Investigarea tulburărilor metabolismelor intermediare

Constantin Ionescu-Tîrgovişte, Cornelia Pencea, Olivia Georgescu

Introducere

Deşi glucoza sanguină ocupă un rol central în diagnosticul diabetului, alţi metaboliţi aparţinând glucidelor, lipidelor sau proteinelor pot fi modificaţi în cursul acestei boli.

Întrucât tulburările metabolice specifice diabetului sunt secundare modificărilor în secreţia insulinei sau a hormonilor de contrareglare, dozarea acestora face parte din investigaţiile obligatorii pentru elucidarea factorilor etiopatogenetici prezenţi (29).

Informaţii etiopatogenetice indirecte pentru DZ de tip 2 pot fi furnizate de determinarea numărului receptorilor insulinici, a captării şi utilizării periferice a glucozei, a debitului hepatic de glucoză. Acestea însă sunt laborioase, şi în prezent sunt utilizate numai în scop de cercetare (12).

Tot în scop de cercetare sunt utilizate investigaţiile ce vizează detectarea unor defecte genetice în transcrierea unor molecule proteice importante din punct de vedere funcţional incluzând: insulina, pro-insulina. receptorul insulinic, tirozinkinaza receptorului insulinic, transportorii de glucoza, canalele ionice şi numeroase enzime din ciclul de metabolizare al glucozei, ca de exemplu glucokinaza şi glicogensintetaza (24, 26).

1. Investigarea metabolismului glucidic

1.1. Glicemia à jeun

Metodele de dozare ale glucozei sanguineGlicemia poate fi determinată prin trei tipuri de metode:

-metode reductometrice bazate pe determinarea corpilor reducători din sânge, care sunt, pe lângă glucoză, şi alte tipuri de glucide. Valorile obţinute pot fi cu 30% mai mari decât cele enzimatice;

-metodele furfuralice (cea mai cunoscută fiind cea cu ortotoluidină), deşi nespecifice (dozează şi alte glucide din sânge), dau totuşi rezultate apropiate de metodele enzimatice, având o reproductibilitate bună (12). Valorile normale sunt între 60 şi 100 mg/dl, cu 5-10 mg/dl mai mari ca cele pentru glucozo-oxidază. Valorile pot fi crescute când fructoza şi galactoza din sânge se află în concentraţii mari, aşa cum se întâmplă în unele hipoglicemii (26);

-metodele enzimatice (cu hexokinază sau cu glucozo oxidază) sunt specifice pentru glucoză. Cea cu glucozo-oxidază foloseşte transformarea glucozei în gluconat, în prezenţa enzimei şi a oxigenului molecular, cu formare de apă oxigenată. Intensitatea reacţiei poate fi apreciată fie prin măsurarea directă a oxigenului consumat (analizorul Beckman) sau a peroxidului de hidrogen format (analizorul Yellow-Spring), fie prin metodele utilizând un cromogen.

Proba de dozareDeterminarea glicemiei în plasmă dă o valoare cu cca. 15% (nu cu 15 mg/dl) mai mare decât

în sângele integral. Diferenţa se datorează faptului că aproximativ 40% din volumul sângelui este ocupat de hematii (egal cu valoarea hematocritului). Cum cca. 35% din hematii sunt ocupate de hemoglobină, în care glucoza nu este distribuită, reiese că aceasta este exclusă din 15% dintr-o probă în care hematocritul este de 43% (0,35X0,43=15%). Cu alte cuvinte, numai 85% din volumul folosit pentru determinare conţine glucoză, în timp ce valoarea obţinută este raportată la întregul volum.

Sângele arterial are o concentraţie de glucoză mai mare decât sângele venos sau capilar. Valoarea mai mică a glucozei în sângele venos se datorează faptului că în ţesuturi, o parte este consumată. Sângele recoltat din deget sau din lobul urechii reprezintă un amestec de sânge arterial şi venos. Când degetul este încălzit, datorită vasodilataţiei, contribuţia sângelui arterial creşte. În stare de post, ţesuturile periferice (cu excepţia creierului şi hematiilor) nu consumă glucoza; ca urmare, există o mică diferenţă între concentraţia de glucoza din sângele arterial şi din cel venos. După o încărcare cu glucoză însă, diferenţa arterio-venoasă a glucozei poate atinge 40 mg/dl, cu valoare mai mare în sângele arterial (12).

Momentul recoltării

1

Glicemia à jeun trebuie recoltată după minimum 8 ore de post, preferabil după 14 ore de post. În prezent există tendinţa de a acorda importanţă mai mare glicemiei à jeun, mai ales când ea este urmărită pe parcursul mai multor ani. Dacă, de exemplu, glicemia à jeun a crescut constant în timp, de la 80 la 90, la 100. şi apoi la 110 mg/dl, această dinamică indică aproape cu certitudine evoluţia către diabetul zaharat clinic manifest (24).

Interpretarea rezultatelor:În condiţii obişnuite, glicemiile nu depăşesc la persoanele tinere 100 mg/dl (ajung însă

postprandial la vârstnici până la 180 mg/dl) şi nu scad spontan sub 50 mg/dl. Creşterile "fiziologice" legate de vârstă devin semnificative numai după 60 de ani (45).

Valoarea glicemiei, recoltată după un post de 12-14 ore, prezintă cea mai mică variaţie interindividuală.

Valorile glicemiei determinate prin metoda cu glucozo-oxidaza, trebuie interpretate astfel:- valori normale la o glicemie à jeun > 60 mg/dl şi sub 110 mg/dl;- valori anormale (scăzute sau crescute), când glicemia à jeun este < 50 mg/dl sau mai mare

de 110 mg/dl;- valoarea glicemică à jeun constant peste 110 mg/dl şi mai mică decât 126 mg/dl defineşte

stadiul de alterare a glicemiei à jeun (IFG-impaired fasting glycemia). În această situaţie este necesară efectuarea hiperglicemiei provocate oral, deoarece glicemia à jeun modificată indică un risc major pentru progresia în timp spre diabet zaharat. De altfel, IFG ca şi IGT (impaired glucose tolerance) se asociază cu un risc cardiovascular crescut, făcând parte din evoluţia stadială a diabetului zaharat de tip 2 (22). Se consideră că o valoare glicemică à jeun între 110-126 mg/dl indică un debit hepatic crescut de glucoză asociat unui deficit insulinosecretor (scăderea sau dispariţia vârfului insulinosecretor precoce) (45). Într-un studiu recent (45) realizat pe 224 de subiecţi aflaţi la risc pentru diabet zaharat, la care s-a determinat glicemia à jeun, s-a observat că: 24% dintre cei cu glicemii între 100-109 mg/dl şi 50% dintre cei cu glicemii între 110-125 mg/dl au fost diagnosticaţi cu diabet zaharat la testul de toleranţă orală la glucoză.

Autocontrolul glicemiilorÎn prezent există numeroase sisteme de determinare a glicemiei la domiciliu, utilizate în

marea lor majoritate de pacienţii diabetici pentru a-şi orienta tratamentul în funcţie de valorile obţinute. Ca tipuri de glucometre cu performanţe tehnice notabile putem cita: Medisense, Reflolux-S, Mini-Accutrend, Lifescan One Touch (57). Metodele de citire automată pe reflexomeţre sunt mai precise decât cele citite de pacient cu ochiul liber pe o scală de culoare. Marele merit al testelor se dovedeşte atunci când dorim a diferenţia o hipoglicemie de o hiperglicemie, în prezenţa unor semne clinice neconcludente. Acurateţea estimărilor glicemice este însă întotdeauna inferioară măsurătorilor de laborator. Ca factori de eroare ce pot interveni în exprimarea rezultatelor sunt citate variaţiile de temperatură ale mediului înconjurător (temperaturile scăzute afişează valori glicemice scăzute) şi umiditatea peste 60% (28). Problema cost-eficienţă în automonitorizarea pacienţilor cu diabet zaharat tip 2 rămâne discutabilă din mau multe puncte de vedere:

1. Pacientul nu îşi ajustează tratamentul2. Testarea glicemiei à jeun este mai puţin importantă decât cea postprandială (27).3. Majoritatea pacienţilor trataţi cu antidiabetice orale au excursii postprandiale mari

(dincolo de recomandările OMS)4. Hb A1C se corelează mai mult cu glicemia preprandială decât cu cea postprandială (4).Un calcul aproximativ estimează că testarea zilnică a glicemiei pentru cei 300 000 de

diabetici aflaţi în evidenţa Centrelor de Diabet din România ar costa aproximativ 6 milioane de dolari. Ultima generaţie a sistemelor de monitorizare a glicemiei este reprezentată de Satellit G şi

Gluco-watch, care pot determina glicemii atât din sângele capilar cât şi din sângele venos, principiul de funcţionare bazându-se pe existenţa unor senzori glicemici subcutanaţi şi pe măsurarea amplitudinii curentului electric generat prin reacţia de glucozoxidare. Aparatele portabile sunt bine tolerate şi sunt dotate cu sisteme de corecţie privind valorile din sângele venos comparativ cu cele din sângele capilar, precum şi cu un electrod suplimentar care compensează interferenţele din exterior (41, 45). Totuşi, în ciuda eforturilor de a dezvolta aceste sisteme soluţia aplicabilă clinic pe scară largă nu este încă satisfăcătoare (13).

Autocontrolul glicemic reprezintă o etapă importantă în planul educaţional al diabeticului (51, 54). Asociaţia Americană de Diabet (ADA) recomandă cel puţin 3 testări pe zi pentru pacienţii cu

2

diabet zaharat tip1.Pentru a uşura această situaţie a fost recent introdus un sistem de monitorizare continuă a

glicemiei, cu ajutorul unor senzori implantaţi subcutanat (31). Metoda minim invazivă se bazează pe conceptul, conform căruia, concentraţia glucozei în ţesutul interstiţial s-ar corela cu glicemia.

Dispozitivul prezintă şi avantajul de a fi conectat direct la computerul medicului curant diabetolog, valorile glicemice fiind automat înregistrate şi înscrise pe un grafic.

Alte glucide sanguineDintre hexoze, fructoza şi galactoza pot produce uneori hipoglicemii la pacienţii cu tulburări

metabolice. Diagnosticul întâmpină dificultăţi datorită interferenţei acestor zaharuri în dozarea precisă a glicemiei, atunci când nu se utilizează tehnicile enzimatice.

Fructoza poate fi determinată folosind enzima specifică fructo-kinaza, sau alte metode mai laborioase.

Fructoza nu apare în sânge decât după o ingestie crescută a unor cantităţi mari care poate duce la intoleranţă la glucoză şi hiperlipemie. Aportul zilnic de fructoză este de 100g. Fructozemia la diabetici este semnificativ mai mare faţă de nediabetici (12,03 vs 7,70 micromoli/l) şi s-a observat că scăderea glicemiei conduce la scăderea fructozemiei (26). Fructozemia şi fructozuria apare în intoleranţa ereditară la fructoză sau în deficienţa de fructoză-1,6-difosfatază. Ele se asociază cu hepatomegalie şi hipoglicemii (26).

Testul de toleranţă la fructoză foloseşte calea i.v., întrucât administrată oral, ea produce la bolnavii cu intoleranţă ereditară la fructoză simptome gastro-intestinale marcate. După recoltarea a două probe bazale se administrează i.v. 0,25 g/Kg corp fructoză dintr-o soluţie 20% introdusă în interval de 2 min. Se recoltează probe la 10, 20, 30, 45, 60, 75 şi 90 min., dozându-se glucoza, fructoza, insulina, lactatul şi fosfatul anorganic. În mod normal după o creştere iniţială rapidă a fructozemiei, valorile revin rapid la normal. O creştere uşoară însă a glicemiei este obişnuită. Dimpotrivă, la bolnavii cu intoleranţă ereditară la fructoză se înregistrează o scadere marcată a glicemiei, astfel că după 40 min. simptomele de hipoglicemie sunt evidente. Insulinemia plasmatică scade sub nivelele detectabile, fosforul anorganic scade cu 50% sau mai mult, în timp ce lactatul plasmatic creşte.

La bolnavii cu fructozurie benignă se înregistrează o întârziere în scăderea fructozemiei, fără însă a fi influenţate insulinemia, glicemia, fosfatemia sau lactatemia (24).

La pacienţii cu deficienţă de fructozo- 1,6-difosfatază, testul poate induce o acidemie lactică marcată şi o hipoglicemie profundă, fiind contraindicat.

Galactoza poate fi şi ea determinată în sânge prin metode enzimatice bazate pe galactozo-dehidrogenaza ori galactozo-oxidaza. Galactoza nu apare în sânge sau urină în cantităţi semnificative decât după o ingestie importantă şi nefiziologică.

Apariţia ei în urină se întâlneşte în afecţiunile hepatice severe ori în galactozemie (erori de metabolism date de deficienţe în galactozidază).

Testele de toleranţă orală sau i.v. la galactoză sunt periculoase şi deci contraindicate. În anexa ..... redăm tabelul cu unităţile internaţionale pentru valorile biochimice uzuale, precum şi unele nomograme necesare calculării unor parametri utili pentru diagnostic (24).

1.2. Testul oral de toleranţă la glucoză Testul oral de toleranţă la glucoză sau hiperglicemia provocată orală este unul din testele

cele mai frecvent utilizate în practica medicală şi cel mai bine codificat, de explorare a metabolismului glucidic. Valoarea sa pentru diagnosticarea etapelor subclinice ale intoleranţei la glucoză este bine dovedită. Pentru diagnosticul hipoglicemiilor, testul prezintă o valoare mai mică, dar încă suficientă pentru utilizarea sa curentă (36).

Există mai multe variante ale testului, atât în ceea ce priveşte cantitatea de glucoză folosită, cât şi a frecvenţei determinărilor (la 30 sau la 60 minute) sau perioada de urmărire (între 2 şi 6 ore).

Cantitatea de glucoză: în prezent, conform recomandărilor OMS, se folosesc 75 g glucoză anhidră pulvis, dizolvată în 250-300 ml apă, eventual aromatizată. La copii se utilizează o doză de 1,75 g/Kg corp nedepăşind însă 75 g (24).

Frecvenţa determinărilor: criteriile OMS de încadrare a unui bolnav se referă la analiza valorilor la timpul zero şi la 2 h (eventual şi la l h).

Durata testului: pentru diagnosticul de diabet, durata de 2 ore este suficientă, fiind în acelaşi

3

timp aplicabilă pe scară largă în scop de depistare activă a bolii. Pentru diagnosticul hipoglicemiei reactive însă, se recomandă un test oral de toleranţă la glucoza prelungit, la 3, 4 sau 5 ore. El va fi descris separat (22).

Factori de variaţie: există numeroşi factori care pot influenţa în mod semnificativ valoarea hiperglicemiei provocate orale. Dintre aceştia menţionăm:

1. Dieta: în absenţa unui aport glucidic adecvat, valorile glicemice în cursul testului pot prezenta cifre anormale. Astfel, o carenţă glucidică în zilele ce preced determinarea, induc valori crescute („diabetul de foame”). Deşi cantitatea de glucide necesară evitării alterării toleranţei la glucoza prin înfometare este de ~ 100 g/zi, se recomandă ca, în cele trei zile ce preced testul, aportul glucidic să fie de 200-300 g/zi (4).

2. Efortul fizic: inactivitatea fizică poate scădea toleranţa la glucoză. Problema este importantă la vârstnici. Acelaşi efect îl are statul prelungit în pat.

3. Bolile cronice: se însoţesc adeseori de valori crescute ale glicemiilor în cursul testului. Frecvenţa acestora este mai mare în afecţiunile hepatice, şi se datorează numai în parte dietelor carenţate şi inactivităţii fizice.

4. Medicaţia: numeroase medicamante au o influenţă marcată asupra valorilor glicemice, pe care de cele mai multe ori le cresc (tabelul 1). Dintre cele mai frecvente medicamente utilizate, cu efect hiperglicemiant, menţionăm: diureticele (in special tiazidicele), datorită depleţiei potasice; glucocorticosteroizii (prin acţiunea lor antiinsulinică); estrogenii de sinteză; difenilhidantoina (printr-un efect de inhibiţie a celulelor β- pancreatice) (30).

Ingestia cronică de salicilaţi şi de inhibitori ai monoaminooxidazei (în special derivaţii de hidrazină) se însoţesc uneori de hipoglicemie. Pentru multe din medicamentele menţionate (în special pentru corticosteroizi, estrogeni de sinteză şi salicilaţi), tulburarea toleranţei la glucoză este de durată, normalizarea înregistrându-se după săptămâni sau chiar luni de la întreruperea lor (31).

Tabelul 1. Medicamentele şi agenţii chimici care influenţează toleranţa la glucoză

Diureticele şi agenţii antihipertensivi Catecolaminele şi agenţi activi neurologic

-Clortalidona -Adrenalina-Clonidina -Izoproterenolul-Diazoxidul -Levodopa-Furosemidul -Noradrenalina-Tiazidicele -Fenitoinul

Agenţi activi hormonali Agenţii analgezici, antipiretici şi antiinflamatori

-Corticotropina-Dextrotiroxina Agenţii neoplastici-Glucagonul -Aloxanul-Glucocorticosteroizii -L-asparaginaza-Contraceptivele orale -Streptozotocinul-Somatotropinul-Hormonii tiroidieni Diferite

Agenţii psihoactivi -Izoniazida-Clorpotinexul -Acidul nicotinic -Haloperidolul-Carbonatul de litiu-Fenotiazinicele-Antidepresivele triciclice

5. Vârsta: Glicemia à jeun creşte nesemnificativ cu cca 1 mg/ dl/ decadă de vârstă. După încărcarea cu glucoză, creşterea glicemică la l h sporeşte per decadă de vârstă cu ~ 10 mg/dl (între 4 şi 14 mg/dl); valoarea la două ore creşte cu ~ 50 mg/dl (între 1 şi 11 mg/dl) (45). Distribuţia

4

concentraţiei glucozei după o încărcare orală pare a fi unimodală. Aceasta susţine ideea că printre vârstnici nu există două populaţii separate de persoane, una normală şi alta diabetică. Cauza deteriorării cu vârsta a toleranţei la glucoză este complexă. Dintre factorii implicaţi menţionăm: dietele carenţate, hipoactivitatea fizică, scăderea masei active (în special musculare) care stochează o parte din glucide, alterarea secreţiei de insulină, creşterea concentraţiei antagoniştilor insulinici. Seltzer arată că la vârstnicii cu diete carenţate şi activitate fizică scăzută, testul oral are valori patologice în 53% din cazuri; în condiţii de dietă carenţată, dar cu creşterea activităţii fizice, procentul scade la 33%; în fine, când atât dieta, cât şi activitatea fizică sunt „optimizate”, testul rămâne anormal în numai 17% din cazuri.

6. Sarcina: în sarcină, homeostazia glicemică este modificată de doi factori cu acţiune opusă. O tendinţă la hiperglicemie se înregistrează în cursul unei încărcări orale cu glucoză, datorită antagonismului insulinic exercitat de hormonii placentari (lactogenul placentar şi somato-mamotropina corionică). O tendinţă la hipoglicemie, se înregistrează datorită creşterii cerinţelor de glucoză pentru dezvoltarea fătului. Valorile „normale” ale glicemiilor la femeile însărcinate, în sângele venos vor fi: à jeun, sub 90. mg/dl; la l h, sub 170 mg/dl; la 2 h, sub 145 mg/dl; la 3 h, sub 125 mg/dl (33, 48).

Testul de toleranţă orală la glucoză se va efectua în săptămânile 24-28 pentru gravidele cu risc la limită pentru a dezvolta un diabet gestaţional. Testarea va fi efectuată imediat (glicemiei à jeun, apoi test de heredocolaterale de diabet gestaţional, sau cu încărcare cu 100g glucoză) pentru gravidele cu risc crescut, înţelegând prin aceasta obezele, cele cu antecedente patologice personale de diabet gestaţional în cursul unei sarcini anterioare. Determinările se vor face după un post alimentar de 8-14 ore pe o dietă de peste 150g hidraţi de carbon pe zi.

Variabilitatea testului oral de toleranţă la glucoză În mod obişnuit, creşterile glicemice maximale în cursul testului se înregistrează între 30 şi

60 min. (ceva mai târziu la diabetici), scăzând apoi către valoarea de pornire sau puţin sub ea. Dacă determinările se prelungesc peste 2 h, la determinările frecvente (de exemplu, din 10 în 10 min.), curbele „normale” sunt variabile. Ele fac parte din oscilaţiile de mică amplitudine ce apar postprandial (fig.1). După cum se observă, atât valorile la l h, cât şi la 2 h sunt diferite în cazuri diferite; în plus, valorile maxime par a se situa în apropiere de 45 min (4). Stabilizarea glicemiilor nu se înregistrează înainte de 3-4 ore.

Fig.1.Variante de normal ale testului oral de încărcare la glucoză

Oscilaţiile glicemice din decursul hiperglicemiei provocate se datorează în principal următorilor doi factori: în primul rând secreţiei intermitente a insulinei, datorate unui senzor existent în celula β-pancreatică şi care explică oscilaţiile glicemice înregistrate paralel; în al doilea rând,

5

ritmul de absorbţie al glucozei, mai rapid în prima fază (când concentraţia ei intestinală este mare) şi mai lent apoi. Rezultă în final o scădere fluctuantă a glicemiei şi a insulinemiei. Deşi fluctuaţiile glicemice şi insulinemice diferă de la persoană la persoană, valorile înregistrate pe parcursul testului nu depăşesc anumite limite (160 mg/dl pentru glucoză, 75 μU/ml pentru insulină), având o tendinţă de stabilizare în 3-4 ore (30).

Reproductibilitatea testului hiperglicemiei provocateReproductibilitatea testului de toleranţă la glucoză la 48 de ore interval, evidenţiază o

variabilitate marcată. Atât glicemia à jeun (într-o măsură mai mică), cât şi cea înregistrată la 1 h şi 2 h prezintă o diferenţă care oscilează între 10% şi 30% faţă de primul test. Variabilitatea este mai mare la persoanele cu alterarea toleranţei la glucoză. Există o variabilitate diurnă a valorilor glicemice, care sunt mai mari la un test efectuat după amiază faţă de cel efectuat în cursul dimineţii. Diferenţa a fost explicată prin ritmul diferit de secreţie al hormonilor de contrareglare în raport cu secreţia de insulină.

Interpretarea testului oral de toleranţă la glucozăTestul se efectuează numai la persoanele la care glicemia à jeun este sub 126 mg/dl dar peste

110 mg/dl (45).Capacitatea unui individ de a răspunde normal la o încărcare glucidică depinde în primul

rând posibilitatea celulelor beta pancreatice de a produce şi a elibera insulina proporţional cu creşterea glicemică indusă. În al doi lea rând, depinde de sensibilitatea ţesuturilor periferice (în special a celulelor hepatice, musculare şi adipoase) la acţiunea insulinei. Pentru încadrarea unui adult într-o anumită categorie de toleranţă glucidică, în raport cu valorile glicemice preprandiale şi la 2 ore de la ingestia a 75 g glucoză, există trei posibilităţi:

-valorile glicemice în plasma venoasă sub 110 mg/dl à jeun şi sub 140 mg/dl la 2 ore reprezintă parametrii normali;

-valorile glicemice à jeun peste 126 mg/dl şi/sau peste 200 mg/dl la 2 ore indică diabet clinic manifest;

-o glicemie à jeun sub 110 mg/dl, dar cu o valoare a glicemiei la 2 h între 140 şi 200 mg/dl, defineşte categoria denumită „toleranţă alterată la glucoză” (IGT - Impaired Glucose Tolerance). Ea se suprapune în mare parte cu vechiul termen de „diabet chimic”. Acest termen sugera mai bine caracterul evolutiv al intoleranţei la glucoză, chiar dacă nu totdeauna un diabet chimic evoluează către diabet clinic manifest. Într-un studiu efectuat de noi, din 507 cazuri de diabet chimic reîncadrate conform criteriilor OMS în categoria IGT, după o perioadă de urmărire în medie de 5,2 ani, în aproximativ o treime din cazuri intoleranţa glicemică s-a agravat, trecând deja în categoria diabetului clinic manifest. Această grupă de bolnavi s-a recrutat în special din cazurile care nu au respectat indicaţiile terapeutice de ordin dietetic, aşa cum rezultă din faptul că nu au scăzut în greutate. Dimpotrivă, în cele o treime din cazuri, în care valorile glicemice la cel de al doilea test s-au normalizat, în majoritate au făcut parte din cei care au respectat indicaţiile terapeutice. Aceste date sugerează că în formele minore de intoleranţă la glucoză, tulburările pot fi reversibile prin măsuri de ordin dietetic şi prin creşterea gradului de activitate fizică (25). Prezenţa IGT pare a fi un predictor mai bun al evoluţiei toleranţei la glucoză către diabet, comparativ cu IFG. Din punct de vedere fiziopatologic IGT ar sugera existenţa unei insulinorezistenţe periferice crescute (40).

Scăderea toleranţei orale la glucoză poate fi întâlnită în afecţiuni precum: hipertiroidie, hiperlipidemie (dislipidemie) tip III, IV, sau V, hemocromatoză, boală Cushing, feocromocitom, afecţiuni hepatice severe, sau intervenţii chirurgicale pe tractul gastrointestinal (gastrectomie, gastroenterostomă). În aceste cazuri se poate practica testul i.v. de toleranţă la glucoză. Creşterea toleranţei la testul oral de încărcare cu glucoză (cu tendinţa la hipoglicemie) poate să apară în tumori pancreatice, afecţiuni gastrointestinale cu deficit de absorbţie (steatoree, sprue celiac, boală celiacă), hipotiroidism, boală Addison, hipoparatiroidism sau hipopituitarism (45).

1.3. Testul oral de toleranţă la glucoză prelungit Pentru urmărirea ripostei pancreatice şi pentru diagnosticul de hipoglicemie se foloseşte, de

regulă, testul oral de toleranţă la glucoză prelungit timp de 3, 4 sau 5 ore. Într-adevăr, analizând un număr mare de teste de toleranţă la glucoză administrată oral, se constată o valoare minimă a glicemiei plasată la 180 min. în mai mult de jumătate din cazuri, foarte puţine prezentând scăderea maximă la

6

300 min. (30).Deşi limita superioară a glicemiilor care definesc diagnosticul diabet sau IGT sunt

standardizate şi respectate (chiar dacă nu totdeauna considerate ca potrivite), valorile minime „fiziologice” înregistrate în cursul acestui test nu au fost încă definite. Pentru acest motiv, mulţi autori consideră hiperglicemia provocată orală ca fiind un test cu valoare limitată în diagnosticul hipoglicemiei. Această limitare mai decurge şi din faptul că stimularea cu 100 g glucoză este nefiziologică, depăşind cantităţile de glucide existente într-un prânz obişnuit. Mai mult, rareori se poate înregistra un aport de glucide simple depăşind 30-40 g/masă, fapt care explică neconcordanţa dintre valoarea minimă glicemică înregistrată postprandial, comparativ cu cea înregistrată în cursul testului oral de toleranţă la glucoză (30).

O curbă „plată” a hiperglicemiei provocate se defineşte prin valoarea maximă glicemică înregistrată < 130 mg/dl (după unii < 140 mg/dl).Nu sunt puţine cazurile în care nici una din valorile glicemice din cursul testului de încărcare nu depăşesc 100 mg/dl. Curbele plate au fost considerate ca exprimând un hiperinsulinism, care în perspectivă ar putea duce la un diabet zaharat de tip 2. În fapt, o valoare glicemică mică indică o funcţie β-celulară normală şi o bună sensibilitate periferică la insulină (4).

Dacă investigarea este efectuată pentru diagnosticarea unei presupuse hipoglicemii organice, bolnavul va fi supravegheat continuu, notându-se semnele şi simptomele care survin, precum şi momentul instalării lor. Dacă semnele clinice caracteristice neuroglicopeniei sunt marcate sau în iminenţa pierderii stării de conştienţă, se va efectua ultima prelevare de sânge, după care testul va fi întrerupt.

În practică, la un pacient supus testului pentru confirmarea sau excluderea diagnosticului de hipoglicemie funcţională sugerată pe baza simptomelor clinice, interpretarea valorilor acestui test se va face în felul următor:

-diagnosticul poate fi susţinut atunci când valoarea glicemică scade sub 40 mg/dl şi se însoţeşte de apariţia semnelor clinice de neuroglicopenie. O creştere concomitentă a cortizonului plasmatic peste 275 μMol/l şi a STH peste 10 μg/l constituie un argument suplimentar (deşi nu absolut) util;

-diagnosticul de hipoglicemie devine îndoielnic atunci când o valoare glicemică sub 40 mg/dl nu se însoţeşte de semne clinice de neuroglicopenie. Dacă valoarea este înregistrată accidental, în cursul unei probe efectuate la persoane aparent sănătoase, ea nu justifică includerea persoanei în categoria pacienţilor cu „hipoglicemie asimptomatică” – aşa cum suntem îndreptăţiţi să includem un pacient cu intoleranţă la glucoza, când valorile glicemice sunt crescute, fără manifestări clinice caracteristice (4);

-diagnosticul poate fi exclus când semnele clinice sugestive de neuroglicopenie nu se însoţesc de o scădere a glicemiei sub 50 mg/dl;

-hipoglicemia (glicemie sub 40 mg/dl) apărută în cursul testului şi însoţită de simptomele clinice de neuroglicopenie, se poate întâlni şi în hipoglicemiile organice (insulinom sau endocrinopatii), mai ales dacă în cursul probei se instalează pierderea stării de conştientă;

-o curbă plată a hiperglicemiei provocată oral, fără a atinge valorile minime de 40-50 mg/dl, nu constituie un argument pentru diagnosticul de hipoglicemie funcţională, acest aspect fiind întâlnit cel mai adesea la persoanele sănătoase (30);

-trebuie ţinut seama de variabilitatea mare a valorilor glicemice la repetarea acestui test, variabilitate care poate ţine de condiţii diferite (în special de ordin alimentar sau de grad de activitate fizică), dar şi de factori endogeni greu de controlat (stare psihică, răspunsul hormonilor de contrareglare etc.);

-mai informativă decât un test oral prelungit de toleranţă la glucoză, este obţinerea în cursul zilei a unei valori glicemice sub 40 mg/dl pe o probă recoltată în prezenţa simpţomelor caracteristice de neuroglicopenie (30).

1.4. Testul prânzului standard Urmărirea răspunsului glicemic şi insulinemic după ingestia unui prânz standard a fost

considerat ca o metodă diagnostică mai potrivită pentru identificarea cazurilor cu hipoglicemie reactivă, datorită caracterului său „fiziologic” (12).

Din păcate, până în prezent nu există un consens sau o standardizare a compoziţiei prânzului

7

de testare şi nici a timpilor de recoltare a probelor pentru determinarea glicemiei şi insulinemiei. Cei mai mulţi autori consideră că acest test trebuie să conţină aproximativ o treime din raţia calorică zilnică (pentru un adult cu activitate fizică uşoară - cca. 750 Kcal), alcătuită în aşa fel încât să cuprindă 50% glucide complexe, 30% grăsimi şj 20% proteine. În Institutul de Diabet, Nutriţie şi Boli Metabolice “N. Paulescu” din Bucureşti, testul la masă este folosit atât pentru evaluarea răspunsului hiperglicemlc şi insulinemic al bolnavilor cu diabet zaharat de tip 2, cât şi al urmăririi scăderilor glicemice postprandiale. Prânzul standard este alcătuit din:

50 g pâine l măr de 150 g sau 2 roşii mari (200g) l ou fiert.....50 ml lapte sau iaurt. Acest prânz conţine ~ 500 Kcal.La bolnavii diabetici, interpretarea testului (glicemie şi insulinemie à jeun, apoi la o oră şi la

două ore de la terminarea consumării alimentelor) este următoarea:- bolnavul este considerat bine echilibrat, dacă glicemia postprandială nu depăşeşte 150

mg/dl;- un echilibru „mediocru”, când glicemia postprandială se înscrie între 150-200 mg/dl;- un echilibru „prost”, când glicemia postprandială depăşeşte 200 mg/dl.În raport cu valorile obţinute, se ajustează tratamentul oral (creşterea dozei de biguanide sau

sulfamide) sau se trece la tratamentul insulinic. Acesta din urmă trebuie avut în vedere ori de câte ori o creştere glicemică mare în cursul testului se asociază cu un răspuns insulinemic mic.

La bolnavii suspecţi de hipoglicemii funcţionale, testul prânzului standard trebuie prelungit, recoltările pentru glicemie şi insulinemie făcându-se din oră în oră, timp de 3, 4 sau chiar 5 ore. Sunt luate în consideraţie valorile glicemice care scad sub 50 mg/dl şi valorile insulinemice care depăşesc 80-100 μU/ml. Din păcate, valoarea insulinemiei înregistrată postprandial este destul de variabilă şi nu totdeauna concordantă cu valoarea glicemică. Alături de insulinemiile postprandiale crescute (care depăşesc de 5 ori valoarea bazală) la bolnavii cu glicemii scăzute, acestea din urmă se pot întâlni uneori şi în cazurile în care răspunsul insulinemic este mic (de exemplu, numai de 3 ori sau chiar numai de 2 ori valoarea bazală). Devine evident că răspunsul insulinemic este numai unul din elementele care determină evoluţia valorilor glicemice postprandiale, alături de hormonii de contrareglare, mult mai dificil de determinat în practica curentă (12).

Unul din dezavantajele majore ale prânzului standard constă în aceea că nu mimează totdeauna compoziţia dietei consumate în mod obişnuit la micul dejun, care este variabilă de la bolnav la bolnav. Mai mult, răspunsul hipoglicemic simptomatic acuzat de pacient apare mai frecvent şi mai puternic după consumul unor anumite alimente, în special a celor bogate în glucide simple. Acest tip de consum, chiar dacă nu este indicat din punct de vedere nutriţional, face parte din realitatea vieţii de zi cu zi, motiv pentru care trebuie luat în consideraţie (24).

O problemă importantă pentru stabilirea valorii diagnostice a unui prânz standard este variabilitatea de la o zi la alta a răspunsului glicemic şi insulinemic, la un prânz identic (24).

1.5. Testul i.v. de toleranţă la glucozăBazele teoreticeHomeostazia glicemică este asigurată prin mecanisme fizico-chimice şi hormonale cu o

acţiune temporală bine definită. În condiţii obişnuite, glicemia nu depăşeşte 150 mg/dl şi nu scade sub 50 mg/dl. Variaţia diurnă se înscrie deci în limita de 100 mg/dl, indiferent de starea de moment (postprandial sau după o pauză alimentară).

În condiţii patologice, creşterile glicemice postprandiale pot fi prea rapide (de exemplu, după o rezectie gastrică) sau, dimpotrivă, prea întârziate (de exemplu. în sindromul de malabsorbţie).

Preluarea hepatică a glucozei din circulaţie cu întârziere, ori utilizarea ei scăzută în ţesuturile periferice, stau la baza hiperglicemiei care caracterizează diabetul zaharat. Dimpotrivă, o utilizare crescută a glucozei (ca în hipertiroidism sau în secreţia excesivă de insulină) pot. duce la scăderea glucozei sanguine într- un ritm mai crescut decât cel obişnuit (24).

Testul i.v. de toleranţă la glucoză a fost folosit atât pentru diagnosticul stadiilor precoce ale diabetului zaharat, cât şi al hipoglicemiei (12, 29). Utilitatea sa pentru diagnosticul hipoglicemiei este însă minimă, şi nu justifică folosirea lui curentă. Chiar pentru diagnosticul de alterare a toleranţei la

8

glucoză, informaţiile par că nu depăşesc pe cele ale testului oral de toleranţă la glucoză. Utilitatea lui este evidentă numai în trei situaţii: 1) când absorbţia intestinală a glucozei este crescută (rezecţie gastrică, hipertiroidism), 2) când absorbţia intestinală a glucozei este scăzută (sindrom de malabsorbţie, hipotiroidism), 3) când individul nu poate ingera glucoza pentru efectuarea testului oral.

Sunt autori care consideră că o creştere bruscă a glucozei sanguine la administrarea i.v., care este mai mare şi mai rapidă decât cea înregistrată după administrarea ei orală, chiar dacă este nefiziologică, ar putea evidenţia mai bine un defect în dinamica secretorie β-celulară, caracteristică diabetului zaharat de tip 2 (30).

Limitele testului toleranţei i.v. la glucoză ţine de doi factori:-ocolind calea digestivă de absorbţie a glucozei, testul este într-o oarecare măsură

nefiziologic. Se ştie în prezent că stimularea postprandială a secreţiei de insulină şi de glucagon prezintă şi o componentă umorală entero-insulară;

-testul este destul de laborios presupunând recoltări glicemice multiple, la intervale precise. În general, este greu acceptat de pacient.

TehnicăTestul i.v. de toleranţă la glucoză (numit uneori şi „viteza de metabolizare a glucozei") are

multe variante, care dau însă aceeaşi valoare a constantei K (scăderea glicemiei în %). Vom indica tehnica cea mai utilizată:

-se cateterizează o venă antebranhială cu un ac cu mandren, în vederea prelevării probelor de sânge pentru determinarea glicemiei (eventual şi a insulinemiei, care nu intră totuşi în testul standard).

-în vena antecubitală opusă se introduce rapid (în 1-4 minute) o soluţie concentrată de glucoză (25%, 33% sau 50%) pentru a realiza doza de 0,5 g/kg corp. Unii autori introduc o cantitate standard de 25 g glucoză, indiferent de greutatea individului.

-după terminarea injectării glucozei se recoltează sânge din vena opusă, la intervale de 10 minute, timp de 60 de minute (în total 6 determinări). Unii autori pornesc cu recoltarea de la 20 minute, efectuând numai 5 determinări.

Calcul şi interpretarePe baza timpului de înjumătăţire (t1/2) al glucozei (de exemplu, timpul în minute necesar

scăderii glucozei sanguine de la 300 mg/dl la 150 mg/dl) (fig.2) se calculează, pe hârtie semilogaritmică, scăderea în procente a glucozei sanguine, cunoscută ca indicele sau constanta K (fig.3.).

9

Fig.3. Metodă grafică de determinare a timpului de înjumătăţire a glucozei sanguine

K(% scădere glicemică/minut)=0,69/t1/2 x100

Constanta K (coeficientul de asimilare a glucozei de către ţesuturi), exprimă rapiditatea şi mărimea răspunsului insulinemic iniţial la creşterea indusă a glicemiei, precum şi sensibilitatea ţesuturilor periferice la acţiunea insulinei (20).

În mod normal coeficientul de utilizare a glucozei (constanta K) se situează între 1,5 şi 3. Valorile între 1,5 şi 1 sunt neconcludente. Tulburarea toleranţei la glucoză se caracterizează printr-un indice subunitar. Un indice K mai mare decât 3 (dar mai mic decât 5) se poate întâlni la persoanele tinere, active; valori deosebit de ridicate (până la 7) au fost raportate în nesidioblastoză. În hipoglicemiile organice şi funcţionale se aşteaptă o valoare crescută a constantei K care nu se înregistrează decât rareori. De regulă, valoarea sa este normală. Răspunsul insulinemic precoce însă, este de regulă mai mic (20). Se poate trage concluzia că testul intravenos la glucoză are o valoare extrem de limitată pentru diagnosticul hipoglicemiilor, fiind indicat numai în unele circumstanţe.

1 6. Tehnica modernă a testului i.v. de toleranţă la glucozăÎn ultimii ani, testul i.v. de toleranţă la glucoză a suferit modificări importante, încercând să

surprindă cele două faze, „precoce” şi „tardivă”, ale răspunsului insulinic la stimularea suprafiziologică cu glucoză. Ceea ce contează mai mult aici nu este valoarea glicemică, ci răspunsul insulinic, care trebuie monitorizat la intervale foarte scurte, în primele 10 minute ale testului în care se înregistrează „faza precoce” (30). Întrucât în unele forme de DZ de tip 2 proporţia de pro-insulină faţă de insulină creşte în mod substanţial, diferenţierea acestora prin tehnicile imunologice moderne poate fi deosebit de utilă, dar din păcate inaccesibilă investigaţiilor curente (43, 61).

În tabelul 2, redăm elementele esenţiale ale testului i.v. la glucoză.

Tabelul 2. Protocolul testului i.v. de toleranţă la glucoza*

Respectarea a cel puţin 3 zile de dietă normoglucidică şi de activitate fizică normală; Postul anterior de cel puţin 10 ore, dar nu mai mult de 16 ore. În această perioadă,

pacientul se poate hidrata, dar nu trebuie să fumeze; Începerea testului între orele 8-10 dimineaţă. Doza de glucoza 0,5g/kg corp, la

maximum 30g; Concentraţia soluţiei de glucoza de 25%; Diluantul glucozei va fi serul fiziologic; Injectarea se face fie cu seringa manuală, fie cu pompă programabilă;

10

Durata injectării: 3 min ±15 sec; Sfârşitul injectării este considerat timpul 0; Numărul minim de probe: 2 bazale, apoi la l, 3, 5 şi 10 min; Prelevările prin canula lăsată în vena de la antebraţ, care va fi spălată cu ser fiziologic

după injectarea glucozei.

* Testul i.v de toleranţă la glucoză are un coeficient de variabilitate de circa 30% (20).1.7. Testul intravenos cu tolbutamid Acest test a fost multă vreme considerat ca esenţial pentru diferenţierea între o hipoglicemie

organică (insulinom) şi una funcţională (reactivă). Rezultatele fals-pozitive şi fals-negative, precum şi pericolul inducerii unei hipoglicemii severe, i-au limitat mult din importanţă.

Tehnica testului este următoarea: pacientului, aflat în clinostatism după postul de noapte, i se recoltează două glicemii „bazale”, la interval de 15 min. Între cele două determinări pacientul este ţinut pe o perfuzie cu ser fiziologic. Dacă una sau ambele glicemii (determinate rapid) sunt sub 50 mg/dl, testul nu va fi efectuat. Dacă glicemiile bazale depăşesc această valoare, se va injecta i.v. la 2-3 min., l g tolbutamid în soluţie 5%. La copil, doza va fi 30 mg/kg corp, până la maximum l g. Se recoltează apoi sânge pentru determinarea glicemiei şi insulinemiei (eventual şi pentru alţi hormoni) la momentele următoare: 5, 10, 20, 30, 60, 90, 120 şi 180 min. Unii autori reduc recoltările numai la 5, 10, 20, 30 şi 40 min (11).

În cursul testului pot apărea semne uşoare de neuroglicopenie. Dacă acestea devin mai profunde, afectând starea de conştienţă, testul va fi întrerupt, iar perfuzia continuată cu glucoză 20%. În cazurile mai severe, asocierea la perfuzie a hemisuccinatului de hidrocortizon se dovedeşte utilă.

Tipic, în insulinom, glicemia scade cu mai mult de 70% faţă de valoarea de bază, iar insulinemia plasmatică creşte la valori depăşind 100-150 mU/l în primele 5-10 min. Valorile glicemice scăzute persistă cel puţin 3 ore de la începerea probei.

În hipoglicemiile funcţionale, scăderile glicemice sunt, de regulă, mai mari cu 50% fată. de valoarea de bază, însă fără a depuşi 70%; valorile glicemice revin la normal după 90 minute. Insulinemiie sunt crescute, dar rareori depăşesc 100mU/l. În diabet zaharat răspunsul este scăzut (40). Există numeroase rezultate fals-pozitive şi fals-negative, precum şi o posibilă discordanţă între scăderile glicemice (uneori marcate) şi creşterile insulinemice (uneori disproporţionat de mici) - ca de exemplu în nesidioblastoză - ori dimpotrivă, creşteri insulinemice importante fără scăderi glicemice paralele - ca în bolile hepatice.

1.8. Testul la glucagon Glucagonul este un hormon hiperglicemiant şi glicogenolitic. Pentru acest motiv,

administrarea sa poate fi făcută pentru a aprecia capacitatea insulino-secretorie (indusă de creşterea glicemică) şi/sau funcţia glicogenolitică. Avantajul administrării glucagonului este acela că, spre deosebire de alte teste dinamice, produce o creştere a glicemiei.

Testul constă în administrarea a l mg glucagon i.v. (sau 30 μg/kg corp la copilul mic) în 2-3 min. Sângele se recoltează înainte de administrarea glucagonului, apoi la fiecare 5 min. după administrarea lui, timp de 30 min. Se determină glicemia, insulinemia şi peptidul C (43).

După un post de noapte, glucagonul produce o creştere tranzitorie a insulinemiei cu 30-100 μU/ml, precum şi o creştere a glicemiei cu 25-75 mg/dl. Valorile insulinemiei şi glicemiei revin către valorile bazale în 2-3 ore, rareori cu o scădere sub valoarea bazală (20).

În insulinom se înregistrează de regulă (nu totdeauna) o creştere rapidă şi marcată a insulinemiei (cu peste 150 μU/ml, în primele 10 min.).

Valoarea testului este mult limitată de răspunsul insulinemic exagerat, înregistrat adeseori în stările caracterizate prin insulinorezistenţă, ca de exemplu în: obezitate, acromegalie sau în sindromul Cushing (40, 46, 56, 59).

La pacienţii cu hipoglicemie datorită unei afectări hepatice asociate cu o glicogenoliză defectuoasă, creşterea glicemiei după administrarea glucagonului este mică (sub 15 mg/dl). La pacienţii (de regulă copii) cu glicogenoză de tip I, se înregistrează paralel o creştere marcată a lactatemiei, aceasta din urmă fiind rapid corectată prin administrare de glucoză (2, 24).

1.9. Testul de toleranţă la insulină

11

Prin acest test se apreciază sensibilitatea pacientului la insulina exogenă.Tehnica este următoarea: se recoltează, la interval de 15 min., două probe pentru

determinarea glicemiei şi numai dacă valoarea acestora este peste 50 mg/dl testul va fi continuat. Între cele două determinări, bolnavul este ţinut pe o perfuzie cu ser fiziologic. Se administrează apoi i.v. insulină intr-o doză de 0,1 U/kg corp, până la maximum 10 U. O alternativă este administrarea i.m. de insulină 0,15 U/kg corp, până la maximum 15 U. Se recoltează sânge pentru determinarea glicemiei şi a peptidului C (eventual şi a cortizolului şi STH-lui) la 20, 30, 60, 90, 120 şi 180 min (20, 49, 50).

Răspunsul simpato-adrenergic poate fi măsurat prin înregistrarea continuă a variaţiei relative a rezistenţei electrice cutanate, prin determinarea adrenalinei şi noradrenalinei la 20, 30 şi 60 min. sau prin măsurarea eliminărilor urinare a acestora pe probe colectate timp de 3 ore înaintea testului şi 3 ore după. (20).

În timpul probei, bolnavul va fi supravegheat permanent pentru surprinderea şi înregistrarea semnelor de neuroglicopenie. Dacă acestea riscă să ducă la pierderea stării de conştienţă, testul va fi întrerupt şi continuat cu o perfuzie de glucoză hipertonă, eventual adăugându-se hemisuccinat de hidrocortizon (34, 43).

În mod obişnuit, la persoanele sănătoase se înregistrează simptome caracteristice de neuroglicopenie care încep la 20-30 min. după injectarea insulinei şi care durează 10-30 min. Dacă glicemia scade sub 40 mg/dl, cortizolul plasmatic creşte cu cel puţin 275 mmol/l, iar STH-ul cu 10 μg/l, indicând o funcţie hipotalamo-hipofizară normală. În următoarele trei ore glicemia trebuie să revină la cel puţin 80% faţă de valoarea de bază, peptidul C trebuie să scadă sub 1,5 μg/l, iar catecolaminele urinare să crească cu cel puţin 400% (34, 56, 58).

Pacienţii cu hipoglicemie à jeun în special cei cu hiperinsulinism, tumori nepancreatice sau endocrinopatii (insuficienţă adrenocorticosuprarenală, hipotiroidie, hipopituitarism) prezintă o sensibililate crescută la insulină şi o lipsă de răspuns hiperglicemic corector, cu valori glicemice rămânând sub 40 mg/dl, ori sub 70% din valoarea à jeun (35, 34, 56, 58).

O rezistenţă crescută la insulină cu scăderi glicemice sub sub 25% din valoarea iniţială se întâlneşte la unele boli hepatice şi în unele endocrinopatii (acromegalie, sindrom Cushing). La pacienţii cu hipoglicemii datorate hipopituitarismului, scăderea glicemică nu este urmată de o creştere a STH-ului, iar la cei cu insuficienţă cortico-suprarenală, de o creştere a cortizonului (40).

Elementul esenţial al testului rezultă din interpretarea valorilor peptidului C: la normali şi în hipoglicemiile funcţionale, când glicemiile scad sub 40 mg/dl, peptidul C scade şi el sub 1,5 μg/l. La pacienţii cu insulinom, datorită autonomiei secretorii a ţesutului tumoral care continuă să secrete, peptidul C nu scade sub 1,5 μg/l. Deci, unele excepţii nu sunt excluse. Acest element constituie un puternic sprijin pentru diagnosticul de insulinom.

Un test fals-pozitiv (peptidul C nu scade sub 1,5 μg/l) se poate datora unei scăderi prea mici a glicemiei, care rămâne peste 40 mg/dl.

Un test fals-negativ (peptidul C scade sub 1,5 μg/l) se poate înregistra la pacienţii a căror tumoră secretă în special proinsulină sau la pacienţii cu tumori parţial supresibile (49).

În perioada anterioară determinării peptidului C, caracterul nesupresibil al secreţiei endogene de insulină era testat prin administrarea în scop de obţinere a hipoglicemiei a insulinei de peşte, care nu interferă cu determinarea insulinemiei plasmatice (40).

1.10. Insulina plasmatică Este oarecum surprinzător faptul că deşi insulina (8)a fost primul hormon peptidic determinat

încă din 1958 de către Yallow, determinarea ei nu a ajuns încă o investigaţie de rutină, datorită mai multor factori:

- există mai multe metode de determinare a insulinei plasmatice cu specificităţi şi sensibilităţi diferite. Valorile obţinute cu unele sau cu altele dintre ele nu sunt superpozabile (31).

- titrurile care dozează sub termenul de insulină atât insulina cât şi proinsulina a creat multă confuzie în privinţa termenului de hiperinsulinism. Dacă proinsulina (care are o slabă activitate insulinică, echivalând cu 5% din ea) creşte ca proporţie în sânge (de la 15% la 30% sau chiar 50% din insulina imunoreactivă) atunci hiperinsulinismul sugerat este de fapt un hipoinsulinism patent. Evident, interpretarea fiziopatologică şi etiopatogenică a diabetului este total diferită în cele două situaţii (25). Determinarea insulinei plasmatice ocupă deci un loc important în studiul factorilor patogenici ai diabetului zaharat (deficitul insulinosecretor şi insulinorezistenţa periferică) precum şi în

12

diagnosticul etiopatogenetic al hipoglicemiilor (31). Cele mai importante cauze de hipoglicemie se datoresc hiperinsulinismului, fie endogen (insulinom, nesidioblastoză, unele hipoglicemii funcţionale, supradozări de sulfonil-ureice), fie exogen (administrarea terapeutică de insulină exogenă). Determinarea insulinei plasmatice este radioimunologică (RIA: radio immune assay; IRI: immuno reactive insulin).Ea prezintă dezavantajul că antiserul folosit pentru dozare dă o reacţie încrucişată cu proinsulină. Pentru acest motiv, valoarea determinată a insulinemiei trebuie interpretată în lumina datelor care arată că în unele cazuri şi în mod deosebit în insulinoame, componenta proinsulinică plasmatică poate fi importantă, ajungând sau depăşind 50% din valoarea RIA. Întrucât proinsulina are o acţiune hipoglicemiantă mult mai mică decât cea a insulinei, poate fi explicată lipsa de corelaţie între IRI şi valoarea glicemică întâlnită uneori. Din acest punct de vedere, termenul IRI pare mai corect decât cel de insulinemie plasmatică.

Tehnica RIA mai prezintă un dezavantaj major, şi anume acela, că la persoanele insulinotratate, la care există anticorpi antiinsulinici, valorile determinate sunt mult mai mari decât cele reale, datorită dozării paralele şi a insulinei legate de anticorpi, care este o insulina temporar inactivă.

Tehnicile moderne de determinare permit măsurarea „insulinei libere” (nelegată de proteine), care este fracţia sa activă. În fine, în prezent există chituri de determinare separată a insulinei şi a proinsulinei. Insulinemia determinată prin aceste metode specifice indică valori ceva mai mari (cu 15%) faţă de metoda RIA (care include determinarea atât a insulinei cât şi a proinsulinei) (25).

Valoarea normală a insulinei plasmatice à jeun, la pacienţii nediabetici sau la persoanele normoponderale nediabetice, variază între 10 şi 20 μU/ml. Acurateţea de determinare scade la valori sub 10 μU/ml, datorită unei "legări nespecifice". Determinarea precisă a valorilor în această zonă ar fi importantă pentru interpretarea corectă a unei hipoglicemii, întrucât, în mod normal, scăderile glicemice în cursul unui post prelungit se însoţesc de o scădere paralelă şi a concentraţiei IRI, mergând până la valori nedetectabile (27).

Valoarea insulinei plasmatice trebuie interpretată totdeauna în raport cu cea a glucozei sanguine. În mod normal, insulinemia plasmatică creşte paralel cu creşterea glicemiei peste 100 mg/dl, fiind maximală la o glicemie de cca. 300 mg/dl (fig.4.). Astfel, o insulinemie plasmatică crescută, reprezentând o valoare „normală” la un individ cu glicemie crescută, devine anormală atunci când glicemia se află în limite fiziologice sau este chiar scăzută (36, 38, 44).

Fig.4. Stimularea secreţiei de insulină depinde de concentraţia de glucoză plasmatică, fiind maximală la valori între 300-400 mg/dl

Pentru ca o valoare insulinemică să fie „normală”, ea trebuie să fie „adecvată” valorii glicemice de moment. Unii autori au propus unele formule matematice pentru a extrage informaţii din raportul IRI/glucoză, a căror lipsă de valoare practică le-a împiedicat generalizarea.

În prezent se consideră ca inadecvată o insulinemie plasmatică peste 10 μU/ml la o persoană

13

cu o glicemie à jeun scăzută. Valorile insulinemice mari sunt sugestive pentru hiperinsulinismul endogen. Mai pot fi însă întâlnite în unele cazuri rare, de neoplasme nepancreatice însoţite de hipoglicemie. Pentru a fi siguri de valoarea determinată trebuie exclusă administrarea secretă de insulină, precum şi prezenţa anticorpilor sau autoanticorpilor insulinei (2, 6, 24, 33, 35, 36, 56. 58).

O insulinemie à jeun crescută (de exemplu, 30 sau 40 μU/ml) nu justifică diagnosticul de hiperinsulinism dacă glicemia concomitentă este şi ea crescută. Această situaţie poate fi întâlnită în obezitate, în sindromul Cushing, în acromegalie sau în distrofia lipoatrofică.

Determinarea paralelă a glicemiei şi insulinemiei în cursul testelor dinamice (hiperglicemie provocată orală sau i.v. testul la Rastinon, la glucagon sau la leucină) permite o mai bună interpretare a bazei fiziopatologice a tulburării de glicoreglare, indiferent că ea este de tipul hiperglicemie sau hipoglicemie.

Determinarea insulinemiei este necesară şi recomandată pentru stabilirea diagnosticului cauzal al hipoglicemiei, pentru orientarea atitudinii terapeutice şi pentru evaluarea insulinorezistenţei în sindromul ovarelor polichistice (în vederea ajustării terapiei cu Metformin sau cu Tiazolidindione).

Referitor la determinarea componentei proinsulinice din plasmă (PLC: proinsulin-like component) ea este posibilă, dar necesită o tehnică disponibilă numai în puţine laboratoare. Întrucât în unele insulinoame, în special în cele maligne, secreţia proinsulinică poate fi importantă (depăşind cu mult proporţia normală, care este sub 25% şi de regulă, sub 10%), această distincţie ar putea fi utilă în interpretarea corectă a unor cazuri de hipoglicemie. Chiar dacă tehnic ea nu este posibilă, trebuie totuşi avută în vedere atunci când valoarea IRI se află în dezacord cu valoarea glicemiei.

1.11. Testul stimulării intraarteriale cu calciuAcest test este realizat preoperator la pacienţii la care s-a pus diagnosticul biochimic de

insulinom pentru a localiza procesul tumoral (25).Studiile in vitro au demonstrat că o creştere importantă a concentraţiei extracelulare de calciu

antrenează o creştere rapidă a calciului intracelular, şi în final a secreţiei de insulină din celulele tumorale. Testul constă în injectarea de calciu gluconic în fiecare din arterele gastroduodenală, mezenterică superioară, splenică şi hepatică. Iniţial şi la 3 min. după injectarea de Ca2+ se determină insulinemia în vena hepatică dreaptă. Se consideră pozitiv testul dacă se înregistraează o creştere a insulinemiei de cel puţin două ori faţă de valoarea iniţială. Pozitivarea testului indică existenţa insulinom-ului în teritoriul vascular al arterei utilizate.

Dezavantaje: este o metodă scumpă şi invazivă.

1.12. Determinarea peptidului C plasmatic Desfacerea enzimatică a proinsulinei pune în libertate cantităţi echimolare de insulină şi

peptid C. Acesta din urmă a fost izolat şi sintetizat cu două decenii în urmă. Peptidul C rămâne alături de insulină în granulele celulelor β, eliberarea sa făcându-se paralel cu secreţia insulinei. Pentru pregătirea antiserului necesar dozării peptidului C se foloseşte, în general, un peptid C uman cu 31 aminoacizi (37, 49).

Deşi secretate în cantităţi echimolare, concentraţiile plasmatice ale insulinei şi peptidului C nu sunt egale, datorită metabolizării şi eliminării lor diferite. Întrucât peptidul C se elimină mai lent, în special pe cale renală, concentraţia sa plasmatică exprimă mai bine secreţia β-celulară integrată, comparativ cu cea a insulinei (2).

Întrucât peptidul C nu dă o reacţie încrucişată cu anticorpii insulinici, determinarea sa poate fi unul dintre cei mai utili indicatori ai secreţiei β-pancreatice la diabeticii insulino-dependenţi, trataţi cu insulină exogenă. Totuşi, antiserul pentru peptidul C prezintă o reacţie încrucişată cu proinsulina şi componenta de tip proinsulinic, care în unele cazuri de insulinom poate reprezenta o mare parte din secreţia tumorală (45).

Determinarea peptidului C se face în ser. Dacă dozarea se face dincolo de 24 de ore, serul trebuie ţinut la congelator, la -20°C, până în momentul determinării (37).

Valoarea diagnostică a peptidului C este maximă atunci când prelevarea sângelui a avut loc în cursul unui episod hipoglicemic. În prezenţa unei glicemii à jeun sub 50 mg/dl, un peptid C peste 1,5 μg/l poate fi considerat ca patognomonic pentru hiperinsulinism. Valoarea peptidului C este scăzută în hipoglicemiile neînsoţite de hiperinsulinism. O valoare a peptidului C sub 1,0 μg/l face improbabil diagnosticul de hipoglicemie hiperinsulinemică (45).

14

Mai dificilă este interpretarea valorii peptidului C în condiţii de stimulare. Datorită timpului său de înjumătăţire mai lung, comparativ cu cel al glucozei, valoarea sa poate rămâne crescută atunci când concentraţia glucozei a scăzut, aşa cum se întâmplă după ingestia de glucoză. Valori crescute ale peptidului C se întâlnesc în insulinom şi în diabetul zaharat tip 2 (2, 55).

În fine, o valoare mică a peptidului C, în prezenţa unei concentraţii insulinemice mari, este indicatorul fidel al hipoglicemiei induse de insulina exogenă în diabetul zaharat tip 1. Pentru a diferenţia insulinomul de hipoglicemia indusă prin administrare de insulină exogenă se poate calcula raportul insulinemie/peptid C. O valoare sub 1 mmol/l (47, 17 μg/mg) sugerează prezenţa insulinomului, a stimulării secreţiei endogene de insulină prin administrare de sulfonilureice sau a insuficienţei renale cronice. O valoare de peste 1 mmol/l apare în administrarea exogenă de insulină şi în afecţiuni hepatice (ciroza) (2, 5, 53, 55, 58).

Pentru pacienţii cu vârste peste 30 ani se impune o dozare a peptidului C pentru încadrarea diagnostică a diabetului zaharat. O valoare à jeun sub 0,17 mmol/l orientează diagnosticul spre diabetul de tip autoimun; o valoare cuprinsă între 0,17-0,32 mmol/l necesită o dozare suplimentară a anticorpilor GAD (glutamic acid decarboxilaza). Dacă aceştia sunt prezenţi diagnosticul va fi de diabet zaharat tip 1, iar dacă sunt absenţi diagnosticul va fi de diabet zaharat tip 2. O valoare a peptidului C de peste 0,32 mmol/l orientează spre diabet zaharat tip 2 cu insulinorezistenţă (2).

Studii recente arată că valoarea postprandială a peptidului C diferenţiază mai bine cele două tipuri de diabet, comparativ cu valoarea à jeun. Astfel o cifră medie de 0,74 mmol/l este specifică pentru diabetul tip 2 (non-autoimun) în timp ce o medie de 0,30 mmol/l caracterizează diabetul zaharat autoimun. Pentru diabetul de tip 2 insulinotratat s-au obţinut valori bazale şi post stimulare cu glucagon ale peptidului C mai mici comparativ cu diabetul de tip 2 netratat cu insulină (45).

Determinarea peptidului C în laborator este deci utilă clinicianului în aprecierea şi identificarea pacienţilor cu diabet zaharat tip 2 care necesită insulinoterapie.

1.13. Determinarea hemoglobinei glicozilate este importantă nu atât pentru diagnosticarea diabetului zaharat, ci pentru monitorizarea controlului metabolic al pacientului. În funcţie de fracţiunea Hb A1C a hemoglobinei glicate se poate estima cu mare probabilitate valoarea medie a glicemiilor din ultimele 90-120 zile (3, 9, 58, 60), folosind formula: media glicemică=HbA1C x33,3-86. Valoarea normală a HbA1C la persoane sănătoase se situează între 4-6% (în medie 5%). O HbA1C de 6% echivalează cu o medie glicemică de 120 mg/dl. Pentru o estimare rapidă se poate considera că 1 procent de HbA1C peste 6 reprezintă aproximativ 30mg/dl peste valoarea de 120 mg/dl (astfel HbA1C =7% corespunde pentru 150 mg/dl, 8% pentru 180 mg/dl şi 9% pentru 210 mg/dl) (47, 52).

Un control metabolic bun este sugerat de HbA1C sub 7%, un control metabolic satisfăcător pentru valori 7 - 7,5% şi un control nesatisfăcător (precar) peste 7,5%.(45) Asociaţia Diabetologilor Americani recomandă ca ţintă terapeutică o valoare a HbA1C de 7%. Se recomandă revizuirea schemei de tratament sau a dietei la pacienţii cu HbA1C peste 8%. Prin analize prospective s-a demonstrat că după vârsta de 30 de ani se înregistrează o creştere a valorii HbA1C cu 0,1% pe decadă.

Determinarea HbA1C este importantă deoarece valoarea ei sugerează media valorilor glicemice pre sau postprandiale, precum şi a valorilor bazale nocturne. Această analiză nu trebuie să înlocuiască automonitorizarea glicemică, ci să o completeze pentru reflectarea cât mai exactă a profilului glicemic al pacientului (58).

Valorile hemoglobinei glicozilate pot fi crescute în următoarele situaţii:-prezenţa hemoglobinei F (fetale) la gravide sau postpartum, în insuficienţă renală cronică

cu/fără hemodializă, în anemia feriprivă, splenectomie, dislipidemie cu hipertrigliceridemie şi consum excesiv de alcool sau de salicilaţi. Valorile HbA1C pot fi scăzute în: anemia hemolitică, în prezenţa hemoglobinelor anormale (HbS, HbC sau HbD), în sferocitoza congenitală, în hemoragii acute sau cronice oculte precum şi în sarcină (45).

Există câteva metode de determinare a hemoglobinei glicate dintre care menţionăm:-cromatografia, cu răşini schimbătoare de ioni;-metoda calorimetrică, cu acid tiobarbituric;-metoda de separare electroforetică, pe suport de gel-agaroză;-metoda radioimunologică;-mai recent metoda Abbot-iMx, care nu prezintă interferenţe cu serul lipemic sau uremic, cu

alte tipuri de hemoglobină şi nu este afectată de temperatură sau pH. Principiul acestei metode se

15

bazează pe combinarea hemoglobinei glicate cu un agent polianionic, din care rezultă un complex capturat de matricea cationică a fazei solide. Cuantificarea HbA1C se face prin imunofluorescenţă.(52) Corecţia pentru valoarea standardizată a HbA1C se face cu ajutorul formulei: HbA1C = (iMx%Hb + 1,76) / 1,49 (47).

Asociaţia Diabetologilor Americani recomandă efectuarea HbA1C cel puţin de două ori pe an la diabetul zaharat tip 2 şi de 4 ori pe an la cel de tip 1 (45, 47). S-a observat că există o corelaţie directă între calitatea controlului metabolic şi numărul determinărilor HbA1C (7). Măsurarea HbA1C rămâne un indicator major al controlului glicemic şi un predictor al complicaţiilor cronice (32) . Standardizarea metodei de determinare este însă esenţială (3).

1.14. Determinarea fructozaminei ca produs stabil de glicozilare al proteinelor serice poate orienta asupra controlului metabolic pe termen mediu de 7-14 zile („memoria de durată medie”). Valorile normale se situează între 2,0-2,8 mmol/l; între 2,8-3,2 controlul metabolic este considerat bun; între 3,2-3,7 nesatisfăcător, iar peste 3,7 mmol/l dezechilibrul este major. Dozarea fructozaminei este utilă în monitorizarea pacienţilor cu diabet zaharat, valorile sale corelându-se cu cele ale HbA1C, dar nefiind afectate de prezenţa Hb anormale (exemplu HbF). Metoda de determinare este ieftină şi rapidă, ea putând sugera o modificare precoce în metabolismul glucidic. Valorile pot fi modificate în cazul creşterii bilirubinemiei sau albuminei serice. Deasemenea valori neconcordante cu glicemia se pot întâlni în afecţiuni tiroidiene sau în alte boli caracterizate printr-un turn-over crescut. În acest caz, pentru obiectivitatea rezultatelor se va folosi raportul fructoză/albumină ale cărui limite normale sunt cuprinse între 54-86 μmol/g (2).

1.15. Anticorpii anti-insulinici Determinarea anticorpilor anti-insulinici este importantă pentru diagnosticul hipoglicemiilor,

din două puncte de vedere:-prezenţa anticorpilor anti-insulinici (produşi împotriva insulinei exogene) sau a

autoanticorpilor anti-insulinici (produşi împotriva propriei insuline, devenită imunogenă din motive necunoscute) poate explica unele hipoglicemii, prin mecanismele care sunt descrise pe larg în alte capitole;

-un titru de anticorpi insulinici crescuţi, la pacienţii cu hipoglicemie, care neagă administrarea exogenă de insulină, poate sugera sindromul hipoglicemic prin administrare secretă sau nemărturisită de insulină (1).

Întrucât metodele de determinare a insulinei plasmatice utilizează un antiser care reacţionează şi cu anticorpii anti-insulinici, în prezenţa acestora valorile IRI pot fi mult mai mari decât cele reale, sugerând un hiperinsulinism care de fapt nu există.

De mare ajutor pentru interpretarea corectă a valorii IRI la un pacient tratat anterior cu insulină este determinarea paralelă a peptidului C. Acesta exprimă fidel secreţia endogenă de insulina, iar tehnica sa de determinare nu interfera cu prezenţa anticorpilor anti-insulinici (1, 55). Utilizarea metodei de determinare a anticorpilor anticelule insulare cu markeri imuni poate indica o scădere rapidă a funcţiei beta celulare restante la pacienţii cu diabet zaharat tip1 nou depistaţi (6, 33).

Anticorpii antiinsulinemici se determină printr-o metodă radioizotopică, testul fiind interpretat ca pozitiv, pentru o valoare obţinută ce depăşeşte +3 deviaţii standard, limitele situându-se între 80-110 mU/l.

Studii recente au arătat că anticorpii antiinsulinici sunt prezenţi într-un procent de peste 90% la copiii cu diabet zaharat tip 1 cu debut sub vârsta de 5 ani şi de 40% la pacienţii cu diabet debutat după vârsta de 12 ani (1).

Interpretarea corectă a valorii anticorpilor anti-insulinici trebuie să ţină seama de dinamica apariţiei şi dispariţiei lor, adică de farmacocinetica lor. Datele noastre au arătat că titrul acestor anticorpi începe să crească după două-trei săptămâni de la introducerea terapeutică a insulinei, atinge un maximum la cca. o lună şi se menţine cu fluctuaţii pe întregul parcurs al tratamentului insulinic exogen (15). După întreruperea insulinoterapiei, dispariţia anticorpilor necesită o perioadă de timp mai lungă decât apariţia lor (fig.5), concentraţii semnificative putând fi regăsite în unele cazuri şi la 2-3 ani de la ultima injecţie cu insulină exogenă. Această perioadă depăşeşte cu mult pe cea rezultată din timpul de înjumătăţire al proteinelor care reprezintă substratul anticorpilor insulinici. Nu este exclus ca în aceste cazuri menţinerea unei producţii de anticorpi să se datoreze unei antigenicităţi a propriei

16

insuline sau unui defect în mecanismul imunologic al organismului, asemănător cu cel înregistrat la pacienţii prezentând anticorpi la insulină (23). O producţie de anticorpi antiinsulinici se înregistrează şi după folosirea insulinelor umane înalt purificate, în care se presupune că nu există alte cauze de stimulare a producţiei de anticorpi capabili să interfereze cu dozarea anticorpilor antiinsulinici (1).

Fig.5. Dinamica apariţiei şi dispariţiei anticorpilor antiinsulinici la 5 pacienţi trataţi temporar cu insulină

1.16. Caracterizarea receptorilor insulinici La nivel celular, insulina acţionează datorită legării sale de receptorii specifici prezenţi în

membrana celulelor. Acţiunea insulinei va depinde pe de o parte de concentraţia hormonului circulant, iar pe de alta de numărul şi capacitatea de legare, adică de afinitatea receptorilor pentru insulina (10). Unele tulburări atribuite insulinei pot fi induse de modificările structurale sau funcţionale ale receptorilor insulinici. Totuşi, caracterizarea situsurilor de legare insulinică, precum şi aprecierea numărului lor, poate fi făcută prin tehnici laborioase, disponibile numai în scop de cercetare (6, 16).

Teoretic, o creştere a afinităţii receptorilor insulinici pentru hormon ar putea explica unele hipoglicemii „normoinsulinemice”.

În ultima vreme, au fost descrise unele hipoglicemii induse de prezenţa în serul bolnavilor a anticorpilor antireceptori insulari. Mimarea efectelor insulinice în aceste cazuri este dificil de explicat, cu atât mai mult cu cât, de regulă, anticorpii la receptorii insulinici induc o stare hiperglicemică cronică (10, 17).

Metoda de bază pentru determinarea receptorilor insulinici este radioimunodozarea. Celulele sunt incubate cu insulină marcată cu I125 şi apoi separate de insulina liberă din mediu. Indirect, poate fi apreciat procentul total de insulină radioactivă legată de celule. Trebuie avut în vedere că, pe lângă legarea de receptori a insulinei marcate, mai există şi o legare nespecifică, pe componentele celulare de suprafaţă, altele decât receptorii (6, 18).

Determinarea receptorilor poate fi făcută pe monocite, pe hematii, adipocite, hepatocite, fibroblaşti, placentă şi virtual, pe alte tipuri celulare. Rezultatele determinării receptorilor insulinici pe adipocite, monocite şi eritrocite în diferite stări fiziologice şi patologice sunt redate în tabelul 3.

Tabelul 3. Rezultatul studiilor de legare insulinică în diferite stări clinice, după Taylor, 1984 - Date culese din literatură

Adipocite Monocite EritrociteFiziologic

17

Diete bogate în glucide ↓Diete hipocalorice ↑Efort ↑ ↑Sarcină ↓ N NVârstă înaintată ↓, N NAsociate cu diabetInsulinodependent (control mediu) ↓ N NInsulinodependent (control prost) ↑ ↑Insulinodependent (pe diete bogate în fibre) ↓, N - -Tratament cu Glibenclamid ↑ NTratament cu Metformin ↑Copii din mame diabetice ↑, N NAsociate cu diferite afecţiuniObezitateCiroză ↓, N ↓, N ↓Insuficienţă renală cronică N, ↓ N, ↓ ↓Sindrom Cushing N ↓,NAcromegalie NInsulinom ↓Tireotoxicoză ↓ ↓

↑=crescut; ↓=scăzut; N=normal

1.17. Metode de evaluare a insulinorezistenţeiInsulinorezistenţa poate fi definită ca un sindrom în care un anumit nivel plasmatic al

insulinei se asociază cu un răspuns glicemic sub normal. Cercetările din domeniul insulinorezistenţei au un istoric lung, începând cu testul dezvoltat de Himsworth în 1930, pentru ca în jurul anului 1970 să fie concepute testul de supresie a insulinosecreţiei endogene de către Reaven şi clampul euglicemic hiperinsulinemic de către De Fronzo şi colaboratorii. Importanţa deosebită care i se acordă în ultimul deceniu rezultă din posibilitatea ca insulinorezistenţa şi hiperinsulinismul să constituie un factor etiopatogenic major pentru diabetul zaharat de tip 2 şi pentru bolile cardiovasculare (34).

Cauzele insulinorezistenţei pot fi:Defecte intrinseci ale celulei ţintă:-mutaţii în gena receptorului de insulină-mutaţii în alte gene importante pentru acţiunea insulinei Factori secundari afectând celula ţintă:-stări fiziologice: pubertatea, sarcina, vârsta înaintată; -stări patologice: stresul, infecţiile, postul prelungit, diabetul zaharat, obezitatea, ciroza

hepatică, uremia şi sindromul X metabolic;-hormoni în exces ca: glucagonul, hormonii tiroidieni, STH, catecolaminele;-insulinomul.Sensibilitatea la insulină poate fi evaluată indirect prin urmărirea secreţiei endogene de

insulină ca răspuns la administrarea intravenoasă a glucozei; sunt incluse aici testele care realizează un circuit închis („closed loop”): determinarea glicemiei à jeun, a insulinemiei bazale, calcularea indicelui HOMA, efectuarea modelului minim Bergman şi calcularea indicelui QUICKI. Metodele directe furnizează date cantitative prin măsurarea răspunsurilor metabolice ce urmează administrării de insulină exogenă: clampul euglicemic hiperinsulinemic, clampul hiperglicemic, testele de supresie ale insulinei endogene şi testul de toleranţă la insulină. Se realizează un circuit deschis („open loop”) în care se întrerup mecanismele feed-back negative dintre celula beta pancreatică şi ţesuturile insulinodependente.

A. Metodele directe de evaluare a insulinorezistenţei

Clampul euglicemic hiperinsulinemicEste cea mai frecventă metodă de evaluare a acţiunii insulinei ”in vivo”. Ea are următorul

18

principiu: hiperinsulinemia (de aproximativ 50-80 microU/ml), creată prin administrarea insulinei exogene la o rată constantă scade până la zero producţia hepatică de glucoză în paralel cu creşterea utilizării periferice a glucozei; cantitatea de glucoză exogenă necesară de administrat pentru menţinerea euglicemiei este o măsură directă a utilizării periferice a glucozei, deci a rezistenţei la insulină. Cu cât cantitatea de glucoză administrată este mai mică, cu atât insulinorezistenţa este mai mare. Măsurătorile se fac în condiţii de platou glicemic şi insulinemic, atins după 2 ore de perfuzie, rata de infuzie a insulinei fiind ajustată în permanenţă prin determinări frecvente la 5-10 minute ale glicemiei (29, 34).

Ca şi variante se pot induce diferite nivele de hiperinsulinemie sau se pot face măsurători în condiţii de hiperglicemie. Clampul hiperglicemic realizează o creştere bruscă a nivelului glicemic peste valorile bazale, fie printr-o infuzie continuă de glucoză cu o rată progresiv descrescătoare, fie prin administrarea unui bolus i.v. de glucoză. După atingerea condiţiilor de „steady state” (platou) cantitatea de glucoză infuzată va aproxima destul de bine cantitatea de glucoză utilizată de ţesuturile periferice. Raportul dintre cantitatea de glucoză metabolizată şi nivelul mediu al insulinemiei în cursul perioadei de „steady state” permite estimarea globală a sensibilităţii la insulină. Clampul hiperglicemic rămâne o metodă utilizată în principal pentru studiul răspunsului beta celular pancreatic, nefiind folosit de rutină pentru determinarea sensibilităţii la insulină (34).

Clampul euglicemic se poate cupla cu: tehnici folosind glucoza marcată pentru evidenţierea producţiei hepatice reziduale de glucoză şi pentru diferenţierea acţiunii hepatice de cea periferică a insulinei; calorimetria indirectă pentru diferenţierea metabolismului oxidativ de cel nonoxidativ al glucozei.

Testele de supresie a insulinosecreţiei endogene cuprind:- testul de supresie cu adrenalină şi propranolol: se administrează glucoză şi insulină

exogenă la o rată predeterminată, iar insulinosecreţia endogenă este suprimată cu adrenalină şi propranolol. Insulinorezistenţa se determină prin evaluarea glicemiei în condiţiile platoului glicemic (steady-state plasma glucose-SSPG), obţinut după 120 de minute de perfuzie; cu cât platoul glicemic (SSPG) este mai mare, cu atât insulinorezistenţa este mai severă;

- testul de supresie cu somatostatin (Sandostatin) a fost introdus pentru evitarea efectelor adverse cardiovasculare ale adrenalinei;

-testul infuziei de insulină-glucoză (IGI test): se administrează glucoza şi insulina în doze fixe timp de 150 minute. Este o metodă simplificată dar fiabilă, utilă în studiile populaţionale.

Testul de toleranţă la insulină constă în administrarea unui bolus de insulină rapidă cu urmărirea glicemiei timp de 30 de minute. Insulinorezistenţa se caracterizează printr-un răspuns hipoglicemic mic sau întârziat. La finalul testului se poate injecta glucoză i.v. pentru prevenirea sau corecţia unei eventuale hipoglicemii. Deşi testul este criticat, există o bună corelaţie între rezultatele lui şi cele ale clampului.

B. Metode indirecte de evaluare a insulinorezistenţeiMăsurarea glicemiei şi insulinemiei à jeunGlicemia şi insulinemia bazală au fost folosite de mult timp pentru a estima sensibilitatea

ţesuturilor la insulină. Astfel, raportul dintre nivelul glicemic bazal (mg/dl) şi insulinemia bazală (μU/ml) a fost de mult propus ca un indicator al insulinorezistenţei. În mod normal acest raport este situat între 6 şi 7. Totuşi până în prezent nu au fost întreprinse încercări serioase pentru a standardiza şi a valida utilizarea curentă a acestuia în practica în practica clinică.

Indicele HOMA (Homeostasis Model Assessment)Indicele HOMA se bazează pe caracteristicile cunoscute ale răspunsului secretor beta celular

la stimularea cu glucoză, alături de nivelurile bazale ale glicemiei şi insulinemiei.Nivelul bazal al insulinemiei este determinat în mare parte de nivelul glicemiei, iar

hiperglicemia à jeun ce apare la subiecţii cu diabet pare să fie determinată de feedback-ul dintre ficat şi celulele beta, în încercarea de a menţine o acţiune eficientă a insulinei atât la nivel hepatic cât şi periferic. Gradul hiperglicemiei bazale va fi astfel determinat de o combinaţie între insulinorezistenţă şi deficitul secretor beta celular, rezultând un set unic de valori bazale ale glicemiei şi insulinemiei.

Pentru calcularea gradului de insulinorezistenţă a fost folosită formula simplificată:

19

HOMA-IR=glicemie [mmol/l] x insulinemie [microU/ml] / 22,5.

Studii recente au arătat o bună corelaţie a HOMA-IR cu rezultatele clampului euglicemic hiperinsulinemic, determinările insulinemiilor fiind făcute printr-o metodă RIA insulin-specifică care diferenţiază proinsulina de proinsulina clivată. Într-un studiu realizat de noi la Institutul ”N.C. Paulescu” în colaborare cu Clinica de diabet-nutriţie Oradea pe un număr de 180 pacienţi am observat că valoarea medie HOMA pentru pacienţii nediabetici a fost semnificativ mai mică decât cea obţinută pentru categoria de pacienţi cu glicemie à jeun modificată (IFG) 2,60 versus 4,62, sau pentru pacienţii diabetici (12), datele noastre corelându-se cu cele publicate de Bonora şi colaboratorii (4). Deşi s-a observat o variaţie importantă a valorilor HOMA, am acceptat o limită normală de 2,5. Pentru întreg lotul populaţional HOMA a fost de 3,17, valoare superioară limitei admise. Pentru un grup de 22 pacienţi cu vârste sub 40 de ani, aparent sănătoşi, cu parametrii biologici în limite normale, indicele HOMA a fost de 1,62, semnificativ statistic mai mic decât valoarea înregistrată pentru tot lotul populaţional. HOMA reprezintă deci,o alternativă valoroasă şi simplă de evaluare a insulinorezistenţei in vivo la om, utilă mai ales în studiile pe un număr mare de cazuri (12).

Modelul minimal BergmanSe administrează intravenos un bolus de glucoză, urmat la 20 minute de administrarea unui al

doilea secretagog al insulinei (Tolbutamid i.v.), urmărindu-se prin recoltări frecvente evoluţia glicemiei şi insulinemiei timp de 180 minute. Datele obţinute se analizează computerizat. Un răspuns insulinemic capabil să readucă rapid glicemia la normal exprimă o sensibilitate periferică bună la acţiunea insulinei. Modelul Bergman este un test dinamic, fiziologic pentru că menţine interrelaţiile de tip feed-beck între glucoză şi insulină, permiţând evaluarea secreţiei endogene de insulină în cursul aceluiaşi test (34).

Metoda QUICKI se bazează pe determinarea unui nou indicator al sensibilităţii la insulină, calculat conform formulei:

QUICKI=1 / [log(I0) + log(G0)], unde I0 = insulinemia bazală (μU/ml) şi G0 = glicemia à jeun (mg/dl).

Studii recente au arătat o bună corelaţie între indicele QUICKI şi metoda clampului, precum şi între indicele QUICKI şi HOMA-IR. Există deasemenea metode matematice bazate pe determinarea insulinei şi peptidului C în cursul administrării intravenoase de glucoză, al căror rezultat corelează mai bine cu caracteristicile secreţiei de insulină în diferite etape ale diabetogenezei (29).

Alţi trei indici de indulinosensibilitate utilizaţi în studiile clinice sunt:

Indexul de insulinosensibilitate (ISI): 10000/√(glicemie bazală X insulinemie bazală)X(glicemiemedie (TTGO)X insulinemiemedie (TTGO))

1A index: exp [ 3,29-0,25 x ln(insulinemie) – 0,22 x ln(BMI)-0,25 x ln(trigliceridemie)]

1B index: exp [ 2,63-0,28 x ln(insulinemie) - 0,31 x ln(trigliceridemie)]

Trebuie menţionat că toate metodele enumerate au avantaje şi dezavantaje, nici una dintre ele neântrunind criteriile pentru un test ideal de evaluare a sensibilităţii la insulină (34).

1.18. Tehnica spectroscopiei în rezonanţă magnetică nucleară(NMR - Nuclear Magnetic Resonance)Această tehnică permite determinarea neinvazivă a concentraţiei tisulare a unor metaboliţi

importanţi pentru evidenţierea unor modificări în ficat, muşchi sau alt ţesut, la pacienţii cu obezitate sau diabet zaharat. În acest fel poate fi examinată reglarea captării periferice a glucozei şi debitul hepatic de glucoză, cele două procese fundamentale întâlnite în insulinorezistenţă (32).

Principalii atomi investigaţi cuprind 1H, 31P şi 13C. Cel mai util este 31P, care este singurul

20

fosfor natural, fiind prezent 100% în toţi compuşii ce conţin fosfor (molecula ATP şi fosfocreatina, glucozo-6-fosfat în muşchi, intermediar metabolic ce indică o etapă limitantă în sinteza glicogenului în muşchi). 13C permite determinarea ritmului de încorporare a glucozei marcate cu acest carbon, administrat i.v., în glicogenul muscular (de regulă, în gastrocnemius) (32).

Sonda de captare a rezonanţei nucleilor din atomii investigaţi este plasată pe muşchiul gastrocnemian ori în zona hepatică, acţionând ca o antenă atât în etapa transmiterii impulsurilor electromagnetice, cât şi în etapa receptării energiei electromagnetice ce se întoarce din ţesuturi.

Deşi tehnica este foarte costisitoare, caracterul său neinvaziv şi marea precizie în determinare, o recomandă ca o metodă cu mare viitor în studiile cu adresă etiopatogenetică. De exemplu, ea se dovedeşte mai utilă pentru măsurarea glicogenului muscular decât metoda biopsiei. Cu ea se determină uşor defectul de acţiune a insulinei indicat de afectarea sintezei de glicogen în muşchi, ţesut cu importanţă majoră în inducerea insulinorezistenţei. În acest mod s-a putut demonstra că ritmul sintezei glicogenului la pacienţii diabetici, la concentraţii similare de insulină şi glucoză, este cu 50% mai mic faţă de persoanele normale (32).

S-a constatat, prin aceeaşi metodă, că utilizarea periferică a glucozei la diabetici este mult scăzută faţă de nediabetici, reflectând o afectare profundă a disponibilităţii glucozei, în special pentru căile neoxidative. Acest lucru demonstrează că defectul major în DZ de tip 2 este scăderea sintezei de glicogen. Cauza acestei scăderi se datorează fie transportului deficitar de glucoză în muşchi, fie fosforilării deficitare a glucozei, întrucât concentraţia de glucozo-6-P din muşchi este mai mică la diabetici faţă de martori. Întrucât acest defect se înregistrează şi la descendenţii încă nediabetici ai pacienţilor diabetici, este sugerat că defectul este moştenit, şi nu indus de mecanismul invocat în teroria glucotoxicităţii. Se pare că defectul este de tip transport de glucoza/activitate hexokinazică şi precede momentul instalării clinice a bolii.

Tot prin această metodă s-a demonstrat că, spre deosebire de subiecţii normali, la care 1/3 din producţia de glucoza într-un post de 22 ore este dată de glicogenoliză şi 2/3 de neoglucogeneză, la diabetici producţia hepatică de glucoză este crescută cu circa 20%, sursa fiind în mică măsură glicogenoliza şi aproape exclusiv gluconeogenezar

1.19. Tomografia în emisie de pozitroni (TEP)Această tehnică imagistică introdusă în medicină în ultima vreme permite aprecierea in vivo

a fluxului sanguin, a ritmurilor metabolice sau a densităţii receptorilor. Este o tehnică neinvazivă, care detectează 2 fotoni produşi printr-o reacţie de anihilare între un pozitron şi un electron, în ţesuturi. Tehnica are o rezoluţie bună, datorită detectorilor multipli plasaţi în cerc în jurul pacientului. TEP este una dintre puţinele metode neinvazive care permite cuantificarea fluxului sanguin miocardic la om. Se obţin imagini cvasisecţionate dintr-o zonă de interes, în condiţii cunoscute (în repaus şi, spre exemplu în cursul testului presor la rece). Creşterea fluxului sanguin miocardic se exprimă prin intensificarea zonelor colorate în roşu sau galben (42).

Beneficiu major al TEP constă în posibilitatea investigării unor structuri anatomice mici, de numai 1-3 cm3. Limitele metodei constau în costul mare şi complexitatea modelării matematice care poate influenţa rezultatul.

Captarea glucozei în întregul organism a fost găsită la diabetici şi la hipertensivi cu 1/3 mai mică faţă de nediabetici. Dimpotrivă, la atleţi ea este cu 75% mai mare faţă de sedentari (42).

Prin această metodă s-a demonstrat că hiperinsulinismul indus printr-o perfuzie cu insulină creşte cu 90% fluxul sanguin în muşchi.

1.20. Angiografia prin rezonanţă magnetică este o metodă neinvazivă de mare acurateţe, care permite aprecierea structurii arterei renale şi măsoară fluxul sanguin renal. Se poate diagnostica astfel stenoza arterei renale. Tehnica se bazează pe emiterea unui flux electromagnetic care destabilizează protonii din anumiţi atomi, energia emisă de aceştia putând fi măsurată şi cuantificată. Avantajul metodei îl reprezintă faptul că se poate utiliza la pacienţi cu funcţie renală modificată, angiografia clasică fiind rezervată cazurilor în care se tentează intervenţii endovasculare. Dezavantajul îl reprezintă costul foarte mare, metoda neputând fi folosită ca screening (42).

2. Investigarea metabolismului lipidic

21

Observaţie: Evaluarea biochimică a metabolismului lipidic nu se recomandă a fi efectuată în cursul şi în primele 3 luni după următoarele situaţii:

1. Evenimente vasculare acute: infarct miocardic acut, stroke etc.2. Traumatisme.3. Sarcină.4. Scădere ponderală importantă bruscă.5. Administrarea unor medicamente.

2.1. Colesterolul seric total

Indicaţii de determinare (2, 11, 24):1. evaluarea riscului de boală coronariană;2. screening-ul hiperlipemiilor primare şi secundare;3. monitorizarea tratamentului normolipemiant.

Metode de determinare:Cea mai utilizată metodă este metoda enzimatică.Material: ser sau plasmă heparinate.Principiu: hidroliza enzimatică a esterilor de colesterol (în prezenţa unei esteraze) şi oxidarea

enzimatică a colesterolului rezultat (în prezenţa unei oxidaze) cu formare de peroxid; acesta formează prin oxidare cu fenol şi 4-aminoantipirină un derivat chinonic colorat în roşu. Intensitatea culorii este proporţională cu concentraţia colesterolului şi se măsoară fotometric.

Interpretare: ≤220 mg/dl = normal;220-240 mg/dl = se repetă măsurătoarea;

>240 mg/dl = crescut.În diabetul zaharat: <210 mg/dl = normal; 210-230 mg/dl = risc semnificativ de boală vasculară; >230 mg/dl = risc crescut.Corecţii:

-formulă de echivalare: mmol/l = mg/dl x 0,02585;-multiplicare cu 1,03 când recoltarea se efectuează pe EDTA;-determinarea poate fi realizată şi postprandial.

Factori de variaţie:Factori fiziologici:

-variaţie intraindividuală: până la 10% (30 mg/dl);-variaţie intraanuală: valori 8% mai mari iarna;-poziţia: creşteri cu 5-15% în ortostatism;-sarcina: valori crescute.

Factori patologici:Valori crescute pot apărea în:

-hipercolesterolemia idiopatică;-hiperlipoproteinemii;-hipotiroidism;-obstrucţii biliare (litiază, carcinom, ciroză biliară etc);-afecţiuni renale (nefropatie interstiţială, tromboză de venă renală, colagenoze etc);-afecţiuni pancreatice (pancreatita cronică, pancreatectomie);-boala von Gierke;-medicamente (progestative, steroizi anabolizanţi, corticosteroizi, diuretice tiazidice).

Valori scăzute pot apărea în:-hipertiroidism;-boli mieloproliferative;-malnutriţia (înfometare, malabsorbţie, neoplasme, uremie);-anemia cronică (anemii hemolitice, anemii hipocrome, anemia pernicioasă recidivantă);

22

-hipobetalipoproteinemia şi abetalipoproteinemia;-boala Tangier (deficitul familial de HDL colesterol, probabil prin sinteză insuficientă Apo

A);-distrucţie severă hepatocitară (medicamentoasă, toxică, autoimună, virală);-aport scăzut de colesterol;-infecţii.

2.2. HDL Colesterolul seric

Indicaţii de determinare (2, 11):1. evaluarea riscului de boală coronariană;2. diagnosticul şi monitorizarea unor dislipoproteinemii.

Metode de determinare:Cea mai utilizată metodă este metoda enzimatică.Principiu: fracţiunile lipoproteinice serice sunt precipitate prin adăugare de acid fosfotungstic

şi ioni de magneziu sau fier; supernatantul rezultat prin centrifugare conţine doar HDL al cărui conţinut în colesterol se determină enzimatic prin metoda descrisă mai sus.

Valori normale: - 35-55 mg/dl la bărbaţi; - 45-55 mg/dl la femei.În diabetul zaharat: >45 mg/dl la bărbaţi şi >50 mg/dl la femei = normal; <40 mg/dl = scăzut.Formulă de echivalare: mmol/l = mg/dl x 0,02584.

Factori de variaţie:Valori crescute apar în:-consum moderat de alcool;-anomalii lipidice familiare cu “protecţie” împotriva aterosclerozei: hiperalfalipoproteinemia

şi hipobetalipoproteinemia;-terapia orală estrogenică;-exerciul fizic intens;-situaţii care cresc clearance-ul plasmatic al trigliceridelor.Valori scăzute apar în:-înfometare;-obezitate;-sedentarism;-fumat;-hipo şi hipertiroidism;-boli hepatice acute şi cronice;-boli renale, uremie;-unele anemii cronice şi boli mieloproliferative;-cazul consumului anumitor medicamente (steroizi anabolizanţi, progestative, betablocante,

tiazidice, neomicină, fenotiazide etc);-anomalii genetice:-hipertrigliceridemia familială;-hipoalfalipoproteinemia familială;-boala Tangier, forma homozigotă;-deficitul familial de LCAT şi “boala ochilor de peşte”;-boala Niemann-Pick;-deficitul de HDL cu xantome plane;-deficitul de apo A I şi apo C III.

2.3. LDL Colesterolul seric

Indicaţii de determinare (2, 11):1. evaluarea riscului de boală coronariană.

23

2. diagnosticul dislipidemiilor şi monitorizarea tratamentului normolipemiant.

Metoda de determinare:Cea mai facilă metodă este metoda matematică (formula Friedewald):LDL colesterolemie (mg/dl) =Colesterolemie (mg/dl) - HDL colesterolemie (mg/dl) - TG-

emie (mg/dl)/5În diabetul zaharat: <115 mg/dl (<100 mg/dl conform ADA) = normal; 115-155 mg/dl = risc semnificativ de boală vasculară; >155 mg/dl = risc crescut.Corecţii:-formulă de corecţie: mmol/l = mg/dl x 0,026;-metoda se poate aplica doar dacă trigliceridemia are valori sub 400 mg/dl.-determinarea se execută după 12 ore de post alimentar.

Factori de variaţie:Valori crescute (în relaţie directă cu riscul de boală coronariană) apar în:-hipercolesterolemia familială;-hiperlipidemia familială combinată;-hipotiroidism;-sindrom nefrotic:-insuficienţa renală cronică;-mielom multiplu;-porfirie;-anorexie:-sarcină:-aport crescut de colesterol şi grăsimi saturate în dietă;-cazul consumului unor medicamente: (steroizi anabolizanţi, betablocante, progestative,

carbamazepină etc).Valori scăzute apar în:-boli severe;-abetalipoproteinemie;-terapie estrogenică orală.

2.4. Trigliceridele serice

Indicaţi de determinare (2, 11, 24):1. evaluarea riscului de boală coronariană.2. diagnosticul dislipidemiilor şi monitorizarea tratamentului normolipemiant.

Metode de determinare:Cea mai utilizată metodă este metoda enzimatică.Material: ser sau plasmă (heparinată, EDTA).Principiu: trigliceridele sunt hidrolizate enzimatic (de către lipază) cu eliberare de glicerol

care este fosforilat în prezenţa glicerolkinazei formând glicerol 3 fosfat; apa oxigenată, formată prin oxidarea acestuia, reacţionează cu 4-amino antipirina şi clorofenolul generând un derivat chinonic de culoare roşie; intensitatea culorii este direct proporţională cu concentraţia trigliceridelor şi se măsoară fotometric.

Interpretare: - normal: - 35-160 mg/dl la femei;- 40-200 mg/dl la bărbaţi.

- >150-160 mg/dl - se recomandă repetarea determinării; - >200 mg/dl - crescut.

În diabetul zaharat: <150 mg/dl = normal; 150-200 mg/dl = risc semnificativ de boală vasculară; >200 mg/dl = risc crescut.

24

Corecţii:-formulă de echivalare: mmol/l = mg/dl x 0,012;-repaus alimentar >12 ore;-valorile din ser sunt mai mari cu 5% decât cele din plasmă;-variaţii - diurne: valori mai mici dimineaţa;- intraindividuale: între 12-40%;- analitice: între 5-10%.

Factori de variaţie:Valori crescute apar în:-hiperlipemii familiale (de ex. deficitul de lipoproteinlipază, deficitul de apo C II,

hipertrigliceridemia familială, disbetalipoproteinemia);-boli hepatice;-sindrom nefrotic;-hipertiroidism;-alcoolism;-gută;-pancreatite acute şi cronice;-boala von Gierke;-infarct miocardic;-afecţiuni intercurente (de ex. gripa);-cazul consumului unor medicamente (de ex. contraceptive);orale, betablocante, hidroclorotiazida, steroizi anabolizanţi, corticoizi);-sarcină.Valori scăzute apar în:-abetalipoproteinemie;-malnutriţie;-scădere ponderală recentă;-exerciţiu fizic intensiv (scădere tranzitorie);-consumul unor medicamente (alfa blocante).

2.5. Apoproteinele serice

Indicaţii de determinare (2):1. evaluarea riscului de boală coronariană;2. stabilirea tipului unor hiperlipemii.

Metode de determinare:Se folosesc metoda imunologică.Principiu: formarea unui precipitat insolubil format prin reacţia dintre apoproteinele din ser

ca antigen şi antiser specific din reactiv ca anticorp.Valori normale:- Apo A I - 106-206 mg/dl.- Apo B 100 - 52-161 mg/dl.- Lp (a) <30 mg/dl.Corecţii: - metoda impune repaus alimentar >12 ore.

Factori de variaţie:Factori fiziologici:-vârsta;-sexul;-etnia: Lp (a) are valori crescute în populaţia neagră, fiind probabil principalul factor de risc

coronarian.Factori patologici: anomalii genetice.

25

2.6. Electroforeza proteinelor serice

Indicaţii de determinare:1. identificarea unor hiperlipemii familiale;2. în anumite situaţii ca:

-trigliceridemie >300 mg/dl;-ser lactescent;-hiperuricemie;-istoric familial de boală coronariană precoce;-ateroscleroză sau boală coronariană ischemică la pacienţi cu vârstă <40 ani.

Factori de variaţie:Valori crescute apar în:

-hiperbetalipoproteinemie;-hiperalfalipoproteinemie;Valori scăzute apar în:-abetalipoproteinemie (sindrom Bassen-Kornzweig);-hipobetalipoproteinemia;-boala Tangier.

2.7. Acizii graşi liberi

Indicaţii de determinare (2, 11, 21):1. evaluarea riscului de boală coronariană.2. diagnosticul dislipidemiilor şi monitorizarea tratamentului normolipemiant.

Metode de determinare:Cea mai folosită metodă este metoda enzimatică.Material: plasmă pe EDTA.Principiu: Acidul gras liber este fosforilat în prezenţa acilCoA sintetazei şi apoi este oxidat

cu formare de peroxid; acesta, în prezenţa aminoantipirinei şi toluidinei, formează un compus de culoare roşie a cărei intensitate se măsoară fotometric şi este direct proporţională cu concentraţia acidului gras liber determinat.

Interpretare: 0,1-0,9 mmol/l = normal.

2.8. Lipide totale

Indicaţii de determinare (24, 46, 61):1.evaluarea riscului de boală coronariană.

Metode de determinare:Cea mai utilizată metodă este metoda vanilină-fosfat.Material: ser.Principiu: acizii graşi din lipidele serice se eliberează şi se sulfonează prin tratare cu acid

sulfuric la cald. Se obţine un compus colorat în violet cu vanilină şi fosfat.Valori normale: 400-800 mg/dl.Corecţii:-pentru lipidemii peste 1500 mg/dl se va repeta determinarea cu diluţie de ser dublă (0,1 ml

în 2 ml apă), standardul rămânând la fel. Rezultatul se înmulţeşte cu doi.

Factorii de variaţie sunt similari cu cei menţionaţi la fracţiunile lipidice.

26

Observaţie: Formula de echivalare: mmol/l = mg/ml x 10 : GM, unde GM = Greutate Moleculară.

2.9. Metaboliţii intermediari Acidul lactic (lactatul) şi piruvic (piruvatul)La pH-ul lichidelor biologice, acizii lactic şi piruvic sunt ionizaţi aproape în întregime,

acţionând ca ioni liberi de lactat şi piruvat. În mod normal, concentraţia plasmatică a lactatului variază între 0,8 şi 1,2 mMol/l, iar cea a piruvatului între 0,08 şi 0,12 mMol/l, adică de cca 10 ori mai mică (16, 24).

Concentraţia plasmatică a acestor doi metaboliţi creşte în mod apreciabil în numeroase condiţii fiziologice (în primul rând în efort) şi patologice (cea mai gravă fiind acidoza lactică). Hipoxia reprezintă unul din factorii principali ai producţiei excesive de lactat, întrucât în absenţa oxigenului, care acţionează ca acceptor de hidrogen formând apa, acceptorul temporal şi limitat de hidrogen în hipoxie este acidul piruvic, care se transformă în acid lactic (fig.6). Acidul lactic este un metabolit final a cărui utilizare presupune retransformarea lui în acid piruvic (38).

Fig.6. Etapele glicolizei ce conduc la acid lactic

Lactatul şi piruvatul prezintă deseori valori crescute la pacienţii cu hipoglicemie, şi anume în acele cazuri în care există o afectare a gluconeogenezei (glicogenoze, hipoglicemia alcoolică, unele hipoglicemii tumorale) (17, 19, 38).

27

Pentru a pune bază pe valorile determinate de acid lactic şi piruvic, trebuie să fim siguri de trespectarea condiţiilor de prelevare (pacient în repaus de cel puţin 15 minute, recoltarea fără stază prelungită) şi de determinare (24).

Acizii graşi liberi şi glicerolulAcizii graşi şi glicerolul sunt eliberaţi paralel în circulaţie, prin desfacerea trigliceridelor din

ţesutul adipos în cursul lipolizei. Întrucât aceasta este stimulată de numeroşi factori (de ex. stresul, efortul fizic sau alte stări de activare simpatică), prelevarea sângelui trebuie făcută evitând aceste situaţii.

În hiperinsulinism (cu sau fără hipoglicemie) pot fi înregistrate fie valori scăzute (aşa cum ar fi de aşteptat), fie valori crescute (ca urmare a activităţii lipolitice exagerate induse de hormonii de contrareglare) (2, 39, 46, 58).

Corpii cetonici plasmatici şi urinariDintre cei trei corpi cetonici, acetoacetatul, β-hidroxibutiratul şi acetona, numai primii doi

prezintă concentraţii plasmatice semnificative. Ei sunt produşi exclusiv în ficat, ca intermediari fiziologici, care pot fi utilizaţi în scop energetic de multe ţesuturi (miocard, celule nervoase, muşchi) (11).

Concentraţia plasmatică a acetoacetatului şi a β-hidroxibutiratului, considerate împreună, este în mod normal sub l mMol/1. Ea poate creşte (uneori de 10 şi chiar de 20 de ori decât valoarea normală) în numeroase circumstanţe fiziologice (postul prelungit, de exemplu), cât şi patologice (coma diabetică cetoacidotică, de exemplu). Dacă în mod obişnuit raportul între β-hidroxibutirat şi acetoacetat este unitar sau uşor supraunitar, în condiţii patologice (hiperinsulinism, consum de alcool, hipoxie) creşterea se face predominant pe seama β-hidroxibutiratului. Determinarea calitativă a corpilor cetonici urinari este utilă, într-o oarecare măsură, în diferenţierea unei come diabetice cetoacidotice de o comă diabetică hipoglicemică. Totuşi, o reacţie pozitivă pentru corpi cetonici în urină nu exclude în totalitate o comă hipoglicemică (11).

Corpii cetonici plasmatici scad postprandial, după administrarea i.v, de glucoză, fructoză şi insulină; cresc în mod apreciabil (în special la copii) în majoritatea condiţiilor asociate cu hipoglicemie spontană indusă de hiperinsulinism şi în absenţa afectării hepatice.

S-a afirmat că la copii, imposibilitatea creşterii β-hidroxibutiratului peste 1,1 mMol/1, atunci când glicemia scade sub 40 mg/dl, constituie un element diagnostic pentru hiperinsulinismul endogen, indiferent de valoarea insulinemiei plasmatice (11).

Alanina plasmaticăAlanina este principalul aminoacid gluconeogenetic (fig.7). În cea mai mare parte el rezultă

din proteoliza musculară. Poate însă apărea şi prin transaminarea piruvat-ului. Concentraţia medie a alaninei plasmatice à jeun variază între 150 şi500 μMol/l. Valoarea scade progresiv în cursul postului, paralel cu scăderea glicemiei. Hiperalaninemia se întâlneşte frecvent în afectarea gluconeogenezei hepatice, în special la copii. Se mai întâlneşte în varianta idiopatică a hipoglicemiei cetozice (probabil datorită insuficienţei de piruvat) (35).

CH3 – CH – COOH

NH2

Fig.7. Molecula de alanină

3. Investigarea metabolismului protidic

Determinarea capacităţii de depurare a plasmei se poate face prin studiul concentraţiei serice a principalilor cataboliţi proteici: uree, creatinină şi acid uric.

3.1. Ureea sangvină determinată prin metoda DAM (diacetil monoxina) are valori normale de 20-40 mg/dl, considerându-se ca anormale valorile ce depăşesc 50-60 mg/dl (5).

Fiziologic, ureea sangvină variază cu ingestia de proteine; s-a constatat că la o ingestie de peste 2g/kg corp/zi, ea poate atinge 50-60 mg/dl. Deasemenea, în oligurii se pot produce hiperazotemii extrarenale (2).

28

Patologic, creşterea ureei sangvine este întâlnită în nefropatiile cu insuficienţă renală, în stările de deshidratare cu pierderi excesive de lichide: vomismente, diaree, poliurie, transpiraţii, distrugeri tisulare mari, hemoragii abundente, hipercorticism şi în diabetul zaharat dezechilibrat (5).

Valorile crescute ale ureei semnifică alterarea funcţiei renale, fie prin azotemie prerenală (cauzată de scăderea fluxului sangvin renal) fie prin azotemie postrenală (obstrucţie de tract urinar).

Valori scăzute ale ureei se întâlnesc în stări de hiperhidratare induse iatrogen, în insuficienţă hepatică toxică (cauzată de intoxicaţii, otrăviri), în sarcină (prin creşterea necesarului de proteine pentru sinteză), în acromegalie şi în cazul administrării de hormoni anabolizanţi (2).

În raport cu dieta, ureea scade în cazul regimurilor hipoproteice, bogate în hidraţi de carbon şi în cazul nutriţiei exclusiv parenterale.

3.2. Creatinina este derivatul deshidratat al creatinei, împreună cu care ea coexistă în sânge şi în muşchi. Nu este influenţată de aportul proteic, diureză sau de efortul fizic, fiind proporţionată cu masa corporală, de aceea valorile sunt mai mari la bărbaţi (0,6-1,1 mg/dl) comparativ cu femeile (0,5-0,9 mg/dl). Nivelul seric constant al creatininei, originea ei strict endogenă şi eliminarea ei renală exclusiv prin procese de filtrare glomerulară, permit evaluarea filtratului glomerular după formula: F.G.=100/creatininemie [ml/minut].

În stadiile precoce ale nefropatiilor clearence-ul creatininei endogene este afectat înainte de creşterea creatininei serice.

Creatininemia creşte în nefropatiile acute şi cronice, în bolile consumptive grave ca şi în bolile musculare severe ca miastenia gravis şi astenia musculară progresivă (2).

S-a observat că, o pierdere a funcţiei renale de aproximativ 50% duce la creşterea valorii creatininei de la 1 la 2 mg/dl. Totuşi creatininemia este mai puţin sensibilă ca test screening în afectarea renală uşoară sau medie.

Scăderi fiziologice ale creatininei serice se produc în sarcină, valorile normale fiind cuprinse între 0,4-0,6 mg/dl. O creştere de peste 0,8 mg/dl constituie un semnal de alarmă pentru clinician (2).

3.3. Acidul uric seric poate prezenta variaţii foarte mari de la o zi la alta; fiziologic valoarea lui poate creşte în condiţii de stress emoţional, post prelungit sau dimpotrivă creştere în greutate. De regulă, determinarea lui este folosită în monitorizarea gutei şi a tratamentului citostatic în neoplazii (2).

Acidul uric are valori normale în sânge la bărbaţi de 3,4-7,0 mg/dl, iar la femei de 2,4-5,7 mg/dl. În insuficienţa renală el este prima substanţă reţinută în sânge. Valorile uricemiei pot fi crescute deci în gută, procese neoplazice, eclampsie, anemie Biermer, siclemie, psoriazis sau alcolism. De asemenea, valorile acidului uric pot fi crescute în diete hiperproteice şi în cazul administrării de diuretice. S-a observat că 80% dintre pacienţii cu hipertrigliceridemie şi hipertensiune arterială au şi acidul uric peste valorile normale (2).

Unele stări patologice ca boala Wilson, sindromul Fanconi, boala celiacă, acromegalia ca şi administrarea drogurilor uricozurice (salicilaţi, probenecid) se pot asocia unor valori scăzute ale acidului uric seric (2).

Produşii de catabolism proteic se pot determina şi în urina de 24 de ore.Ureea urinară are valori normale cuprinse între 20-35 g/24h (333-583 mmol/24h), creatinina

urinară între 1-1,5 g/24h (8,84-13,3 mmol/24h), iar acidul uric 0,5-2g/24h (3-12 mmol/24h).Se utilizează foarte frecvent calcularea clearence-ului la creatinină ca raport între valoarea

creatininei în urină x volumul urinar / minut şi concentraţia plasmatică a creatininei.Valorile normale sunt de 97-140 ml/min. la bărbaţi şi de 85-125 ml/minut la femei (5).Clearence-ul permite evaluarea mărimii filtratului glomerular şi a fluxului sangvin renal (2).Eliminarea urinară de proteine este principalul criteriu pentru definiţia şi diagnosticul

afectării renale din cursul evoluţiei diabetului zaharat. Nefropatia diabetică se baza pe definiţia clasică a eliminării urinare medii de proteine (din trei colecţii pe 24h) de peste 0,5g/24h (care corespunde unei eliminări de albumină de peste 300mg/24h, peste 200 μg/minut sau peste 300 μg/mg creatinină). Studiile recente au arătat semnificaţia diagnostică şi mai ales prognostică a eliminării urinare subclinice de albumină, denumită microalbuminurie (MA) aceasta fiind citată ca factor de risc pentru boala coronariană ischemică. MA reprezintă o eliminare urinară persistentă (pozitivă la minimum două din trei determinări efectuate într-un interval de maximum 6 săptămâni) de albumină între 30-300mg/24h (echivalent cu 20-200 μg/minut şi 30-300 μg/mg creatinină) (48). Apariţia MA marchează ireversibilitatea leziunilor renale, dar o terapie adecvată poate amâna pe o perioadă nedeterminată

29

progresia leziunilor bolii renale diabeticeRaportul albumină/creatinină (RAC) urinară este un nou criteriu introdus pentru estimarea

ratei eliminării albuminei. RAC se poate efectua dintr-o singură probă matinală de urină, oferind o bună posibilitate de monitorizare în ambulator. Valorile RAC în mg/g între 30-300 semnifică MA, peste aceste valori fiind vorba despre proteinurie clinică (48).

Asociaţia Diabetologilor Americani (ADA) recomandă testarea microalbuminuriei la adulţi cu diabet zaharat, imediat după diagnosticare, iar la copiii cu diabet zaharat tip 1 după pubertate, sau după 5 ani de la diagnosticare (2).

30

Bibliografie

1. Alistar H. – Classifying diabetes in adults; the role of the genetic and immune markers. Diabetes Reviews International, vol. 5; 6-10, 1996

2. Bakerman S., Backerman P. – Bakerman’s ABC’s of interpretative laboratory data – Third Edition, 465-504, 1994.3. Bartlett W.A., Jones A.F., Hall R.A., Legg E.V. Standardization of HbA1c measurements. (Letter) Diabetic Medicina 17:

558-559, 2000.4. Bonara E., Calcaterra F., Lambardi S. şi col.. Plasma glucose levels throughout the day and HbA1c interrelationships in

type 2 diabetes: implications for treatment and monitoring of metabolic control. Diabetes Care 24: 2023 – 2029, 2001.5. Cosma M. – Explorări paraclinice în practica medicală – Ghid de date biologice 204-205, Ed. Junimea – 1982. 6. Decochez K., Keymeulen B., Somers G. şi col.. Use of an islet cell antibody assay to identity type 1 diabetic patients with

rapid decrease in C – peptide levels after clinical onset. Diabetes Care 23: 1072-1078, 2000.7. Deichmann R.E., Castello E., Horswell R., Friday K.E. Improvements in diabetic care as measured by HbA1c after a

physician education project. Diabetes Care 22: 1612-1616, 1999. 8. Dukes I. D. – K+ channels generate excitement in pancreatic beta cells – Diabetes 45; 845-853, 1996. 9. Elias S. I. şi col.. – Basal and postglucagon C-peptide levels in diabetes – Diabetes Care 25: 453-457, 200210. Fabien N., Bergerot I., Orgiazzi I. – Lymphocite function associated antigen – 1, integrin α4 and L-selectin mediate T-

cell homing to the pancreas in model of adoptive transfer of diabetes in NOD-mice. Diabetes 45: 1181-1186, 1996. 11. Fischbach T. F. – A manual of laboratory diagnostic test. 3rd Edition 196-245, 1988.12. Georgescu O., Amorin Popa R., Guja L., Vlădică M., Lichiardopol R., Ionescu-Târgovişte C. – Insulinorezistenţa în

populaţia generală – Jurnalul Român de Diabetologie 2: 116-118, 2002.13. Gerritsen M. Problems associated with subcutaneously implanted glucose sensors. Diabetes Care 23: 143-145, 2000.14. Goldstein D.E. – Glicated Hb for the Management of the diabetic patient 65-70, 2002. 15. Groop L.C., Bottazzo G.F., Donisch D. – Islet cell antibodies identify latent Type 1 diabetes in patients aged 35-75 years

at diagnosis. Diabetes 35: 237-241, 1986. 16. Ionescu-Tîrgovişte C., Bruckner I., Ioiart R., Cheţa D., Ikuodite D., Herdea M., Mincu I. – Metabolic lactic ketoacidosis.

Diabetologia Croatica 7: 381-387, 1978. 17. Ionescu-Tîrgovişte C., Cheţa D., Mihalache Natalia, Popa E., Mincu I. – Parametrii biochimici minimali necesari

diagnosticului şi tratamentului urgenţelor metabolice. Viaţa Medicală 25: 513-515, 1978. 18. Ionescu-Tîrgovişte C., Cheţa D., Truia C.I., Mirodon Z., Cheţa N., Mincu I. – Correlation between insulin antibodies and

the HLA system in a group of type 1 diabetic patients in Bucharest. Rev. Română de Medicină; Med. Internă 24: 11-17, 1986.

19. Ionescu-Tîrgovişte C., Mihalache N., Cheţa D., Popa E., Mincu I. – The glucose / lactate molar ratio as indicator of metabolic vulnerability to acidosis. Symposium über orale Antidiabetika – Dresden 12-14 Jun. 1978.

20. Ionescu-Tîrgovişte C., Mincu I., Simionescu M., Cheţa D., Mirodon Z., Sîntu E., Popa E., Bârnea A. – Dissappearance rate of insulin antibodies after discontinuing insulin treatment in 32 type 2 (non-insulin-dependent) diabetic patients. Diabetologia 27: 592-595, 1984.

21. Ionescu-Tîrgovişte C., Mincu I., Stănescu J. – The incidence of hyperlipoproteinemia (HLP) in different forms of diabetes mellitus. Diabetologia, 11: 352, 1975.

22. Ionescu-Tîrgovişte C., Mirodon Z., Cheţa D., Sîntu E., Mincu I. – Disappearance rate of insulin antibodies after discontinuing insulin treatment (Abstract). Diabetologia 21: 285, 1981.

23. Ionescu-Tîrgovişte C., Mirodon Z., Cheţa D., Sîntu E., Simionescu M., Nicolau A., Mincu I. – Comparative study of insulin antibodies in diabetic patients with primary insulin-dependence (type 1) and secondary insulin-dependence (type II). Rev. Rom. Med. Med. Int. 27: 303-311, 1989.

24. Ivanovici G. – Interpretarea analizelor de laborator. Ed. Medicală, pg. 50-67, 1976. 25. Joslin’s Diabetes Mellitus ed by C. Ronald Kahn and Gordon C. Weir, 13-th ed; Les et Fehiger, a Waverty Company,

1992. 26. Kawasaki T., H. Akanuma H, Yamanouchi T. – Increased fructose concentrations in blood and urine in patients with

diabetes. Diabetes Care 25: 353-357, 2002. 27. Kennedy L. – Self-monitoring of blood glucose in type 2 diabetes; time for evidence of eficacy. Diabetes Care 24: 977-

978, 2001. 28. King J. M. şi col.. – Effect of ambient temperature and humidity on performance of blood glucose meters. Diabetic

Medicine 12: 337-340, 1995.29. Kjems, L.L., Volund A., Madsbad S. – Quantification of beta-cell function during IVGTT in type II and non-diabetic

subjects: assessment of insulin secretion by mathematical methods. Diabetologia 44: 1339-1348, 2001. 30. Ko GTC. Chan J.C.N. Lau E. şi col.. Fasting plasma glucose as a secreening test for diabetes and its relationship with

cardiovascular risk factors in Hong Kong Chinese. Diabetes Care: 170-172, 1997. 31. Maran A., Crepaldi C., Tiengo A. şi col.. - Continuous subcutaneous glucose monitoring in diabetic patients: a

multicenter analysis. Diabetes Care 25: 347-352, 2002. 32. Marshall S.M., P.D. Home P.D., Manleyetall S.E. – Standardization of glycated haemoglobin. (Letters). Diabetic

Medicine 19: 429, 2002. 33. Mincu I., Cheţa D., Ionescu-Târgovişte C., Sîntu E., Mirodon Z. – Study of insulin antibodies in diabetic receiving a

single type of insulin from the onset of the treatment. Diabetologia Croatica 10: 217-224, 1981. 34. Mincu I., Dumitrescu C., Mihalache N., Ionescu-Târgovişte C. şi col.. – Valoarea comparativă a unor teste de explorare a

metabolismului glucidic. Med. Int. 29: 59-68, 1978. 35. Mirodon Z., Ionescu L, Ionescu-Târgovişte C. – Semnificaţia insulinemiei serice la pacienţii cu diabet zaharat nou

descoperiţi. Acta Diabetol. Rom. 21: 138-139, 1995.

31

36. Mincu, I., Ionescu-Târgovişte C. – Hipoglicemiile. Ed. Med. Bucureşti, 1990.37. Mincu I., Ionescu-Târgovişte C., Lichiardopol R., Boboc D., Marinescu C., Bruckner I., Mirodon Z., Georgescu M. –

Studiul privind secreţia de insulină în diabetul zaharat. Acta Diabetal. Rom. 14: 17, 1988. 38. Mincu I., Ionescu-Târgovişte C., Popa E., Bohaia D. şi col.. – Participarea lactatului şi piruvatului în acidoza metabilică

din diabetul zaharat decompensat. Acta Diabetol. Rom. 1: 599-608, 1975. 39. Mincu I., Popescu A., Ionescu-Târgovişte C. – Elemente de biochimie şi fiziologie a nutriţiei. Editura Medicală,

Bucureşti, 1985. 40. Mooy J.M., Grooradian P.A., de Vries H. şi col.. – Intra-individual variation of glucose, specific insulin and proinsulin

concentrations measured by two oral glucose tolerance tests in a general Caucasian population the Hoom Study. Diabetologia 39: 298-305, 1996.

41. Nijpels G., Popp-Snijders C., Kostense P.J. şi col. – Fasting proinsulin and 2-h post-load glucose levels predit the conversion to NIDDM in subjects with impaired glucose tolerance. The Hoom Study. Diabetologia 39: 113-118, 1996.

42. Olbricht C.J., Arlant I.P. – Magnetic resonance angiography – the procedure of choice to diagnose renal artery stenosis? – Nephrology Dialysis and Transplantation vol. 13: 1620-1621, 1998.

43. O’Sulivan J.B., Mahan C.M. – Criteria for the oral glucose tolerance test in pregnancy. Diabetes 13: 278-285, 1964. 44. Parksen N., Munn S., Steers G. şi col.. Effects of glucose ingestion versus infusion on pulsatile insulin secretion: incretin

effect is schieved by amplification of insulin secretory burst mass. Diabetes 45: 1317-1323, 1996. 45. Perry R.C., Shankar R.R., Fineberg N. şi col.. HbA1c measurement improves the detection of type 2 diabetes in high-risk

individuals with nondiagnostic levels of fasting plasma glucose: The Easly Diabetes Intervention Programe (EDIP). Diabetes Care 24: 465-471, 2001.

46. Postma T., Stores J.A.P. Clinical Chem. Acta 22, 596 1968. 47. Sacks D.B., Burns D.E., Goldstein D.E. şi col.: Guidelines and recommandations for laboratory analysis in the diagnosis

and management of diabetes mellitus. Diabetes Care 25: 750-786, 2002. 48. Serafinceanu C., Ionescu-Târgovişte C. – Consideraţii privind definiţia şi clasificarea actuală stadială a bolii renale

diabetice– Jurnalul Român de Diabetologie, vol. 8, 33-34, 2001. 49. Service F. J., Rizza R.A., Zimmermann B.R. şi col.. – The classification of diabetes by clinical and C-peptide criteria: a

prospective population – based study. Diabetes Care 20: 198-201, 1997. 50. Simell T., Maenpaa J., Kapera E.A. şi col. – Serum insulin profiles in consecutive children 2 years after the diagnosis of

IDDM. Diabetologia 39: 97-106, 1995. 51. Smiths D.E., Heckermeyer C.M., Kratt P. and Mason D.A. – Motivational interviewing to improve adherence to a

behavioral weight-control program for older obese women with NIDDM a pilot study. Diabetes Care 20: 52-54, 1997. 52. Stott A., Casson I.F., Higgins G.J. – Glycated haemoglobin assays. Approaches to standardization of results. Diabetic

Medicine 18: 274-279, 2001. 53. Şerban V. – Progrese în Diabetologie. Editura de Vest, Timişoara, 1996. 54. Tattersall R.B. – Home blood glucose monitoring. Diabetologia 16: 71-74, 1979. 55. Torn C. Predictability of C-peptide for autoimmune diabetes at diagnosis – Practical Diabetes International vol. 18, 3; 83-

88, 2001. 56. Traité de Diabetologie edited by Tchobrontsky G., Slawka G., Assan R. and Freychest P., Pradel Publishers, Paris, 1990. 57. Treszen K.L. şi col.. – Evaluation of a second generation electrochemical blood glucose monitoring system – Diabetic

Medicine 12: 173-176, 1995. 58. Wallach J. – Interpretation of diagnostic tests, 562-567, 1998. 59. Williams Textbook of Endocrinology edited by Wilson I.D. and Forter D.W., 8th edition; W.B. Saunders Company, 1992. 60. Wilson David H. – Abbot Glicated Hemoglobin Assay 54-62, 2002. 61. Zöllner M., Mirsch K.Z. – Gestational experimental Medicine 135-545, 1962.

32