6513 42 25 0,3943 0,5221
18 9 0,4210 0,5688 43 13 0,4701 0,6018
19 5 0,3945 0,4815 44 5 0,5152 0,6222
20 21 0,3416 0,4523 45 19 0,4504 0,5895
21 12 0,4218 0,6004 46 15 0,4154 0,5619
22 22 0,4291 0,5705 47 14 0,3266 0,5552
23 20 0,3279 0,3846 48 8 0,3058 0,4014
24 9 0,4373 0,5897 49 15 0,3107 0,4743
25 8 0,4565 0,6417 50 12 0,4217 0,5431
Anhang 111
Abbildung 1: Verteilung der Hengste basierend auf dem Fertilitätsparameter Tr/R.
Anhang 112
Abbildung 2: Verteilung der Hengste basierend auf dem Fertilitätsparameter NRR33.
Anhang 113
9.3 Rezepturen
1. Bleizitrat mit NaOH
1,33 g Bleinitrat und 1,6 Natriumzitrat mit 30 ml A. bidest. in einem 50 ml-
Messzylinder mit Schliffstopfen 1 min schütteln. Lösung 30 min stehen lassen, da-
bei gelegentlich schütteln. Tropfenweise NaOH in Aq. dest. dazugeben (2 ml 1 N
NaOH (Chemapol, Tschechien) in 25 ml Aq. dest.
2. Kakodylatpuffer pH 7,2; 0,2M
10,7 g Natriumkakodylat in 250 ml A. bidest. mit 21 ml 0,2 M HCl (830 µl konz.
HCl (Merck, Darmstadt) auf 50 ml A. bidest.) auf pH 7,2 einstellen. Um die 0,1 M
Pufferlösung herzustellen, wird die 0,2 M-Lösung 1:2 mit A. bidest. verdünnt.
3. Ethanol
Ethanol 100% (Bundesmonopolverwaltung für Branntwein, Offenbach am Main).
4. Formolzitratlösung für die morphologische Beurteilung mittels Phasenkontrast-
mikroskopie. Aufbereitungsmethode der Reproduktionsmedizinischen Einheit der
Kliniken – Tierärztliche Hochschule Hannover: 2,9 g tri-Natriumzitrat 2 H2O ad
100 ml Aqua dest. Von der Lösung 4 ml verwerfen, und statt dessen 4 ml 37%iges
Formalin zugeben.
5. Gelatine (Roth, Heidelberg) in 0,88 M Saccharose Puffer pH 7,2 bei 37°C.
6. Glutaraldehyd
5%ige Glutaraldehyd-Lösung: 50 ml 25%iges Glutaraldehyd (Agar Scientific, Es-
sex, England) in 200 ml 0,1 M Kakodylatpuffer pH 7,2.
Anhang 114
7. INRA-82:
Zusammensetzung des Verdünners INRA-82:
Aqua bidest. : 1 l
Glucose : 50 g
Lactose-Monohydrat : 3 g
Raffinose x 5H2O : 3 g
Na Citrat x 2 H2O : 0,5 g
K Citrat x H2O : 0,82 g
HEPES : 9,52 g
Penicillin : 1 g
Gentamycin : 1 g
Magermilch (0,3% Fett) : 1 l
Zusammensetzung des Tiefgefrierverdünners:
INRA 82 : 935 ml
Eidotter* : 40 ml
Glycerin : 2.5 %
* Eidotter und Aqua bidest. 1:1 verdünnen und 10 min bei 15000 x g zentrifugie-
ren. Daraus den Überstand verwenden.
8. Osmiumtetroxid 1%
Möglichst 2 Tage vor Gebrauch ansetzen, da sich Osmium schwer löst, 50 ml A.
bidest in eine braune 100 ml Flasche mit Schliffstopfen gießen. Weitere Bearbei-
tung unter dem Abzug und mit Schutzhandschuhen. Osmiumtetroxid-Ampulle (1g
Osmium) mit Ampullensäge ansägen, aufbrechen und beide Ampullenhälften in
die vorbereitete braune Flasche geben. Flasche mit Glasstopfen und Planfilm gut
verschließen und danach leicht schwenken, damit Luftblasen aus den
Ampullenhälften entweichen. Mindestens 24 Std. Unter dem Abzug bei Raumtem-
peratur lösen lassen und anschließend im Kühlschrank aufbewahren. Mit 1% Os-
mium fixieren. Dafür wird die zuvor hergestellte 2%ige Lösung mit 0,2 M
Kakodylatpuffer 1:2 verdünnt.
Anhang 115
9. Propylenoxid/Epongemisch mit BDMA: (unter dem Abzug herstellen)
Ansatz A: 62 ml Glycidether 100 + 100 ml DDSA (Dodecenylbernsteinsäure-
anhydrid) (Eponhärter, weichere Komponente).
Ansatz B: 100 ml Glycidether + 89 ml MNA (Methyl Nadic Anhydride)
(Eponhärter, härtere Komponente).
Ansätze A und B müssen jeweils 20 min mit Glasstab in einem Becherglas gerührt
werden, bis sich keine Schlieren mehr bilden und die Farbe der Mischung einheit-
lich ist. Ansätze A und B in gekennzeichnete braune Flaschen mit Schraubver-
schluss gießen und im Kühlschrank aufbewahren. Kurz vor Gebrauch 4 Teile A
und 6 Teile B unter Zugabe von 2% BDMA (Benzyldimethylamine) (Polymerisa-
tionsbeschleuniger) mischen, dabei ebenfalls einheitliche Durchmischung beachten
(keine Schlierenbildung und einheitliche Farbe). Vor der Einkapselung der Proben
müssen die beim Rühren entstandenen Luftblasen verschwunden sein.
10. Toluidinblaulösung für Semidünnschnitte
2,5 g NaHCO3 und 1g Toluidinblau in 100 ml A. dest. lösen. Diese Stammlösung
ist mehrere Monate im Kühlschrank haltbar. Zum Gebrauch 1 Teil Stammlösung
mit 3 Teilen A. dest. verdünnen; stets frisch ansetzen und filtrieren.
11. Uranylazetat 2,5% (vorsichtige Handhabung, schwach radioaktiv)
0,156 g Uranylazetat (Lachema, Tschechien) in 6,25 ml 25% Ethanol lösen. Lö-
sung immer frisch herstellen; schwer löslich daher mindestens 1 bis 2 Std. Erwär-
men und vor Gebrauch abkühlen.
Anhang 116
9.4 Protokoll für die morphologische Beurteilung fixierter Spermien der
Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule
Hannover
Name Hengst:
Datum:
Ejakulat:
Methode: z. B. Formolzitrat
Kopfkappenveränderungen: Prozentsatz:
geschwollen
in Ablösung
deformiert
persistierendes Akrosomgranulum
andere Kopfkappenveränderungen
Kopfveränderungen: Prozentsatz:
deformiert
verjüngt
schmal
Zwergkopf
Riesenkopf
andere Kopfveränderungen
Halsveränderungen: Prozentsatz:
Halsbruch
paraxialer Schwanzansatz
retroaxialer Schwanzansatz
Plasmatropfen
andere Halsveränderungen
Verbindungsstückveränderungen: Prozentsatz:
Plasmatropfen
andere Verbindungsstückveränderungen
Haupt- und Endstückveränderungen: Prozentsatz:
Schleifenform
aufgerollt
um den Kopf gerollt
rudimentär
Plasmatropfen
andere Haupt- und Endstückveränderungen
Doppel- und Mehrfachmissbildungen: Prozentsatz:
Doppelkopf mit einem Schwanz
einköpfiger Zwillingsschwanz
Summe Gesamtprozentsatz:
Anhang 117
9.5 Protokoll für die transmissionselektronenmikroskopische Beurteilung von Spermien
9.5.1 Standardprotokoll für die Beurteilung von Spermienköpfen
Plasmamembran
Glatt anliegend
Gewellt
Gefranst
In Ablösung (fragmentiert oder teilweise abgelöst)
Abgehoben
Aufgerollt
Vollständig abgelöst
Granulabildung (akrosomreagiert)
Akrosom
Akrosom intakt
Äußere akrosomale Membran abgelöst und akrosomale Matrix in Ablösung
Akrosom gewellt
Akrosomale Matrix und akrosomale Membranen abgehoben
Akrosomale Matrix und akrosomale Membranen abgelöst
Granulabildung (akrosomreagiert)
Akrosomhypoplasie
Akrosom verdickt im proximalen Bereich
Deformiertes Akrosom
Akrosomale Matrix mit niedrigerer Dichte
Getrennte akrosomale Matrix
Akrosomvakuole
Akrosomale Höhle mit amorphem Material
Kern
Kern intakt
Große oder sehr viele kleine Kernvakuolen
Kernvakuole mit amorpher Masse
Kondensationsstörungen
Taschenförmige Kernhöhle
Kernhöhle mit Akrosominhalt
Deformierter Kopf
Andere Kopfabweichungen
Kopf mit einem oder mehreren Geißelanschnitten
Doppelköpfe und Mehrfachköpfe
Mikrotubuli-Ansammlungen
Zytoplasmastrukturen im Halsbereich
Übermäßiges Zytoplasma zwischen dem Kern und dem Akrosom
Übermäßiges Zytoplasma zwischen dem Akrosom und der Plasmamembran
Amorphe Masse zwischen dem Kern und dem Akrosom
Andere Zellen
Anhang 118
9.5.2 Standardprotokoll für die Beurteilung von Geißelquerschnitten
Plasmamembran
Glatt anliegend
Gewellt
Gefranst
Abgehoben
In Ablösung (fragmentiert oder teilweise abgelöst)
Aufgerollt
Vollständig abgelöst
Innere Strukturen
Intakt
Mitochondrienscheide nicht intakt (nur bei den proximalen Geißeln)
Mitochondrienschäden (Dichte der Matrix)
Mantelfasern nicht intakt
Ringfasern nicht intakt (nur bei den distalen Geißeln)
Fehlen von einem oder mehreren Mikrotubuli
Andere Anomalie des Tubulusmusters
Mehrere Geißelquerschnitte in einer Membran
Geißelquerschnitt und Geißellängschnitt in einer Membran
Zytoplasma zwischen den inneren Strukturen und der Plasmamembran
Mikrotubuli-Ansammlungen
Andere Zellen
Anhang 119
9.5.3 Standardprotokoll für die Beurteilung von Geißellängsschnitten
Plasmamembran
Glatt anliegend
Gewellt
Gefranst
Abgehoben
In Ablösung (fragmentiert oder teilweise abgelöst)
Aufgerollt
Vollständig abgelöst
Innere Strukturen
Intakt
Mitochondrienscheide nicht intakt (im proximalen Bereich der Geißel)
Mitochondrienschäden (Dichte der Matrix)
Mantelfasern nicht intakt
Ringfasern nicht intakt (in distalen Bereich der Geißel)
Fehlen von einem oder mehreren Mikrotubuli
Andere Anomalie des Tubulusmusters
Mehrere Längsschnitte in einer Membran
Geißellängschnitt und Geißelquerschnitt in einer Membran
Zytoplasma zwischen den inneren Strukturen und der Plasmamembran
Mikrotubuli-Ansammlungen
Halsansatzdefekt
Halsbruch
Geknickte Geißel
Schleifenförmige Geißel
Deformierte Geißel
Doppelköpfe
Keine Ordnung der inneren Strukturen
Andere Zellen
Danksagung 120
Danksagung Mein erster Dank geht an Herrn Prof. Dr. Schoon und Herrn Prof. Dr. Sieme für die wissen-
schaftliche Betreuung und die Unterstützung bei der Anfertigung meiner Dissertation.
Herrn Prof. Dr. Schoon möchte ich herzlich danken für das zur Verfügung Stellen des Trans-
missionselektronenmikroskops, die ständige Hilfsbereitschaft und die sehr gastfreundliche
Aufnahme an der Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig.
Herrn Prof. Dr. Sieme danke ich insbesonders für die Überlassung des interessanten Disserta-
tionsthemas und die schöne Zeit am Landgestüt.
Danken möchte ich auch Herrn Landstallmeister Dr. Bade für die Bereitstellung der Hengste
und Fertilitätsdaten, als auch allen Mitarbeitern des Niedersächsischen Landgestüts Celle für
die Freundschaft und die nette Zusammenarbeit.
Des Weiteren danke ich Frau Schröder aus der Repro der Tierärztliche Hochschule Hannover
für die Einarbeitung in die Phasenkontrastmikroskopie.
Weiterhin möchte ich Frau Dr. Aupperle für die Einweisung in die Transmissions-
elektronenmikroskopie danken.
Mein besonderer Dank gilt Frau Langhof, die jederzeit bereit war, meine technischen Fragen
im Labor oder im Elmiraum zu beantworten. Ihr Enthusiasmus beim Anblick dieser künstleri-
schen, schwarzen Zellen auf dem kontrastreichen, gelben Hintergrund war ansteckend.
An dieser Stelle möchte ich mich auch bei Herrn Dr. Rohn vom Institut für Biometrie, Epi-
demiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover für die
Unterstützung bei der statistischen Auswertung meiner Daten bedanken.
Mein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie und ebenso der Familie Huesmann, denen
diese Arbeit gewidmet ist. Meinen Eltern bin ich sehr dankbar für die immerwährende Unter-
stützung, nicht nur beim Studium, sondern auch im professionellen und persönlichen Leben.
Frau Brigitte Huesmann sei gedankt für die tatkräftige Hilfe beim ersten Korrekturlesen und
Herrn Manfred Hille-Huesmann danke ich für die computertechnische Hilfe. Doch vor allem
danke ich ihnen für die gemütlichen Abende und die menschliche Wärme, die aus Aurich
mein zweites Zuhause gemacht haben.
Danksagung 121
Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Ass. Prof. Dr. med. vet. Ingeborg Hein für das zeitauf-
wändige Korrekturlesen meiner ganzen Arbeit. Ohne ihre Hilfe hätte ich es sicher nicht ge-
schafft. “Inge, ich weiß, was ich Dir zu verdanken habe!”
Ich möchte auch Susann Müller, Tina Meyer-Scheel und Elisabeth Schöntal ein aufrichtiges
Dankeschön sagen für die Hilfe und stetige Ermutigung beim Schreiben.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei all den nicht einzeln erwähnten Menschen bedanken, die
mir mit moralischer Unterstützung in dieser Zeit zur Seite standen.
![Aus der Chirurgischen Klinik und Poliklinik · 2019. 7. 23. · Ganzkörper-Computertomographie (focused assessment with computed tomography in trauma, FACTT) [12]. Nach der nativen](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/5fbbfc0a9f6d70375b5b8546/aus-der-chirurgischen-klinik-und-poliklinik-2019-7-23-ganzkrper-computertomographie.jpg)
