Biocapteurs ampérométriques à cholinestérasespour la détermination des pesticidesorganophosphorés

Graziella Turdean, Ionel Catalin Popescu et Liviu Oniciu

Résumé: Le but de cette étude est une présentation comparative des différents types de biocapteurs ampérométriques àcholinestérase pour la détermination des pesticides organophosphorés basée sur l'information bibliographique des 20dernières années. L'étude contient la présentation de la structure et les propriétés des cholinestérases, les principalesréactions impliquées dans le fonctionnement du biocapteur ampérométrique, leurs applications et les facteurs influen-çant le procès de la détection ou (et) de l'inhibition. Les valeurs de la limite de détection obtenues à l'aide des biocap-teurs mono- ou bi-enzymatiques sont relativement plus élevées par rapport à celles obtenues par les méthodesimmunologiques ou par chromatographie en phase gazeuse et liquide, qui demeurent les méthodes de référence.Comme il a été montré aussi pour d'autres biocapteurs ampérométriques, l'application du traitement cinétique de Mi-chaelis–Menten, utilisé pour les réactions catalysées par l'enzyme libre, peut être extrapolée pour examiner la réponsedes biocapteurs ampérométriques à l'enzyme immobilisée. Le compromis positif entre les avantages et les inconvé-nients, ainsi que les conditions expérimentales « douces », font du biocapteur ampérométrique monoenzymatique, unoutil analytique intéressant pour la détection des pesticides organophosphorés.

Mots clés: biocapteurs ampérométriques, acetylcholinestérase, pesticides organophosphorés, cinétique, inhibition.

Abstract: The purpose of this study is a comparative presentation of the different types of the amperometric biosensorsbased on cholinesterases for the determination of organophosphorous pesticides using the bibliographical information ofthe last 20 years. The study contains the presentation of the structure and properties of the cholinesterases, the main re-actions implied in the functioning of the amperometric biosensors, their applications and factors influencing the detec-tion or (and) the inhibition process. The detection limit of the mono- or bi-enzymatic amperometric biosensors arerelatively higher than those corresponding with the immunobiosensors or with gas and liquid chromatography, whichare still considered as the reference methods. As shown, for many other amperometric biosensors, the Michaelis–Menten’s kinetic treatment used for reactions catalyzed by free enzymes can be extended to describe the response ofamperometric biosensors based on immobilized cholinesterases. The positive compromise between advantages anddrawbacks, as well as the “soft” experimental conditions, point to the amperometric monoenzymatic bioelectrode, as anattractive analytical tool for the detection of organophosphorous pesticides.

Key words: amperometric biosensor, acetylcholinesterase, organophosphorous pesticides, kinetic, inhibition.Turdeanet al. 331

Introduction

Pendant les dernières années, l’utilisation des pesticides(insecticides, herbicides, fongicides) en quantités de plus enplus importantes — afin de surmonter les nécessités de nour-riture réclamées par l’explosion démographique — a en-traîné l’augmentation de la pollution de l’environnement,notamment avec des insecticides organophosphorés. Cessubstances toxiques possèdent un effet nocif contre les in-sectes et les mammifères, mais aussi présentent un danger

important pour l’être humain, puisqu’elles agissent au ni-veau du système nerveux.

Dû à leur persistance dans le sol et dans l’eau de la nappephréatique, les normes nationales et internationales imposentdes concentrations maximales admissibles des pesticides deplus en plus faibles. Les méthodes analytiques acceptéespour leur dosage utilisent des techniques très complexespour l’identification et la détermination. Parmi ces techni-ques, les plus utilisées sont la chromatographie en phase li-quide et en phase gazeuse, souvent couplées à laspectrométrie de masse, techniques très performantes maisaussi laborieuses, coûteuses et qui nécessitent un personnelhautement qualifié.

Étant très spécifique, le mécanisme d’inhibition des choli-nestérases induit par les pesticides organophosphorés aconduit au développement de nombreuses techniques d’analyserapide. Ainsi, une solution moderne aux méthodes déjàclassiques est offerte par les méthodes électroanalytiques,qui utilisent des outils simples, capables de délivrer une in-formation rapide dans différents domaines d’application :

Can. J. Chem.80: 315–331 (2002) DOI: 10.1139/V02-021 © 2002 CNRC Canada

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Reçu le 27 mars 2000. Publié au site Web des Pressesscientifiques du CNRC à http://canjchem.cnrc.ca,le 22 mars 2002.

G. Turdean,1 I.C. Popescu et L. Oniciu.2 Département deChimie Physique, Université Babes-Bolyai, 3400 Cluj-Napoca, Roumanie.

1Auteur correspondant (courriel : gturdean@chem.ubbcluj.ro).2Décédé.

agro-alimentaire (1), biomédical (2, 3) et environnement (4).Parmi ceux-ci, les biocapteurs électrochimiques sont de plusen plus utilisés. Ils consistent dans le couplage d’un récep-teur de nature biologique à un transducteur électrochimique.Grâce à l’excellente spécificité des enzymes et à la trèsbonne sensibilité des transducteurs ampérométriques, la plu-part des recherches récentes a été orientée vers la réalisationde biocapteurs ampérométriques enzymatiques. Ceux-ci met-tent en valeur, à la fois, la grande variété des éléments de re-connaissance biologiques et les avantages de la techniqueampérométrique, comme par exemple : la haute sensibilité etla bonne sélectivité pour l’espèce électroactive; le domainede linéarité étendu; la fabrication facile d’un appareillagepeu coûteux; l’utilisation des matériaux d’électrodes compa-tibles dans différents milieux.

Depuis la construction du premier biocapteur ampéromé-trique pour glucose (5) et malgré une activité de rechercheintense, les applications des biocapteurs introduites dans lavie courante sont encore rares. L’obstacle majeur au déve-loppement et à la commercialisation de ces outils estl’instabilité de l’enzyme immobilisée. À la fois, l’existencede certaines substances susceptibles d’interférer au niveaudu transducteur, souvent présentes dans les échantillons àanalyser, constitue encore un problème à résoudre.

Les pesticides organophosphorés

DéfinitionConformément aux normes du Food and Agricultural

Organization (FAO) (6) un pesticide est défini comme« toute substance ou mélange de substances : (i) utiliséepour la prévention, la destruction ou le contrôle de tout ani-mal, espèces de plantes, qui cause préjudice pendant, ou in-terfère avec, la production, le traitement, le stockage, letransport ou la commercialisation des aliments, des produitsagricoles, du bois ou des produits en bois, du fourrage pouranimaux; (ii ) administrée aux animaux pour le contrôle desinsectes; comme régulateur de croissance des plantes, défo-liant, ou agent conservant les fruits pour prévenir leur chuteprématurée; (iii ) appliquée à la récolte (soit avant, soit après)en vue de protéger les produits de la détérioration pendant lestockage et le transport » (6).

StructureLe grand développement des pesticides organophosphorés

a commencé en 1944, quand Schrader a synthétisé le para-thion. Les pesticides organophosphorés, dont la formule gé-nérale est présentée dans la figure 1, sont des esters, desamines ou des dérivés thiols de l’acide phosphorique ouphosphonique. Les groupements R1 et R2 peuvent être desalkyls ou des aryles et X est un groupe hydrolysable alipha-tique, aromatique ou hétérocyclique. En général, ils sont descomposés solubles dans l’eau. En milieu alcalin, ils sont ra-

pidement hydrolysés et oxydés en acide (thio)phosphoriqueou (thio)phosphonique (mono- ou di-substitué).

Modalités d’action des pesticidesL’action des pesticides organophosphorés sur les insectes

et les mammifères se situe au niveau du système nerveux.Ces substances toxiques inhibent l’acétylcholinestérase(AChE), entraînant une accumulation d’acétylcholine dansles tissus nerveux. Au niveau des synapses cholinergiques,cette inhibition est due au blocage du site estérique del’enzyme (phosphorylation ou carbamylation du OH de lasérine du site actif) (7–9) par les composés organophospho-rés, qui agissent en compétition avec le substrat spécifiquede l’enzyme (10). Cette fixation conduit à la formation decomplexes intermédiaires de type phosphoryl- ou carbamyl-AChE, qui s’hydrolysent très lentement (11). L’accumulationde l’acétylcholine due à l’inhibition de l’AChE peut avoirdes suites graves : maladies ou même la mort (12).

Sources de pollution par les pesticidesDe grandes quantités de ces pesticides peuvent être appor-

tées au milieu aquatique, soit directement (par dispersion),soit indirectement (par lavage des terrains agricoles), oumême accidentellement. La nature, la concentration, la solu-bilité dans l’eau et la capacité de dégradation des pesticidessont des facteurs qui influencent leur transport dans le mi-lieu aquatique (13).

La contamination humaine par ces différentes substancestoxiques se fait principalement par l’intermédiaire de l’eau,des plantes ou des animaux qui ont ingéré des plantes conta-minées. Mais elle peut se faire également par ingestion, in-halation ou contact direct (14, 15).

Grâce à leur stabilité, les pesticides peuvent persister dansle sol pendant des mois ou des années. Une proportion im-portante de ces substances n’atteint pas leur cible et se dé-pose ou dérive dans différents écosystèmes. Une fraction sesublime dans l’air et fait l’objet d’un transport vers les zonesocéaniques les plus reculées. En milieu continental, on ob-serve aussi une incorporation à la biomasse terrestre ou lim-nique.

Normes de qualité pour l’eau potablePlusieurs normes réglementent l’utilisation et la commer-

cialisation des pesticides. Les précautions concernant la pro-tection des animaux (gibier, poisson) et du personnel,pendant la fabrication ou l’utilisation de ces pesticides, doi-vent être strictement respectées, certains de ces produitsayant un temps de demi-vie d’environ 3 mois.

Un des problèmes majeurs liés à l’utilisation de ces pesti-cides est la persistance des métabolites dans les eaux et dansles plantes, que l’on retrouve ultérieurement dans les ali-ments.

La législation concernant l’utilisation des pesticides estdevenue de plus en plus stricte, recommandant des testsnombreux et sensibles. Ainsi la norme fixée pour la produc-tion de l’eau potable, par la Communauté Économique Euro-péenne (CEE) (16), limite la teneur maximale enpesticides à 0,1µg L–1 pour chaque substance de ce groupe età 0,5µg L–1 pour l’ensemble des pesticides et de leurs com-posés de dégradation, pendant que la U.S. Environmental

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Fig. 1. Formule générale des pesticides organophosphorés.

Protection Agency établit des niveaux maximums pourchaque pesticide qui doit être mesuré (3).

Méthodes de détection des pesticides dans l’eau, l’air etle sol

Le développement des méthodes de « monitoring » est es-sentiellement centré sur trois niveaux : (i) outil rapide, trèssensible et spécifique; (ii ) technologie sophistiquée et du-rable ou solide; (iii ) outil capable de combiner la sensibilité,la flexibilité et la solidité des techniques mentionnées (p. ex.biocapteur). Parmi les nombreuses méthodes de détectiondes pesticides organophosphorés rapportés dans la littéra-ture — chromatographiques, spectophotométriques, électro-chimiques, immunologiques et enzymatiques — nousn’allons détailler ici que les méthodes ampérométriques ba-sées sur l’utilisation des cholinestérases.

Biocapteurs ampérométriques

DéfinitionUn biocapteur est un dispositif intégré, indépendant, ca-

pable de fournir des informations analytiques quantitativesou demi-quantitatives, utilisant un élément de reconnais-sance biologique (récepteur biologique) qui est en contactdirect avec un transducteur (17–25). Cette définition est enconformité avec les normes émises par la Commission del’IUPAC.

Caractéristiques de la détection ampérométriqueSuivant la définition déjà donnée, un biocapteur ampéro-

métrique (BA) est constitué par deux unités opérationnellesde base : le récepteur et le transducteur. Dans le cas de BA,le transducteur est de type ampérométrique. Celui-ci estconstitué notamment d’une électrode conventionnelle oumodifiée qui fournit à un potentiel contrôlé, comme signalde réponse, un courant électrique, entretenu par la réactionélectrochimique d’une espèce chimique, résultante naturellede la réaction biochimique ou d’un intermédiaire (médiateurredox), délibérémentintroduit dans la structure du BA (fig. 2).

Le récepteur peut être de type catalytique (enzyme, orga-nite, cellule, tissu) ou de type non catalytique (anticorps, an-tigène).

La quantité du substrat impliquée dans la réaction électro-chimique, qui est à la base du fonctionnement du transduc-teur ampérométrique (TA), est donnée par la loi de Faraday.L’intensité (densité) du courant obtenu au niveau del’interface électrochimique active dépend de la concentrationde l’espèce électroactive, du type de transport de masse del’espèce électroactive et de la valeur du potentiel del’électrode (par l’intermédiaire d’une relation de type Bu-tler–Volmer).

La construction, les performances et les possibilitésd’utilisation des BA dépendent exclusivement de la naturedu signal d’excitation et des conditions de transport demasse de l’espèce électroactive vers l’électrode. Selon laforme du signal d’excitation du TA, on peut avoir des mesu-res ampérométriques (à potentiel contrôlé) ou voltamétriques(balayage de potentiel d’électrode) (25, 26).

Les techniques ampérométriques nécessitant un appareil-lage simple sont, par conséquent, très utilisées pour la carac-térisation des BA. D’autre part, elles ont l’avantage de

mesurer le courant à des valeurs fixes de potentield’électrode (généralement, dans la zone contrôlée par la dif-fusion), ce qui élimine la contribution du courant capacitif(limite de détection plus basse). Si la solution voisine du TAn’est pas agitée, le signal mesuré varie avec le temps (équa-tion Cotrell), ce qui rend difficile les mesures. Différentessolutions ont été proposées : (i) utilisation des TA en régimehydrodynamique (électrode à disque tournant, électrode« wall-jet », etc.); (ii ) insertion entre le BA et l’échantillond’une barrière (membrane) qui limite l’augmentation entemps de l’épaisseur de la couche de diffusion; (iii ) pulsa-tion du potentiel d’électrode d’une valeur initiale correspon-dant à la zone d’inactivité électrochimique à une valeurfinale située dans la zone d’activité électrochimique con-trôlée par la diffusion; (iv) utilisation de microélectrodes(électrodes ayant une dimension caractéristique d’environ1 × 10–6 m), avec leurs particularités remarcables (3), no-tamment : (a) le transport de l’espèce électroactive par diffu-sion sphérique, qui améliore l’accès de celle-ci vers lasurface de l’électrode, et (b) le courant capacitif réduit, quiaugmente le rapport signal/bruit.

Les techniques voltampérométriques (comme la voltampé-rométrie cyclique) ont d’excellentes capacités de diagnostic.Elles sont utilisées dans le processus d’élaboration etd’insertion du BA dans différentes techniques d’analyses.Les difficultés liées aux appareillages utilisés et à la contri-bution relativementimportante du courant capacitif (ic ~ vitessede balayage) limitent l’utilisation de ces techniques pour ladétection ampérométrique.

Il est intéressant de remarquer que la sélectivité du BA,déterminée principalement par l’enzyme, peut être aussi mo-dulée par le contrôle adéquat des étapes qui interviennentdans le fonctionnement du TA associé : le transfert de chargeà l’interface du TA (contrôle électrochimique) et le transfertde matière vers l’électrode (contrôle hydrodynamique).

Techniques d’immobilisation de l’élément biologiqueLes caractéristiques des capteurs à enzyme dépendent des

propriétés de l’enzyme immobilisée (27). Dans le cas del’immobilisation, l’enzyme soluble dans un milieu aqueux se

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Fig. 2. Types de détection ampérométrique directe et indirecte.Enzox–Enzred, l’enzyme; Medox–Medred, le médiateur; S, lesubstrat, P, le produit; X, le reactant ou produit électroactif.

fixe dans une matrice insoluble dans l’eau. Ainsi, on observeune décroissance artificielle de la mobilité de l’enzyme, as-sociée à une transformation de la catalyse homogène en unecatalyse hétérogène (28).

Les principales techniques d’immobilisation de l’enzymesont présentées dans la figure 3.

Les méthodes d’immobilisation doivent garantir (28–30) :(i) le maintien de l’intégrité de la conformation tertiaire del’enzyme, en particulier au niveau du site actif; (ii ) l’accèsdu substrat au site actif de la biomolécule; (iii ) le transportdu substrat et du produit à travers la couche biologique im-mobilisée.

Après immobilisation, les propriétés de l’enzyme peuventêtre modifiées par suite des effets conformationnels, des ef-fets stériques et des effets de transfert de matière. Il est évi-

dent que les modifications observées sur les propriétés enzy-matiques après immobilisation sont la résultante des diffé-rents facteurs cités, l’effet de chaque facteur isolé étant àdéterminer.

Les avantages et les inconvénients de l’immobilisation del’enzyme sont présentés dans le tableau 1.

Biocapteurs ampérométriques àcholinestérases

Les cholinestérases

ClassificationLes cholinestérases sont divisées en acétylcholinestérase

(E.C. 3.1.1.7.) (AChE) et en pseudocholinestérase (E.C.3.1.1.8.) (p. ex. butyrylcholinestérase) (BuChE) (35–38).

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Avantages Inconvénients

Augmentation de la stabilité de l’enzyme vis-à-vis de lamodification du pH ou de la température;

Augmentation de la complexité du système étudié;

Diminution du coût de l’analyse due à la réutilisation del’enzyme;

Nécessité pour le substrat de diffuser vers l’enzyme et pour leco-substrat ou le produit de diffuser vers le transducteur;

Fonctionnement sur de longues périodes;

Utilisation directe de l’enzyme dans le milieu réactionnel qu’ilcatalyse;

Modifications des propriétés de l’enzyme dues aux interactionssupport – site actif de l’enzyme et aux différences entre laphase aqueuse et le microenvironnement de l’enzyme

Séparation rapide du milieu réactionnel;

Utilisation dans des solvants organiques ou à hautetempérature, conditions dans lesquelles normalementl’enzyme perd son activité;

Facilité de mise en oeuvre des réacteurs en continu;Limitation des interférences

Tableau 1. Avantages et inconvénients de l’enzyme immobilisée (31–34).

Fig. 3. Techniques d’immobilisation de l’enzyme.

HistoriqueL’acétylcholinestérase a été découverte en 1938 par David

Nachmanson. Il a isolé et purifié cette enzyme à partir desmembranes excitables provenant des nerfs de différentsmammifères, oiseaux, reptiles et insectes (39). La plupartdes recherches, dirigées vers l’étude de sa structure, ont étéréalisées avec de l’enzyme isolée et purifiée de la plaqueélectrique de l’anguilleElectrophorus electricus(37, 40, 41).

StructureL’enzyme est une protéine complexe qui possède un

centre anionique, un centre estérique, une multitude de cen-tres périphériques et de nombreux domaines hydrophobes(39). Le site actif de l’enzyme contient le centre anionique,qui fixe les groupements cationiques du substrat (p. ex. selsd’ammonium quaternaire) et le centre estérique (qui possèdeune sérine), dont le OH est acylé pendant la réactiond’hydrolyse (42, 43) (fig. 4).

Le centre anionique contient des charges négatives, quiproviennent du groupement COO– des chaînes latérales desacides aminés aspartique ou glutamique. Ce centre anioniquepermet la fixation des charges positives (p. ex. choline) pro-venant du substrat (35).

Les principales caractéristiques des cholinestérases sont pré-sentées dans le tableau 2. D’autre part, il faut mentionner quede nombreuses études ont été élaborées sur le comportementdes cholinestérases, dans des situations spécifiques, comme parexemple : le viellisement (37, 40, 42–49), l’inhibition des cho-linestérases et l’inactivation thermique (50).

Techniques d’immobilisation des cholinestérasesDans la plupart des applications, l’enzyme doit être im-

mobilisée sous sa forme active (54). L’immobilisation di-minue l’action des inhibiteurs irréversibles sur l’activitéenzymatique (27). Dans le tableau 3 sont présentées les dif-férentes modalités d’immobilisation de l’AChE et la BuChE(éventuellement couplées avec la choline oxydase, ChO) enfonction du type de détection utilisée. Le pH optimumd’immobilisation est situé entre 7,2 à 7,8 (54).

L’immobilisation de l’enzyme par « liaisons covalentes »met en jeu une réaction chimique, qui réalise une liaison irré-versible entre la molécule d’enzyme et les groupements réactifsdu support. À ce type de liaison s’ajoutent toujours des phéno-mènes d’électrosorption, qui consolident la liaison support–en-zyme. La formation de la liaison covalente peut conduire à lamodification de la structure tridimensionnelle de l’enzyme, al-térant son activité enzymatique (28). Pour l’immobilisation del’AChE par liaison covalente sur une surface de platine, onpeut utiliser avec succès différentes méthodes de modificationchimique du groupement OH présent sur la surface du support: (i) activation des groupements OH par le carbodiimide ou lechlorure de trésil, pour produire des groupements capables deréagir directement avec l’enzyme; (ii) modification basée sur laformation de pontages entre les groupements aminés d’un sup-port et de l’enzyme par l’intermédiaire d’un ligand bi- ou mul-ti-fonctionnel, ce qui permet d’écarter le biocatalyseur de sonsupport solide et d’améliorer l’accessibilité du substrat au siteactif de l’enzyme (29). De même, l’utilisation du glutaraldé-hyde (GA), qui se lie sur les groupements aminés du silane, estégalement possible. D’autres réactifs hétérofonctionnels (ester

n-γ-maleimidobutyriloxisuccinamidique) sont utilisés et peu-vent former des liaisons avec les fonctions thiols de silane (54).

Dans la technique de « co-réticulation », les moléculesd’enzyme sont liées entre elles par pontages intermoléculai-res, faisant intervenir des agents bi- ou multi-fonctionnels.On obtient ainsi des structures de très haut poids molécu-laire. La co-réticulation avec GA fournit des films reproduc-tibles, dans lesquels, la densité enzymatique, l’épaisseur etla nature de la protéine inactive peuvent être contrôlées (28).

Réactions utilisées dans le fonctionnementdes biocapteurs ampérométriques àcholinestérases

Les deux principales étapes impliquées dans le fonction-nement des biocapteurs ampérométriques à cholinestérasessont : la réaction biochimique d’hydrolyse catalysée parl’enzyme et la détection électrochimique de l’espèce élec-troactive formée pendant la réaction biochimique. Les réac-tions possibles sont synthétisées dans le tableau 4.

Le mécanisme de l’hydrolyse — du plus simple subs-trat — l’acétylthiocholine (ASCh), catalysé par l’AChE, suittrois étapes (39) décrites dans les schémas suivants (fig. 5).

L’ASCh se fixe sur le site actif de l’enzyme par des liai-sons électrostatiques, qui se forment entre la charge positive

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Fig. 4. La structure de l’acétylcholinestérase (A) et comparaisonentre la structure de l’enzyme inhibée (B) et de l’enzyme noninhibée (C) (133).

de l’atome d’azote d’ASCh et la charge négative du siteanionique de l’enzyme, formant un complexe enzyme–subs-trat (ES) (étape I). En même temps, la réaction d’acétylationde l’OH de la sérine du site estérique est catalysée par laprésence du groupement imidazole basique de l’histidine etpar le groupement acide AH (l’hydroxyl de tyrosine). Il y aalors formation de l’enzyme acétylée EA (étape I). La désacé-tylation (étapes II, III) est une réaction rapide, qui permet lalibération de l’enzyme libre (E) en quelques millisecondes.

L’hydrolyse de l’ASCh catalysée par l’AChE, en considérantles deux étapes d’acétylation et de désacétylation, a un méca-nisme identique à celui d’une réaction acide–base (39).

La détection électrochimique est réalisée par l’oxydation de lathiocholine – produit électroactif de la réaction biochimique –dans le cas du système monoenzymatique ou par l’oxydation–ré-duction (en fonction de transducteur) de l’eau oxygénée, dans lecas du système bienzymatique. L’oxydation peut avoir lieu di-rectement sur l’électrode ou par l’intermédiaire des médiateursredox. Ces différentes modalités de détection possibles serontdétaillées et exemplifiées par la suite.

Application des biocapteursampérométriques à cholinestérases pour ladétection des pesticides organophosphorés

L’utilisation des biocapteurs ampérométriques à cholines-térase est largement répandue pour la détection de la concen-tration globale en pesticides. Le principe de détection d’unbiocapteur est fondé sur l’effet inhibiteur exercé par les pes-ticides sur l’enzyme immobilisée. La différence entrel’activité enzymatique initiale et celle enregistrée après uneincubation dans un échantillon contaminé, fournit des infor-mations d’un côté sur la présence des pesticides et de l’autrecôté sur le potentiel toxique et la concentration del’échantillon (80, 92–94).

Les différents types de biocapteurs ampérométriques utili-sés pour la détection des pesticides présentés par la suitesont classifiés selon le type de cholinestérase immobiliséeacétylcholinestérase (AChE) ou butyrylcholinestérase(BuChE) et selon le nombre d’enzymes immobilisées (mo-no-, bi- ou tri-enzymatique).

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CaractéristiquesAcétylcholinestérase (E.C. 3.1.1.7.) (estérase spécifique,« vraie » cholinestérase)

Butyrylcholinestérase (E.C.3.1.1.8.) (estérase non spécifique,pseudo– cholinestérase)

Masse moléculaire (Mét.d’équilibre de sédimentation)

260 000 ± 10 000 Da (40), dont 23,9 % sont dus auxcarbohydrates (35)

340 000 Da (35)

Localisation Tissus nerveux, musculaires, organe électrique, érythrocyte(prédominante) (37, 47), organe (thymus) (51)

Sérum (prédominante) (37),pancréas, foie, certaine glandesalivaire (51); existe sous formesoluble dans l’eau (39)

Activateurs MgCl2, CaCl2, Mn2+ et NaCl (51), KCl, BaCl2 (48) Métaux divalents, aminoacides etalcools (49)

Inhibiteurs Uréthanes (fisostigmine, neostigmine), sels d’ammoniumquaternaires (bleu de méthylène, choline, prostigmine),métaux lourds (30), amine, amide, composés hétérocycliquesavec azote (alcaloïdes), alkyl-fluorophosphates, alkyl-polyphosphates, (barbituriques), nicotine, Pb2+, F– (51, 52)

Inhibition par l’excès de substrat Acétylcoline et d’autres substrats (53) en grandeconcentration (47, 49)

Non observé (47)

pH optimal 7,5–8 (47) 8,5 (47)

Points isoélectriques 4,65–4,7 (47) 4,0 (47)

Stabilité aux variations de pH Faible (47) Plus élevée (47)

Substrats possibles :Acétylcholine + (44) + (37, 44)Propionylcholine + (44) + (44)Butyrylcholine + (44) + (44, 47)Tributyrylcholine – (47) + (47)Acétyl-β-méthylcholine + (37, 47) – (37, 47)Benzoylcholine – (47) + (44, 47)Phénilacetylcholine – (47) + (47)Atrolacétylcholine – (47) + (36)Succinylcholine – + (53)Butyrylcholine – + (37)

Tableau 2. Les propriétés des cholinestérases.

Système monoenzymatiqueL’utilisation de la technique ampérométrique monocholi-

nestérique (AChE ou BuChE) nécessite l’utilisation commesubstrat de l’acétylthiocholine ou de la butyrylthiocholine.Dans ce cas, la détection électrochimique est réalisée parl’oxydation de la thiocholine, conformément aux réactions 1(tableau 4) (12, 55–57, 62, 63, 76, 77, 81–86, 95) ou réac-tions 2 (tableau 4) (57, 80–82, 87, 88).

Les conditions expérimentales de détection des pesticideset les limites de détection correspondantes sont présentéesdans le tableau 5.

Du fait que la surtension d’oxydation du substrat (thio-composé) sur le platine est relativement grande, on préfèreutiliser des électrodes en carbone non- ou (et) modifiées.D’autre part l’oxydation de la thiocholine est un procès irré-versible et suivant les conditions expérimentales (présenceou absence de l’oxygène, présence ou absence d’un média-teur) (62–63, 77, 96–100) la valeur du potentiel appliqué à

l’électrode se situe dans l’intervalle entre –0,2 et –0,85V/Ag/AgCl. Le mécanisme d’oxydation de la thiocholine(RSH) est analogue à celui de l’oxydation de la cystéine. Ladétermination du nombre d’électrons impliqués dans ce pro-cessus confirme que deux ions de Co (I) s’oxydent en mêmetemps par interaction avec la liaison disulfurée du produitd’oxydation (RSSR) (99, 100).

L’immobilisation de l’AChE est possible par liaison cova-lente sur graphite modifié avecN-cyclo-hexyl-N ′ (2-N-mé-thylmorpholino) éthylcarbodiimide-4-toluènesulphonate (62,101) ou par inclusion dans un mélange biocomposite, pré-paré de poudre de graphite, d’une résine époxydique (Epo-Tek H77) et de l’enzyme (12, 102). Dans ces cas, la détec-tion de l’ASChI a lieu à +0,8 V/ESC (97) et de l’ASChCl à+0,7 V/Ag/AgCl. (12, 102) La réalisation d’une électrodebiocomposite, dont la construction est simple et rigide, cor-respond à un biocapteur à usage unique très adéquat pourl’usage dans le domaine médical (102).

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EnzymeTechniquesd’immobilisation Membrane – support – agent d’immobilisation

Electrode detravail

Référencesbibliographiques

AChE Inclusion PVA-SbQ Pt 55–57Liaison covalente Nylon Type Clark 58

Polyéthylénimine 50 % + GA CV 59GA + BSA – nylon CV 10Couplage avec les sels de diazonium, condensation

avec diimide – verre silanisé60

Nylon CV 61Réticulation GA CoPC-SPE 62

TCNQ – GE – BSA + GA EG 63

AChE + ChO Adsorption Nylon modifié avec le diméthylsulfate + lysine + GA Type Clark 64Pall immunodyne Pt 65TTF-TCNQ – Pt Pt 66

Inclusion PVA-SbQ Type Clark 67, 68Réticulation ChO + polyasetidine – dialyse Pt 58

AChE + BSA + GAChO réticulation + ChO – nylon + GA + Type Clark 69AChE adsorption AChE – nylonRéticulation GA – acétate de cellulose Pt 70Réticulation GA – nylon Type Clark 71Liaison covalente Polymère rédox (poly(4-vinylpyridine)Os(2,2′-

bipyridine)2Cl par l’intermédiaire de l’avidinCV 72

Pt 73

BuChE Réticulation GA – TCNQ-graphite Grafite 74

BuChE + ChO Inclusion Membrane de dyalise Type Clark 75Liaison covalente Nylon Pall Biodyne modifié + carbodiimide Type Clark 4

AChE ou BuChE Réticulation GA + nylon – immobilon Affinity EPC 76GA + BSA CoPC-EPC 77

AChE + ChO + HRP Liaisonélectrostatique

Dialdehyde glutarique Au 78

BuChE + ChO + HRP Réticulation GA SPE 79

Nota : GA, glutaraldéhyde; CV, carbone vitreux; EPC, électrode à pâte de carbone; PVA-SbQ, alcool polyvinylique; TTF-TCNQ, tétrathiafulvalène-tétracianoquinodiméthane; EG, électrode en graphite; SPE, « screen printed electrode ».

Tableau 3. Modalités d’immobilisation de l’AChE et de la BuChE.

Afin d’augmenter la stabilité de la biomolécule en vue deson immobilisation, sans que l’immobilisation ait un effetd’inactivation de l’enzyme, ceci a été possible grâce à la mo-dification chimique de l’enzyme à l’aide des polymères syn-thétiques (p. ex. copolymère acrylamide – acide acrylique) etun agent de condensation comme le réactif Woodward (N-éthyl-5-phényloxazolium-3-sulphonate) (103). Une augmen-tation de la concentration du réactif Woodward réduit lenombre des liaisons hélicoïdales polymère–protéine, tout enmaintenant l’activité enzymatique de l’AChE immobilisée.

Le matériel le plus utilisé pour la construction del’électrode est le platine (55). On peut utiliser aussi une élec-trode d’argent recouverte d’un film de mercure. Le thiolformé pendant l’hydrolyse de l’iodure de butyrylthiocholine(BuSChI), en présence de BuChE immobilisée par réticula-tion avec GA sur une membrane de nitrocellulose, formeavec le mercure un composé électroactif, qui se réduit à unpotentiel de –0,55 V/ECS. On obtient une limite de détec-tion de 3 × 10–11 M de chlorophos (40). Un autre matérielsouvent utilisé est la pâte de carbone, qui permet l’oxydationde la thiocholine à +0,61 V/Ag/AgCl (voltampérométrie hy-drodynamique) (57).

Système bienzymatique à enzymes immobiliséesLorsque l’on utilise l’acétylcholine comme substrat, le

système cholinestérique doit être couplé avec une autre en-zyme : la choline oxydase (ChO). La détection électrochi-mique est obtenue par l’oxydation de H2O2 produite dans laréaction biochimique sur une anode de platine (68, 71, 73,96) ou par la mesure de la consommation de l’O2 impliquédans la réaction biochimique en utilisant une électrodeClark, conformément aux réactions 3 (tableau 4) (58, 71, 73,75). Les différentes conditions expérimentales proposés pourla réalisation des biocapteur bienzymatique sont présentéesdans le tableau 5.

L’inconvénient de la méthode bienzymatique est quel’étape d’oxydation de la choline peut être fortement in-fluencée par les fluctuations de la teneur en O2 dans le voisi-nage de l’électrode. Dans le cas où serait utilisée la détectionampérométrique d’H2O2, le fait que celle-ci a lieu à un po-tentiel relativement élevé, où certains composés peuvent êtrefacilement oxydés, rend la méthode sensible aux interféren-ces (104, 105).

Le plus simple modèle de biocapteur bienzymatiqueconsiste à associer une anode de platine et une cathode deAg/AgCl (électrode Clark) et à les recouvrir ensuite d’unematrice enzymatique à base d’une membrane d’acétate de cel-lulose protégée par une membrane Immobilon™. La mem-brane d’acétate de cellulose protège l’anode de platine contreles éventuels interférents électrochimiques chargés négative-ment (p. ex. : phénols), très répandus dans l’eau (91).

Les études par voltampérométrie cyclique, avec une élec-trode d’or recouverte d’une membrane AChE + ChO, souli-gnent l’importance du transport de masse à l’intérieur de lamatrice bienzymatique (tableau 4, équation [3]).L’hydrolyse, au niveau de la couche enzymatique, del’acétylcholine (ACh) libre en choline (Ch), en présenced’AChE immobilisée, est réalisée avec un bon rendement.La concentration du produit (Ch) dans la matrice enzyma-tique est proportionnelle avec la concentration de l’ACh enphase aqueuse. Il est possible qu’il existe une lente libéra-tion de la Ch du réseau enzymatique, mais la choline oxy-dase fixe ce produit d’hydrolyse (Ch) avec une sensibilitéqui dépend de la concentration d’ACh libre (ou de Ch dansla couche enzymatique) (106).

La voltampérométrie cyclique d’un médiateur (l’hexa-cyanoferrate (III)) sur une électrode de carbone vitreux avecl’AChE immobilisée indique un comportement irréversibledu médiateur, contrairement au cas où l’électrode serait cou-verte de choline oxydase (ChO) quand le comportement dumédiateur est réversible. Une relation non linéaire entre le

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Schéma de réaction

Système monoenzymatique

[1] Acétylthiocholine + H2OAChEimmobilisée thiocholine + acide acétique

Thiocholine + 0.41 V/AgAgCl composé disulfure + 2H+ + 2e–

[2] Butyrylthiocholine + H2OBuChEimmobilisée thiocholine + acide butyrique

Thiocholine + 0.41 V / AgAgCl composé disulfure + 2H+ + 2e–

Système bienzymatique avec deux enzyme immobilisées

[3] Acétylcholine + H2O AChEimmobilisée choline + acide acétique

Choline + 2O2 + H2O ChOimmobilisée bétaine + 2H2O2

H2O2+ 0.6 V / AgAgCl O2 + 2H+ + 2e–

[4] Butyrylcholine + H2O BuChEimmobilisée choline + acide butyrique

Choline + 2O2 + H2O ChOimmobilisée bétaine + 2H2O2

H2O2+ 0.6 V / AgAgCl O2 + 2H+ + 2e–

[5] Acétylcholine + H2O ChOimmobilisée choline + acide acétique

Choline[H2] + ChO[FAD]immobilisée→ bétaine + ChO[FADH2]

ChO[FADH2] eld TTF TCNQ− ChO[FAD] + 2H+ + 2e–

Système bienzymatique avec une enzyme libre

[6] Acétylcholine + H2O AChElibre choline + acide acétique

Choline + 202 + H2O ChOimmobilisée bétaine + 2H2O2

H2O2+ 0.6 V / AgAgCl O2 + 2H+ + 2e–

[7] Butyrylcholine + H2OBuCHElibre choline + acide butyrique

Choline + 2O2 + H2O ChOimmobilisée bétaine + 2H2O2

H2O2+ 0.6 V / AgAgCl O2 + 2H+ + 2e–

Système trienzymatique avec les enzymes immobilisées

[8] Acétylcholine + H2OAChEimmobilisée choline + acide acétique

Choline + 2O2 + H2O ChOimmobilisée bétaine + 2H2O2

H2O2 + 2H+ + 2Med(red) HRP 2H2O +Med(ox)

Med(ox) + e– → Med(red)

Nota : Med, médiateur redox.

Tableau 4. Réactions impliquées dans le fonctionnement desbiocapteurs à cholinestérases.

courant de pic (ip) et la racine carrée de la vitesse de ba-layage des potentiels (v1/2) est observée pour chaque élec-trode modifiée de ChO, AChE et AChE + ChO, indiquant untransfert de masse lent, dû à la complexité du film. Ainsi, lescourbesip vs. v1/2 révèlent, dans le cas des faibles vitesses debalayage des potentiels, un contrôle diffusif, suivi d’une li-mitation du courant dû au transfert des électrons observéeaux grandes vitesses de balayage du potentiel. Ce phéno-mène de non linéarité est beaucoup plus prononcé quandl’électrode est modifiée avec un film bienzymatique

(AChE + ChO). De même la différence de potentiel entre lepic anodique et le pic cathodique (εa – εc) augmente, si lacomplexité du film augmente (105).

Sur le même principe (réaction 3, tableau 4) a été imaginéun bioréacteur qui contient un complexe AChE–chitine im-mobilisée sur une colonne à l’aide du glutharaldéhyde (GA).La choline formée dans le réacteur passe dans un récipientcontenant un biocapteur à ChO immobilisée sur une mem-brane de nylon (Pall Immunodyne Affinity) à l’aide de la po-lyazetidine. Avec ce système (en tampon phosphate, pH 7,5

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Fig. 5. Mécanisme d’hydrolyse de l’acétylcholine catalysée par l’acétycholinésterase.

à 37°C) on obtient des limites de détection de 1 ppb de ma-lathion et 10 ppb de paraoxon (107).

Le principe de fonctionnement d’un biocapteur avecBuChE + ChO immobilisées est décrit par les réactions 4(tableau 4) (4, 75).

L’oxydation de l’H2O2 dans une solution de tampon gly-cine 0,1 M, pH 8 à 25°C permet d’obtenir un seuil de détec-tion de 6µg L–1 pour le malathion et de 2µg L–1 pour leparaoxon. Les interférents du paraoxon sont : Pb2+, Hg2+,Cd2+, F–, PO4

3–, [Fe(CN)6]3–, salicilate, arséniate, acétate, ni-

cotine, nicotinate, nicotinamide, tyrosine, alanine, hexamé-thylène tétramine, hydroxyéthylamine (4). La mêmeélectrode peut être utilisée en milieu organique — chloro-forme–hexan (50 %, v/v) — pour la détection de 4,5µg L–1

paraoxon (75).

Système bienzymatique avec l’acétylcholinestérase ensolution et la choline oxydase immobilisée

Le principe de fonctionnement de ce type de biocapteurest présenté dans la réaction 6 (tableau 4) (58, 84). Dans cecas il faut remarquer, d’une part, qu’on observe une adsorp-tion de l’AChE sur la membrane du biocapteur, ce qui mo-

difie la précision des mesures de l’activité de l’enzyme in-hibée. D’autre part, en raison de l’hydrolyse spontanée duparaoxon à pH > 8, dans le cas de l’AChE libre ou immobi-lisée la stabilité du pesticide impose que l’incubation soitfaite à pH 7, de façon à assurer une sensibilité maximale dubiocapteur bi-enzymatique. Dans ces conditions, avec uneélectrode de platine polarisée à +0,6 V/Ag/AgCl (détectionde l’oxydation de H2O2), on obtient une limite de détectionde 2,6 ppb de paraoxon (58).

Système trienzymatiqueLa possibilité de la réalisation d’un biocapteur trienzyma-

tique a été investiguée en utilisant la séquence des réactions8 (tableau 4) (72, 73, 78, 79).

Les trois enzymes, l’AChE, la ChO et la peroxydase(HRP), ont été immobilisées en présence d’un polymère re-dox PVP-Os(bpy)2Cl (chlorure de poly(4-vinylpyridine-Os-2,2′-bypyridine) et d’un agent réticulant, le polyéthylèneglycol (PEG), sur une électrode en carbone vitreux (72).D’autres manières d’immobilisation utilisent la réticulationdu mélange des trois enzymes avec glutharaldéhyde (GA)sur « screen-printed electrode » (79) ou à l’aide des liaisons

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Enzyme SubstratpH*Température (°C)

Potentiel appliquéET Inhibiteur Limite de détection

Référencesbibliographiques

AChE ASCh 7 0,7 V/Ag/AgCl Paraoxon 27µg L–1 1220 Graphite Dichlorvos 22µg L–1

— 0,410 V/Ag/AgCl Différents pesticides 3,9–10,3µg L–1 5530 Pt

7,3 0,3 V/Ag/AgCl Paraoxon 12µg L–1 9637 CoPC-EPC Heptenophos 1800µg L–1

8 0,410 V/Ag/AgCl Paraoxon 110µg L–1 9530 Pt Trichlorfon 5µM

7 0 V/Ag/AgCl Paraoxon 0,011–0,019µg L–1 6220 SPE

8 0,41 V/ECS Paraoxon 0,3–1µg L–1 5620 Pt

7,2 0,1 V/ECS Paraoxon 49,5µg L–1 63— Graphite

BuChE BuSChCl 7,3 0,3 V/Ag/AgCl Paraoxon 1,5µg L–1 9637 CoPC-EPC Heptenophos 8,4µg L–1

7,4 0,1 V/Ag/AgCl DIFP 0,06 ppm 7420 Graphite-TCNQ PMSF 8 ppm

BuSChI — 0,61 V/Ag/AgCl Diazinon 1,5–4 × 10–9 M 5720 EPC

AChE + ChO AChCl 7 0,6 V/Ag/AgCl Paraoxon 0,14 ppb 58— Pt

Glycine, 8,5 0,65 V/Ag/AgCl Paraoxon 10–100 ppb 7125 Pt

Nota : CoPC-EPC, électrodes à pâte de carbone modifiée avec la phtalocyanine de cobalt (CoPC); CV, carbone vitreux; ET, électrode de travail; SPE,« screen printed electrode »; ECS, électrode de calomel saturée; TCNQ, 7,7,8,8-tetracyanoquinodiméthane; DIFP, diizopropylfluorophosphate; PMSF,fluorure de phénylmétylsulphonyl; *, tampon phosphate.

Tableau 5. Conditions expérimentales de détection des pesticides en solutions aqueuses à l’aide des biocapteurs ampérométriques.

électrostatiques (« self-assembled ») par l’intermédiaire dudialdehyde glutharique sur une électrode en or (78), qui per-met la détection de 1 ppb trichlorfon. Pendant l’utilisationdu système trienzymatique il est important de contrôlerl’hydrolyse spontanée du substrat l’ACh en Ch, qui a lieuquelques minutes après la préparation de la solution d’ACh.La réponse du biocapteur n’est pas satisfaisante, car la cho-line formée diffuse lentement vers la ChO et, de plus,l’AChE est inhibée par la suite de l’immobilisation dans lepolymère redox qui contient de la pyridine, connue commeayant une action inhibitrice (72).

Influence des conditions expérimentalessur le fonctionnement du biocapteursampérométriques à cholinestérases pour ladétection des inhibiteurs

Tenant compte de la particularité de la détermination despesticides à l’aide des biocapteurs enzymatiques, l’influencedes conditions expérimentales sur leur fonctionnement doitêtre examinée séparément sur la réaction enzymatique (en-zyme–substrat) et sur celle d’inhibition (enzyme–substrat–inhibiteur).

Influence des conditions expérimentales sur la réactionenzymatique

Nature du milieu tamponDifférents types de solutions tampon (phosphate, glycine,

citrate ou acide 4-(2-hydroxyethyl)-piperazine-1-éthane sul-fonique (HEPES)) ont été utilisés pour la détection des pes-ticides. On peut remarquer que certaines de ces solutionstampon contiennent des additifs (comme NaCl, MgCl2, KCl,gélatine) ayant le rôle d’augmenter la stabilité de l’AchE(11, 12, 28, 40, 56, 59, 63, 74, 79, 108).

pHLa dépendance de la réponse du biocapteur du pH du mi-

lieu réactionnel repose sur son influence sur l’activité enzy-matique de l’AChE (71, 108). Les paramètres cinétiquesintrinsèques de l’enzyme immobilisée ne sont pas les mêmes

que pour l’enzyme libre, à cause des contraintesconformationnelles, diffusionnelles ou stériques (65). Ainsi,une valeur de pH optimal pour l’activité de l’AChE de 8 aété observée en travaillant dans une solution de tamponphosphate pour l’enzyme immobilisée, alors que pourl’enzyme libre, dans les mêmes conditions, le pH optimal est9. Le changement du pH optimum pour l’activité enzyma-tique provoqué par l’immobilisation de l’enzyme est un phé-nomène connu, fréquemment observé (109). Dans lalittérature sont rapportées aussi d’autres valeurs du pH opti-mal : 7,2 à 8 (phosphate, borate) (62, 63, 76, 77, 8) (phos-phate) (56, 109), (HEPES 2,5 mM) (108, 110) et 8,5(glycine) (71).

Une relation entre la concentration du tampon et le cou-rant généré par le BA a été observée. Généralement, le cou-rant mesuré par le capteur diminue avec l’augmentation dela concentration du tampon. Néanmoins, à une valeur trèsfaible de celle-ci, le courant de fond est très stable. Une so-lution tampon HEPES, ayant une force ionique de 2,5 mM,maintient une ligne de base stable, avec un minimum de dé-rive (108, 110).

L’utilisation de certains matériaux pour la réalisation desélectrodes composites impose parfois le pH de travail. Parexemple, aux valeurs du pH plus élevées que 7, on a cons-taté une faible dégradation de l’électrode du graphite–epoxi(Epo-Tek H77)–AChE (12).

TempératureLa réponse du biocapteur est caractérisée par des valeurs

maximales si la température du substrat est de 30°C (67) ou40°C (110). Néanmoins, généralement les mesures sont ef-fectuées dans l’intervalle de température entre 20 et 30°C,car à partir de 50°C l’enzyme est rapidement dénaturée.Pour améliorer la précision des mesures, la température detravail doit être maintenue à une valeur constante, pour évi-ter toute fluctuation de la réponse du biocapteur qui pourraitêtre interprétée comme une inhibition (76).

Nature de la matriceLes caractéristiques de la matrice utilisée comme support

pour l’immobilisation de l’enzyme ont un impact important

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Fig. 6. Profils de concentration du substrat et du produit de la réaction dans une membrane ayant une concentration enzymatique faible(A), et élevée (B); 1, zone de réaction; 2, zone morte (114).

sur les performances du biocapteur : le domaine de réponselinéaire, la sensibilité, le temps de réponse, la stabilité opé-rationnelle et au stockage pendant la conservation (111).

Dans le cas de l’utilisation d’un système de détectionbienzymatique et d’un transducteur de type Clark en milieubiologique, il est recommandé de protéger la matrice enzy-matique par une membrane de type Nafion, dont le rôle estd’empêcher l’interférence de l’acide ascorbique — élec-troactif au potentiel de travail de l’électrode — avec le si-gnal de la choline ou de l’acétylcholine (112). D’autresmembranes qui améliorent les propriétés mécaniques de lamatrice enzymatique peuvent être l’acétate de cellulose (69)ou le nitrate de cellulose (113). Il faut souligner que la mem-brane de protection agit comme une barrière de diffusion del’H 2O2, produite dans la couche enzymatique, versl’électrode, en réduisant de 40 % l’amplitude du signal (69).Ainsi, la membrane, en limitant la diffusion du substrat, del’inhibiteur et de l’H2O2, diminue aussi le pourcentaged’inhibition, en réduisant à la fois la concentrationd’inhibiteur décelable.

Concentration optimale de l’enzyme immobiliséeLe degré d’inhibition est une expression dépendante de la

concentration d’enzyme immobilisée. Quand cette concen-tration est suffisamment élevée, le biocapteur n’est plus in-fluencé par la présence des inhibiteurs en faibleconcentration. Ceci s’explique par l’évolution de la concen-tration du substrat ou du produit dans la couche enzymatiquequi est fonction de la quantité d’enzyme immobilisée. Pourune faible concentration d’enzyme immobilisée, la concen-tration du substrat décroisse lentement dans la couched’enzyme jusqu’à une valeur stationnaire [Se], qui se trouveà la surface de l’électrode. Quand la concentration d’enzymeimmobilisée est élevée, la consommation du substrat a lieutrès vite, dans une région de la couche enzymatique dé-nommée « de réaction », pendant que la région « morte » estlimitée par une « interface », dont la position dépend de laconcentration d’enzyme immobilisée (114).

Le signal fourni par le biocapteur dépend de la quantitéd’enzyme immobilisée suivant une fonction hyperbolique :(i) dans la zone de faible concentration d’enzyme immobi-lisée, le système est contrôlé par la cinétique enzymatique,le signal étant fortement dépendant de la quantité d’enzymeet de la présence des inhibiteurs ou activateurs; (ii ) dans lazone de grande concentration d’enzyme immobilisée (pa-lier), le système est contrôlé par la diffusion du substrat,l’enzyme étant en excès vis-à-vis des possibilités d’accès dusubstrat et, par conséquent, peu dépendant de la présencedes inhibiteurs.

Pour une concentration donnée de pesticide, le degréd’inhibition augmente avec la diminution de la quantité del’enzyme fixée. Ainsi, il est important de fixer de faiblesquantités d’enzyme, pour pouvoir déceler des concentrationsfaibles de pesticides (71).

Influence des solvants organiquesLe remplacement de l’eau par des solvants organiques a

parfois comme résultat le changement de la sélectivité del’inhibiteur enzymatique (p. ex. les inhibiteurs forts del’enzyme dans l’eau deviennent faibles en milieu organiqueet vice versa) (115, 116).

La corrélation entre l’activité enzymatique et le degréd’inhibition dû à certains inhibiteurs de type pesticides oumétaux a été étudiée jusqu’à présent essentiellement en mi-lieu aqueux. Le remplacement de l’eau par d’autres solvantsnon aqueux et l’étude de l’inhibition de l’activité enzyma-tique dans ces milieux sont justifiés par le fait que certainsinhibiteurs ne sont pas solubles ou peu solubles dans l’eau(116, 117).

L’utilisation des biocapteurs enzymatiques pour la détec-tion de l’inhibition de l’activité enzymatique représente ungrand intérêt pour l’évaluation et le suivi de la pollution del’environnement (118). Il est connu que l’AChE, la tyrosi-nase et la peroxydase, libres ou immobilisées, peuvent êtreutilisées pour la détection des pesticides (119). Les résidusdes pesticides, présents dans l’eau ou dans les aliments enconcentrations réduites, peuvent être concentrés facilementen solvants organiques et, après, déterminés à l’aide des bio-capteurs (45, 120).

Les études réalisées en milieu non aqueux avec l’AChEimmobilisée ont permis de classer les solvants en trois grou-pes (45) : (i) solvants organiques fortement hydrophobes,non miscibles à l’eau, qui n’influencent pas l’activité enzy-matique; (ii ) solvants organiques hydrophobes, partiellementmiscibles à l’eau, qui influencent partiellement l’activité en-zymatique, la présence de l’eau dans la solution maintientune partie de l’activité enzymatique; (iii ) solvants organi-ques hydrophiles (alcools), totalement miscibles à l’eau, quiinactivent totalement l’enzyme par la destruction de la mo-nocouche d’eau nécessaire à son fonctionnement.

En même temps l’activité de l’AChE immobilisée peutêtre classifiée selon le paramètre de hydrophobicité (logP)du solvant, oùP représente le coefficient de répartition dusolvant entre 1-octanol et l’eau (30, 45) : (i) non décelableen solvants hydrophiles avec logP < 0; (ii ) variable en sol-vants avec 0 < log P < 2; (iii ) forte en solvants hydrophobesavec logP > 2.

Pour les inhibiteurs irréversibles, l’influence des solvantsorganiques sur l’effet inhibiteur est considérée moins forteque pour les inhibiteurs réversibles (30).

Facteurs influençant l’inhibition de l’enzymeL’activité de l’enzyme immobilisée utilisée pour la détec-

tion des inhibiteurs peut être altérée par la présence des inhi-biteurs irréversibles, lorsque leur concentration est élevée ouen cas d’utilisation dans des conditions « dures » (tempéra-ture élevée, pH acide), qui conduisent à la dénaturation de laprotéine. Les principaux facteurs qui influencent l’inhibitionde l’AChE sont présentés ci-dessous :

Concentration du substratL’action des inhibiteurs sur les cholinestérases immobili-

sées dépend non seulement de la nature de l’enzyme et del’inhibiteur, mais aussi de la concentration du substrat (27).En comparant la cinétique de réaction en présence du subs-trat et en présence de l’inhibiteur, il resulte que dans la pré-sence simultanée du substrat et de l’inhibiteur, le processusd’inhibition est une compétition entre le substrat etl’inhibiteur qui se rattachent au même site actif de la choli-nestérase. Pour la détection des pesticides à l’aide des bio-capteurs on peut utiliser soit l’inhibition en présence dusubstrat, soit mesurer l’activité enzymatique restante après

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l’incubation du biocapteur en présence de l’inhibiteur (10).La seconde méthode est plus souvent utilisée, car elle éli-mine la compétition substrat–inhibiteur pour l’enzyme im-mobilisée.

Temps d’incubationLe temps d’incubation est déterminé par le degré

d’inhibition de l’enzyme. À une concentration donnée depesticide, le degré d’inhibition augmente jusqu’à une valeurlimite avec l’augmentation du temps d’incubation (10, 71).Les systèmes d’analyse en flux (FIA) présentent l’avantaged’être reproductibles et éliminent la nécessité d’atteindre unsignal stationnaire (56, 57, 110).

pHLa littérature mentionne que l’inhibition de l’AChE par

les composés organophosphorés est maximale au pH physio-logique, pH 7,4 pour systèmes bienzymatiques (optimumpour ChO) (114) ou pH entre 8 et 9 pour systèmes monoen-zymatiques (30).

TempératureDes températures élevées d’incubation entraînent la déna-

turation de l’enzyme et l’hydrolyse spontanée du pesticideanalysé (71). La température optimale d’incubation est géné-ralement de 30°C, pour un temps d’incubation qui ne doitpas dépasser 30 min.

Nature du pesticideL’AChE immobilisée est plus rapidement inhibée par les

pesticides organophosphorés (paraoxon), que par les pestici-des de type carbamates (carbaryl) (10). L’AChE immobiliséeà l’aide du glutaraldéhyde (GA) et de l’albumine de sérumbovin (BSA) sur la surface d’une électrode à pH est inac-tivée irréversiblement en présence des pesticides organo-phosphorés (dichlorvos) (121, 122).

RégénérationEn présence des pesticides organophosphorés, on constate

que l’inhibition de l’activité des cholinestérases est irréver-sible. Mais, dans certaines conditions, l’activité enzymatiquepeut être totalement récupérée après un certain temps de la-vage de l’électrode avec des solutions tamponnées ou, leplus souvent, après une incubation dans des réactifs nucléo-philes (9).

La phosphorylation de l’oxime permet la régénération del’enzyme inhibée et le rétablissement de l’activité enzyma-tique conformément les équations [9] :

[9] EInh + R–H Kr → EInh–R–H kr → E–H

+ RInh

Le pourcentage de régénération se calcule en utilisantl’équation [10] (123) :

[10] % réactivation =a aa aEIA EI

E EI

−−

× 100

où : aE = activité de l’enzyme native;aEI = activité del’enzyme inhibée;aEIA = activité de l’enzyme réactivée avecrégénérateur.

Le degré de régénération spontanée de l’AChE dépend dupH, de la température et de la structure chimique du radicalfixé sur l’atome de phosphore.

Lorsque l’activité de l’AChE présente dans une membranea été fortement inhibée, la régénération de l’activité enzyma-tique n’est plus totale. Ceci peut être dû au fait que lecomplexe oxime phosphorylé, formé à l’intérieur de la mem-brane, diffuse difficilement (124). La faible régénération estdue à un processus d’hydrolyse d’un groupement alkyl d’uneliaison O–P, lié à la génération simultanée d’une charge né-gative de l’oxygène du groupement O–P, qui empêche la ré-génération avec des réactifs nucléophiles (125). La constantede régénération de premier ordre (kr,obs) est donnée parl’équation [11] :

[11] ln (Ao – Ar) = –(kr,obst) + ln (Ao – Ai)

où : Ao = activité avant inhibition;Ai = activité après inhibi-tion; Ar = activité après régénération.

Dans la plupart des cas, la régénération de l’AChE se réa-lise avec la iodure deN-méthyl-2-pyridaldoxime (2-PAM)(8, 9, 37, 56, 59, 108, 109, 124–128), conformément àl’équation [12] (129).

Le mécanisme de régénération de l’AChE consiste dansl’attaque nucléophile de l’oxygène du 2-PAM sur l’atome dephosphore, attaque favorisée par l’alcalinité du rested’histidine (fig. 7).

D’autres oximes peuvent servir à la régénération des choli-nestérases : bromure de 1,1,′triméthylène-bis(4-formylpy-ridinium) dioxime; 4-PAM, 3-PAM (121); mononitrosoacetone(MINA) (110, 130); obidoxime (111, 125); hydroxylamine (9)imidazopyridinium 4-oxime (8) 1-benzyl 2-carbaldoxime pyri-dinium (8); bromure de 1,1,′triméthylène-bis-(4-hydroxi imino-méthyl)pyridinium (TMB-4) (27, 57, 127, 130, 131);isonitrosoacétofenone (NAP) (127); diacétylmonoxime (DAM)(131); chlorure de (1–1,2-diméthyl-2-nitropropyloximéthyl)-2-(hydroxi imométhyl)-3-méthyl imidazolium (ICD467) (126);chlorure de (1,1,méthylène bis(4-(hydroxi iminométhyl)pyridi-nium) (MMB-4) (126); chlorure de (1-(((4-(aminocarbonyl)py-ridinio)métoxi)méthyl)-2-((hydroxi imino)méthyl)pyridinium)(HI-6) (126); chlorure de (oxi-bis-(4-hydroxi iminoéthyl pyridi-nium-1-méthyl) (toxigonin) (60), sulphosuccinimidyl-6-(bioti-namide)hexanoate de sodium (73).

L’efficacité de la régénération dépend de la structure dugroupement organophosphoré lié à l’enzyme (8) et, donc, dutype d’inhibition (124, 130). Les difficultés de régénérationde l’activité enzymatique imposent de réétalonner les bio-capteurs après l’inhibition et la régénération (109).

Aspects cinétiques des réactionsenzymatiques

Étant donné que le fonctionnement du biocapteur ampéro-métrique à cholinestérase est basé sur une réaction catalyséepar l’enzyme (réactions dans le tableau 4), il faut brièvementexaminer les modalités connues pour aborder cette réaction,du point de vue cinétique, dans le cas de l’enzyme immobi-lisée.

Cinétique enzymatique en phase hétérogèneDe nombreux chercheurs ont essayé de modeler la réac-

tion enzymatique quand l’enzyme est immobilisée. La ciné-

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Turdean et al. 327

tique des réactions à enzyme immobilisée est complètementdifférente de celle à enzyme immobilisée parce que (30) :(i) l’immobilisation modifie la conformation de l’enzyme;(ii ) l’interaction enzyme–substrat a lieu dans un milieu diffé-rent de celui de l’enzyme en solution; (iii ) il existe une ré-partition du substrat entre la matrice contenant l’enzymeimmobilisée et la solution; (iv) la réaction enzymatique peutêtre contrôlée par la diffusion.

Pour les enzymes immobilisées, en appliquant le traite-ment de Michaelis–Menten utilisé pour l’enzyme en solu-tion, on peut déterminer une constanteKM apparente(KM,app), qui n’est plus une caractéristique intrinsèque del’enzyme, mais de la protéine immobilisée et de son environ-nement (donc du processus électroenzymatique). Cette cons-tante cinétique dépend des phénomènes de diffusion, quipeuvent induire souvent des non linéarités sur les linéarisa-tions utilisées pour calculer sa valeur.

Le processus global régissant le fonctionnement du cap-teur tient compte de la cinétique enzymatique, des phénomè-nes de diffusion à l’intérieur du matériau support del’enzyme et aussi des étapes de transfert de charge avecl’électrode. Ces deux dernières ne sont pas déterminantes devitesse (c’est-à-dire qu’elles n’interviennent pas dans la ci-nétique), si le potentiel de détection de l’espèce électroactiveest correctement choisi et l’accès du substrat dans la matriceenzymatique est facile. Dans ce cas, la cinétique réaction-nelle sera limitée par le processus biochimique. Ainsi, la ci-nétique peut être régie par la réaction enzymatique, sil’apport en substrat est suffisamment important. L’utilisationd’une convection forcée a été envisagée à l’aide d’une élec-trode tournante ou d’une agitation magnétique.

La réponse en courant du biocapteur constitue, en fait, unemesure de la vitesse du processus global (que l’on pourraitqualifier d’électroenzymatique), qui se déroule à l’électrodemodifiée par le biomatériau. Du fait de la similitude descourbesv vs. [S] etI vs. [S], obtenues en phase homogène etavec une électrode à enzyme, il est possible d’utiliser le mo-dèle de Michaelis–Menten pour modéliser le fonctionnementde l’électrode à enzyme (catalyse hétérogène). Ce procédépermet d’extraire des mesures expérimentales la constanteMichaelis apparente (KM,app) et le courant maximum(Imax,app). Bien que peu rigoureuses (puisqu’elles sont forte-ment dépendantes des conditions expérimentales), ces gran-deurs sont très utiles pour caractériser globalement lecomportement du biomatériel immobilisé.

Cinétique de la réaction d’inhibition de l’enzymeLes inhibiteurs sont des substances capables d’interagir

avec l’enzyme et, par conséquent, de réduire la vitesse de laréaction catalysée par l’enzyme. Il existe deux typesd’inhibition de l’enzyme : réversible et irréversible. Dans

l’inhibition réversible il existe un équilibre entre l’enzyme etl’inhibiteur. L’inhibition irréversible augmente avec letemps de contact enzyme–inhibiteur. Une inhibition totale-ment irréversible s’obtient quand la concentration del’inhibiteur irréversible dépasse celle de l’enzyme.

Le mécanisme d’inhibition de l’AChE induit par les orga-nophosphorés est analogue au mécanisme d’hydrolyse dusubstrat (l’équation 13) (132) et suit deux étapes (conformé-ment les équations 14) :

[13]

[14] E–OH + InhXk

k+

−

1

1

E–OH–InhX

(E) + (P) (EInH)k2 → E–OH–Inh + X

(EP)

où : k1 et k–1 sont les constantes de vitesse en sens direct etinverse de la formation de l’intermédiaire (ES);k2 constantede vitesse de la formation du produit (P). (i) La formationréversible, avec la constantek+1, du complexe de Michaelisenzyme–inhibiteur (EInh) très stable; l’attaque del’inhibiteur (InhX) ayant lieu au niveau du groupement OHde la sérine du site actif de l’enzyme. La stabilité ducomplexe EInh dépend de la nature du radical X (133);(ii ) la phosphorylation de l’enzyme, avec la constantek2, (laliaison de l’inhibiteur par l’intermédiaire de son atome de

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328 Can. J. Chem. Vol. 80, 2002

[12]

Fig. 7. Mécanisme de régénération de l’AChE inhibée le 2-PAM.

phosphore au site actif de l’enzyme) avec le déplacement dugroupement X (15, 113, 134).

La cinétique de détection des pesticides organophosphoréss’étudie par l’incubation de l’enzyme (AChE) libre ou im-mobilisée en présence de l’inhibiteur suivie par la mesure del’activité restante (9, 10, 96). Cette approche est basée surl’équation d’Aldrige [15] (8, 10, 30, 59, 91, 96) :

[15] ln [ ]I

Ik ta

O

Inh=

où : Io = signal avant inhibition;I = signal après inhibition(10, 71, 96, 110, 135);ka = constante bimoléculaire, calculéeà l’aide de la relationka = k2/Kd (96, 135),Kd = constante dedissociation du complexe EInh, calculée commeKd = k–1/k+1;[Inh] = concentration d’inhibiteur;t = temps d’incubation.

Conclusions

Étant donnée l’ample utilisation dans le domaine agricoledes pesticides organophosphorés, très toxiques, les normesde qualité de l’environnement sont devenues de plus en plussévères et impératives à appliquer. Dans ce contexte, les pro-priétés analytiques de biocapteurs doivent être similairesavec les méthodes analytiques utilisées couramment. Les ca-ractéristiques spécifiques des détecteurs demandés pour lecontrôle de l’environnement sont : (i) spécificité pour unseul substrat (utile dans l’analyse qualitative); (ii ) mesure del’effet toxique global pour les systèmes d’alarme; (iii ) spéci-ficité de groupe pour l’identification rapide d’une classe desubstances (utile dans les mesures sélectives).

Le principe de détection des pesticides à l’aide d’un bio-capteur ampérométrique est fondé sur leur effet inhibiteurexercé par ceux-ci sur différentes cholinestérases. La diffé-rence entre l’activité enzymatique initiale et celle enregistréeaprès une incubation dans un échantillon contaminé, fournitdes informations, d’un côté, sur la présence des pesticides et,de l’autre côté, sur le potentiel toxique de l’échantillon.

La fragilité et la complexité de l’outil biologique le ren-dent difficile à maîtriser complètement et en même tempsconstituent le frein le plus important au développement desbiocapteurs. Les techniques d’immobilisation, les caractéris-tiques du transducteur, la technologie associée à la concep-tion du prototype sont les autres facteurs d’ordre scientifiqueinfluençant le développement des biocapteurs. Du point devue commercial, la difficulté réside dans la définition desbesoins et la taille encore réduite du marché del’instrumentation pour l’environnement — fortement condi-tionnés par la réglementation — malgré que l’effort finan-cier, soit de la recherche, soit des industries, est important.

Différents types d’application ont été classifiés selon letype de cholinestérase et du système enzymatique utilisé.Les meilleures limites de détection citées pour le paraoxon(le plus étudié organophosphoré) sont : 0,3 à 1µg L–1

(AChE) (56) et 1,5µg L–1 (BuChE) (96) ou 0,14µg L–1 =ppb (AChE + ChO) (58) et 2µg L–1 (BuChE + ChO) (4). Leniveau de concentration détecté par le biocapteur se situe auniveau d’alarme, donc il peut être utilisé dans les échantil-lons d’eau de rivière ou estuaire, quelques jours aprèsl’application des pesticides (136). Ces valeurs sont relative-ment grandes en comparaison avec celles rapportées pour la

technique immunologique (4 ng parathion) (137), ou bienpour la chromatographie en phase gazeuse (0,1µg L–1 met-sulfuron-methyl) (138) ou liquide (0,08µg L–1 paraoxon)(139), qui reste comme méthode de référence. La comparai-son entre les résultats obtenus à l’aide des biocapteurs et pard’autres méthodes démontre que le biocapteur à cholinesté-rase peut être employé pour développer une méthode de me-sure en continu, applicable dans l’eau de rivière (140).Malgré certains avantages, le biocapteur n’est pas imple-menté totalement dans le monitoring de l’environnementparce qu’il doit accomplir encore des nécessités demandéspour les techniques robustes comme (i) la reproductibilité delongue et courte durée; (ii ) l’absence des réponses interfé-rentes et (iii ) la solidité suffisante pendant l’utilisation dansdifférents matrices de l’environnement.

Bien que ce domaine de recherche ait été étudié depuis unpeu plus d’une vingtaine d’années, la recherche active decollaborations pluridisciplinaires (biochimie, toxicologie,écotoxicologie, chimie, électrochimie, physique, électro-nique et informatique) est laborieuse, et plusieurs program-mes nationaux des Ministères de la Recherche ouprogrammes internationaux coordonnés par la Communautéeuropéenne sont en déroulement présentement.

L’intérêt scientifique pour l’étude et le développement del’instrumentation analytique est matérialisé par la publica-tion des livres (voir références bibliographiques), d’unerevue spécialisée (Biosensors & Bioelectronics) et parl’organisation périodique des congrès spécialement dédiés àce sujet (p. ex. : BIOSENSORS’98 – Berlin, le 5ème; ou Bio-sensors’2000 – San Diego le 6ème).

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