Biochemische und funktionelle Charakterisierung eines ... · Biochemische und funktionelle Charakterisierung eines anaerob induzierten Ferredoxins aus Chlamydomonas reinhardtii Dissertation

Biochemische und funktionelle Charakterisierung

eines anaerob induzierten Ferredoxins aus

Chlamydomonas reinhardtii

Dissertation zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

angefertigt im Lehrstuhl Biochemie der Pflanzen

Arbeitsgruppe Photobiotechnologie

vorgelegt von

Jessica Jacobs

aus

Wuppertal

Bochum

Juli 2009

Biochemical and functional characterisation of an

anaerobically induced ferredoxin from

Chlamydomonas reinhardtii

Dissertation to obtain the degree

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) at the Faculty of Biology and Biotechnology

Ruhr-University Bochum

International Graduate School of Bioscience

Ruhr-University Bochum

Department of Plant Biochemistry

Work group Photobiotechnology

submitted by

Jessica Jacobs

from

Wuppertal, Germany

Bochum

Juli 2009

Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

Jacobs J., Pudollek S., Hemschemeier A. und Happe T. (2008) A novel, anaerobically

induced ferredoxin in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett., 583, 2, 325-329.

Referent: Prof. Dr. Thomas Happe, Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, AG

Photobiotechnologie

Korreferent: Prof. Dr. Elmar Weiler, Lehrstuhl für Pflanzenphysiolgie

Tag der Abgabe: 1. Juli 2009

Diese Arbeit wurde gefördert durch das Projekt „SOLAR-H“ der Europäischen Union und die

Deutsche Forschungsgemeinschaft im Sonderforschungsbereich 480.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .......................................................................................................................... 1

1.1 Photofermentation in Chlamydomonas reinhardtii........................................................ 1

1.2 Ferredoxine sind universelle Elektronenüberträger ....................................................... 5

1.3 Ziele dieser Arbeit .......................................................................................................... 8

2 Material und Methoden ................................................................................................. 10

2.1 Organismen und Anzucht............................................................................................. 10

2.1.1 Chlamydomonas reinhardtii..................................................................................... 10

2.1.2 Escherichia coli........................................................................................................ 11

2.2 Plasmide ....................................................................................................................... 11

2.3 Oligonukleotide............................................................................................................ 12

2.4 Chemikalien ................................................................................................................. 13

2.5 Enzyme......................................................................................................................... 13

2.6 Kits ............................................................................................................................... 14

2.7 Molekulargenetische Methoden ................................................................................... 14

2.7.1 Präparation von genomischer DNA aus C. reinhardtii............................................ 14

2.7.2 Transformation von C. reinhardtii........................................................................... 14

2.7.3 Präparation von RNA und mRNA aus C. reinhardtii.............................................. 14

2.7.4 Elektrophoretische Trennung von Gesamt-RNA und Northern Blotting................. 15

2.7.5 Gen-„Silencing“ in C. reinhardtii durch artifizielle microRNAs ........................... 15

2.7.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) ..... 16

2.7.7 Klonierung................................................................................................................ 16

2.7.8 Heterologe Expression von Genen in E.coli mit dem Strep-Tag II System............. 18

2.8 Biochemische Methoden .............................................................................................. 18

2.8.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen....................................................18

2.8.2 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und Western Blotting............................. 18

2.8.3 Eisenbestimmung ..................................................................................................... 20

2.8.4 Strep-Tag II Affinitätsaufreinigung ......................................................................... 20

2.8.5 Aufreinigung von nativem Fdx5 .............................................................................. 20

2.8.6 Herstellung von polyklonalen Fdx5 Antikörpern..................................................... 21

2.8.7 Massenspektrometrische Identifizierung und N-terminale Sequenzierung.............. 21

2.8.8 Bestimmung des Redoxpotentials mittel cyclischer Voltammetrie (CV) ................ 21

2.8.9 Ferredoxin-abhängige Aktivitätstests....................................................................... 22

2.8.10 Isolierung von C. reinhardtii Chloroplasten und Mitochondrien............................. 23

2.9 Spektroskopische Methoden ........................................................................................ 23

2.9.1 Aufnahme von EPR (Electron Paramagnetic Resonance)- Signalen von Fdx5....... 23

2.9.2 Konfokale Laser Scanning Fluoreszenz Mikroskopie.............................................. 23

2.9.3 Eisenbestimmung mittels Röntgenfluoreszenzanalyse ............................................ 24

2.10 Physiologische Messungen .......................................................................................... 24

2.10.1 Chlorophyll- und Carotinoidbestimmung ................................................................ 24

2.10.2 In vitro- Test zur Messung der Hydrogenaseaktivität .............................................. 24

2.10.3 Nachweis von Fermentationsprodukten ................................................................... 25

3 Ergebnisse ....................................................................................................................... 26

3.1 Im Genom von C. reinhardtii kodieren sechs Gene für Ferredoxine........................... 26

3.2 Heterologe Expression von FDX5 aus C. reinhardtii in E.coli.................................... 29

3.3 Aufreinigung von heterolog synthetisiertem Fdx5 durch Strep-Tactin

Affinitätschromatographie............................................................................................ 30

3.4 Gegen heterolog produziertes Fdx5 gerichtete Antiköper zeigen die Akkumulation von

Fdx5 in C. reinhardtii auf Proteinebene....................................................................... 32

3.5 Partielle Aufreinigung von Fdx5 aus C. reinhardtii für die N-terminale Sequenzierung

...................................................................................................................................... 33

3.6 Biochemische Charakterisierung von Fdx5 ................................................................. 34

3.7 Zelluläre Lokalisation von Fdx5 .................................................................................. 37

3.8 Funktionelle Charakterisierung von Fdx5 durch Ferredoxin-abhängige Aktivitätstests..

...................................................................................................................................... 40

3.9 Postranskriptionelles Gen-„Silencing“ von FDX5 mittels artifizieller miRNAs ......... 43

3.9.1 Physiologische Analysen der amiRNA-Transformanden ........................................ 45

4 Diskussion ....................................................................................................................... 49

5 Zusammenfassung.......................................................................................................... 70

6 Summary ......................................................................................................................... 72

7 Literaturverzeichnis....................................................................................................... 73

8 Anhang ............................................................................................................................ 83

8.1 Auflistung der Ferredoxin-kodierenden Gene aus C. reinhardtii................................ 83

8.2 Auflistung der verwendeten Arbeitsgeräte................................................................... 83

9 Lebenslauf ....................................................................................................................... 85

Abkürzungsverzeichnis


Abb. Abbildung

Ack Acetat-Kinase

ad auf, bis (hinzufügen)

A. dest destilliertes Wasser

Adh Alkohol-Dehydrogenase

AdhE Acetaldehyd- und Alkohol-Dehydrogenase

Aox alternative Oxidase

Bp Basenpaare

c Konzentration

°C Grad Celsius

Chl Chlorophyll

cDNA komplementäre DNA

Cox Cytochrom-c- Oxidase

Cpx1 Coproporphyrinogen III Oxidase

Crd1 Isoform der oxidativen Cyclase (Mg-Protoporphyrin IX Monomethyl

Ester Cyclase)

Crd2 noch unbekanntes Genprodukt des Gens CRD2

Cyc6 Cytochrom c6

Da Dalton

DIG Digoxygenin

DNA Desoxyribonukleinsäure

E Extinktion

ε Extinktionskoeffizient

EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat

EPR Electron Paramagnetic Resonance

Fd Ferredoxin

Fdx2, 3, 4, 5, 6 Ferredoxin 2, 3, 4, 5, 6 aus C. reinhardtii

Fnr Ferredoxin-NADP-Oxidoreduktase

Ftr Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase

GFP Grün-fluoreszierendes Protein


Gogat Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase

h Stunde

H+ Proton

HydA1 [FeFe]-Hydrogenase 1 aus C. reinhardtii

JGI „Joint Genome Institute“

kDa Kilodalton

L10a ribosomales Protein L10a

mRNA messengerRNA

miRNA microRNA

NAD(P)H Nicotinamidadenindinukleotid (-phosphat)

Nar Nitrat-Reduktase

NCBI “National Center for Biotechnologial Information”

Nir Nitrit-Reduktase

OD optische Dichte (optical density)

p.A. per Analysis

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Pc Plastocyanin

PCR Polymerase-Ketten-Reaktion

Pdc Pyruvat-Decarboxylase

PEG Polyethylenglycol

PetF in der Photosynthese aktives Gen aus C. reinhardtii

Pfl Pyruvat Formiat-Lyase

PflA Pfl-Aktivase

Pfo Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase

Pq Plastochinon

PS I, PS II Photosystem I und II

Ptox putative chloroplastidäre Plastochinon / Sauerstoff-Oxidoreduktase

RNA Ribonukleinsäure

RNAi RNA-Interferenz

rpm “rotations per minute” (Umdrehungen pro Minute)

RT Raumtemperatur (ca. 22°C)

RT-PCR reverse Transkriptase PCR

Rubisco Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/ Oxygenase

SAM S-adenosylmethionine


SDS Natrium-Dodecylsulfat

SIR Sulfit-Reduktase

Tab. Tabelle

TAP Tris-Acetat-Phosphate

TcdE 2-Ketobutyrat Formiat-Lyase aus E. coli

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

U Unit

UTR untranslatierte Region

Vol. Volumen

(v/v) volume per volume

(w/v) weight per volume

Verzeichnis der wichtigsten Gene Gen kodiertes Protein

BLE Phleomycin-Resistenz

CTH1 Isoform der oxidativen Cyclase (Mg-Protoporphyrin-IX-Monomethyl-

Ester Cyclase)

CPX1 Coproporphyrinogen III Oxidase

CRD1 Isoform der oxidativen Cyclase (Mg-Protoporphyrin-IX-Monomethyl-

Ester Cyclase)

CRD2 Genprodukt bislang unbekannt

CYC6 Cytochrom c6

FDX2, 3, 4, 5, 6 Ferredoxine 2, 3, 4, 5 und 6

HydA1 [FeFe]-Hydrogenase HydA1

PETF PetF

PFL1 Pyruvat-Formiat-Lyase

PFLA Pfl-Aktivase

RBCS kleine Unterheit der Rubisco (RbcS)

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Photofermentation in Chlamydomonas reinhardtii

Die einzellige Grünalge C. reinhardtii ist ein photosynthetischer Flagellat, welcher der

Ordnung der Volvocales in der Klasse der Chlorophyceae angehört. Die Alge, die mitunter

auch als „photosynthetic yeast“ bezeichnet wurde, hat sich in vergangenen Jahrzehnten zu

einem bedeutenden Modellorganismus in der Zell- und Molekularbiologie entwickelt

(ROCHAIX, 1995). Die Anzucht von C. reinhardtii ist unproblematisch und kann unter sehr

definierten Bedingungen erfolgen, wobei die Grünalge sowohl photoautotroph,

photoheterotroph als auch heterotroph in Abwesenheit von Licht mit Acetat als

Kohlenstoffquelle wachsen kann. Der einfache Lebenszyklus und die leichte genetische

Manipulierbarkeit haben C. reinhardtii zu einem idealen Modellsystem für die Erforschung

der Photosynthese, der Chloroplasten- und der Flagellen-Biogenese (HARRIS, 2001; TAM und

LEFEVBRE, 1993; WEBBER et al., 1995) gemacht. Die in den letzten Jahren abgeschlossene

Sequenzierung aller drei Genome der einzelligen Grünalge hat die Chlamydomonas-

Forschung dabei einen weiteren großen Schritt vorangebracht (MICHAELIS et al., 1990; MAUL

et al., 2002; MERCHANT et al., 2007).

Während C. reinhardtii jahrzehntelang insbesondere als einzelliges Pflanzenmodell

untersucht wurde, haben Studien besonders aus den letzten Jahren gezeigt, dass die Alge auch

viele säugetier- (MERCHANT et al., 2007) und sogar bakterienartige Eigenschaften

(HEMSCHEMEIER und HAPPE, 2005) aufweist. So kann C. reinhardtii im Dunkeln unter

anaeroben Bedingungen innerhalb weniger Minuten einen komplexen

Fermentationsstoffwechsel ausbilden, der für Pflanzen untypisch ist. Dieser ist

gekennzeichnet durch die Produktion von Wasserstoff, Formiat, Ethanol, Acetat und CO2,

sowie Spuren von Glycerol und Lactat (GFELLER und GIBBS, 1981; HEMSCHEMEIER und

HAPPE, 2005; HEMSCHEMEIER et al., 2008 a).

Eine Besonderheit von C. reinhardtii ist, dass dieser Fermentationsstoffwechsel nicht nur im

Dunkeln, sondern auch unter Belichtung ausgebildet werden kann, wenn den Zellen das

Nährelement Schwefel entzogen wird und sie gleichzeitig luftdicht verschlossen sind (MELIS

et al. 2000). Da Schwefel essentieller Bestandteil von Proteinen (Cystein, Methionin), Lipiden

(Sulfoquinosovyl-Diglyceride) und Kofaktoren (Biotin, Thiaminpyrophosphat, [FeS]-Cluster)

ist, induziert der Mangel an Schwefel in der Alge daher eine Reihe von Reaktionen, die unter

anderem zu einer erhöhten Sulfataufnahme und -assimilation führen (LIEN und SCHREINER,

1975; YILDIZ et al., 1996; RAVINA et al., 1999; SATO et al., 2000). Der Grund für die

Einleitung

2

Anaerobisierung einer luftdicht verschlossenen Schwefelmangelkultur liegt jedoch in einer

drastischen Abnahme der photosynthetischen Aktivität der Zellen (WYKOFF et al., 1998), die

generell auf einen Verlust an PSII- Aktivität zurückzuführen ist, da die fortlaufende

Neusynthese des PSII-Kernproteins D1, das besonders bei hohen Lichtintensitäten oxidativen

Schäden und einem dadurch verstärkten Abbau (MELIS et al., 2000; OHAD et al., 1984)

unterliegt, nicht aufrechterhalten werden kann. Weitere Gründe sind die Akkumulation von

„Plastochinon-nicht-reduzierenden“ PSII-Zentren (WYKOFF et al., 1998; GUENTHER et al.,

1990) und das Auftreten von State I/ State II Transition (WYKOFF et al., 1998). Die bei

gleichbleibender Respirationsrate (MELIS et al., 2000) daraus resultierende Netto-

Sauerstoffaufnahme der Zellen führt somit trotz Belichtung zur Anaerobisierung einer

luftdicht verschlossenen Algenkultur und damit zur Induktion des Gärungsstoffwechsels.

Der Fermentationsmetabolismus von C. reinhardtii ist verwandt mit der gemischten

Säuregärung der Enterobakterien, wie z.B. von Escherichia coli. Die Produktion von Formiat,

Ethanol und Acetat im Verhältnis von 2:1:1, wie sie bei dunkel gärenden C. reinhardtii-

Kulturen zu beobachten ist (GFELLER und Gibbs, 1984), wird im Allgemeinen dem

Fermentationsenzym Pyruvat-Formiat-Lyase (Pfl) zugeschrieben, welches ein typisch

bakterielles Gärungsenzym ist (KREUZBERG, 1984). In Anwesenheit von Coenzym A

katalysiert es die thioklastische Spaltung von Pyruvat in Formiat und Acetyl-CoA.

Auch unter S-Mangelbedingungen konnte die Produktion von Formiat und Ethanol in C.

reinhardtii nachgewiesen werden (HEMSCHEMEIER und HAPPE, 2005). Real-Time PCR

Experimente haben gezeigt, dass die Transkription des PFL1-Gens unter S-

Mangelbedingungen induziert wird (HEMSCHEMEIER et al., 2008 a; JACOBS, Diplomarbeit).

Auch auf Proteinebene konnte eine aktive Pfl in C. reinhardtii nachgewiesen werden

(HEMSCHEMEIER et al., 2008 a; JACOBS, Diplomarbeit). Die Pfl1 gehört zur Klasse der

sogenannten Glycylradikal-Enzyme (KNAPPE et al., 1984; WAGNER et al., 1992) und wird

posttranslational durch die Pfl-Aktivase aktiviert, einem Radikal-S-Adenosylmethionin-

(SAM) Protein, dass für die Reaktion SAM und in E. coli, reduziertes Flavodoxin als

Elektronendonor benötigt (BLASCHKOWSKI et al., 1982). Bislang wurden im Genom von C.

reinhardtii keine Flavodoxine gefunden, so dass es sich bei dem benötigten Ein-

Elektronenüberträger auch um ein Ferredoxin handeln könnte. Auch die der Pfl-Reaktion

nachfolgenden typischen Enzyme, wie die Alkoholdehydrogenase konnten in C. reinhardtii

nachgewiesen werden, sowie mögliche Ethanol-produzierende Enzyme wie die Pyruvat-

Decarboxylase und die Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase (ATTEIA et al., 2006;

HEMSCHEMEIER et al., 2008 a).

Einleitung

3

Abb. 1-1: Schematische Darstellung des Fermentationsmetabolismus in C. reinhardtii (nach

Hemschemeier et al., 2008 a). Während der Fermentation wird Glucose über die Glykolyse zu Pyruvat

abgebaut. Pyruvat kann anschließend über drei mögliche Wege umgesetzt werden. Die Pyruvat-Decarboxylase

decarboxyliert Pyruvat zu Acetaldehyd, welches durch die Alkohol-Dehydrogenase zu Ethanol reduziert wird.

Die Pyruvat Formiat-Lyase spaltet Pyruvat thioklastisch in Formiat und AcetylCoA. Das AcetylCoA wird

anschließend durch eine bifunktionale Acetaldehyd/Alkoholdehydrogenase zu Ethanol reduziert oder durch die

Phosphotransacetylase und die Acetat-Kinase zu Acetat umgesetzt. Durch die Pyruvat-Ferredoxin-

Oxidoreduktase kann Pyruvat zu AcetylCoA decarboxyliert werden. Ack = Acetat-Kinase, Adh = Alkohol-

Dehydrogenase, AdhE = Alkoholdehydrogenase, Pdc = Pyruvat-Decarboxyalse, Pfl = Pyruvat Formiat-Lyase,

PflA = Pfl-Aktivase, Pfo = Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase, Pta = Phosphotransacetylase

Neben den typischen Fermentationsprodukten Formiat, Ethanol und Acetat produziert C.

reinhardtii unter anaeroben Bedingungen auch Wasserstoff. Dieser wird durch die monomere

[FeFe]-Hydrogenase HydA1 (HAPPE und NABER, 1993) gebildet, welche die Reduktion von

Protonen zu Wasserstoff katalysiert. Da die Wasserstoffbildung in C. reinhardtii jedoch vor

allem über die photosynthetische Elektronentransportkette mit Elektronen versorgt wird

(HEMSCHEMEIER et al., 2008 b, WINKLER, Dissertation, 2009), bilden die Zellen im Dunkeln

kaum Wasserstoff. Belichtete Schwefelmangelkulturen der Grünalge dagegen produzieren

signifikante Mengen des energiereichen Gases (MELIS et al., 2000), weshalb dieser spezielle

Wasserstoffmetabolismus auch intensiv von Biotechnologen untersucht wird (MELIS, 2007).

Ebenso wie die Pfl1, ist HydA1 ein sauerstoffsensitives Enzym, das durch die Reaktion mit

Sauerstoff irreversibel inaktiviert wird (HAPPE und NABER, 1993). Die Regulation der

HYDA1-Expression erfolgt nach bisherigen Studien auf transkriptioneller Ebene durch

Einleitung

4

Promotorelemente, die durch Anaerobiose reguliert werden (STIRNBERG und HAPPE, 2004)

und erfolgt parallel zur Transkription des PFL1-Gens. Der Elektronendonor von HydA1 ist

vermutlich das in der Photosynthese aktive [2Fe2S]- Ferredoxin PetF (HAPPE und NABER,

1993; WINKLER, Dissertation, 2009), das somit die Wasserstoffproduktion durch die

Hydrogenase an die photosynthetische Elektronentransportkette koppelt.

Abb. 1-2: Schematische Darstellung des Wasserstoffmetabolismus in C. reinhardtii. Elektronen für die

lichtabhängige Produktion von Wasserstoff in Schwefelmangelkulturen von C. reinhardtii stammen aus zwei

Quellen. Zum einen werden Elektronen, die aus der Restaktivität von PSII stammen, über die photosynthetische

Elektronentransportkette auf HydA1 übertragen. Zum anderen werden über die NAD(P)H-Plastochinon-

Oxidoreduktase Nda2 Elektronen, die durch den oxidativen Stärkeabbau freigesetzt werden, auf den

Plastochinonpool übertragen (JANS et al., 2008). Über eine noch nicht näher identifizierte chloroplastidäre

Plastochinon/Sauerstoff Oxidoreduktase können Elektronen aus dem Plastochinonpool wieder auf Sauerstoff

übertragen werden. Cyt b6f = Cytochrom-b6f-Komplex, Fd = Ferredoxin, Nda2 = NAD(P)H-Plastochinon-

Oxidoreduktase, Pc = Plastocyanin, Pq = Plastochinon, PS II, I = Photosystem II, I, Ptox = putative

chloroplastidäre Plastochinon/Sauerstoff Oxidoreduktase.

Unter Schwefelmangel werden die Elektronen, die auf die Hydrogenase übertragen werden,

von unterschiedlichen Quellen bereitgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Elektronen

fast zu gleichen Teilen aus einer Restaktivität von PSII, sowie aus der nicht-photochemischen

Reduktion des Plastochinonpools (HEMSCHEMEIER et al., 2008 b) herrühren. Bei Letzterem

stammen die Elektronen aus dem oxidativen Abbau organischer Substrate, wie z.B. Stärke

und werden über eine NAD(P)H-Plastochinon-Oxidoreduktase auf den Plastochinonpool

Einleitung

5

übertragen. Dieser Prozess ist möglicherweise Teil der so genannten Chlororespiration

(FOUCHARD et al., 2005).

Die Bedeutung, die der Hydrogenase unter Schwefelmangelbedingungen zukommt, liegt

wahrscheinlich in ihrer Funktion als Elektronensenke (HAPPE et al., 2002). Schwefelmangel

bewirkt in den Algenzellen eine Drosselung der CO2-Fixierung, da das zentrale Protein des

Calvin-Zyklus, die Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase/-oxygenase (Rubisco), abgebaut

wird (ZHANG et al., 2002). Durch die Einstellung des Calvin-Zyklus und weiterer

anabolischer Prozesse sinkt der Bedarf der Zelle an Reduktionsäquvivalenten und ATP, was

zu einem erhöhten Redoxpotential führt (ANTAL et al., 2003), das offenbar durch die

Hydrogenase abgeleitet wird.

Der außergewöhnlich komplexe, bakterienartige Photofermentationsmetabolismus von C.

reinhardtii, bietet folglich diverse metabolische und biosynthetische Stoffwechselprozesse in

denen Ferredoxine eine Funktion ausüben könnten, angefangen von typisch pflanzlichen bis

hin zu typisch bakteriellen Reaktionen

1.2 Ferredoxine sind universelle Elektronenüberträger

[FeS]-Proteine gehören neben Flavodoxinen, Cytochromen und Kupferproteinen zu den

wichtigsten elektronenübertragenden Proteinen in der Natur. Als prosthetische Gruppe

enthalten sie einen [FeS]-Cluster, in dem Eisen über schwefelhaltige Liganden gebunden

wird. Es wird angenommen, dass [FeS]-Cluster zu den ersten katalytischen Zentren gehörten,

die während der chemischen Evolution gebildet wurden (HUBER und WÄCHTERSHÄUSER,

1998). Unter anaeroben Bedingungen können sich die einfacheren [FeS]-Cluster in einer

Mischung aus Eisen, Sulfid und Thiolen, wie sie auch auf der primitiven Erde vorkamen,

selbst zusammenbauen (BERG und HOLM, 1982). Die Entstehung und die Entwicklung der

ersten [FeS]-Proteine fanden in anaeroben Bakterien statt (HALL et al., 1974). Davon

ausgehend entwickelte sich eine Vielzahl von Proteinen mit verschiedenen Kombinationen

von [FeS]-Clustern. Bis heute sind über 120 verschiedene Gruppen von Proteinen und

Enzymen bekannt, die [FeS]-Cluster besitzen (HALL et al., 1974; JOHNSON, 1994; BEINERT

2000). Die Funktionen, die [FeS]-Proteine ausüben, sind mannigfaltig und umfassen eine

Vielzahl von Stoffwechselwegen. Neben der Elektronenübertragung katalysieren sie unter

anderem Hydratationen / Dehydratationen, dienen als Sauerstoff- und Eisensensoren,

generieren und stabilisieren Radikale und spielen eine Rolle in regulatorischen Prozessen

(JOHNSON et al., 2005).

Einleitung

6

Unter den [FeS]-Proteinen bilden die Ferredoxine eine große, ubiquitär verbreitete Gruppe.

Bei ihnen handelt es sich um kleine, lösliche Proteine mit einer unter physiologischen

Bedingungen negativen Nettoladung, die in allen Organismengruppen gefunden werden

können. Sie sind an der Übertragung von Elektronen beteiligt, weisen ein niedriges

Redoxpotential auf und zeigen EPR-(Electron Paramagnetic Resonance) Signale, die typisch

für den jeweiligen Cluster-Typ sind (BRUSCHI und GUERLESQUIN, 1988). Der Name

Ferredoxin wurde erstmalig von MORTENSEN et al. (1962) für ein eisenhaltiges Protein aus

Clostridium pasteurianum benutzt, das als Elektronenüberträger in der Wasserstoffproduktion

des Bakteriums fungierte. Gleichzeitig wurde von TAGAWA und ARNON (1962) aus Spinacia

oleocera ein eisenhaltiges Protein isoliert, das die Reduktion von NADP+ zu NADPH durch

belichtete Chloroplasten katalysierte. Zudem konnten sie zeigen, dass das Ferredoxin aus C.

pasteurianum das Protein aus S. oleocera funktionell ersetzen konnte. Aufgrund der ähnlichen

Redoxpotentiale und ihrer funktionellen Austauschbarkeit wurde auch das pflanzliche Protein

als Ferredoxin bezeichnet. Auch andere Proteine mit diesen Eigenschaften wurden von

diesem Zeitpunkt in die Gruppe der Ferredoxine eingeordnet.

In Bakterien vorkommende Ferredoxine weisen unterschiedliche Typen von [FeS]-Clustern

auf. Neben den einfachen [2Fe2S]-Clustern können auch Ferredoxine mit [3Fe3S]- oder

[3Fe4S]-, sowie [4Fe4S]- oder auch 2[4Fe4S]- Cluster gefunden werden (BRUSCHI und

GUERLESQUIN, 1988). Sie nehmen an vielen elektronenübertragenden Prozessen teil, wie z.B.

dem Wasserstoff-, CO2- und Formiat-Metabolismus oder auch der phosphoroklastischen

Spaltung von Pyruvat (BRUSCHI und GUERLESQUIN, 1988). Eine Besonderheit stellen die

sogenannten Hochpotential-Eisenschwefel-Proteine (HiPIP) dar. Bei ihnen handelt es sich um

[4Fe4S]-Ferredoxine, die in photosynthetisch aktiven Bakterien vorkommen und

außergewöhnlich hohe Redoxpotentiale (+ 350 mV) aufweisen (HALL et al., 1974). Neben

den HiPIP tritt in einigen Bakterien eine weitere ungewöhnliche Klasse von Ferredoxinen auf,

die den Thioredoxinen ähnlich ist. Diese besitzen [2Fe2S]-Cluster und bilden Homodimere.

Die Funktion dieser Ferredoxine ist noch weitestgehend unbekannt. Es wird jedoch vermutet,

dass sie eine Rolle in der Stickstofffixierung spielen (MEYER, 2001).

Neben den oben aufgeführten Gruppen tritt in der Natur noch eine weitere Klasse von

Ferredoxinen auf, und zwar die überwiegend in Pflanzen, Algen und Cyanobakterien

vorkommenden [2Fe2S]-Ferredoxine. Diese Ferredoxine, die aus historischen Gründen auch

als Ferredoxine des „Pflanzen-Typs“ bezeichnet werden, fungieren auch hier als Ein-

Elektronen-Überträger in verschiedenen Reaktionen. Eine der bedeutensten und am besten

erforschten Reaktionen ist dabei die sogenannte Photoreduktion von

Einleitung

7

Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP). Ferredoxin wird durch Photosystem I (PSI)

reduziert und überträgt die Elektronen in einer durch Ferredoxin-NADP-Oxidoreduktase

(Fnr) katalysierten Reaktion auf NADP+ (ARNON, 1965).

In vielen Pflanzen und Algen können Ferredoxine in unterschiedlichen Isoformen gefunden

werden (BERTINI et al., 2002). So konnten beispielsweise in Zea mays vier unterschiedliche

Isoproteine nachgewiesen werden (HASE et al., 1991 a). Diese Isoformen können

gewebespezifisch gebildet werden und dabei funktionelle Unterschiede aufweisen (HASE et

al., 1991 b). Auch in nicht photosynthetisch aktiven Pflanzenzellen wurden bereits

Ferredoxin-Isoformen gefunden (SUZUKI et al., 1985; WADA et al., 1986). In den nicht

Photosynthese betreibenden Zellen von Wurzeln und Früchten werden Reduktionsäqvivalente

durch den oxidativen Pentosephosphatzyklus bereitgestellt und Elektronen über die Fnr auf

Ferredoxin übertragen, was genau dem umgekehrten Elektronenfluss in der Photosynthese

entspricht (FUKUYAMA , 2004). Das reduzierte Ferredoxin stellt wiederum Elektronen für

andere reduktive Prozesse wie die Nitrat- und Schwefelassimilation bereit (WADA et al.,

1986).

Aus der einzelligen Grünalge C. reinhardtii wurde bisher lediglich ein Ferredoxin isoliert und

charakterisiert. Es handelt sich hierbei um das für die NADP+-Photoreduktion von C.

reinhardtii verantwortliche Ferredoxin PetF. PetF ist ein typisches [2Fe2S]-Ferredoxin des

„Pflanzen-Typs“, das eine sehr negative Nettoladung und mehrere saure Reste an

konservierten Stellen der Aminosäuresequenz aufweist (ROGERS et al., 1992). Das native

Protein besteht aus 94 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 9908 Dalton

(SCHMITTER et al., 1988). Das Absorptionsspektrum des oxidierten Proteins weist die für

[2Fe2S]-Ferredoxine typischen Maxima bei 330, 420 und 465 nm auf (SCHMITTER et al.,

1988). Das PETF-Gen befindet sich im Kerngenom, das kodierte und im Cytoplasma

synthetisierte Protein wird aber mittels eines 32 Aminosäuren umfassenden Transitpeptids in

den Chloroplasten transportiert, wo es als Elektronenakzeptor für PSI dient (SCHMITTER et al.,

1988; FISCHER et al., 1999). Mittels „Cross-Linking“ wurde nachgewiesen, dass PetF auch

Substrat der Glutamat-Synthase und Nitrit-Reduktase ist (GARCIA-SÁNCHEZ et al., 2000).

Auch die Interaktion zwischen diesem Ferredoxin und Ferredoxin-Thioredoxin-Reduktase

wurde bereits bestätigt (JAQUOT et al., 1997). Daneben sind pflanzliche Ferredoxine auch bei

der Schwefel-Assimilation und der Aminosäure- und Fettsäuresynthese von Bedeutung

(KNAFF, 1996). Im Fall von C. reinhardtii kann PetF auch als Elektronenüberträger zwischen

PSI und der eingangs beschriebenen monomeren [FeFe]-Hydrogenase HydA1 fungieren, die

Einleitung

8

ein zentrales Element des komplexen anaeroben Stoffwechsels der Alge ist (WINKLER,

Dissertation, 2009).

Abb. 1-3: Typische Reaktionspartner von [2Fe2S]-Ferredoxinen des Pflanzen-Typs. In den Chloroplasten

wird Ferredoxin (Fd) von Photosystem I (PSI) reduziert und transferiert Elektronen auf diverse Redoxpartner,

wie die Acyl-Trägerprotein (Acp) -Desaturasen, die Ferredoxin-NADP+-Oxidoreduktase (Fnr ), die Ferredoxin-

Thioredoxin-Reduktase (Ftr ), die Glutamin-Oxoglutarat-Aminotransferase (Gogat), die Nitrit-Reduktase (Nir ),

die Sulfit-Reduktase (Sir) und im Fall von C. reinhardtii auf die Hydrogenase (HydA1) (KNAFF, 1996,

WINKLER, Dissertation, 2009). Cyt b6f = Cytochrom-b6f-Komplex, Fd = Ferredoxin, Pc = Plastocyanin, Pq =

Plastochinon, PS II = Photosystem II

Bei den Reaktionen, die PetF mit seinen Redoxpartnern eingeht, spielen elektrostatische

Wechselwirkungen eine große Rolle. PetF bildet mit seinen Reaktionspartnern spezifische

elektrostatische Komplexe aus, die durch eine Anzahl konservierter, carboxylierter Reste auf

Seite des Ferredoxins und von Arginin- oder Lysinresten auf Seite der Interaktionspartner

stabilisiert werden (GARCIA-SÁNCHEZ et al., 2000; JAQUOT et al., 1997; MAYORAL et al. 2005;

Knaff, 1996).

1.3 Ziele dieser Arbeit

Bei Untersuchungen der Expression verschiedener Gene des Fermentations- und

Wasserstoffmetabolismus von C. reinhardtii zeigte sich in Northern Blot und Real-Time PCR

Analysen, dass die Transkriptmenge des PETF-Gens unter Schwefelmangel abnimmt,

während bei FDX5, einem weiteren Ferredoxin-kodierenden Gen aus C. reinhardtii, eine

außergewöhnlich starke Akkumulation des Transkriptes beobachtet werden konnte (JACOBS,

Einleitung

9

2005, Diplomarbeit; HEMSCHEMEIER, 2002, Diplomarbeit). Die Akkumulation des FDX5-

Transkriptes und die gleichzeitige Abnahme des PETF-Transkriptes deuten daraufhin, dass

der Ferredoxingehalt in C. reinhardtii unter photofermentativen Bedingungen moduliert und

eventuell die Synthese spezialisierter Ferredoxine induziert wird, die im veränderten

Stoffwechsel der Zellen aktiv sind. Ziel dieser Arbeit ist eine umfassende biochemische und

funktionelle Charakterisierung des FDX5-Genproduktes, bei dem es sich um ein potentielles

Ferredoxin handelt. Hierfür soll ein heterologes Expressionsystem in E. coli und ein

effektives Protokoll für die Aufreinigung des rekombinanten Proteins etabliert werden. Das

rekombinante Protein dient als Ausgangspunkt für die biochemische Charakterisierung und

die Herstellung polyklonaler Antikörper. Mittels Lokalisationsstudien und Interaktionstests

sollen Erkenntnisse über die mögliche Funktion von Fdx5 in der Photofermentation von C.

reinhardtii gewonnen werden.

Material und Methoden

10

2 Material und Methoden

2.1 Organismen und Anzucht

2.1.1 Chlamydomonas reinhardtii

Folgende C. reinhardtii Stämme wurden im Rahmen dieser Arbeit verwendet:

Stamm Genotyp Referenz

C. reinhardtii CC-125 mt+ 137c HARRIS, 1989

C. reinhardtii SAG 83.81 cw15 mt+ DAVIES und PLASKITT, 1971

C. reinhardtii CW 388 Arg- cw15 arg7 nitI mt+ PURTON und ROCHAIX, 1994

SAG: „Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen“, Göttingen, Deutschland; CC: „Culture

Collection at Duke University“, Durham, NC, USA.

2.1.1.1 Kultivierung von C. reinhardtii

Die Anzucht von C. reinhardtii erfolgte photoheterotroph in 200 mL Tris-Acetat-Phosphat

(TAP)- Medium (HARRIS, 1989) in Erlenmeyerkolben unter konstanter Belichtung mit 100

µmol Photonen x m-2 x s-1 und konstantem Schütteln bei 20°C.

2.1.1.2 Schwefelmangelinduktion

Für die Schwefelmangelinduktion wurden die Zellen durch Zentrifugation (2,5 min, 3000

rpm) in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet und in TAP-S Medium (TAP Medium,

in dem alle sulfathaltigen Salze durch die entsprechenden Chloride ersetzt wurden)

gewaschen und resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen in Vierkantflaschen gefüllt,

mit luftdichten Subastopfen („red rubber Suba seals 37“, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA)

verschlossen und unter kontinuierlicher, einseitiger Belichtung mit 100 µmol Photonen x m-2

x s-1 inkubiert.

2.1.1.3 Kupfermangelinduktion

Die Herstellung von TAP-Cu, sowie die Anzucht unter Cu-freien Bedingungen wurden wie

von QUINN und MERCHANT (1998) bechrieben, durchgeführt.

2.1.1.4 Anaerobe Induktion

Für die anaerobe Induktion wurden Zellen durch Zentrifugation (2,5 min, 3000 rpm) in der

exponentiellen Wachstumsphase geerntet und die Zelldichte auf einen Wert von 100 µg/ml


11

Chlorophyll in einem Volumen von 10 ml eingestellt. Anschließend erfolgte eine Begasung

der Kulturen mit Argon.

2.1.2 Escherichia coli

Für molekularbiologische sowie biochemische Techniken wurden folgende E. coli Stämme

verwendet:

Stamm Genotyp Referenz/Firma

E.coli DH5α MCR F’end A1 hsd 17 (rk-mk+) sup E44 thi-1 rec A1� ∆

(laclzyA-argF) u 169 deo R

RALEIGH et al., 1989;

WOODCOCK et al., 1989 /

(Novagen/ Merck,

Darmstadt, Deutschland)

E.coli BL21(DE3)pLysS F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), dcm, gal, λ (DE3),

pLysS, Cmr

STUDIER und MOFFAT, 1986

(Novagen/ Merck,

Darmstadt, Deutschland)

2.1.2.1 Kultivierung von E. coli

Gewöhnlich wurden E. coli Zellen in LB-Medium (25 g x l-1 Luria Broth Base, Invitrogen

Gibco, Carlsbad, CA, USA) oder auf LB-Platten (30 g x l-1 Luria Agar, Invitrogen Gibco) bei

37 °C über Nacht angezogen. Dafür wurden alle Medien bei 120°C für 20 min. autoklaviert.

Hitzelabile Komponenten wurden sterilfiltriert und dem Medium nach dem Autoklavieren

hinzugefügt. Zur Selektion plasmidtragender E. coli Zellen wurden Antibiotika in folgenden

Konzentrationen hinzugefügt: Ampicillin: 100 µg x ml-1; Chloramphenicol: 20 µg x ml-1;

Kanamycin: 10 µg/ml.

2.2 Plasmide

Folgende Plasmide wurden während dieser Arbeit verwendet oder hergestellt:

Plasmid Charakteristika Referenz/Firma

pGEM TEasy linearer Klonierungsvektor mit 3’- Thyminüberhängen, welche die

Klonierung von PCR-Fragmenten der Taq-Polymerase erleichtern;

ermöglicht Blau-Weiß-Selektion; ApR 3,02 kb

Promega

(Mannheim,

Deutschland)

pASK-IBA7 Expressionsvektor, der das Anhängen eines N-terminalen Strep-Tag

II an ein rekombinantes Protein ermöglicht; Regulation über

Anhydrotetracyclin (Vektor enthält tet-Promotor und Operator

sowie das Gen für den tet-Repressor); ApR; 3,25 kb

IBA

(Göttingen,

Deutschland)

pJJ6 151 bp Fragment von RPL10A in pGEM (Sondenherstellung) JACOBS,

Diplomarbeit, 2005


12

pJJ7 260 bp Fragment von HYDA1 in pGEM (Sondenherstellung) JACOBS,

Diplomarbeit, 2005

pJJ10 271 bp Fragment von FDX5 in pGEM (Sondenherstellung) JACOBS,

Diplomarbeit, 2005

pJJ20 orf des PETF Gens, exklusive der Transitsequenz, in pASK IBA7 diese Arbeit

pJJ23 orf des FDX5 Gens, exklusive der Transitsequenz, in pASK IBA7 diese Arbeit

pMF59 Konstrukt zur Expression eines Ble/ GFP-Fusionsproteins mit zwei

rbcS2-Intron-Elementen vor bzw. innerhalb der BLE Sequenz,

nachgeschalteter cgfp-Sequenz, sowie 5’- und 3’-UTR des rbcS2-

Gens von C. reinhardtii. Die Expression der Gensequenzen

unterliegt der Kontrolle des artifiziellen HSP70A/ RBCS2-

Tandempromotors. ApR; 5,07 kb

FUHRMANN et al.,

1999

pJJ24 Konstrukt zur Expression eines Fdx5-Transitpeptid/ GFP-

Fusionsproteins. Ausgangsplasmid für dieses Konstrukt war

pMF59.

diese Arbeit

pChlamiRNA2 Konstrukt zur Expression einer artifiziellen miRNA. Der

Transkriptionsterminator beinhaltet die 3’-UTR des RPL12 Gens.

Die Expression der amiRNA-Sequenz unterliegt der Kontrolle des

artifiziellen HSP70A/ RBCS2-Tandempromotors. Der Vektor trägt

die Sequenz des ARG7-Gens. ApR; 12,65 kb

MOLNÁR et al., 2009

pJJ27 Fdx5 amiRNA Variante 1 in pChlamiRNA2 miRNA diese Arbeit

pJJ28 Fdx5 amiRNA Variante 2 in pChlamiRNA2 miRNA diese Arbeit

2.3 Oligonukleotide

Folgende Oligonukleotide wurden in dieser Arbeit abgeleitet und verwendet:

Primer Sequenz Verwendung

Ferredoxin_5_157 CCGCTGACACCTACATCCTG

Ferredoxin_3_504 AACCGCTCATAGTGCTAGGC

RT-PCR

Fdx2_5_29 GCCACGCTGTAGCTCATTCT

Fdx2_3_344 AGCATGTTCTGGTCGGACTG

RT-PCR

Fdx3_5_55 CCGGACAACCAATACATCCT

Fdx3_3_215 TCCTCCTCGTCTAGCGTGAA

RT-PCR

Fdx4_5_19 GAAGGCAAGCAGGTGGATCT

Fdx4_3_296 CTGGTCATCAGCTGCATGTC

RT-PCR

Fdx5_5_777 CGGCTTGAAGAGTCAAGAGT

Fdx5_3_1047 CCACACCAGAGCCATACATA

RT-PCR

Fdx6_5_494 CGACCTGTGGATGGAAGATG

Fdx6_3_658 ATCTCCTGGTTGCCGTAGTG

RT-PCR

Fdx5_5_Strep ATGGTAGGTCTCAGCGCTTTCAGGTGACGCTGCGCATGC Klonierung in


13

Fdx5_3_Strep ATGGTAGGTCTCATATCACTGGTGCTTGCCGTACTCGCA pASK-IBA7

PetF_5_Strep ATGGTAGGTCTCAGCGCTACAAGGTCACCCTGAAGACCC

PetF_3_Strep ATGGTAGGTCTCATATCAGTACAGGGCCTCCTCCTGGTG

Klonierung in

pASK-IBA7

Fdx5_5_pMF CGACCCATTTGCAGGCTGGCACAGCAGTTTCAGGCATTG

Fdx5_3_pMF GTCGGGCCGGCCCTGGTGCTTGCCGTACTCGC

Klonierung in

pMF59

amiFor_Fdx5_1 CTAGTGTGGCGACTCTTCCGGGAGAATCTCGCTGATCGGC

ACCATGGGGGTGGTGGTGATCAGCGCTATTCTTTCGGAAG

AGTCGCCACG

amiRev_Fdx5_1 CTAGCGTGGCGACTCTTCCGAAAGAATAGCGCTGATCAC

CACCACCCCCATGGTGCCGATCAGCGAGATTCTCCCGGA

AGAGTCGCCACA

Klonierung in

pChlamiRNA2

amiFor_Fdx5_2 CTAGTAGACGGGTATGTATGGGTCTATCTCGCTGATCGGC

ACCATGGGGGTGGTGGTGATCAGCGCTATAGAGCCATAC

ATACCCGTCTG

amiRev_Fdx5_2 CTAGCAGACGGGTATGTATGGCTCTATAGCGCTGATCACC

ACCACCCCCATGGTGCCGATCAGCGAGATAGACCCATAC

ATACCCGTCTA

Klonierung in

pChlamiRNA2

2.4 Chemikalien

Die eingesetzten Chemikalien wurden in größtmöglicher Reinheit (p.A. Qualität) von den

Firmen Acros, LKB-Pharmacia, Merck, Roche, Roth, Serva und Sigma bezogen.

2.5 Enzyme

Es wurden folgende Enzyme verwendet, die nicht Bestandteil eines Kit-Systems waren:

Enzym Hersteller

Cytochrom c (Pferdeherz) Sigma, St. Louis, Mo, USA

Ferredoxin-NADP+-Oxidoreduktase (S. oleocera) Sigma, St. Louis, Mo, USA

Hydrogenase HydA1 (C. reinhardtii) S. Stripp (Ruhr-Universität Bochum, Lehrstuhl

Biochemie der Pflanzen, AG

Photobiotechnologie)

Pfu Ultra Hotstart Polymerase Stratagene, La Jolla, CA, USA

Photosystem I (C. reinhardtii) M. Hippler (Westfälische Wilhelms-Universität

Münster, Institut für Biochemie und

Biotechnologie der Pflanzen, Münster,

Deutschland)

Plastocyanin (C. reinhardtii) M. Hippler

Restriktionsendonukleasen Fermentas, Burlington, Canada

Superscript II Reverse Transkriptase Invitrogen Gibco, Carlsbad, CA, USA


14

Taq-DNA-Polymerase Fermentas, Burlington, Canada

T4-DNA Ligase Fermentas, Burlington, Canada

2.6 Kits

Folgende Kits wurden verwendet:

Bezeichnung Hersteller

DIG RNA Labeling Kit (Sp6/T7) Roche Applied Science,

Mannheim, Deutschland

Gene JetTM Plasmid MiniPrepKit Fermentas, Burlington, Canada

GFXTM

PCR DNA and Gel Band Purification Kit GE Healthcare, Chalfont, UK

Mini EluteTM

Reaction Cleanup Kit Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

Nucleo Trap mRNA-Isolierungskit Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

OneStep RT-PCR Kit Qiagen, Hilden, Deutschland

pGEM-TEasy Vektor System Promega, Promega, Madison, WI, USA),

Testsystem zum Nachweis von Formiat und Ethanol R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland

2.7 Molekulargenetische Methoden

2.7.1 Präparation von genomischer DNA aus C. reinhardtii

Die Isolierung von genomischer DNA aus C. reinhardtti erfolgte nach NEWMAN et al. (1990).

2.7.2 Transformation von C. reinhardtii

Die Transformation von zellwandlosen C. reinhardtii Stämmen erfolgte nach der „Glasperlen-

Methode“ (KINDLE, 1990)

2.7.3 Präparation von RNA und mRNA aus C. reinhardtii

Die Präparation von Gesamt-RNA aus C. reinhardtii erfolgte nach Johanningmeierund

Howell, 1984. Die RNA-Konzentration wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260

nm gegen Wasser als Referenz bestimmt. Eine Absorption von 1,0 entspricht einer

Konzentration von 40 µg RNA pro ml. Zur Bestimmung des Reinheitsgrades der RNA wurde

der Quotient der Absorption bei 260 und 280 nm ermittelt.

Die Isolierung der mRNA erfolgte mit Hilfe des Oligotex mRNA Mini Kits von Macherey-

Nagel nach Angaben des Herstellers. Vor der mRNA-Isolierung wurde die einzusetzende

RNA-Menge bestimmt. Die Lagerung der mRNA erfolgte bei -80°C.


15

2.7.4 Elektrophoretische Trennung von Gesamt-RNA und Northern Blotting

Die Auftrennung von Gesamt-RNA in 1,5 % Formaldehyd-MOPS Agarose-Gelen und

Northern Blotting erfolgte nach bereits beschriebenen Standardmethoden unter Nutzung von

Digoxigenin-markierten RNA-Sonden (Sambrook et al., 1989).

2.7.5 Gen-„Silencing“ in C. reinhardtii durch artifizielle microRNAs

Gemäß dem von MOLNÁR et al. (2009) entwickelten Protokoll wurden basierend auf der

Zielsequenz des FDX5-Gens mittels der Web MicroRNA Designer Plattform (WMD2,

http://wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl) geeignete miRNA Kandidaten gesucht.

Um die Wahrscheinlichkeit des Gen-„Silencing“ zu erhöhen, wurden zwei miRNAs

ausgewählt, die unterschiedliche Bereiche des Gens zum Ziel haben. miRNA Variante 1

(TTCTTTCGGAAGAGTCGCCAC) ist komplementär zu einer in der 5’-UTR des FDX5-

Gens gelegenen Sequenz, während die Zielsequenz von amiRNA Variante 2

(TAGAGCCATACATACCCGTCT) in der 3’-UTR liegt. Ausgehend von diesen miRNA-

Sequenzen wurden mit dem WMD2 „Oligo“-Programm 90 nt umfassende Oligonukleotide

entworfen, die nach Annealing zu doppelsträngigen DNA-Molekülen bereits einen SpeI

kompatiblen Überhang aufwiesen.

CTAGTGTGGCGACTCTTCCGGGAGAA TCTCGCTGATCGGCACCA

TGGGGGTGGTGGTGATCAGCGCTATTCTTTCGGAAGAGTCGCCA

CG

miRNA Variante 1

(amiFor_Fdx5_1,

amiRev_Fdx5_1)

CTAGCGTGGCGACTCTTCCGAAAGAA TAGCGCTGATCACCACCA

CCCCCATGGTGCCGATCAGCGAGATTCTCCCGGAAGAGTCGCCA

CA

CTAGTAGACGGGTATGTATGGGTCTA TCTCGCTGATCGGCACCA

TGGGGGTGGTGGTGATCAGCGCTATAGAGCCATACATACCCGTC

TG

miRNA Variante 2

(amiFor_Fdx5_2,

amiRev_Fdx5_2)

CTAGCAGACGGGTATGTATGGCTCTA TAGCGCTGATCACCACCA

CCCCCATGGTGCCGATCAGCGAGATAGACCCATACATACCCGTC

TA

Für das Annealing wurden die betreffenden Oligonukleotide in einer Konzentration von 100

µM für fünf min in Annealingpuffer (20 mM Tris ph 8, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl) gekocht

und langsam über Nacht (ü.N.) abgekühlt. Um die hohen Salzkonzentrationen zu entfernen,

wurde die doppelsträngige DNA mit dem „GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit“


16

(GE Healthcare) aufgereinigt. Die Klonierung in das Expressionsplasmid pChlamiRNA2

(MOLNÁR et al., 2009) erfolgte über die Restriktionsschnittstelle SpeI. Die SpeI-

Restriktionsschnittstelle in pChlamiRNA2 werden flankiert von den modifizierten Armen des

miRNA-Vorläufermoleküls cre-MIR1157, die zusammen mit dem eingefügten

doppelsträngigen Oligonukleotid den artifiziellen miRNA-Vorläufer bilden, der zur miRNA

prozessiert wird. Im Anschluss an die Klonierung erfolgte die Transformation von C.

reinhardtii CW 388 Arg- mittels „Glasperlen“-Methode.

2.7.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR)

Für Kontrollexperimente wurde die PCR mit Taq DNA Polymerase durchgeführt. Für die

sequenzexakte Amplifizierung von DNA-Fragmenten wurde Pfu Ultra Hotstart Polymerase

verwendet. Die Primer wurden von Sigma-Genosys Ltd (Sigma-Aldrich) bezogen und in einer

Konzentration von 0,4 µM eingesetzt.

„One Step“ RT-PCRs wurden mit dem „OneStep RT-PCR- Kit“ von Qiagen nach

Herstellerangaben durchgeführt. Für die „Two-Step“ RT-PCR wurde die Superscript II

Reverse Transkriptase von Invitrogen verwendet. Das Protokoll für die reverse Transkription

orientierte sich an den Herstellerangaben. Im Anschluss an die cDNA-Synthese wurden dem

Ansatz NaOH und EDTA zugegeben und 15 min bei 65 °C inkubiert, um noch vorliegende

RNA zu hydrolysieren. Die Aufreinigung der cDNA erfolgte mit dem „Mini Elute Reaction

Cleanup Kit“ von Quiagen nach Herstellerangaben. Eluiert wurde in 10 µl Wasser. Die

aufgereinigte cDNA wurde als Matrize für eine PCR mit einer ausgewählten

Primerkombination eingesetzt.

2.7.7 Klonierung

2.7.7.1 Transformation von E .coli

Kompetente E. coli Dh5α- bzw BL21-Zellen wurden nach SAMBROOK et al. (1989) unter

Aufnahme in 200µl eines TB-Puffers (250 mM KCl, 10 mM PIPES, pH 6,7) mit 15 mM

CaCl2 hergestellt und bei -80°C gelagert. Die Transformation erfolgte nach der CaCl2-

Standardmethode (COHEN et al., 1972), modifiziert nach SAMBROOK (1989).

2.7.7.2 Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli

Die Gewinnung von Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte mittels des „GFX™ Micro Plasmid

Prep Kit“ von Amersham nach den Herstellerangaben.


17

2.7.7.3 Elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte durch Flachbett-Elektrophorese in 1 % TAE

(Tris-Acetat-EDTA)-Agarose-Gelen. Die Analyse und Photographie erfolgte auf einem UV-

Lichttransilluminator.

2.7.7.4 Bestimmung der DNA-Konzentration

Die DNA-Konzentration wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm gegen

Wasser als Referenz bestimmt. Eine Absorption von 1,0 entspricht einer Konzentration von

50 µg DNA pro ml. Als Maß für die Reinheit der der Nukleinsäure wurde der Quotient OD 260

/OD 280 ermittelt, der bei einer reinen Lösung zwischen 1,8 und 2,0 liegen sollte.

2.7.7.5 Ligation von DNA-Fragmenten

Für die Ligation von DNA-Fragmenten mit Vektoren wurden das DNA-Fragment und das

Plasmid im Verhältnis von 3:1 in einem Reaktionsansatz mit T4-Ligase und dem

entsprechenden Puffer zusammengegeben. Der Ligationsansatz wurde ü.N. bei 4°C inkubiert.

PCR-Produkte wurden, abhängig von der Sauberkeit der PCR-Probe, direkt kloniert oder

vorher mit dem „GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit“ von GE Healthcare (

Chalfont, UK) aufgereinigt.

2.7.7.6 Restriktion von Plasmid-DNA

Die Restriktion von DNA mit Restriktionsendonukleasen erfolgte in dem jeweiligen vom

Hersteller empfohlenen Puffersystem. Die Restriktionstemperatur und -dauer sowie die

Inaktivierung des Enzyms richtete sich je nach verwendeter Endonuklease nach den

Herstellerangaben. Plasmid-DNA wurde mit 1 bis 2 U Enzym pro µg DNA verdaut.

2.7.7.7 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

DNA-Fragmente wurden mittels des „GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit“ von

GE Healthcare ( Chalfont, UK) isoliert. Die gewünschte Bande wurde bei schwacher UV-

Bestrahlung mit dem Skalpell aus dem Agarosegel herausgeschnitten. Das Gelstück wurde in

ein Eppendorf-Gefäß überführt und in 300 µl Capture-Puffer bei 60°C gelöst. Die weiteren

Schritte der Isolierung erfolgten nach den Herstellerangaben.

2.7.7.8 Sequenzierung

Die DNA-Sequenzanalyse erfolgte im Rahmen einer Sequenzierservice-Einrichtung des

Lehrstuhls für Biochemie I an der Ruhr-Universität Bochum nach dem

Didesoxyribonukleotid-Kettenabbruch-Prinzip (SANGER et al., 1977).


18

2.7.8 Heterologe Expression von Genen in E.coli mit dem Strep-Tag II System

Für die heterologe Expression von Genen aus C. reinhardtii in E. coli wurde der Vektor

pASK-IBA7 des Strep-Tag Systems der Firma IBA (Göttingen, Deutschland) eingesetzt, bei

dem der Strep-Tag II N-terminal an das Zielprotein angefügt wird. Das Prinzip des Strep-Tag

Systems beruht auf der Bindung von Biotin an Streptavidin. Der Strep-Tag II besteht aus acht

Aminosäuren (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) und bindet an die Biotin-Bindedomäne des

Streptavidins. Damit wird eine affinitätschromatographische Aufreinigung des Strep-Tag II

Fusionsproteins über eine Strep-Tactin Säule, einer molekularbiologisch erzeugten Form des

Streptavidin, ermöglicht. Die Expression eines Genes in Vektor pASK-IBA7 unterliegt der

Kontrolle des TET-Promotors und ist durch die Zugabe von Anhydrotetracyclin (AHT)

induzierbar. Der TET-Repressor ist auf dem pASK-IBA Vektor kodiert und wird konstitutiv

exprimiert. Die Expression des klonierten Gens wird bis zur Induktion durch AHT strikt

unterdrückt. Im Gegensatz zum LAC-Promotor ist die Kontrolle durch den TET-Promotor

streng kontrolliert, so dass vor der Induktion keine Grundexpression des rekombinanten

Proteins zu beobachten ist (SKERRA, 1994)

Für die heterologe Expression wurde E. coli Stamm BL21 DE3 pLys mit dem entsprechenden

Expressionsplasmid transformiert. Die Protein-Produktion erfolgte in 3 l Vogel-Bonner

Medium (VOGEL und BONNER, 1955) Die Zellkultur wurde unter Schütteln bei 37°C

inkubiert, bis sie eine OD550 von 0,4 erreichte. Daraufhin erfolgte die Induktion der

Genexpression durch die Zugabe von 0,1 µg/ml Anhydrotetracyclin. Anschließend wurden

die Zellen für 4 h bei 37°C geschüttelt, danach durch Zentrifugation geerntet und das Pellet

bei -20 °C eingefroren.

2.8 Biochemische Methoden

2.8.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde ein Bio-Rad-Mikroassay nach BRADFORD

(1976) durchgeführt. Die Durchführung erfolgte nach Herstellerangaben unter Verwendung

von BSA als Standard.

2.8.2 Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und Western Blotting

Der Nachweis und die semiquantitative Analyse von spezifischen Proteinen in C. reinhardtii

Proteinrohextrakten und in Proteinproben erfolgte durch SDS-PAGE und Western Blotting.


19

2.8.2.1 Herstellung von Protein-Rohextrakten

1 ml Zellkultur wurde abzentrifugiert und das Pellet in 200 µl Proteinprobenpuffer (0.25 M

Tris-HCl, pH 8, 25 % Glycerin, 7.5 % SDS, 0, 25 mg/ml Bromophenolblau, 12.5% v/v β-

Mercaptoethanol) resuspendiert. Der Ansatz wurde für 5 min bei 95 °C inkubiert. Die Proben

wurden bei 4°C aufbewahrt und vor dem Auftragen auf das SDS-Gel ein weiteres Mal

aufgekocht, dann 1 min bei 14.000 rpm abzentrifugiert.

2.8.2.2 SDS-PAGE

Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen

erfolgte unter Verwendung diskontinuierlicher Glycin-SDS-Polyacrylamidgele nach

LAEMMLI (1970). Für die bessere Auflösung von Proteinen < 30 kDa wurden Tricin-SDS-

Polyacrylamidgele nach SCHÄGGER (2006) verwendet.

2.8.2.3 Native PAGE

Die native PAGE wurde analog zur SDS-PAGE durchgeführt. Jedoch enthielten die

Polyacrylamidgele und der Laufpuffer kein SDS.

2.8.2.4 Coomassie- Färbung von PAA-Gelen

Für die Coomassie-Färbung wurden SDS-Gele ca. 30 min in Färbelösung (0,1 % Coomassie

R250 in 10x Entfärber) inkubiert und anschließend mehrmals in 1x Entfärber (45 % Ethanol,

45 % Essigsäure, 10 % Wasser) gewaschen.

2.8.2.5 Silberfärbung von PAA-Gelen

Die Silberfärbung von Gelen erfolgte nach Standardmethoden (BLUM et al., 1987).

2.8.2.6 Western Blotting

Western Blotting wurde nach Standardmethoden, wie bereits beschrieben (HEMSCHEMEIER et

al., 2008 a), durchgeführt.

Folgende Antikörper wurden im Rahmen dieser Arbeit benutzt:

Antikörper Verdünnung Referenz

AdhE 1:2000 KESSLER , persönl. Mitteilung

AOX1 1:10000 Agrisera (Vännäs, Schweden)

Cyc6 1:1000 MERCHANT, persönl. Mitteilung

Fdx5 1:1000 diese Arbeit

HydA1 1:5000 HAPPE et al, 1994

TdcE (Kreuzreaktion gegen PFL) 1:5000 SAWERS, persönl. Mitteilung


20

PetF 1:1000 BÖHME, 1977

Rubisco (große Untereinheit) 1:5000 NEALE, 1993

Strep Tag II (Strep-Tactin AP Konjugat) 1:4000 IBA (Göttingen, Deutschland)

“ImmunoPure Goat Anti Rabbit IgG”, Peroxidase

gekoppelt

1:5000 Pierce (Rockford, IL, USA)

2.8.3 Eisenbestimmung

Die Bestimmung des Eisengehaltes in Proteinen erfolgte gemäß der Methode nach FISH

(1988). Dafür wurden 400 µl Proteinlösung mit 200 µl Lösung A (0.14 M

Kaliumpermanganat, 0.6 M HCl) versetzt und 2 h bei 60°C inkubiert. Nach kurzem Abkühlen

wurde 200 µl Lösung B (1.3 mM Ferrospektral, 2.6 mM Neocuproin, 0.4 M Natriumascorbat,

1 M Ammoniumacetat) dazugegeben und für 30 min bei RT inkubiert. Die Aufnahme der

Absorption bei 562 nm folgte nach einem kurzen Zentrifugationsschritt. Die Berechnung des

Fe-Gehaltes orientierte sich an einer mit definierten Eisenmengen erstellten Eichgerade.

2.8.4 Strep-Tag II Affinitätsaufreinigung

Alle Schritte der Aufreinigung wurden unter anaeroben Bedingungen in einem Anaerob-Zelt

durchgeführt. Das Zellpellet (siehe Kapitel 2.7.8) wurde eins zu eins in 100 mM Tris-HCl, pH

8, resuspendiert und die Zellen durch Ultraschall aufgeschlossen (6 Pulse á 30 sec, 1 min

Pause, 30 % - 40 % Power). Das Zelllysat wurde für 1 h bei 45000 rpm und 4°C

abzentrifugiert, um Zelltrümmer zu beseitigen. Der Überstand wurde mit 5 mg Avidin

versetzt und 30 min auf Eis inkubiert, um biotinylierte Proteine zu komplexieren.

Anschließend wurde der Proteinextrakt durch einen 0,2 µM Sterilfilter filtriert. Dieser Schritt

verhindert die Bindung biotinylierter Proteine aus der Zelle an die Strep-Tactin Säule. Der

klare Überstand wurde für die Affinitätsreinigung auf eine mit 100 mM Tris-HCl, pH 8 mit

150 mM NaCl äquilibrierte Strep-Tactin Säule gegeben. Nach mehrmaligem Waschen mit 20

ml 100 mM Tris-HCl, pH 8 erfolgte die Elution des Strep-TagII Fusionsproteins mit 2,5 mM

Desthiobiotin in 10 Fraktion von jeweils 1 ml.

2.8.5 Aufreinigung von nativem Fdx5

Für die Isolation von nativem Fdx5 aus C. reinhardtii wurden 10 l einer

Schwefelmangelkultur in der H2-produzierenden Phase durch Zentrifugation geerntet. Alle

Schritte der Aufreinigung wurden unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Der

Zellaufschluss erfolgte durch Ultraschall (4 Pulse á 30 sec, 1 min Pause, 30 % - 40 % Power).

Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (1 h, 45000 rpm, 4°C) entfernt und der


21

Proteinüberstand mit Ammoniumsulfat gefällt. Nach dem ersten Schritt (40 % Sättigung)

wurde die Proteinlösung zentrifugiert (1 h, 12000 rpm, 4°C) und der Überstand zu 80 %

Ammoniumsulfat gesättigt. Im Anschluss erfolgte eine weitere Zentrifugation. Das Pellet

wurde in 15 ml 50 mM Tris–HCl, pH 8 resuspendiert und gegen das 100-fache Volumen des

gleichen Puffers ü.N. dialysiert. Die Proteinlösung wurde auf eine mit 50 mM Tris-HCl, pH 8

äquilibrierte Q-Sepharose „fast-flow“ Säule (30 x 60 mm) (Amersham Bioscience, München,

Germany) aufgetragen. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer wurde Fdx5 mit einem

linearen Salzgradienten (0–750 mM NaCl) eluiert. Die Fdx5 enthaltenden Fraktionen wurden

vereinigt, auf eine zweite Q-Sepharose „fast-flow“ Säule (20 x 35 mm) aufgetragen und mit

einem weiteren linearen Salzgradienten (0–500 mM NaCl) eluiert.

2.8.6 Herstellung von polyklonalen Fdx5 Antikörpern

Polyklonale Antikörper wurden durch die Immunisierung eines Kaninchens mit heterolog

produziertem Fdx5 hergestellt, von welchem der Strep-Tag durch Faktor Xa Protease nach

den Anleitungen des Herstellers (Novagen/ Merck, Darmstadt, Deutschland) entfernt wurde.

Die Antikörperproduktion wurde von BioGenes- Gesellschaft für Biopolymere (Berlin,

Deutschland) nach Standard-Immunisierungsprotokollen durchgeführt.

2.8.7 Massenspektrometrische Identifizierung und N-terminale Sequenzierung

Die massenspektrometrische Identifizierung wurde in Zusammenarbeit mit M. Nowaczyk

(Ruhr-Universität Bochum, Lehrstuhl Biochemie der Pflanzen, Bochum, Deutschland)

durchgeführt und erfolgte wie zuvor beschrieben (LAX et al., 2007). Die NH2-terminale

Sequenzierung erfolgte durch Edman-Abbau und wurde von der Proteome Factory AG

(Berlin, Deutschland) durchgeführt.

2.8.8 Bestimmung des Redoxpotentials mittel cyclischer Voltammetrie (CV)

Die Bestimmung des Redoxpotentials mittels cyclischer Voltammetrie erfolgte in

Kooperation mit H. Krassen (Universität Bielefeld, Fakultät für Chemie, Physikalische

Chemie III, Bielefeld, Deutschland). Die CV-Messung wurde in einem elektrochemischen

Drei-Elektroden-Aufbau mit der Goldelektrode als Arbeits-, dem Platinnetz als Gegen-, und

Ag/AgCl als Referenzelektrode durchgeführt. Die Konzentration der Proteinlösung betrug

100 µM.


22

2.8.9 Ferredoxin-abhängige Aktivitätstests

2.8.9.1 NDAP+-Photoreduktion

Die NDAP+-Photoreduktion entspricht in ihrem Ablauf einem Teil der photosynthetischen

Elektronentransportkette. Dabei wird Ascorbat als künstlicher Elektronendonor eingesetzt, der

mittels Plastocyanin als Elektronenüberträger Elektronen auf Photosystem I überträgt. Die

Elektronen werden durch Ferredoxin auf die Fnr transportiert, welche NADP+ zu NADPH

reduziert. Die Bildung von NADPH kann photometrisch bei 340 nm bestimmt werden. C.

reinhardtii Plastocyanin und PSI wurden im Rahmen einer Kooperation mit der

Arbeitsgruppe von Prof. M. Hippler am Institut für Biochemie und Biotechnologie der

Pflanzen der Universität Münster (Deutschland) bereitgestellt.

Der Testansatz für die NDAP+-Photoreduktion (FINAZZI et al., 2005) enthielt 10 mM MgCL2,

0,03 % β−Dodecylmaltosid, 5 mM Na-Ascorbat, 60 µM DCPIP, 10 µM NADP+, 5 µg Chl/ ml

PSI, 4 µM Plastocyanin 0,5 µM Fnr (S. oleocera) und variierende Ferredoxin-

Konzentrationen in 20 mM Tricin, pH 7,6. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von

Ferredoxin gestartet und der Ansatz mit Weißlicht in einer Intensität von ca. 1000 µE/ m2 x s

bestrahlt. Alle 30 s wurde dem Ansatz ein Aliquot entnommen und die Absorption bei 340 nm

bestimmt. Der Extinktionskoeffizient von NADPH bei 340 nm beträgt ε340 = oder 6,22 x mM-

1 x cm-1.

2.8.9.2 Cytc-Reduktion

In dieser rekonstituierten Redoxkaskade wird die Fnr durch NADPH reduziert und überträgt

Elektronen auf Ferredoxin, welches wiederum Cytc reduziert. Die Reduktion von Cytc kann

photometrisch bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt werden. Der Testansatz für die

Cytc-Reduktion enthielt 2 mM NADPH, 5 mM Cytc (Pferdeherz), 0,1 U/ml Fnr (S. oleocera)

und variierende Ferredoxin-Konzentrationen in 50 mM Tris-HCl, pH 8. Die Reaktion wurde

durch die Zugabe von Ferredoxin gestartet. Die Änderung der Absorption wurde

kontinuierlich mit dem Photometer gemessen. Der Extinktionskoeffizient für reduziertes Cytc

beträgt ε550 = 19,1 x mM-1 x cm-1.

2.8.9.3 HydA1-Reduktion

Um die Reduktion von HydA1 durch Ferredoxin zu untersuchen, wurde durch Natrium-

Dithionit reduziertes Ferredoxin mit 0,5 µg HydA1 (aufgereinigt und zur Verfügung gestellt

von S. Stripp aus dem Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen, AG Photobiotechnologie, Ruhr-

Universität Bochum, Deutschland) in 100 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl für 20 min bei


23

37°C inkubiert. Die Inkubation erfolgte unter anaeroben Bedingungen in einem

Gesamtvolumen von 200 µl in luftdicht verschlossenen Reaktionsgefäßen. Der freigesetzte

Wasserstoff wurde mittels Gaschromatographie nachgewiesen und quantifiziert.

2.8.10 Isolierung von C. reinhardtii Chloroplasten und Mitochondrien

S-Mangel-induzierte C. reinhardtii SAG 83.81 Zellen wurden in einem GSA Rotor (Sorvall/

Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) für 5 min zentrifugiert und in isotonischer Lösung

(0.3 M Sorbitol, 10 mM Tricin-HCl, pH 7.8, 5 mM MgCl2) resuspendiert. Die Zellsuspension

wurde mit dem „BioNeb Cell Disruption“ System (Glas-Col, Terre Haute, USA) bei einem

N2-Gasdruck von 20 p.s.i. aufgeschlossen und kurz bei 5000 rpm in einem SS34 Rotor

(Sorvall/ Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) zentrifugiert. Das Pellet wurde für die

Isolierung von intakten Chloroplasten (ZERGES und ROCHAIX, 1998), der Überstand für die

Isolierung von Mitochondrien genutzt (ERIKKSON et al., 1995)

2.9 Spektroskopische Methoden

2.9.1 Aufnahme von EPR (Electron Paramagnetic Resonance)- Signalen von Fdx5

Die EPR-spektroskopische Untersuchung von Fdx5 erfolgte in Zusammenarbeit mit S.

Pudollek an der Freien Universität Berlin, Fachbereich Physik, AG EPR-Spektroskopie von

biologischen Systemen. Für die Untersuchung wurden die Proteinproben auf eine

Konzentration von 200 µM eingestellt und mit 20 mM Natrium-Dithionit reduziert. Sie

wurden in EPR-Röhrchen überführt und in Isopropanpol eingefroren. Alle Experimente

wurden an einem Bruker Biospin Elexsys E580 Spektrometer (Bruker Corporation, Billerica,

USA), ausgestattet mit einem Super HighQ Resonator, durchgeführt. Die Aufnahme der

Spektren erfolgte bei einer Temperatur von T = 10 K und einer Mikrowellen-Frequenz von m

= 9.38 GHz. Es wurde eine Mikrowellen-Leistung von P = 4 mW und eine

Amplitudenmodulation von 0.5 mT bei 100 kHz Modulationsfrequenz genutzt.

2.9.2 Konfokale Laser Scanning Fluoreszenz Mikroskopie

Die Fluoreszenz-Emissionen von C. reinhardtii Transformanden wurden an einem Zeiss LSM

510 META Mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) untersucht. cGFP und Chloroplasten

wurden mit der 488 nm Linie eines Argon-Ionen-Lasers angeregt. Die Fluoreszenz-

Emissionen wurden unter Nutzung der Strahlenteiler HFT UV/488/543/633 und NFT545

durch den Bandpassfilter BP505-530 und den Langpassfilter LP560 selektiert.


24

2.9.3 Eisenbestimmung mittels Röntgenfluoreszenzanalyse

Die Röntgenfluoreszenzanalyse erfolgte in Kooperation mit M. Haumann an der freien

Universität Berlin, Fachbereich Physik, AG Biophysik und Photosynthese. Für die

Untersuchung wurden Proteinproben mit einer Konzentration von 100 µM eingesetzt. Die

Messung wurde an einem Bruker S2 PICOFOX (Bruker Corporation, Billerica, USA)

durchgeführt.

2.10 Physiologische Messungen

2.10.1 Chlorophyll- und Carotinoidbestimmung

1 ml einer C. reinhardtii Zellkultur wurde durch Zentrifugation sedimentiert und das Pellet

anschließend in 1 ml Aceton resuspendiert. Daraufhin wurde der Ansatz für 2 min bei 80°C

inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation erfolgte die photometrische Bestimmung des

Chlorophyllgehalts des Überstandes bei 652 nm. Der Chlorophyllgehalt lässt sich mit

folgender Gleichung berechnen: Chlorophyllgehalt [µg x ml-1] = E652 x 27,8.

Die Extinktion der Carotinoide wurde unter Beachtung der Absorption von Chlorophyll a und

Chloropyll b berechnet: Carotinoidgehalt [µg x ml-1] = E480 + 0,114 x E663 - 0,638 x E645.

Der Carotinoridgehalt [µg x ml-1] kann dann folgendermaßen bestimmt werden: c = E480 x

0,2-1. (SCHOPFER, 1989)

2.10.2 In vitro- Test zur Messung der Hydrogenaseaktivität

Für die Bestimmung der in vitro Hydrogenaseaktivität wurden 0,5 ml Zellkultur in einem

anaeroben Reaktionsansatz (60 mM Kaliumphosphatpuffer pH 6,8, 1 % Triton X-100, 10 mM

Methylviologen und 100 mM Natrium-Dithionit) durch Schütteln aufgeschlossen. Im

Anschluss wurde der Ansatz eine Minute mit Argon gespült und 20 min bei 37°C und

konstantem Schütteln inkubiert. Der freigesetzte Wasserstoff wurde mittels

Gaschromatographie gemessen. Die Hydrogenaseaktiviät wurde auf den Chlorophyllgehalt

der Zellen und die Zeit (h) bezogen und kann folgendermaßen berechnet werden:

Hydrogenaseaktivität [nmol H2 x h-1 x µg Chl-1] = (area x 3 x 40 x nmol) / (0,5 x µg Chl x

Eichfaktor x h).


25

2.10.3 Nachweis von Fermentationsprodukten

Für den Nachweis von Fermentationsprodukten wurde 1 ml Zellkultur abzentrifugiert und der

Überstand mittels Enzymtests zum Nachweis von Formiat und Ethanol (r-biopharm,

Darmstadt, Deutschland) analysiert. Die Enzymtests wurden gemäß den Herstellerangaben

durchgeführt.

Ergebnisse

26

3 Ergebnisse

3.1 Im Genom von C. reinhardtii kodieren sechs Gene für Ferredoxine

Unter anaeroben S-Mangelbedingungen findet im Metabolismus von C. reinhardtii eine

grundlegende physiologische Umstrukturierung statt, durch welche die Transkription

verschiedenster Gene ein- oder abgeschaltet wird (JACOBS, Diplomarbeit, 2005). Auch die

Transkriptmengen der Ferredoxin-kodierenden Gene PETF und FDX5 sind unter diesen

Bedingungen einer Veränderung unterlegen (JACOBS Diplomarbeit, 2005; HEMSCHEMEIER

Diplomarbeit, 2002). Da Ferredoxine wichtige Elektronenüberträger sind, die auch in

verschiedenen anaeroben Stoffwechselwegen aktiv sind, war ein Ziel dieser Arbeit die

Klärung der Frage, ob noch weitere Ferredoxine-kodierende Gene in C. reinhardtii durch die

veränderten physiologischen Bedingungen unter S-Mangel und Anaerobiose reguliert werden.

Abb. 3-1: Sequenzvergleich der im Genom von C. reinhardtii kodierten Ferredoxine. Dargestellt ist ein

Sequenzvergleich zwischen PetF und den putativen Ferredoxinen Fdx2, Fdx3, Fdx4, Fdx5 und Fx6. Die den

Cluster koordinierenden Cysteinreste sind rot markiert. In PetF und Fdx5 sind die chloroplastidären

Proteaseschnittstellen, an denen das Transitpeptid abgetrennt wird, durch rote Pfeile gekennzeichnet (SCHMITTER

et al, 1988; diese Arbeit). Der Sequenzvergleich wurde mit dem Programm SECentral unter Verwendung der

Scoring-Matrix BLOSUM 62 erstellt.

Protein-BLAST Analysen gegen die JGI Datenbank (Version 3.0) des C. reinhardtii Genoms,

in denen die Proteinsequenz von PetF als Vergleich diente, deckten das Vorhandensein von

insgesamt sechs Genen in C. reinhardtii auf, die für Ferredoxine bzw. Ferredoxin-ähnliche

Proteine kodieren. Ein Sequenzvergleich der putativen Ferredoxine mit PetF zeigt, dass sie

signifikante Ähnlichkeiten zueinander aufweisen und dass in allen Polypetiden die

konservierten Cysteinreste vorkommen, die für die Koordination eines [2Fe2S]-Clusters

Ergebnisse

27

FDX5

PETF

FDX2

FDX3

FDX4

FDX60 h 24 h 48 h 72 h 0 h 0,5 h 4 h

A B

notwendig sind. Im Vergleich zu PetF zeigen insbesondere Fdx3 und Fdx6 auffälige C-

terminale Extensionen, wobei Fdx6 insgesamt große Sequenzabweichungen und Insertionen

gegenüber den anderen Ferredoxinen aufweist (Abb. 3-1).

Um die Transkription der Ferredoxin-kodierenden Gene unter S-Mangelbedingungen, sowie

unter artifiziell durch Argonbegasung induzierten anaeroben Bedingungen zu untersuchen,

wurden semiquantitative RT-PCRs durchgeführt, in denen mit spezifischen Primern für

PETF, FDX2, FDX3, FDX4, FDX5 und FDX6 kurze DNA-Fragmente der jeweiligen

Ferredoxin-kodierenden Gene amplifiziert wurden.

Abb. 3-2: Semiquantitative RT-

PCR Analyse zur Untersuchung

der Transkription der

Ferredoxin-kodierenden Gene

PETF, FDX2, FDX3, FDX4,

FDX5 und FDX6 aus C.

reinhardtii. Es wurde mRNA

eingesetzt, die zu den angegebenen

Zeitpunkten aus S-Mangelkulturen

(A) oder aus artifiziell durch

Begasung mit Argon anaerob

induzierten C. reinhardtii Kulturen

(B) isoliert wurde. Alle RT-PCRs

wurden mit 23 Zyklen

durchgeführt.

Die Ergebnisse der RT-PCRs zeigten (Abb. 3-2), dass sowohl unter S-Mangel als auch unter

artifiziell erzeugten anaeroben Bedingungen die Transkriptmengen aller Ferredoxin-

kodierenden Gene beeinflusst wird.

So ist unter S-Mangel eine Abnahme der Transkriptlevel von PETF, FDX3, FDX4 und FDX6

zu beobachten, während bei FDX2 und FDX5 eine Zunahme zu erkennen ist. Auch unter

artifiziell anaeroben Bedingungen wird eine Abnahme des FDX3, FDX4 und FDX6

Transkriptgehaltes deutlich, der Transkriptlevel von PETF bleibt unter diesen Bedingungen

jedoch konstant. Bei FDX2 kann im Gegensatz zu S-Mangelbedingungen kein Transkript

nachgewiesen werden, während bei FDX5 eine starke Akkumulation des Transkriptes auch

unter artifiziell erzeugten anaeroben Bedingungen deutlich wird.

Ergebnisse

28

Die Resultate der semiquantitativen Analyse veranschaulichen, dass unter S-Mangel- und

artifiziell induzierten anaeroben Bedingungen nur das Transkript des FDX5-Gens signifikant

akkumuliert. FDX5 ist somit das Einzige der Ferredoxin-kodierenden Gene, das

wahrscheinlich ausschließlich durch die veränderten intrazellulären Bedingungen bei

Sauerstoffmangel reguliert wird.

Auch in Northern Blot und Real-Time PCR Analysen zur Untersuchung des mRNA-Levels

verschiedener Schlüsselenzyme des photofermentativen Metabolismus von C. reinhardtii, die

in vorherigen Arbeiten (JACOBS, Diplomarbeit, 2005; HEMSCHEMEIER, Diplomarbeit, 2002;

WEBER, Diplomarbeit, 2002) durchgeführt wurden (Übersicht Tab. 3-1), ist eine starke

Akkumulation des FDX5-Transkriptes unter S-Mangel sowie artifizieller Anaerobiose

erkennbar. Sie erfolgt unter beiden Bedingungen parallel zur Akkumulation der Transkripte

von HYDA1 und PFL1. Der sinkende mRNA-Gehalt von PETF unter S-Mangel und der

unveränderte PETF-mRNA-Gehalt unter artifizieller Anaerobiose wurden durch die

Transkript-Analysen ebenfalls bestätigt.

Gen S-Mangel Artifizielle Anaerobiose Referenz

HYDA1 + + + +

PFL1 + + + +

PETF - - 0

FDX5 + + + + + +

Jacobs, Diplomarbeit, 2005;

Hemschemeier, Diplomarbeit,

2002; Weber, Diplomarbeit, 2002

Tab. 3-1: Übersicht über die Veränderungen des Transkriptgehaltes von HYDA1, PFL1, PETF und FDX5

unter S-Mangel und artifizieller Anaerobiose. Für die Analyse wurde Gesamt- und mRNA eingesetzt, die zu

den angegeben Zeiten aus S-Mangelkulturen (A) oder artifiziell anaerobisierten Kulturen (B) isoliert wurde.

Dabei bedeutet „0“ = keine signifikante Veränderung; „–“ = Abnahme der Transkription; „– – “ = starke

Abnahme der Transkription; „+“ = Zunahme der Transkription; „+ +“ = starke Zunahme der Transkription; „+ +

+“ = sehr starke Zunahme der Transkription.

Die außergewöhnlich starke Akkumulation des FDX5 Transkriptes unter anaeroben

Bedingungen deutet darauf hin, dass das FDX5-Genprodukt eine vitale Funktion in der

veränderten Physiologie von (photo-) fermentierenden C. reinhardtii Zellen besitzen könnte.

Infolgedessen wurde das FDX5-Genprodukt für eine umfassende und funktionelle

Charakterisierung ausgewählt.

Unter S-Mangel und artifiziell anaeroben Bedingungen akkumuliert das Transkript des

Gens FDX5, das für ein putatives Ferredoxin kodiert.

Ergebnisse

29

3.2 Heterologe Expression von FDX5 aus C. reinhardtii in E.coli

Für die heterologe Expression von FDX5 und PETF wurde das Strep-Tag System der Firma

IBA BioTAGnology (IBA GmbH, Göttingen, Deutschland) mit dem dazugehörigen

Expressionsplasmid pASK-IBA7 verwendet.

In diesem Plasmid ist der einklonierten Gensequenz eine 5’-terminal gelegene DNA-Sequenz

vorgeschaltet, die für einen Strep-Tag II kodiert. Der Strep-Tag ist durch einen kurzen Linker und

eine Faktor Xa- Schnittstelle mit dem Ziel-Protein verbunden. Die Expression eines Genes in

diesem System unterliegt der Kontrolle des TET-Promotors und ist durch die Zugabe von

Anhydrotetracyclin (AHT) induzierbar. Der TET-Repressor ist auf dem pASK-IBA Vektor kodiert

und wird konstitutiv exprimiert. Die Expression des klonierten Gens wird bis zur Induktion durch

AHT strikt unterdrückt. Im Gegensatz zum lac-Promotor ist der tet-Promotor streng kontrolliert,

so dass vor der Induktion keine Grundexpression des rekombinanten Proteins zu erwarten ist.

Das FDX5-Gen liegt auf Chromosom 17:702791-704769 in JGI4.0 (GenBank ABC88604)

und kodiert laut Annotation ein 1078 Bp langes Transkript. Das Transkript umfasst einen aus

393 Bp bestehenden offenen Leserahmen, der für ein 130 Aminosäuren (AS) großes Protein

kodiert. Basierend auf der Konsensusequenz Val-X-Ala für chloroplastidäre Signalpeptide

(FRANZEN et al., 1990) konnte eine putative Proteaseschnittstelle zwischen Position 27 und 28

des Proteins (Sequenz V-Q-A27↓F28) identifiziert werden (Abb. 3-3). Für die Klonierung in

ein Expressionsplasmid wurde daher nur die Gensequenz berücksichtigt, die für das native

Protein, exklusive des Transitpeptides, kodiert.

Abb. 3-3: Sequenz des offenen Leserahmens des FDX5-Gens

Dargestellt ist die cDNA-Sequenz des offenen Leserahmens des FDX5-Gens. Unterhalb der cDNA-Sequenz ist in

grüner Farbe die kodierte AS-Sequenz abgebildet. Die putative Proteaseschnittstelle für ein chloroplastidäres

Signalpeptid ist durch einen Pfeil gekennzeichnet. Das resultierende Transitpeptid ist grau unterlegt.

Für die Klonierung wurde die FDX5-cDNA mit den durch den IBA Primer D'Signer1.1

generierten Primern Fdx5_5_Strep und Fdx5_3_Strep, welche die für die gerichtete

Klonierung notwendige BsaI-Restriktionsschnittstelle bereits enthielten, amplifiziert. Das

durch die Klonierung erhaltene Expressionplasmid wurde als pJJ23 bezeichnet.

Um das Expressionsvermögen des erhaltenen Konstruktes zu überprüfen, wurde der

Expressionsstamm E. coli BL21 De3 plys mit pJJ23 transformiert (im Folgenden wird dieser

Ergebnisse

30

Stamm als JJ23 bezeichnet). Im Coomassie-Gel (Abb. 3-4 A) wird im Laufe der Expression

eine zusätzliche Bande sichtbar, die auf einer Höhe von ca. 13,5 kDa läuft und die mittels

Western Blot als Strep-Tag gekoppeltes Protein nachgewiesen werden konnte (Abb. 3-4 B).

0h 1h 2h 3h 4h

0h 1h 2h 3h 4h A B

10 kDa

15 kDa

25 kDa

35 kDa

40 kDa55 kDa70 kDa

Abb. 3-4: Analyse der FDX5-Expression in Expressionsstamm JJ23. Expressionsstamm E. coli BL21 DE3

pLys wurde mit Plasmid pJJ23 transformiert. Während der Proteinexpression wurden nach 0 h, 1 h, 2 h, 3 h und

4 h Proteinproben entnommen, die durch 15%-ige Tris/Glycin SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie R250

gefärbt (A) oder auf Nitrocellulose geblottet und anschließend mittels Strep-Tactin Konjugat immunologisch

nachgewiesen wurden (B). Der Pfeil in Abb. A deutet auf eine bei etwa 13,5 kDa gelegene Proteinbande.

Da von PetF bereits viele Charakteristika bekannt sind, sollte heterolog in E. coli

synthetisiertes PetF als vergleichende Kontrolle in verschiedenen Experimenten mit

rekombinantem Fdx5 dienen. Die Klonierung der PETF-cDNA (Chromosom 14:2749384-

2750217 in JGI4.0; GenBank: P07839) in das Expressionsplamid pASK-IBA7 wurde analog

zur Klonierung der FDX5-cDNA durchgeführt. Die Amplifizierung des cDNA-Bereichs, der

für das native Protein exklusive der chloroplastidären Signalsequenz kodiert (SCHMITTER et

al, 1988), erfolgte mit den Primer PetF_3_Strep und PetF_5_Strep. Das aus der Klonierung

resultierende Plasmid wurde als pJJ20 bezeichnet und wie für das FDX5-Expressionsplamid

beschrieben auf die Expressionsfähigkeit überprüft (Daten nicht gezeigt).

3.3 Aufreinigung von heterolog synthetisiertem Fdx5 durch Strep-Tactin

Affinitätschromatographie

Für die Isolation von rekombinantem Fdx5 aus JJ23-Zelllysat wurde Zellmaterial von

insgesamt drei Litern Expressionskultur verwendet. Die Aufreinigung erfolgte über eine

Strep-Tactin Säule, die Elution erfolgte mit Desthiobiotin.

Ergebnisse

31

Das Prinzip des Strep-Tag Systems beruht auf der Bindung von Biotin an Streptavidin. Der Strep-

Tag II besteht aus acht Aminosäuren (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) und bindet an die

Biotin-Bindedomäne des Streptavidins. Damit wird eine affinitätschromatographische

Aufreinigung des Zielproteins über eine Strep-Tactin Säule, einer molekularbioloisch erzeugten

Form des Streptavidin, ermöglicht.

Zur Analyse der Aufreinigung wurden die erhaltenen Fraktionen über SDS-PAGE aufgetrennt

und mit Coomassie R250 angefärbt.

AB10 kDa

15 kDa

25 kDa

35 kDa40 kDa55 kDa70 kDa

R D W20 E3 E4 E5 E6 E7 E8

Abb. 3-5: Analyse der Strep-Tactin Affinitätschromatographie zur Isolation von rekombinantem Fdx5 aus JJ23

Zelllysat. A: Zelllysat (L ), Durchlauf (D), Waschfraktion 20 (W20) und Elutionsfraktionen (E3-E6) wurden in

äqvivalenten Mengen durch 15% Tris/Tricin SDS-PAGE aufgetrennt Das SDS-Gel wurde anschließend mit

Coomassie R250 angefärbt. B: Elutionsfraktion

Wie in Abb. 3-5 A zu erkennen, eluiert Fdx5 hauptsächlich in Fraktion E6, wobei das Eluat

bräunlich gefärbt ist (Abb. 3-5 B). Bis auf eine leichte Bande in Höhe von 70 kDa sind nur

geringe Verunreinigungen mit anderen Proteinen zu erkennen. Durch die Verwendung von

Vogel-Bonner Medium (VOGEL und BONNER, 1955), einem definierten Minimalmedium mit

hohem FeSO4-Gehalt, und die Nutzung eines hoch affinen Strep-Tactin Materials konnte die

aufgereinigte Proteinmenge von durchschnittlich 1,5 mg Fdx5 pro 3 l Zellkultur auf

durchschnittlich 3-5 mg Fdx5 pro 3 l Zellkultur gesteigert werden.

Eine Besonderheit, die bei isoliertem Fdx5 auftrat, war die zunehmende Oligomerisierung des

Proteins bei Lagerung unter aeroben Luftbedingungen, wie in Abb. 3-6 zu erkennen ist. Wie

Western Blot Analysen zeigten, reagieren die im Gel oberhalb der Fdx5-Bande laufenden

Proteinbanden auch mit anti-Fdx5 Antikörper (Daten nicht gezeigt, Herstellung des

Antikörpers siehe Kapitel 3.4). Bei aerob gelagerten PetF konnte diese Tendenz zur

Oligomer-Bildung nicht beobachtet werden (Daten nicht gezeigt). Durch die anaerobe

Ergebnisse

32

10 kDa

15 kDa

25 kDa

35 kDa

40 kDa55 kDa70 kDa

Aufreinigung und auch Lagerung des isolierten Proteins konnte die Oligomerisiung des

ansonsten monomer vorliegenden Proteins vermieden werden.

Abb. 3-6: Oligomer-Bildung in einer aerob

gelagerten Probe von rekombinantem Fdx5.

Unter aeroben Bedingungen aufgereinigtes und

gelagertes Protein wurde durch Elektropherese

eines 15%-igen Tris/Glycin SDS-Geles

aufgetrennt. Die Färbung des Geles erfolgte mit

Coomassie R250.

Rekombinantes Fdx5 kann in ausreichenden Mengen aus E. coli aufgereinigt werden.

Unter Lufteinfluss neigt das Protein zur Bildung von Oligomeren.

3.4 Gegen heterolog produziertes Fdx5 gerichtete Antiköper zeigen die

Akkumulation von Fdx5 in C. reinhardtii auf Proteinebene

Für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern wurde ein Kaninchen nach einem

Standardprotokoll mit heterolog produziertem Fdx5 immunisiert. Um die Spezifität des

Antikörpers zu erhöhen, wurde der Strep-Tag vor der Immunisierung durch den Verdau mit

Faktor Xa vom Protein entfernt (Abb. 3-7 A)

Abb. 3-7: SDS-PAGE Analyse des mit Faktor Xa

verdauten Fdx5 und Western Blot mit anti-Fdx5

Antikörper zur Kontrolle von Kreuzreaktionen

mit PetF. A: 300 µg Fdx5 wurden mit 10 U Faktor

Xa ü.N. bei RT verdaut. Zur Kontrolle wurde ein

Aliquot des verdauten Proteins (-Tag) und des

unverdauten Original-Proteins (+Tag) in einem 15%-

igen SDS-Gel aufgetrennt und anschließend mit

Coomassie-R250 angefärbt. B: Zur Kontrolle auf

Kreuzreaktionen des anti-C. reinhardtii Fdx5

Antikörpers mit PetF wurden gleiche Mengen an

rekombinanten Fdx5 und PetF durch SDS-PAGE

aufgetrennt und geblottet. Der immunologische

Nachweis erfolgte durch Inkubation mit anti-C.

reinhardtii Fdx5 Antikörper.

- Tag + Tag

Fdx5 PetFB

A

Ergebnisse

33

In Immunoblots reagierte der hergestellte Antikörper mit heterolog produziertem Fdx5 und

zeigte keine Kreuzreaktionen mit PetF, wie in Abb. 3-7 B zu erkennen ist.

Abb. 3-8: Western Blot Analysen mit

anti-Fdx5 Antikörper weisen die

Akkumulation von Fdx5 in

schwefelmangelinduzierten C. reinhardtii

Zellen nach. Äqvivalente Mengen

Rohextrakt wurden mittels SDS-PAGE

aufgetrennt und nach Transfer auf

Nitrocellulose mittels anti-C. reinhardtii

HydA1 Antikörper, anti-E. coli TcdE

Antikörper, anti-S.oleocera PetF Antikörper

und anti-C. reinhardtii Fdx5 Antikörper

nachgewiesen.

Mit dem anti-Fdx5 Antikörper war es erstmals möglich die parallel zur Akkumulation von

FDX5-Transkript (Abb. 3-2, Tab. 3-1) verlaufende Akkumulation von Fdx5-Protein in

Rohextrakten von schwefelmangelinduzierten C. reinhardtii Zellen nachzuweisen (Abb. 3-8).

Unter aeroben Bedingungen kann kein Fdx5 detektiert werden. Die Zunahme von Fdx5

erfolgt gleichzeitig mit der Synthese von HydA1 und Pfl1. Interessanterweise bleibt die

Menge an PetF-Protein unter diesen Bedingungen konstant, obwohl auf Transkriptebene eine

Abnahme beobacht werden kann. Der für die Western Blots eingesetzte anti-S.oleocera PetF

Antikörper wurde auf Kreuzreaktionen mit Fdx5 untersucht und zeigt keinerlei Interaktion mit

dem rekombinanten Protein (Daten nicht gezeigt).

Unter S-Mangel kann eine Akkumulation von Fdx5-Protein beobachtet werden, die

parallel zur Akkumulation von HydA1 und Pfl1 verläu ft.

3.5 Partielle Aufreinigung von Fdx5 aus C. reinhardtii für die N-terminale

Sequenzierung

Um die N-terminale Sequenz des maturierten Fdx5-Proteins zu verifizieren, wurde Fdx5 aus

einer durch S-Mangel induzierten C. reinhardtii Kultur isoliert.

Die erhaltenen Elutionsfraktionen wurden durch Western Blot Analyse unter Anwendung des

anti-Fdx5 Antikörpers analysiert. Fdx5 eluiert dabei hauptsächlich in Fraktion drei bis fünf

PetF

Fdx5

HydA1

Pfl1

0 h 24 h 48 h 72 h

Ergebnisse

34

Fdx5

AB

des zweiten NaCl Gradienten Die Identifizierung des Fdx5-Bande im Coomassie R250

gefärbten SDS-Gel erfolgte im Anschluss durch Massenspektrometrie (Abb11).

Abb. 3-9: Fdx5 wurde mittels

Massenspektrometrie in Elutions-

fraktion vier identifiziert. A: Die

Auftrennung von Elutionsfraktion 4

erfolgte im 15 %-igen Tris-Tricin

Gel. Der Pfeil kennzeichnet die

Fdx5-Bande. B: Fdx5 wurde durch

Massenspektrometrie identifiziert

(B).

Die auf PVDF-Membran transferierte Fdx5-Bande wurde für die N-terminale Sequenzierung

durch Edman-Abbau genutzt und ermöglichte die Identifizierung der ersten fünf Aminosäuren

Phe-Gln-Val-Thr-Leu des nativen Proteins. Damit bestätigt die N-terminale Sequenzierung,

dass heterolog produziertes Fdx5 in seiner Aminosäuresequenz mit nativem, aus der Zelle

aufgereinigtem Fdx5, übereinstimmt. Folglich hat Fdx5 eine Länge von 103 AS und eine

Größe von 11,56 kDa. Darüber hinaus verifiziert das Ergebnis der Sequenzierung das

Vorhandensein eines N-terminalen Transitpeptides mit einer Größe von 27 AS.

3.6 Biochemische Charakterisierung von Fdx5

Das heterolog produzierte und aufgereinigte Ferredoxin, das in seiner Aminosäuresequenz

dem nativen in C. reinhardtii synthetisierten Protein entspricht, diente als Grundlage für eine

umfassende biochemische Charakterisierung, welche u.a. die Frage nach dem [FeS]-Cluster-

Typ von Fdx5 und dem Redoxpotential klären sollte.

Die Bestimmung des Eisengehaltes von rekombinantem Fdx5 mittels der Methode nach FISH

(1988) ergab, basierend auf einem Molekulargewicht von 11,56 kDa, ein Verhältnis von 2,05

± 0,23 mol Eisen/ Mol Protein. Die zur Kontrolle der Eisenbestimmung durchgeführte

Röntgenfluoreszenzspektroskopie bestätigte dieses Ergebnis mit einem Verhältnis von 2,27 ±

0,1 mol Eisen/ Mol Protein. Dies deutet daraufhin, dass das redoxaktive Zentrum von Fdx5

aus einem [2Fe2S]-Cluster besteht.

Die Eisenbestimmung nach FISH beruht auf einer sauren Lyse der Proteine, durch die der [FeS]-

Cluster freigesetzt und das Eisen in Lösung gebracht wird. Das freie Eisen wird durch

Ascorbinsäure zu Fe2+reduziert und von Ferrospektral komplexiert. Die Komplexierung des

Ergebnisse

35

Ferrospektral ist photometrisch nachweisbar und lässt damit Rückschlüsse auf den Eisengehalt der

untersuchten Proteine zu. Bei der Röntgenfluoreszenzspektroskopie findet eine Anregung der

Proteinprobe durch Röntgenstrahlung statt. Die freigesetzte Röntgenemission wird gemessen und

ermöglicht eine Bestimmung der in der Probe enthaltenen Eisenkonzentration (SZOBOSZLAI et al.,

2008).

Das Absorbtionsspektrum von Fdx5 weist drei Maxima bei 333, 419 und 462 nm (Abb. 3-

10 A) auf. Diese Werte korrelieren mit den Werten von 330, 420 und 460 nm, die für PetF

beobachtet worden sind (GALVÁN und MÁRQUEZ, 1985).

Wavelength [nm] 3000 3250 3500 3750

0,5

1,0

1,5

250 300 350 400 450 500 550 3000 3250 3500 3750250 350 450 550

1,5

1

0,5

Ab

sorb

tio

n

EP

R In

ten

sitä

t/ a

.u.

Feld [mT]

*

Wellenlänge (nm)A B

Abb. 3-10 (A) UV/VIS Absorptionsspektrum von oxidiertem und (B) EPR-Spektrum von reduziertem Fdx5. A:

Die Konzentration der Fdx5-Proteinprobe betrug 1 µg/µl. Die Maxima liegen bei 333, 419 und 462 nm. B: Für die

EPR-Messung wurde eine 200 µM Fdx5-Lösung verwendet. *: unspezifisches Glasssignal

Das EPR-Spektrum des reduzierten Ferredoxins zeigte g-Werte von 2.048, 1.956 und 1.905

(Abb.3-10 B) und weist damit vergleichbare Werte zu den bekannten g-Werten von PetF,

2.045, 1.951 und 1.877 (GALVÁN und MÁRQUEZ, 1985) auf.

Die EPR-Spektroskopie ermöglicht den Nachweis, die quantitative Bestimmung und auch die

Strukturaufklärung paramagnetischer Moleküle. Im oxidierten Zustand ist der [FeS]-Cluster von

Ferredoxinen diamagnetisch, da beide Eisenatome als Fe3+ vorliegen (HALL et al., 1977). Nimmt

der Cluster ein Elektron auf, wird ein Eisenatom zu Fe2+ reduziert und das Molekül somit

paramagnetisch, wodurch eine EPR-spektroskopische Analyse ermöglicht wird. Der g-Wert ist

dabei das Maß für den effektiven magnetischen Moment und spezifisch für den vemessenen [FeS]-

Cluster.

Um einen eventuellen Einfluss von Sauerstoff auf den [FeS]-Cluster von Fdx5 zu

untersuchen, wurde auch das EPR-Spektrum einer Proteinprobe, die 24 h mit Raumluft in

Kontakt stand, gemessen. Das ermittelte Spektrum unterschied sich jedoch nicht von den

unter Ausschluss von Sauerstoff gelagerten Proben (Daten nicht gezeigt).

Ergebnisse

36

Das Redoxpotential von Fdx5 wurde mittels cyclischer Voltammetrie im direkten Vergleich

mit PetF bestimmt. Die Messungen ergaben ein Potential von -354 mV für Fdx5 und -369 mV

für PetF und liegen somit beide im selben Redoxbereich (Abb. 3-11). Beide Werte liegen

deutlich niedriger als das bereits früher berichtete Redoxpotential von -410 mV von PetF, das

mittels Redoxtitration bestimmt wurde.

Bei der cyclischen Voltammetrie wird über eine Elektrode ein sich in Abhängigkeit von der Zeit

änderndes ansteigendes und daraufhin wieder abfallendes Potential angelegt. Befindet sich in der

Messlösung eine redoxaktive Substanz, in diesem Fall ein Redoxprotein, dann wird dieses bei

einem spezifischen Potential oxidiert und reduziert. Durch die Lage des Reduktions- und

Oxidationspeaks kann dann das spezifische Redoxpotential des Redoxproteins bestimmt werden.

E = -579 mV (vs Ag/AgCl)E = -369 mV (vs SHE)

0

0

PetF Fdx5

E = -564 mV (vs Ag/AgCl)E = -354 mV (vs SHE)

0

0

Stro

mst

ärke

[µA

]

Stro

mst

ärke

[µA

]

Spannung E [V] Spannung E [V]

Abb. 3-11: Cyclische Voltamogramme von Fdx5 und PetF. Für die Messungen wurde eine

Proteinkonzentration von 100 µM verwendet. Die Voltamogramme wurden mit einer Scan-Rate von 100 mV/s

an einer Gold-Elektrode gemessen, die mit einer L-Cystein Schicht modifiziert war.

Eine charakteristische Eigenschaft von Pflanzen-Typ Ferredoxinen ist ihre sehr negative

Netto-Ladung. Eine Aussage darüber gibt der Isoelektrische Punkt (pI-Wert) eines Proteins,

der den pH-Wert darstellt, bei dem die Nettoladung eines Proteins gleich null ist. Ausgehend

von der AS-Sequenz ergab die Berechung des Isoelektrischen Punktes von Fdx5 einen pI-

Wert von 5,37 während die Berechnung von PetF einen pI-Wert von 3,86 zur Folge hatte.

Dies bedeutet, dass PetF weitaus negativer geladen ist, als Fdx5 (Abb. 3-12 B). Um die

unterschiedlichen Ladungseigenschaften von Fdx5 und PetF zu bestätigen, wurde eine native

Gelelektrophorese durchgeführt.

In einem nativen Gel werden Proteine durch ihre physiologischen Eigenschaften aufgetrennt und

wandern bedingt durch ihre Ladung und Größe. Die native PAGE eignet sich besonders für die Analyse

von Ferredoxinen, da sie sehr klein und äußerst negativ geladen sind und deshalb im nativen Gel sehr

weit laufen.

Ergebnisse

37

PetF Fdx5

Ferredoxin pI-Wert

PetF 3,86

Fdx5 5,87

A

B

Im nativen Gel (Abb. 3-12 A) ist zu erkennen, dass PetF, wie erwartet, als deutlich definierte

Bande sehr weit unten migriert. Fdx5 dagegen ist nicht als distinkte Bande erkennbar, sondern

zeigt sich als gering gewanderter, undefinierter Streifen sehr weit oberhalb der PetF-Bande.

Dies bestätigt damit die durch die pI-Werte angedeuteten Ladungseigenschaften der beiden

Ferredoxine PetF und Fdx5.

Abb. 3-12: Native PAGE

zur Analyse der Ladungs-

eigenschaften von Fdx5 im

Vergleich zu PetF native

Page und Darstellung der

jeweiligen PI-Werte. A: PetF

und Fdx5 wurden in

äqvivalenten Mengen durch

eine native PAGE

aufgetrennt. B: Darstellung

der pI-Werte von PetF und

Fdx5, ausgehend von der

Aminosäuresequenz.

Fdx5 ist ein [2Fe2S]-Ferredoxin mit ähnlichem Redoxpotential wie PetF. Fdx5 ist jedoch

sehr viel positiver geladen.

3.7 Zelluläre Lokalisation von Fdx5

Die N-terminale Sequenzierung von nativem Fdx5 bestätigte das Vorhandensein eines 27 AS

umfassenden N-terminalen Transitpetides, das möglicherweise den Transport des Proteins in

den Chloroplasten vermittelt. Um eine chloroplastidäre Lokalisation des Ferredoxins Fdx5 zu

überprüfen, wurden zwei unterschiedliche Strategien angewendet. Zum einen wurde ein

Fusionsprotein aus dem Fdx5-Transitpeptid und dem Grün Fluoreszierenden Protein (GFP)

hergestellt, um im Anschluss die Lokalisation des Fusionsproteins in vivo mittels Fluoreszenz

Mikroskopie zu beobachten. Zum anderen wurde die Technik der Zellfraktionierung

angewandt, um den Gehalt von Fdx5 in chloroplastidären und mitochondrialen Fraktionen

mittels Western Blot zu bestimmen.

Als Grundlage für die Herstellung von FDX5-Transitsequenz/ GFP-Konstrukten wurde das

Plasmid pMF59 (FUHRMANN et al., 1999) verwendet, dass für ein Ble/ GFP-Fusionsprotein

kodiert, das unter der Kontrolle des konstitutiven HSP70A/RBCS2-Tandempromotors steht

Ergebnisse

38

Das BLE-Gen kodiert für die Phleomycin-Resistenz aus Streptoalloteichus hindustanus. Das

kodierte bakterielle Protein wird in den Zellkern von C. reinhardtii transportiert (FUHRMANN et

al., 1999).

Die in pMF59 verwendete GFP-Sequenz wurde an die „Codon-Usage“ von C. reinhardtii

angepasst und besitzt einige zusätzliche Modifikationen, die die spektralen Eigenschaften des

Proteins verbessern (FUHRMANN et al., 1999). Durch Restriktion mit XcmI und FseI wurde ein

Großteil des BLE-Gens entfernt und an diese Position die das Transitpeptid kodierende

cDNA-Sequenz des FDX5-Gens eingefügt. Der verbleibende Rest des BLE-Gens verblieb als

eine Art Linker zum GFP-Gen. Abb. 3-13 A zeigt eine schematische Darstellung des

hergestellten Konstruktes. Das aus der Klonierung resultierende Plasmid pJJ24 wurde

zusammen mit einer Paromomycin-Resistenzkasette für die Co-Transformation von C.

reinhardtii CW 388- eingesetzt. Aus der Transformation hervorgegangene Klone wurden

durch Kolonie-PCR auf die Integration des FDX5-Transitsequenz/ GFP-Konstruktes

überprüft (Daten nicht gezeigt). Aus dieser Analyse gingen vier positive Transformanden

hervor, die im Anschluss durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie analysiert wurden. In

diesen Messungen diente der mit pMF59 transformierte C. reinhardtii Stamm CC-125 als

Positivkontrolle, als Negativkontrolle wurde der untransformierte C. reinhardtii

Wildtypstamm CW 388- genutzt. Wie in Abb. 3-13 B zu erkennen ist, zeigte der

untransformierte Wildtyp während der Anregung von GFP keine beachtenswerte Fluoreszenz,

während die Positivkontrolle eine deutliche Akkumulation von GFP-Fluoreszenz im Zellkern

aufwies. Bei den das FDX5-Transitsequenz/ GFP-Konstrukt tragenden Transformanden

konnte ebenfalls eine eindeutige GFP-Fluoreszenz, die mit der Autofluoreszenz des

Chloroplasten co-lokalisierte, beobachtet werden. Zudem konnten in diesen Zellen

punktartige Akkumulationen von GFP-Fluoreszenz beobachtet werden, die in den

Randbereichen der Chlorophyll-Autofluoreszenz auftraten.

Ergebnisse

39

Durchlicht GFP Chlorophyll Überlagerung

Wildtyp

Ble/GFP

Fdx5-Transit-peptid/GFP

HSP70/RBCS2 BLEFDX5-Transits. GFP

A

B

Abb. 3-13: Konfokale Fluoreszenzmikroskopie für die Aufklärung der subzellulären Lokalisation von Fdx5. A:

Schematische Darstellung des hergestellten FDX5 Transitsequenz/ GFP-Konstruktes. B: Floureszenzmikroskopie von

C. reinhardtii CW 388- Transformanden wurden durch Durchlicht- oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie

untersucht. Als Kontrolle dienten der Wildtyp C. reinhardtii CW 388- (= Wildtyp) und der mit pMF59 transformierte

C. reinhardtii Stamm CC-125 (= Ble/GFP).

Um die Lokalisation von Fdx5 durch eine weitere Methode zu bestätigen, wurden, wie bereits

oben erwähnt, chloroplastdidäre und mitochondriale Fraktionen von C. reinhardtii mittels

Immunoblotanalyse untersucht.

Für die Zellfraktionierung wurde der C. reinhardtii Stamm SAG 83.81 in der Wasserstoff-

produzierenden Phase einer S-Mangel Induktion verwendet. Nach einem schonenden

Zellaufschluss und einer kurzen Zentrifugation wurde das Pellet für die Isolation von intakten

Chloroplasten über einen diskontinuierlichen Percollgradienten aufgetrennt. Die Isolation der

Mitochondrien aus dem Überstand erfolgte über ein Percollkissen.

Die Coomassie R250 Färbung eines SDS-Gels, in dem Aliquots der erhaltenen Fraktionen

aufgetrennt wurden, zeigte, dass sich chloroplastidäre und mitochondriale Fraktionen in ihrem

Bandenmuster eindeutig unterschieden (Daten nicht gezeigt). Um die Reinheit der erhaltenen

Fraktionen zu überprüfen, wurde das Vorkommen spezifischer Markerproteine untersucht.

Als Marker für die chloroplastidäre Fraktionen dienten die große Untereinheit der Ribulose-

Ergebnisse

40

RbcL

HydA1

Aox1

Fdx5L C M

1,5-Bisphosphat-Carboxylase (Rubisco) und HydA1 (HAPPE et al., 1994), als Marker für die

mitochondriale Fraktion diente die Alternative Oxidase 1 (Aox1).

Abb. 3-14: Analyse der subzellulären Verteilung von

Fdx5 im Vergleich zur großen Untereinheit der

Rubisco (RbcL), zur Alternativen Oxidase (Aox1)

und zur Hydrogenase (HydA1). Für die Analyse

wurde ein Äqvivalent von 80 µg Protein des Zelllysats

(L), der Chloroplasten (C) und der Mitochondrien (M)

über eine 15%-ige Tris/Tricin SDS-PAGE aufgetrennt.

Aufgrund einer geringen Ausbeute wurde von den

Mitochondrien nur ein Äquivalent von 40 µg Protein

aufgetragen. Nach Transfer auf Nitrocellulose erfolgte

der immunologische Nachweis mit den entsprechenden

polyklonalen Antikörpern.

Eine Western Blot Analyse (Abb. 3-14) wies nach, dass die mitochondriale Fraktion frei von

chloroplastidären Proteinen war, die chloroplastidäre Fraktion hingegen mit mitochondrialen

Proteinen verunreinigt war. Das Fdx5 Signal ist in diesen Fraktionen ausschließlich auf die

chloroplastidäre Fraktion beschränkt und zeigt damit das gleiche Bandenmuster wie die

chloroplastidären Proteine Rubisco und HydA1.

Konfokale Fluoreszensmikroskopie und Western Blot Analysen mit isolierten

Chloroplasten und Mitochondrien von C. reinhardtii belegen eine chloroplastidäre

Lokalisation von Fdx5.

3.8 Funktionelle Charakterisierung von Fdx5 durch Ferredoxin-abhängige

Aktivitätstests

Um einen ersten Eindruck über die mögliche Funktion von Fdx5 im Metabolismus von

C. reinhardtii zu gewinnen, wurden verschiedene Ferredoxin-abhängige Aktivitätstests

durchgeführt. Als Positivkontrolle in diesen Analysen wurde heterolog produziertes PetF

genutzt.

Da die Transkription von Fdx5 ausschließlich unter anaeroben Bedingungen stattfindet, lag es

nahe, zunächst eine mögliche Interaktion mit der Hydrogenase HydA1 zu untersuchen, die

Ergebnisse

41

ein Schlüsselenzym des anaeroben Metabolismus von C. reinhardtii ist und Ferredoxin als

Elektronendonor benötigt.

Für die in vitro Tests mit der Hydrogenase wurde Ferredoxin mit NaDT reduziert und 20 min bei

37°C zusammen mit einem Aliquot HydA1 in luftdichten Reaktionsgefäßen inkubiert. Eine Probe

der Gasphase wurde anschließend durch Gaschromatographie analysiert.

In diesen Versuchen (Abb.3-15 A) konnte mit Fdx5 als Elektronendonor keine signifkante

Wasserstoffproduktion gemessen werden. Mit PetF als Elektronendonor hingegen konnte die

Reduktion von HydA1 durch die Bildung deutlicher Mengen an Wasserstoff beobachtet

werden. Die kinetischen Parameter dieser Reaktion mit PetF lagen bei einer maximalen

Hydrogenaseaktivität von 250 µmol H2 pro h und mg Protein und einem Km(PetF)-Wert von 5

µM und sind somit im Einklang mit früheren Beobachtungen (HAPPE und NABER, 1993). In

Folge dieses Ergebnisses scheint die Funktion von Fdx5 als nativer Redoxpartner von HydA1

ausgeschlossen zu sein.

Da die biochemischen Parameter von Fdx5 eine hohe Ähnlichkeit zu den Eigenschaften von

PetF aufweisen, wurde im nächsten Schritt geprüft, ob Fdx5 in typischen Elektronentransfer-

Reaktionen wie der NADP+-Photoreduktion mit PSI und Fnr aktiv ist.

In der photosynthetischen Elektronentransportkette werden Elektronen durch Plastocyanin auf PSI

übertragen, das wiederum Ferredoxin reduziert. Reduziertes Ferredoxin dient neben NADP+ und

H+ als Substrat für die Fnr, die NADPH als Reduktionsmittel für die Zelle bereitstellt. Für die

Messung einer nachweisbaren Interaktion zwischen PSI-Ferredoxin-Fnr wurde daher ausgehend

von Plastocyanin eine in vitro rekonstituierte Redoxkette genutzt (FINAZZI et al., 2005). Als

Reduktionsmittel für Plastocyanin diente in diesem in vitro System Natrium-Ascorbat, das mittels

DCPIP Elektronen auf Plastocyanin überträgt. Als weitere Komponenten wurden PSI, Ferredoxin,

Fnr und NADP+ eingesetzt. Durch Belichtung des in vitro Ansatzes wurde die Reaktion gestartet

und die Bildung von NADPH photometrisch gemessen.

Dabei konnte in Reaktionsansätzen, die PetF enthielten, eine eindeutige NADPH Produktion

beobachtet werden, während Reaktionsansätze mit Fdx5 keine NADPH Bildung aufwiesen

(Abb. 3-15 B). Somit scheint eine mögliche Funktion von Fdx5 in der NADP+-

Photoreduktion ebenfalls ausgeschlossen. Jedoch gibt dieser Versuch keinen Aufschluss

darüber, ob Fdx5 nicht durch PSI reduziert werden kann, ob Fdx5 nicht mit der Fnr

interagieren kann oder ob eine Wechselwirkung mit beiden Reaktionspartnern nicht möglich

ist.

Ergebnisse

42

0

50

100

150

200

250

0 2 4 6 8 10 12

Fdx5

PetF

NADP -Photoreduktion+

0

50

100

150

200

250

300

0 20 40 60 80 100

Fdx5

PetF

HydA1 Reduktion

0

0,5

1

1,5

2

0 20 40 60 80 100

Fdx5

PetF

Cytc Reduktion

nm

ol H

/ h*

µg

Hy

dA1

2

µm

ol C

yt/

l*m

inc r

ed

µm

ol N

AD

PH

/ l*

min

µM Ferredoxin

µM Ferredoxin

µM FerredoxinA B

C

Fdx5 Fdx5PetF PetF

Fdx5PetF

Abb. 3-15: Funktionelle Charakterisierung von Fdx5 durch Ferredoxin-abhängige Aktivitätstests. A: Für

die Messung einer Interaktion mit HydA1 wurden verschiedene Konzentrationen von Ferredoxin mit HydA1

unter anaeroben Bedingungen inkubiert und die resultierende H2-Menge gemessen. B: Für die Untersuchung der

Ferredoxin-Aktivität in der NADP+ Reduktion wurde eine in vitro rekonstituierte Redoxkette von PC-PSI-Fd-

Fnr genutzt, die mit unterschiedlichen Ferredoxinkonzentrationen versetzt wurde. Die Bildung von NADPH

wurde photometrisch gemessen. C: Der Elektronentransfer von Fnr zu Ferredoxin wurde durch eine

rekonstituierte Kaskade von Fnr-Fd-Cytc durch die photometrische Messung der Cytc-Reduktion analysiert.

Auch in diesem System wurden verschiedene Ferredoxinkonzentrationen eingesetzt. Die Messungen zeigen

jeweils beispielhaft eines von mehreren unabhängigen Experimenten mit dem gleichen Reaktionsverlauf.

Um einzugrenzen, welcher Ferredoxin-abhängige Redoxschritt der NADP+-Photoreduktion

mit Fdx5 nicht möglich ist, wurde der Elektronentransfer von Fnr zu Ferredoxin in einem

rekonstituierten System von NADPH-abhängiger Cytc-Reduktion analysiert.

Der Reaktionsansatz für die Messung der NADPH-abhängigen Cytc-Reduktion enthielt neben

NADPH und Cytc noch die Komponenten Fnr und Ferredoxin. Der Elektronentransfer in dieser

rekonstituierten Redoxkaskade verläuft ausgehend von NADPH über die Fnr zu Ferredoxin, was

wiederum die Reduktion von Cytc katalysiert (HASE et al., 1991 b). Die Reduktion von Cytc kann

Ergebnisse

43

dabei photometrisch bestimmt werden (HASE et al., 1991 b) und ermöglicht eine Aussage über den

stattgefundenen Elektronentransfer.

In diesem System konnte sowohl mit PetF als auch mit Fdx5 eine signifikante Cytc-

Reduktion gemessen werden (Abb. 3-15 C). Zudem scheint mit Fdx5 eine deutlich höhere

Maximalgeschwindigkeit der Reaktion möglich zu sein. Dieses Ergebnis bestätigt somit eine

mögliche Interaktion zwischen Fnr und Ferredoxin und lässt indirekt die Aussage zu, dass

Fdx5 in der NADP+-Photoreduktion nicht von PSI reduziert werden kann.

Fdx5 fungiert nicht als Elektronendonor für HydA1, noch kann es als

Elektronenakzeptor von PSI dienen. Eine Interaktion zwischen Fnr und Fdx5 hingegen

ist möglich.

3.9 Postranskriptionelles Gen-„Silencing“ von FDX5 mittels artifizieller

miRNAs

Da die Ferredoxin-abhängigen Aktivitätstests keine genaue Aussage über die mögliche

Funktion von Fdx5 ermöglichten, wurde nach einer weiteren Strategie gesucht, um den

Funktionsbereich des Ferredoxins zu identifizieren. Ein häufig verwendetes Verfahren, um

die Funktion von Proteinen zu untersuchen, ist die Unterdrückung der Synthese der fraglichen

Proteine.

Auch in C. reinhardtii wurden bereits Protokolle etabliert, die, vermittelt durch die Methode der

RNA Interferenz, zum gezielten Abschalten eines Gens führen. Dabei werden in der Zelle lange

doppelsträngige RNA-Moleküle exprimiert, welche die Expression auf dem transkriptionellen oder

posttranskriptionellen Level beeinflussen (SCHRODA, 2006). Oftmals werden diese langen

Transgene jedoch selber durch das zelleigene „Silencing“-System ausgeschaltet, wodurch die

Phänotypen der Mutanten nach einiger Zeit verschwinden. (SCHRODA, 2006). Ein weiteres,

ähnliches System ist das „Silencing“ von Genen durch artifizielle miRNAs. microRNAs sind

kleine, 21-22 nt umfassende RNAs, die in Eukaryonten die post-transkriptionale Regulation durch

gerichteten mRNA Abbau und translationale Arretierung steuern (NAQVI et al., 2009). Kürzlich

wurde nachgewiesen, dass auch in C. reinhardtii die Genexpression durch microRNAs kontrolliert

wird (MOLNÁR et al, 2007). Von dieser Erkenntnis ausgehend wurde von Molar et al. ein potentes

Protokoll entwickelt, in dem artifizielle miRNAs genutzt werden, um die gezielte Degradation von

Transkripten in C. reinhardtii herbeizuführen (MOLNÁR et al.., 2009). Da miRNAs normalerweise

nicht Ziel des zelleigenen „Silencing“-Systems sind, werden die oben angeführten Nachteile der

RNAi-Methode mit dieser neuen „Silencing“-Methode beseitigt.

Ergebnisse

44

Gemäß dem von MOLNÁR et al. entwickelten System wurden in dieser Arbeit artifizielle

miRNA (amiRNA)-Konstrukte hergestellt, um den gezielten Abbau des FDX5-Transkriptes in

C. reinhardtii zu induzieren. Dafür wurden basierend auf der Zielsequenz mittels der Web

MicroRNA Designer Plattform (WMD2, http://wmd2.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl)

zwei geeignete, unterschiedliche Bereiche des Zielgens abdeckende, miRNA Kandidaten für

FDX5 gesucht und mit diesen Sequenzen 90 nt umfassende Oligonukleotide erstellt, die nach

Annealing zu doppelsträngiger DNA in das Plasmid pChlamiRNA2 (MOLNÁR et al., 2009)

ligiert wurden. Die Expression der amiRNAs wird in diesem System durch den konstitutiven

HSP70A/RBCS2-Tandempromotor angetrieben. Zudem trägt pChlamiRNA2 den

Selektionsmarker ARG7. Mit den aus der Klonierung resultierenden Plasmiden pJJ27

(amiRNA 1) und pJJ28 (amiRNA 2) wurde eine Transformation mit C. reinhardtii

Wildtypstamm CW 388- durchgeführt. Jeweils sieben der erhaltenen amiRNA-

Transformanden wurden durch Begasung mit Argon anaerobisiert, um die Induktion der

FDX5-Genexpression auszulösen

Abb. 3-16: Analyse der FDX5- und HYDA1 Expression in artifiziell anaerobisierten amiRNA-

Transformanden. RNA wurde aus jeweils sieben amiRNA1- und amiRNA2-Transformanden nach

vierstündiger Argonbegasung isoliert. Für die Northern Blots wurden äquivalente Mengen an RNA eingesetzt.

Eine L10A (kodierend für das ribosomale Protein L10a) spezifische Sonde wurde als Ladekontrolle benutzt.

Northern Blot Analysen der RNA aus anaerobisierten amiRNA-Transformanden (Abb. 3-16)

zeigen einen im Vergleich zum Wildtypstamm CW 388- niedrigeren FDX5-Transkriptgehalt

in einem großen Teil der Transformanden. Dabei variieren die FDX5-Transkriptmengen in

unterschiedlichem Maße. Um auszuschließen, dass diese Variationen auf einen

unterschiedlichen Grad der Anaerobisierung zurückzuführen sind, wurde der Transkriptgehalt

des anaerob induzierten HYDA1-Gens analysiert. Dieser ist in allen untersuchten

Transformanden nahezu gleich und bestätigt somit einen ähnlichen Anaerobisierungsgrad der

Ergebnisse

45

mit Argon begasten Kulturen. Folglich sind die unterschiedlichen FDX5-Transkriptlevel der

amiRNA-Transformanden auf eine Expression der artifiziellen miRNA zurückzuführen.

Für eine weitergehende Charakterisierung wurden amiRNA-Transformanden 1.10 und 2.2

ausgewählt, da sie einen äußerst geringen FDX5-Transkriptgehalt aufwiesen. Im Vergleich

zum Wildtyp beträgt der FDX5-Transkriptlevel der Transformanden ca. 10 -20 %.

Durch die Expression artifizieller miRNAs konnten mehrere C. reinhardtii

Transformanden generiert werden, die einen verringerten FDX5-Transkriptgehalt

aufweisen.

3.9.1 Physiologische Analysen der amiRNA-Transformanden

Für eine datailierte Charakterisierung wurden amiRNA-Transformanden 1.10 und 2.2 unter S-

Mangelbedingungen sowie anaerober Induktion untersucht. Bei diesen Analysen wurde ein

Schwerpunkt auf die Schlüsselreaktionen des Fermentationsmetabolismus und der

Wasserstoff-, Formiat- und Ethanolproduktion gelegt, um eine eventuelle Beteiligung von

Fdx5 in diesen Stoffwechselwegen zu erkennen.

Es wurde ein Hauptaugenmerk auf die oben angegebenen Fermentionsprodukte gerichtet, da

Ferredoxin als Elektronendonor im Rahmen der Aktivierung der Pyruvat-Formiat-Lyase Pfl1

durch die Pfl-Aktivase und als Substrat der Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase eine Rolle spielen

könnte (HEMSCHEMEIER et al., 2008 a).

In ersten Experimenten konnten unter S-Mangelbedingungen keine gravierenden

Unterschiede zwischen dem Wildtypstamm CW 388- und den amiRNA-Transformanden

beobachtet werden. Der Wasserstoffgehalt in der Gasphase über den Zellen sowie die Mengen

an Formiat und Ethanol in den Medien der jeweiligen Stämme waren ähnlich (Daten nicht

gezeigt).

Auch bei der artifiziellen anaeroben Induktion (Abb. 3-17) zeigten alle drei Stämme ein

übereinstimmendes Verhalten in der gemessenen in vitro Hydrogenaseaktivität und der

Formiat-und Ethanolproduktion.

Ergebnisse

46

0

5

10

15

20

25

1 2 3

3885.2_25.1_10

0

5

10

15

20

1 2 3

3885.2_25.1_10

0

50

100

150

200

250

300

0 1 2 3 4

3885.2_25.1_10

nmol

H/ h

*µg

Chl

2 mg/

l

mg/

l

Zeit [h]Zeit [h]Zeit [h]

in vitroHydrogenaseaktivität Formiatproduktion Ethanolproduktion

Abb. 3-17: Analyse von Schlüsselreaktionen des Fermentationsmetabolismus der artifiziell

anaerobisierten amiRNA Transformanden im Vergleich mit dem Wildtypstamm CW 388-. Für die

Untersuchung wurden die betreffenden C. reinhardtii -Kulturen 3 h mit Argon begast. Nach 1 h, 2 h und 3 h

wurde die in vitro Hydrogenaseaktivität in einem reduziertes Methylviologen enthaltenden Reaktionsansatz

ermittelt und es wurden Proben entnommen, die auf Formiat und Ethanol untersucht wurden. Die Abbildungen

zeigen jeweils beispielhaft eines von zwei unabhängigen Experimenten, welche die gleichen Tendenzen

aufwiesen.

Es ist jedoch noch ein weiterer Metabolismus, an dem Fdx5 beteiligt sein könnte, möglich,

der bislang noch nicht betrachtet wurde. Bei kürzlich durchgeführten Analysen zur

differentiellen Expression von Genen unter Kupfermangel konnte ebenfalls eine starke

Akkumulation des FDX5-Transkriptes beobachtet werden (S. Merchant, persönl.

Kommunikation). Dabei zeigte FDX5 die zweitstärkste Transkriptakkumulation der

untersuchten Gene. Um eine mögliche Beteiligung von Fdx5 am veränderten Metabolismus

unter Cu-Mangel zu untersuchen, wurden deshalb Wachstumskurven der Cu-Mangel-

induzierten amiRNA-Transformanden im Vergleich zum Wildtyp durchgeführt.

Kupfer ist für die meisten Organismen ein bedeutender Nährstoff, da Kupfer ein wichtiger

Kofaktor von Proteinen ist, die an Elektronentransferreaktionen beteiligt sind, wie z.B.

Plastocyanin oder Superoxiddismutasen. Cu-Mangel führt daher, wie S-Mangel, zu weitreichenden

Stoffwechselveränderungen der Zellen (MERCHANT et al., 2006). In C. reinhardtii ist der

veränderte Metabolismus unter Cu-Mangel bereits intensiv untersucht worden (QUINN und

MERCHANT, 1998, ERIKSSON et al., 2004)). Zu den bedeutendsten Adaptionen, die in C.

reinhardtii unter Cu-Mangel beobachtet werden können, gehört beispielsweise die starke

Expression des CYC6-Gens, das für das Elektronentransferprotein Cytochrom c6 kodiert (WOOD,

1978; MERCHANT und BOGORAD, 1987). Cyc6 enthält als Kofaktor ein Häm-Molekül und ersetzt

unter Cu-Mangel vollständig das Cu-enthaltende Plastocyanin der Elektronentransportkette.

Bei den Untersuchungen der Cu-defizienten Stämme konnten interessante Unterschiede

beobachtet werden: Beide amiRNA-Transformanden zeigten unter Cu-Mangel einen im

Vergleich zum Wildtyp Stamm CW 388- eindeutig reduzierten Chlorophyll- und

Carotinoidgehalt (Abb. 3-18 A). Diese Unterschiede sind nicht auf eine eine verringerte

Zellmenge zurückzuführen, da die Zellzahl bei allen drei Stämmen annähernd

Ergebnisse

47

übereinstimmte. Somit scheinen die amiRNA-Transformanden eine dem Wildtyp ähnliche

Wachstumsrate zu besitzen, weisen aber eine deutliche Chlorose auf. Auch unter

photoautotrophen Bedingungen, in denen die Zellen im Minimalmedium wuchsen, konnte

eine Chlorose der amiRNA-Transformanden beobachtet werden (Abb. 3-18 B).

Die Photosyntheseraten der unter photoheterophen Bedingungen angezogenen, Cu-defizienten

amiRNA-Transformanden zeigten ebenfalls eine deutliche Reduktion im Vergleich zum

Wildtyp. 96 h nach Beginn der Messung weist amiRNA Transformande 2.2 eine reelle

Photosyntheserate von 6,6 x 10-8 µMol O2/ Zelle x h und amiRNA Transformande 1.10 eine

Rate von 7,7 x 10-8 µMol O2/ Zelle x h auf. Die reele Photosyntheserate des Wildtyps beträgt

hingegen 10,4 x 10-8 µMol O2/ Zelle x h.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 50 100 150 200 250 300

388

5.2_2

5.1_10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

388

5.2_2

5.1_10

0

1

2

3

4

5

6

0 20 40 60 80 100 120

388

5.2_2

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10000000

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20000000

25000000

0 20 40 60 80 100 120

388

5.2_2

5.1_10

µg/ m

l

Zeit [h] Zeit [h]Zeit [h]

Zel

len/

ml

Zel

len/

ml

Chlorophyllgehalt

Chlorophyllgehalt

Carotinoidgehalt

Carotinoidgehalt

Zellzahl

Zellzahl

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 50 100 150 200 250 300

388

5.2_2

5.1_10

0

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

0 50 100 150 200 250 300

388

5.2_2

5.1_10

Zeit [h]Zeit [h]Zeit [h]

µg/

ml

µg/ m

l

µg/ m

l

A

B

C

388

2.2

1.10

- Cu+ Cu

Abb. 3-18: Analyse von Wachstum und Pigmentgehalt der amiRNA-Transformanden 2.2 und 1.10 unter

Cu-Mangel im Vergleich zum Wiltyp CW 388-. Zellen wurden bis zu einem Chlorophyllgehalt von ca. 25 µg

angezogen und anschließend 1:100 in Cu-freies Medium verdünnt. Der Transfer wurde zweimal wiederholt, um

Ergebnisse

48

- Cu+ Cu + S - S

388

2.2

1.10

die Verschleppung von Cu zu vermeiden und sicherzustellen, dass verbleibendes Cu von den Zellen

aufgebraucht wurde. Anschließend erfolgte ein weiterer Transfer in kupferfreies TAP-Medium (A), bzw.

kupferfreies TMP-Medium (B). Die Kulturen wurden dabei auf einen anfänglichen Chlorophyllgehalt von 5 µg/

ml eingestellt. Zu den angegebenen Zeiten wurden Proben entnommen und auf Chlorophyll- und

Carotinoidgehalt untersucht. Zeitgleich erfolgte die Bestimmung der Zellzahl. Die Messungen zeigen jeweils

beispielhaft eines von zwei unabhängigen Experimenten mit dem gleichen Reaktionsverlauf. Um die Cu-Mangel

Induktion zu bestätigen, wurden nach dreimaligem Transfer der Kulturen in kupferfreies Medium Proben

entnommen, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und nach Blotting auf ihren Cyc6-Gehalt untersucht (C).

Um zu untersuchen, ob die beobachteten Phänotypen wirklich auf einen veränderten Fdx5-

Gehalt der amiRNA-Transformanden im Vergleich zum Wildtyp CW 388- zurückzuführen

sind, wurden Immuno Blots durchgeführt (Abb. 3-19). Diese zeigen, dass unter Cu-

supplementierten, aeroben Bedingungen kein Fdx5-Protein detektiert werden kann. Unter Cu-

Mangel wie auch unter S-Mangel kann Fdx5 hingegen nachgewiesen werden. Jedoch zeigen

die amiRNA-Stämme dabei unter Cu-Mangel eindeutig eine Reduktion des Fdx5-Gehaltes um

mehr als 50 % im Vergleich zum Wildtypstamm CW 388-. Unter S-Mangelbedingungen

hingegen ist der Fdx5-Level der amiRNA-Transformanden im Vergleich zum Wildtyp

konstant.

Abb. 3-19: Analyse des Fdx5-Gehaltes der

amiRNA-Stämme 2.2 und 1.10 unter Cu-

und S-Mangel. Äquivalente Proteinmengen

wurden über eine 15 %-ige Tris/Tricin-PAGE

aufgetrennt und nach Transfer auf PVDF mit

anti-Fdx5 Antikörper inkubiert. Cu-Mangel

Proben wurden nach dreimaligem Transfer

der Kultur in kupferfreies Medium

genommen. S-Mangelproben 48 h nach

Überführung der Kultur in S-Mangelmedium .

Unter Cu-Mangelbedingungen sind der Pigmentgehalt und die Photsyntheserate der

amiRNA-Transformanden 2.2 und 1.10 reduziert

Diskussion

49

4 Diskussion

C. reinhardtii besitzt sechs Ferredoxin-kodierende Gene, die unter S-Mangel differentiell

exprimiert werden.

Ferredoxine sind in der Natur weit verbreitetete Elektronenüberträger. In Pflanzen und Algen

können Ferredoxine gefunden werden, deren redoxaktives Zentrum aus einem [2Fe2S]-

Cluster besteht und die als Pflanzen-Typ Ferredoxine bezeichnet werden. Sie sind wichtig für

eine Vielzahl von metabolischen Reaktionen und haben ebenfalls eine Funktion in Signal-

Prozessen. Es ist bereits bekannt, dass in vielen Pflanzen mehrere Ferredoxin-Isoformen

gefunden werden können. Beispiele dafür sind die Ferredoxine aus Zea mays oder

Arabidopsis thaliana. In Z. mays wurden bislang vier Ferredoxin-Isoformen (FdI-FdIV)

gefunden, von denen FdI und FdIII die am häufigsten auftetenden Isoformen in Blättern bzw.

im Wurzelgewebe darstellen (KIMATA und HASE, 1989; HASE et al., 1991 b). In Wurzeln kann

Ferredoxin durch die Oxidation von NADPH im Rahmen der Umkehrreaktion der Fnr

reduziert werden (SUZUKI et al., 1985), was die Aufrechterhaltung von Ferredoxin-

abhängigen Stoffwechselwegen wie z.B. Nitrit- und Sulfit-Reduktion in nicht-

photosynthetisch aktiven Geweben ermöglicht. NADPH wird dabei durch den oxidativen

Pentosephosphatweg bereitgestellt (BOWSHER et al., 1989). Untersuchungen an

Wurzelferredoxinen im Vergleich zu Blattferredoxinen haben funktionelle Unterschiede

zwischen beiden Ferredoxin-Gruppen aufgedeckt, da Wurzelferredoxine besser durch

NADPH reduziert werden können, während Blattferredoxine höhere Raten in der NADP+-

Photoreduktion erreichen (HASE et al., 1991 b, ONDA et al., 2000, HANKE et al., 2004). In A.

thaliana konnten sechs Ferredoxin-kodierende Gene im Genom gefunden werden. Vier der

kodierten Proteine entsprachen konventionellen [2Fe2S]-Ferredoxinen und wurden

weitergehend untersucht. AtFd1 und AtFd2 konnten dabei als typische Blatt-Ferredoxine

identifiziert werden, während AtFd3 Ähnlichkeiten zu Wurzel-Ferredoxinen zeigt. AtFd4

weist zwar Ähnlichkeiten zu Wurzel-Ferredoxinen auf, besitzt aber ein ungewöhnlich

positives Redoxpotential und kann deshalb keine Elektronen auf die Fnr transferieren (HANKE

et al., 2004).

Auch in C. reinhardtii konnten im Rahmen dieser Arbeit insgesamt sechs Ferredoxin-

kodierende Gene (PETF, FDX2, FDX3, FDX4, FDX5 und FDX6) identifiziert werden, die

unter S-Mangelbedingungen bzw. artifiziell anaeroben Bedingungen differentiell exprimiert

werden. Als Ausgangsbasis für die Analyse der Genexpression mittels semiquantitativer RT-

PCR wurden luftdichtverschlossene S-Mangel-induzierte C. reinhardtii Kulturen verwendet,

Diskussion

50

die bei Belichtung nach ca. 24 h aufgrund einer verringerten Photosyntheserate auf

physiologischem Wege Anaerobiose etablierten (MELIS et al. 2000; WYKOFF et al. 1998).

Dabei konnten zwei Ferredoxin-Gene, FDX5 und FDX2, identifiziert werden, deren

Transkripte unter diesen Bedingungen akkumulierten. Es muss jedoch beachtet werden, dass

sich unter den oben beschriebenen Bedingungen zwei potentiell einflussnehmende Faktoren

ändern: der Schwefelgehalt der Zellen und dadurch bedingt auch der Sauerstoffgehalt der

Kultur. Allein durch den Mangel an Schwefel werden in der Zelle eine Reihe von

Veränderungen induziert, die sich z.B. in einer verstärkten Expression von Genen äußern,

deren Proteinprodukte an der Assimilation von Sulfat beteiligt sind (LIEN und SCHREINER,

1975; YILDIZ et al., 1996; RAVINA et al., 1999; SATO et al., 2000). Dabei ist die

Sulfatassimilation ebenfalls ein Prozess, der das Vorhandensein reduzierter

Elektronenüberträger voraussetzt. Für die Reduktion von Sulfit zu Sulfat werden

beispielsweise 6 Elektronen benötigt, die durch reduziertes Ferredoxin bereitgestellt werden.

In C. reinhardtii konnte bereits PetF als ein Interaktionspartner der Sulfitreduktase

identifiziert werden (GARCIA-SÁNCHEZ et al., 2000). Es wäre jedoch möglich, dass unter S-

Mangel die Synthese eines spezialisierten Ferredoxins stattfindet, das höhere Affinitäten zu

seinen Redoxpartnern aufweist und damit zu einem höheren Sulfatumsatz beiträgt.

In dieser Arbeit waren jedoch die Ferredoxin-Gene von besonderem Interesse, deren

Expression eindeutig durch den Faktor Anaerobiose induziert werden konnte. Für eine weitere

Analyse der Genexpression wurden deshalb Kulturen verwendet, die mit dem inerten Gas

Argon begast wurden. Bei dieser Methode ist der einzige Parameter, der verändert wird, die

Sauerstoffkonzentration der Kultur. Unter diesen artifiziell anaeroben Bedingungen konnte

nur die Akkumulation des FDX5-Transkriptes induziert werden, was den Umkehrschluss

erlaubt, das FDX2 scheinbar nur unter S-Mangelbedingungen verstärkt exprimiert wird.

Interessanterweise scheint auch die Expression des PETF-Gens durch den Faktor Schwefel

beeinflusst zu werden, da unter S-Mangelbedingungen eine eindeutige Abnahme des

Transkriptes beobachtet werden konnte, während unter artifiziell aneroben Bedingungen

keine Veränderung eintrat.

Zusammenfassend erlauben die Ergebnisse der semiquantitativen RT-PCR die Aussage, dass

FDX5 das einzige unter den im Genom zu findenden Ferredoxin-Genen ist, dessen Expression

durch die Abwesenheit von Sauerstoff induziert wird.

Diskussion

51

Die Expression von FDX5 wird durch Hypoxie aktiviert.

Unter den Bedingungen der endogen etablierten Anaerobiose von belichteten S-

Mangelkulturen findet bei C. reinhardtii eine umfassende physiologische Umstrukturierung

statt, die zur Ausbildung des photofermentativen Metabolismus führt, der den Zellen ein

Überleben unter diesen eingeschränkten Bedingungen ermöglicht (MELIS et al. 2000,

HEMSCHEMEIER und HAPPE, 2005, HEMSCHEMEIER et al. 2008 a). Im Rahmen dieser

Umstrukturierung wird die Expression verschiedener Gene induziert oder auch eingestellt,

wie u.a. Real-Time PCR Experimente zeigten (JACOBS, Diplomarbeit, 2005). Zu den Genen,

die selektiv unter anaeroben Bedingungen eingeschaltet werden, gehören u.a. die Gene, die

für Schlüsselenzyme des Fermentations- und Wasserstoffmetabolismus kodieren, wie z.B. das

HYDA1- und das PFL1-Gen (HAPPE und NABER, 1993, HEMSCHEMEIER et al., 2008 a). Die

simultane Aktivierung der FDX5-, HYDA1- und PFL1-Expression lässt darauf schließen, dass

Sauerstoff der entscheidende Faktor für diese Aktivierung ist.

Promotorstudien des FDX5-Gens (persönl. Kommunikation C. Lambertz) haben gezeigt, dass

innerhalb der Promotorsequenz von FDX5 konservierte DNA-Motive der Sequenz G-T-A-C

auftreten, die auch als „copper-response elements“ (CuREs) bezeichnet werden (QUINN et al.

2000, KROPAT et al. 2005). CuRE Motive wurden bereits bei Untersuchungen der durch

Kupfermangel induzierbaren Expression des CYC6-Gens im Promotorbereich des CYC6-Gens

beschrieben. Interessanterweise vermitteln die CuRE-Motive jedoch nicht nur eine Antwort

auf Kupfermangel, sondern auch auf Sauerstoffmangel, wie Reportergenanalysen zeigten

(QUINN et al. 2000; Quinn et al., 2002). Als Regulator, der an die CuRE-Motive bindet,

konnte der spezifische Transkriptionsfaktor Crr1 identifiziert werden (KROPAT et al. 2005).

Obwohl bewiesen ist, dass Crr1 und CuRE-Motiv notwendig sind für eine hypoxische

Induktion der analysierten Gene, ist bislang noch ungeklärt, welcher Mechanismus dafür

verantwortlich ist. Durch Reportergenanalysen mit verkürzten Varianten des FDX5-Promotors

(persönl. Kommunikation C. Lambertz) konnte demonstriert werden, dass auch die CuRE-

Motive von FDX5 notwendig sind für die Aktivierung des Gens unter Anaerobiose.

Da somit FDX5 das Einzige der insgesamt sechs Ferredoxin-kodierenden Gene ist, dessen

Expression nachweislich durch Hypoxie induziert ist, wurde es für weitergehende Analysen

ausgewählt.

In photofermentierenden C. reinhardtii Zellen wird Fdx5-Protein synthetisiert.

Um anaerobe Zellen auf das Vorhandensein von Fdx5 zu untersuchen, wurde ein polyklonaler

anti-Fdx5 Antikörper hergestellt, der in Immunoblots erstmalig den Nachweis einer

Diskussion

52

Akkumulation von Fdx5 auf Proteinebene ermöglichte. Da der Antikörper nicht mit

rekombinanten PetF kreuzreagierte und auch Kreuzreaktionen mit den weiteren C. reinhardtii

Ferredoxinen ausgeschlossen werden können (persönl. Kommunikation S. Schmidt) kann

davon ausgegangen werden, dass die in den Western Blots detektierten Signale spezifisch für

Fdx5 sind. Die Aktivierung der FDX5-Expression durch Hypoxie wird durch die

durchgeführten Western Blots bestätigt, da unter aeroben Bedingungen kein Protein detektiert

werden konnte. Die parallel zur FDX5-Transkriptakkumulation eintretende Fdx5-Synthese ist

ein Hinweis darauf, dass FDX5 auf transkriptioneller Ebene reguliert wird und dass Fdx5 an

Elektronenübertragungen in den durch Hypoxie verursachten Stoffwechselwegen beteiligt ist.

Interessanterweise bleibt unter den untersuchten Bedingungen der PetF-Gehalt der Zellen

gleich, obwohl auf Transkriptebene eine eindeutige Abnahme der PETF-Expression

erkennbar ist. Vorausgesetzt, dass der PetF Antikörper nicht mit den anderen Ferredoxinen

aus C. reinhardtii kreuzreagiert, und es sich bei dem detektierten Protein daher um das PetF-

Protein handelt, kann davon ausgegangen werden, dass PetF ein sehr stabiles Protein ist. Eine

ähnliche Diskrepanz zwischen Transkriptgehalt und Proteinlevel konnte schon bei anderen

Proteinen beobachtet werden. So folgt unter Cu-Mangel die Produktion von Cyc6 und Cpx1

dem CYC6- und CPX1-Transkriptgehalt. Wird Cu jedoch wieder supplementiert, dann können

die Proteine immer noch nachgewiesen werden, wenn die respektiven mRNAs bereits wieder

vollständig abgebaut sind (HILL et al. 1991). Das gleiche Phänomen kann auch bei der durch

Hypoxie induzierten Bildung der beiden Proteine beobachtet werden (QUINN et al., 2002).

Isoliertes Fdx5-Protein reagiert sensitiv auf Sauerstoff.

Für die Aufreinigung von heterolog in E. coli produziertem Fdx5 wurde ein auf dem Strep-

Tag basierendes System gewählt, da die Isolation von Strep-Tag gekoppelten

Metalloproteinen schon beschrieben wurde und ihre Aktivität von der Aufreinigung nicht

beeinflusst wird, wie es etwa bei der Nickel-Nitrilotriessigsäure-Affinitätschromatographie

von Proteinen mit Histidin-Tag beschrieben wurde (TERPE 2003, GIRBAL et al., 2005). Der

Einsatz von E. coli als Expressionswirt begründet sich in der schon dokumentierten Nutzung

dieses Bakteriums für die heterologe Expression von [4Fe4S]-, als auch von [2Fe2S]-

Ferredoxinen (JACQUOT et al., 1997, GUERRINI et al., 2008).

Mit dem etablierten Expressionssystem konnte Fdx5 für nachfolgende Analysen in

ausreichenden Mengen aus E. coli isoliert werden. Dabei zeigte das Protein eine bräunliche

Färbung, wie sie für oxidierte Ferredoxine typisch ist (KNAFF et al., 1996). Die bräunliche

Färbung des Proteins gab einen ersten Hinweis darauf, dass das FDX5-Genprodukt einen

Diskussion

53

[FeS]-Cluster besitzt und das dieser in aktiver Form durch das Maturationssystem von E. coli

in das Apoprotein eingebaut wurde. Interessanterweise konnte bei aerob gelagerten

Proteinproben die Bildung von Oligomeren beobachtet werden. Sauerstoffsensitivität ist für

viele [FeS]-Cluster haltige Proteine bekannt (PETERING et al., 1971). Angriffspunkte des

Sauerstoffs sind dabei u. a. exponierte Fe-Atome des Clusters, die oxidiert werden und

dadurch den Redoxstatus der Clusters verändern, der aufgrund dessen instabil wird und

Eisenatome verliert. Dieser Mechanismus wurde beispielweise ausführlich am Beispiel des

Sauerstoff-abhängigen Transkriptionsfaktors FNR (Fumarate-Nitrate Reduction) aus E. coli

untersucht, der die Expression von über 120 Genen beeinflusst (SAWERS et al., 1988). Unter

anaeroben Bedingungen besitzt die FNR einen Ferredoxin-ähnlichen [4Fe4S]-Cluster. Unter

diesen Bedingungen bilden zwei FNR-Moleküle ein Dimer, welches an DNA binden kann

und so die Transkription beeinflusst. Steigt der Sauerstoffgehalt an, wird der Sauerstoff-labile

[4Fe4S]-Cluster oxidiert und wandelt sich über einen [3Fe4S] in einen [2Fe2S]-Cluster um.

Die mit dem Cluster-Wechsel einhergehende Konformationsänderung verhindert sowohl die

Dimerisierung der FNR-Monomere als auch die Bindung an DNA (KILEY und BEINERT,

1998). Auch für Ferredoxine wurde der starke Einfluss, den Sauerstoff auf den [FeS]-Cluster

haben kann, bereits beschrieben. Das Heterocysten-Ferredoxin FdxH2 aus Anabaena

variabilis besitzt unter Luftbedingungen nur eine Halbwertszeit von ca. 1 h, wie

Absorbtionsmessungen bei 422 nm gezeigt haben (SCHRAUTEMEIER et al., 1995). Analysen

von Proteinmodellen ließen dabei den Schluss zu, dass im Falle von FdxH2 eine Aminosäure,

Valin an Position 77 der Aminosäurekette, die Sauerstoffsensitivität verursacht (SINGH et al.,

2001). Obwohl bei Fdx5 die Oligomerisierung des Proteins unter Luftbedingungen beobachtet

werden kann, scheint der [2Fe2S]-Cluster durch den Sauerstoffeinfluss nicht direkt beeinflusst

zu werden, wie das unveränderte EPR-Spektrum des 24 h unter Raumluft inkubierten

Ferredoxins zeigt. Neben den für die Koordination des Clusters notwendigen Cysteine besitzt

Fdx5 jedoch noch zwei weitere Cysteine, von denen eines nahe des C-Terminus lokalisiert ist.

Es wäre möglich, dass unter Sauerstoffeinfluss die spontane Oxidation dieser Cysteine eintritt

und somit die Ausbildung von Disulfidbrücken gefördert wird. Die spontane Ausbildung von

Disulfidbrücken unter oxidativen Bedingungen ist ein bereits dokumentiertes Phänomen, dass

z.B. beim bakteriellen Transkriptionsfaktor OxyR beobachet werden konnte, der unter

Einfluss von H2O2 eine intramolekulare Disulfidbrücke ausbildet, die Einfluss auf die

Konformation des Proteins hat (BAUER et al., 1999). Es scheint jedoch auch Ferredoxine zu

geben, die funktionell als Dimer vorliegen, wie beispielsweise das [4Fe4S]-Ferredoxin aus

Diskussion

54

Pyrococcus furiosus (HASAN et al., 2002). Die molekularen Hintergründe für diese

Dimerisierung sind jedoch noch unbekannt.

Fdx5 ist ein typisches [2Fe2S]-Ferredoxin des Pflanzen-Typs mit einer außergewöhnlich

positiven Ladung.

Die Bestimmung des Eisengehaltes bewies zum einen, dass Fdx5 Eisenatome und damit einen

[FeS]-Cluster enthält, zum anderen legte das Verhältnis der Eisenatome pro Molekül die

Vermutung nahe, dass es sich bei dem enthaltenen Cluster um einen [2Fe2S]-Cluster handeln

könnte. Die Vermutung, dass Fdx5 ein klassisches [2Fe2S]-Ferredoxin ist, bestätigte sich

durch die UV/VIS- und EPR-Spektren des rekombinanten Proteins. Das Absorptionsspektrum

des oxidierten Ferredoxins zeigt die charakteristschen drei Maxima, die typisch für die Cluster

des [2Fe2S]-Typus sind und die bereits für viele [2Fe2S]-Ferredoxine dokumentiert wurden

(SCHMITTER et al., 1988; HANKE et al., 2004; KNAFF, 1996). [4Fe4S]-Cluster weisen diese

distinkten Maxima nicht auf, sie besitzen ausschließlich eine Schulter bei ca. 390 nm

(MULLINGER et al., 1975; REUBELT et al., 1991). Auch die EPR-Spektren von Fdx5 zeigen

Übereinstimmungen mit den Spektren anderer [2Fe2S]-Ferredoxine (GALVÁN und MÁRQUEZ,

1985, HALL et al. 1973). Ein weiterer Parameter, der das Vorhandensein eines [2Fe2S]-

Clusters bestätigt, ist der Abstand der Cysteine, die diesen Cluster koordinieren, da die

Positionen der Cysteine hoch konserviert sind und kaum variieren (INOUE et al., 1984). Die

meisten Pflanzen-Typ Ferredoxine weisen das Motiv Cys-X4-Cys-X2-Cys-X29-Cys auf, d.h.

sie besitzen vier AS zwischen den Cluster bindenden Cysteinen eins und zwei, zwei AS

zwischen Cystein zwei und drei und exakt 29 AS zwischen Cystein drei und vier (BERTINI et

al., 2002). Dies trifft auch auf die Cluster-koordinierenden Cysteine von Fdx5 zu. Die

Bestimmung des Redoxpotentials mittels cyclischer Voltammetrie zeigte, dass das

Redoxpotential von Fdx5 ca. 15 mV positiver ist als von PetF. Insgesamt sind die gemessenen

Werte jedoch etwas positiver als das früher berichtete Redoxpotential von PetF von -410 mV

gegen SHE (Standard Hydrogen Electrode) das durch Redoxtitration bestimmt wurde

(GALVÁN und MÁRQUEZ, 1985). Diese Variation scheint auf die unterschiedliche Methodik

zurückzuführen zu sein, die für die Bestimmung des Redoxpotentials angewendet wurde, da

solche Abweichungen bereits beschrieben wurden (VERHAGEN et al., 1995; SMITH und

FEINBERG 1990). Abgesehen von der Abweichung zum früher berichteten Potential, scheinen

die Redoxpotentiale von Fdx5 und PetF jedoch sehr ähnlich zu sein und liegen in dem

Wertebereich von -305 und -455 mV, der schon für andere Pflanzen-Typ Ferredoxine

dargestellt wurde. (CAMMACK et al., 1977). Die bislang aufgeführten Pararameter weisen also

Diskussion

55

in ihrer Gesamtheit darauf hin, dass Fdx5 ein klassisches [2Fe2S]-Ferredoxin des Pflanzen-

Types ist.

PetF Fdx5

Abb. 4-1: Vergleichende Darstellung der Oberflächenladung von PetF und Fdx5. Die Protein-Modelle

wurden anhand der Kristallstruktur des Proteins aus C. fusca (BES et al, 1999) angefertigt (persönl.

Kommunikation M. Winkler). Die Ladungsberechnungen nach Coulomb wurden mit Hilfe des Swiss-PDB-

Viewers V4.0 durchgeführt. Rote Feldbereiche stellen negative, blaue positive Ladungsdominanz dar.

Die Ladung von Fdx5 zeigt jedoch eine Abweichung von der typischerweise sehr negativen

Oberflächenladung anderer Ferredoxine (KNAFF, 1996), wie pI-Wert und native PAGE

demonstrierten. Diese positivere Ladung lässt sich auch in der modellierten

Oberflächenladungsverteilung von Fdx5 im Vergleich zu PetF erkennen, da Fdx5 im

Gegensatz zu PetF nicht vollständig negativ geladen ist, sondern an der Protein-„Unterseite“

eine Reihe positiv geladener Aminosäurereste aufweist (Abb. 4-1). Da die Interaktion von

Ferredoxinen mit ihren Reaktionspartnern oftmals auf elektrostatischen Wechselwirkungen

beruht (KNAFF, 1996; FUKUYAMA , 2004), kann vermutet werden, dass die positivere

Oberflächenladung von Fdx5 eine Auswirkung auf die Komplexbildung mit möglichen

Interaktionspartnern hat.

Fdx5 ist ein chloroplastidäres Ferredoxin, das mittels eines 27 Aminosäuren

umfassenden Signalpeptides zu den Plastiden dirigiert wird.

Die N-terminale Sequenzierung des aus C. reinhardtii aufgereinigten Ferredoxins Fdx5

verifizierte das Vorhandensein eines bereits aufgrund der Aminosäuresequenz vermuteten

Transitpeptides von 27 AS. Aufgrund ihrer Größe lassen sich chloroplastidäre und

mitochondriale Transitpeptide in C. reinhardtii nicht voneinander trennen. Die

durchschnittliche Größe für chloroplastidäre Transitpeptide beträgt ca. 29 AS, während die

Diskussion

56

Länge von mitochondrialen Transitpeptiden mit ca. 30 AS angegeben wird (Fránzen et al.,

1998). Im Fall von Fdx5 wird jedoch das Transitpeptid nach der Aminosäuresequenz Val-

Gln-Ala vom Rest des Proteins abgetrennt. Die Sequenz Val-X-Ala wird häufig in der

Position -3 bis -1 der Proteaseschnittstelle von Stroma-lokalisierten Proteinen gefunden

(Fránzen et al., 1998). Dies ist z.B. der Fall bei den PSI Untereinheiten P28, P30 und P37,

welche die Sequenzen Val-Ser-Ala, Val-Arg-Ala und Val-Arg-Ala in Position -3 bis -1 zur

ihren Proteaseschnittstellen aufweisen (FRÁNZEN et al., 1998). Obwohl die Ähnlichkeit der

chloroplastidären Transitpeptide von C. reinhardtii zu den chloroplastidären Transitpeptiden

höherer Pflanzen im Allgemeinen nicht sehr groß ist – die Transitpeptide höherer Pflanzen

sind viel länger und besitzen eine andere Aminosäurekomposition (FRÁNZEN et al., 1998;

GAVEL und HEIJNE, 1990) – kann auch in höheren Pflanzen das weniger stark konservierte

Motiv (Val/Ile)-X-(Ala/Cys)↓ Ala in chloroplastidären Transitpeptiden gefunden werden

(GAVEL und HEIJNE, 1990). Das Vorkommen dieser eher gering konservierten

Konsensussequenz im N-terminalen Bereich der Proteaseschnittstelle von Fdx5 gibt einen

ersten Hinweis auf eine mögliche chloroplastidäre Lokalisation des reifen Proteins.

Die konfokale Fluoreszenzmikroskopie zur Detektion von GFP-gekoppelten Proteinen ist eine

probate Methode, um die Lokalisation von Proteinen in vivo nachzuweisen. GFP wurde

erstmalig 1962 von SHIMOMURA et al. beschrieben und hat sich seitdem zu einem der am

häufigsten genutzten Reportergene entwickelt (TSIEN, 1998). In C. reinhardtii wurde die

Nutzung von verschiedenen Reportergenen bereits beschrieben (MINKO et al., 1999,

BATEMAN und PURTON, 2000). Ein Problem dabei ist jedoch das in C. reinhardtii oftmals

beobachtete „Silencing“ von Fremdgenen (STEVENS et al., 1996; CERUTTI et al., 1997),

welches die Synthese dieser Reportergene hemmt. Deshalb wurde ein an die Codon-„Usage“

von C. reinhardtii angepasstes GFP-Gen entwickelt, dass die Nutzung dieses optimierten

GFPs als Reportergen ermöglicht (FUHRMAN et al., 1999) und welches bereits für

Lokalisationsstudien benutzt wurde (FUHRMAN et al., 1999, GLANZ et al. 2006; WINKLER,

Dissertation, 2009). Die Fdx5-Lokalisatonsstudien dieser Arbeit, die ebenfalls die optimierte

GFP-Sequenz als Reportergen nutzen, weisen auf eine chloroplastidäre Lokalisation des

Fdx5-Polypeptides hin. Die GFP-Fluoreszenz des Fdx5-Transitpeptid/ GFP-Fusionsproteins

co-lokalisiert mit der Chloroplasten-Fluoreszenz und weist damit Übereinstimmungen zu den

Lokalisationsstudien des chloroplastidär lokalisierten Gruppe II Intron RNA-Bindeproteins

NAPL (GLANZ et al. 2006) und der chloroplastidär lokalisten Proteine HydA1 und HydA2

(WINKLER, Dissertation, 2009) auf. Die beobachteten Akkumulationen von GFP-Fluoreszenz,

die am Rande des Chloroplasten lokalisieren, konnten in dieser Art auch bei den

Diskussion

57

Lokalisaktionsstudien von HydA1 und HydA2 beobachtet werden (WINKLER, Dissertation,

2009).

Der dritte Hinweis auf eine chloroplastidäre Lokalisation von Fdx5 konnte durch Immuno

Blot Analysen mit isolierten Mitochondrien und Chloroplasten ermittelt werden, in denen

Fdx5 das gleiche Bandenmuster wie die Proteine HydA1 und RbcL aufwies, von denen die

plastidäre Lokalisation bereits beschrieben wurde (HAPPE et al, 1994; HARTMANN und

HARPEL, 1994). Dabei war die Reinheit der erhaltenen Chloroplasten nicht absolut, es konnte

eine Verunreinigung mit mitochondrialen Proteinen detektiert werden. Diese

Verunreinigungen sind jedoch oftmals nicht zu vermeiden und wurden auch in anderen

Veröffentlichungen beschrieben (ATTEIA et al, 2006). Zusammenfassend kann aufgrund

dieser Ergebnisse der Schluss gezogen werden, dass Fdx5 mittels eines 27 AS großen

Transitpeptides in den Chloroplasten von C. reinhardtii dirigiert wird.

Fdx5 weist funktionelle Unterschiede zu PetF auf, die sich in den Primärsequenzen

beider Ferredoxine wiederspiegeln. Fdx5 besitzt signifikante Abweichungen in den

konservierten Domänen von Pflanzen-Typ Ferredoxinen, die relevant sind für die

elektrostatische Wechselwirkung des Ferredoxins mit seinen Interaktionpartnern.

Da Fdx5 als ein klassisches [2Fe2S]-Ferredoxin des Pflanzen-Types identifiziert werden

konnte, das in Chloroplasten von C. reinhardtii lokalisiert ist, sollte seine Funktionalität in

typischen Elektronentransferreaktionen getestet werden. Aufgrund der durch Anaerobiose

induzierten Expression von FDX5 wurde untersucht, ob eine Interaktion mit der ebenfalls

unter anaeroben Bedingungen gebildeten Hydrogenase HydA1, die nachweislich von PetF

reduziert werden kann, möglich ist (HAPPE und NABER, 1993, WINKLER, Dissertation, 2009).

In in vitro Hydrogenasetests, in denen reduziertes Fdx5 eingesetzt wurde, konnte im

Gegensatz zu PetF jedoch keine Wasserstoffbildung nachgewiesen werden. Die

Komplexbildung von HydA1 und PetF aus C. reinhardtii beruht auf der Beteiligung von

elektrostatischen Kräften, wie die Analyse der Elektronentransferwechselwirkung zwischen

beiden Proteinen in Abhängigkeit von der Elektrolytkonzentration des Reaktionspuffers zeigte

(WINKLER, Dissertation, 2009). Die insgesamt positivere Ladung von Fdx5 gegenüber PetF

könnte deshalb einen entscheidenden Einfluss auf die Bildung eines elektrostatischen

Komplexes mit HydA1 haben und eine Interaktion zwischen beiden Proteinen verhindern.

Durch Analysen mit PetF Punktmutanten konnten spezifische AS von PetF, die an der

Interaktion mit HydA1 beteiligt sind, identifiziert werden (WINKLER, Dissertation, 2009).

Beim Vergleich der Aminosäuresequenzen von PetF und Fdx5 ist ersichtlich, dass die für eine

Diskussion

58

spezifische Wechselwirkung wichtigen Aminosäuren Aspartat an Position 58 und

Phenylalanin an Position 61 in Fdx5 gegen Glycin bzw. Isoleucin ausgetauscht sind, die beide

einen weitaus höheren pI-Wert aufweisen (Abb. 4-2 A). Insbesondere für Asp58 konnte ein

starker Effekt auf die elektrostatische Wechselwirkung mit HydA1 nachgewiesen werden. Es

ist also möglich, dass die Wechselwirkung zwischen Fdx5 und HydA1 aufgrund dieser

fehlenden Aminosäurereste nicht stattfinden kann.

24 27 32 58 61 63 90

9155 58

58 9063/64/653827/2824 32

PetF

PetF

PetF

Fdx5

Fdx5

Fdx5

A

B

C

Abb. 4-2: Darstellung der für die Elektronentransfer-Wechselwirkung mit HydA1 (A), PSI (B) und Fnr

(C) relevanten Aminosäuren. Dargestellt ist ein Vergleich der Aminosäuresequenz von PetF und Fdx5. Die für

eine Interaktion mit HydA1 (Untersuchung an C. reinhardtii von WINKLER, Dissertation, 2009), PSI

(Untersuchungen an Synechocystis sp. PCC 6803 von LELONG et al., 1994; PONCELET et al., 1998; GUILLOUARD

et al., 2000) und Fnr (Untersuchungen an Z. mays und S. oleocera von KURISU et al., 2001, DE PASCALIS et al.,

1993; PIUBELLI et al., 1996) wichtigen AS sind rot markiert Die Zahlen geben die Aminosäureposition in Bezug

auf PetF an.

Die Verwendung einer in vitro rekonstituierten Redoxkette für die Messung der PSI-

abhängigen NADP+-Photoreduktion und der Cyt c-Reduktion lassen den Rückschluss zu, dass

Fdx5 nicht von PSI reduziert werden kann. Die Wechselwirkung von PSI mit Ferredoxin ist

ein bereits ausführlich untersuchtes Themengebiet. Chemische „Crosslinking“-Experimente

haben gezeigt, dass Ferredoxin mit den drei Untereinheiten PsaD, PsaE und PsaC von PSI

interagiert und dass diese Bindungen ebenfalls auf elektrostatischen Wechselwirkungen

beruhen (ROCHAIX et al., 2000). Bislang wurden jedoch nur wenige Untersuchungen

durchgeführt um zu klären, welche Aminosäurereste auf Seite des Ferredoxins für die

Wechselwirkung mit PSI relevant sind. Es konnte bislang an Untersuchungen mit Ferredoxin

aus Synechocystis sp. PCC 6803 festgestellt werden, das ein am C-Terminus lokalisiertes

Glutamat einen entscheidenden Effekt auf die Wechselwirkung zwischen beiden Proteinen hat

(LELONG et al., 1994; PONCELET et al., 1998). Das entsprechende Glutamat kann ebenfalls an

Diskussion

59

der äquvivalenten Position in der Aminosäuresequenz von Fdx5 gefunden werden (Abb. 4-2

B). Es wurden jedoch noch zwei weitere Aminosäuren in Synechocystis sp. PCC 6803 PetF

identifiziert, die die Komplexbildung mit PSI stabilisieren. Der Austausch der beiden

Aspartatreste, die in C. reinhardtii PetF Asp 55, bzw. Asp 58 entsprechen, gegen basische

Aminosäuren, führt zu einer 14- bis 19-fachen Abnahme der Affinität (GUILLOUARD et al.,

2000). In Fdx5 sind diese Aspartatereste nicht vorhanden, an ihre Stelle treten Glutamat, bzw.

Glycin, wobei vor allem Glycin als ungeladene Aminosäure einen viel höheren pI-Wert als

das negativ geladene Aspart aufweist.

Einen weiteren Effekt auf die Wechselwirkung von Fdx5 und PSI könnte auch die C-

terminale Extension von Fdx5 hervorufen. Fdx5 weist eine, im Vergleich zu den meisten

Pflanzen-Typ Ferredoxinen, die durchschnittlich 97 bis 99 AS lang sind (BERTINI et al.,

2002), außergewöhnliche Größe von 103 AS auf (siehe auch Abb. 4-3 A). Gegenüber PetF ist

der C-Terminus von Fdx5 um die Aminosäuren Thr-Cys-Glu-Tyr-Gly-Lys-His-Gln

verlängert. An Synechocystis sp. PCC 6803 PetF konnte gezeigt werden, dass eine

Verlängerung des C-Terminus um sieben AS zu einer 10-fachen Abnahme der Affinität zu

PSI führt (PONCELET et al., 1998).

Im Gegensatz zu der Wechselwirkung mit PSI ist die Interaktion zwischen Fdx5 und Fnr

möglich, wie die Reduktion von Cyt c in einer in vitro rekonstituierten

Elektronentransportkette zeigte. Röntgenstrukturanalysen des Komplexes von Z. mays Fnr

und Ferredoxin haben veranschaulicht, dass Aminosäuren Glu 29, Arg 40, Asp 61, Asp 65

und Asp 66 auf Seiten des Ferredoxins für die Ausbildung intermolekularer Salzbrücken mit

der Fnr relevant sind (KURISU et al., 2001). Diese Aminosäuren können in äquivalenten

Positionen auch in C. reinhardtii PetF gefunden werden, in Fdx5 sind jedoch an den zu Asp

61 und Asp 66 entsprechenden Positionen Glycin (Position 58) und Prolin (Position 64) zu

finden (Abb. 4-2 C). Daneben scheinen aber auch Asp 26, Glu 30, Asp 34, Asp 60 und Asp 67

in S. oleocera Ferredoxin für die Interaktion mit Fnr von Bedeutung zu sein (DE PASCALIS et

al., 1993). Bis auf Asp 67, an dessen Stelle ein Glycin tritt, sind diese AS an

korrespondierenden Positionen in PetF zu finden. In Fdx5 ist hingegen Glu 30 gegen ein

Arginin ausgetaucht. Ausserdem scheint auch Glu 92 von S. oleocera Ferredoxin einen Effekt

auf die Wechselwirkung mit der Fnr zu haben (PIUBELLI et al., 1996). Das zu dieser Position

äquvivalente Glu (Position 90) kann sowohl in C. reinhardtii PetF als auch in Fdx5 gefunden

werden.

Diskussion

60

Obwohl somit einige der vorwiegend negativ geladenen Aminosäuren, die für eine Interaktion

mit der Fnr relevant zu sein scheinen, in Fdx5 durch neutrale oder positiv geladene

Aminosäuren ausgetauscht sind, scheinen diese die Wechselwirkung mit der Fnr im Vergleich

zur Reaktion der Fnr mit PetF nicht zu hemmen. Genauere Aussagen zur Interaktion zwischen

Fdx5 und Fnr können jedoch nicht gemacht werden, da in der für die Analyse verwendeten in

vitro Redoxkette auch der Elektronentransfer zwischen Ferredoxin und Cytc einen

massgeblichen Einfluss auf die Messwerte hat und die Wechselwirkung zwischen Fdx5 und

Cytc bzw. PetF und Cytc unterschiedliche kinetische Eigenschaften aufweisen könnte.

Eine Schlussfolgerung, die aus den Analysen der Wechselwirkung von Fdx5 mit typischen

Reaktionspartnern gezogen werden kann, ist, dass die signifikanten Unterschiede in den

Reaktionen insbesondere mit HydA1 und PSI, die bei Fdx5 im Vergleich zu PetF zu

beobachten waren, auf das Auftreten abweichender Aminosäurereste zurückzuführen sind.

Die meisten Ferredoxine besitzen konservierte Domänen (XU et al., 2006), die vor allem

durch das Auftreten negativ geladener Aminosäurereste charakterisiert sind, und die in der

Sequenz von Fdx5 zum Teil deutlich vom Konsensus abweichen. Die entprechenden Bereiche

sind in Abb. 4-3 A anhand eines Sequenzvergleichs verschiedener Pflanzen-Typ Ferredoxine

in Bezug auf C. reinhardtii PetF dargestellt. Es stellt sich die Frage, ob diese

Sequenzabweichungen auch einen Einfluss auf die Wechselwirkung von Fdx5 mit anderen

typischen Ferredoxin-Redoxpartnern, wie z.B der Ferredoxin/ Thioredoxin-Reduktase oder

der Nitrit-Reduktase haben könnten, die auch mit diesen Domänen interagieren (Xu et al.,

2006, JAQUOT et al., 1997, GARCIA-SÁNCHEZ et al., 2000) oder ob Fdx5 eventuell ein

spezialisiertes Ferredoxin ist, dass eine ganz spezifische Funktion im Metabolismus von. C

reinhardtii erfüllt.

Die ungewöhnliche Aminosäuresequenz von Fdx5 stellt sich auch im Homologievergleich zu

verschiedenen anderen Pflanzen-Typ Ferredoxinen dar (Abb. 4-3 A). “BLAST”-Analysen in

der Datenbank von NCBI zeigen, dass die Übereinstimmung von Fdx5 zu PetF nur 50 %

beträgt. Generell weist Fdx5 die größten Homologien zu cyanobakteriellen Ferredoxinen auf.

Das Phylogramm in Abb. 4.3 B, in dem sich der Verwandschaftsgrad von Pflanzen-Typ

Ferredoxinen aus unterschiedlichen Organismengruppen darstellt, verdeutlicht die

Sonderstellung, die Fdx5 im Vergleich zu den anderen Ferredoxinen einnimmt. Während sich

die Ferredoxine der Grünalgen, der Rotalgen, der Cyanobakterien und der höheren Pflanzen

jeweils in Gruppen zusammenfinden, steht Fdx5 weit ausserhalb dieser Gruppen, was den

geringen Verwandschaftsgrad zu den anderen Ferredoxinen verdeutlicht.

Diskussion

61

C. reinhardtii PetFC. reinhardtii Fdx5

D. salina Fd ID. salina Fd II

C. fusca FdS. quadricauda Fd

P. umbilicalis FdC. caldarium FdS. oleocera FdT. aestivum Fd

Synechocystis spec. PCC 6803 FdS. platensis Fd

A. thaliana Fd3Z. mays Fd3

C. reinhardtii PetF

C. reinhardtii Fdx5

D. salina Fd ID. salina Fd II

C. fusca FdS. quadricauda Fd

P. umbilicalis FdC. caldarium Fd

S. oleocera FdT. aestivum Fd

Synechocystis PCC 6803 FdS. platensis Fd

A. thaliana Fd3Z. mays Fd3

A

B

24 5832 65 90 92

Abb. 4-3: Vergleich von Fdx5 mit verschiedenen Ferredoxinen des Pflanzen-Typs.

Folgende Ferredoxine wurden für den Sequenzvergleich (A) und das Phylogramm (B) verwendet: Grünalgen: C.

reinhardtii PetF (P07839), C. reinhardtii Fdx5 (ABC88604), Dunaliela salina Fd I (P00239), Dunaliela salina

Fd II (P00240), Chlorella fusca Fd (P56408), Scenedesmus quadricauda Fd (P00238); Rotalgen: Porphyra

umbilicalis Fd (P00242), Cyanidium caldarium Fd (P00241); Pflanzen: S. oloecera Blattferredoxin (P00221) ,

Triticum aestivum Blattferredoxin (P00228), A. thaliana Wurzelferredoxin Fd3 (NP_180320), Z. mays

Wurzelferredoxin Fd3 (NP_001105346); Cyanobakterien: Synechocystis spec. PCC6803 Fd (NP_442127),

Spirulina platensis Fd (P00246). Der Sequenzvergleich und das Phylogramm (PAM 250 Multiway Protein

Alignment) wurden mit dem Programm SECentral erstellt. Dir roten Balken markieren die drei konservierten

Bereiche in Pflanzen-Typ Ferredoxinen, die durch das Auftreten elektrostatisch relevanter, negativ geladener AS

gekennzeichnet sind (XU et al. 2006).

In den Sequenzvergleich von Abb. 4-3 wurden auch zwei Pflanzen-Typ Ferredoxine aus A.

thaliana und Z. mays aufgenommen, die als Wurzelferredoxine identifiziert wurden (HANKE

et al., 2004; HASE et al. 1991 b). Wie anfangs beschrieben, können Wurzelferredoxine im

Vergleich zu Blattferredoxinen besser durch NADPH reduziert werden (HASE et al., 1991 b,

ONDA et al., 2000, HANKE et al., 2004). In Bezug auf diese funktionellen Unterschiede

werden Ähnlichkeiten zu Fdx5 erkennbar, das nicht durch PSI reduziert, dafür aber in einer

Umkehrreaktion durch die Fnr reduziert werden kann. Auf Basis der Primärsequenz (Abb. 4-3

A u. B) spiegeln sich diese funktionellen Ähnlichkeiten zwischen Fdx5 und den

Wurzelferredoxinen Fd3 aus A. thaliana und Fd3 aus Z. mays jedoch nicht wieder, da der

Diskussion

62

Verwandschaftsgrad von Fdx5 zu diesen Wurzelferredoxinen ebenso gering erscheint wie zu

typischen Blattferredoxinen.

C. reinhardtii Zellen mit einem reduzierten FDX5-Transkriptgehalt weisen unter Cu-

Mangel einen verringerten Chlorophyllgehalt und eine verringerte photosynthetische

Aktivität auf. Dies weist auf eine Funktionalität von Fdx5 in den unter Cu-Mangel

eintretenden metabolischen Adaptionen von C. reinhardtii hin.

Da die Ferredoxin-abhängigen Aktivitätstests nur einen ersten Eindruck von der

Funktionalität des Fdx5-Proteins vermitteln konnten, wurde als weitere Strategie für die

Aufklärung des Fdx5 abhängigen Stoffwechsels die Ausschaltung des Fdx5-Gens angestrebt.

Dafür wurde eine erst kürzliche vorgestellte Methode des Gen-„Silencing“ durch artifizielle

miRNAs verwendet (MOLNÁR et al., 2009). miRNAs gehören neben siRNAs zur Klasse der

kleinen RNAs, die eine Funktion im „Silencing“-Mechanismus von Zellen haben (BARTEL,

2004). Auch in C. reinhardtii wurde vor kurzem die Existenz von miRNAs entdeckt

(MOLNÁR et al., 2007). Sie werden aus längeren Vorläufer-miRNAs gebildet, die nicht perfekt

gepaarte, doppelsträngige Bereiche ausbilden. Die Prozessierung dieser Vorläufer-miRNAs

verläuft ähnlich, wie für siRNAs beschrieben. Durch das Polymerase III-ähnliche Enzym

Dicer wird aus der Vorläufer-miRNA ein 21-24 nt langes doppelsträngiges RNA-Molekül

freigesetzt (AMBROS, 2001), das daraufhin in den Multienzymkomplex RISC („RNA induced

silencing complex“) aufgenommen wird und an ein Argonaut-Protein bindet. Der Strang mit

der höheren thermodynamischen Stabilität am 5’-Ende, d.h. der Strang mit der stabileren 5’-

Basenpaarung, verbleibt im RISC, während der Passagierstrang, auch als miRNA*

bezeichnet, abgebaut wird (BARTEL, 2004). Der Argonaut-miRNA-Komplex bindet mittels

Watson-Crick-Basenpaarung an komplementäre Sequenzen der Ziel-mRNA und initiiert

dadurch den eigentlichen „Silencing“-Mechanimus. In Abhängigkeit von der

Komplementarität der miRNA zur mRNA wird dann entweder die Degradation der mRNA

oder eine Arretierung der Translation induziert (BARTEL, 2004). Wie in Kapitel 3.9

beschrieben wurde, werden durch die Nutzung von artifiziellen miRNAs als Werkzeug zum

gezielten Ausschalten von Genen die Probleme der RNAi-Methodik umgangen, da miRNAs

in der Regel nicht Ziel des zelleigenen Silencingmechanismus sind (MOLNÁR et al., 2009). In

Pflanzen wurde die Methodik der amiRNAs bereits für das effektive Ausschalten von Genen

beschrieben. So konnten in A. thaliana, Solanum lycopersicum und Nicotiana tabacum schon

verschiedene Gene durch den Einsatz entsprechender amiRNAs ausgeschaltet werden

(SCHWAB et al., 2006, ALVAREZ et al., 2006). Mittels der auch in dieser Arbeit verwendeten

Diskussion

63

Methodik konnten auch in C. reinhardtii bereits verschiedene Gene, z.B. COX90

(Untereinheit der Cytochrom c Oxidase), PSY (Phytoene Synthase), DCL1 (Dicer-ähnliche

Nuklease), sowie MAA7 (Tryptophan Synthase β-UE) und RBCS1/2 (kleine UE der Rubisco)

herunterreguliert werden (MOLNÁR et al, 2009, ZHAO et al., 2008). Dabei zeigten bis zu 72 %

der transgenen C. reinhardtii Linien einen Phänotyp, der auf die Expression der amiRNAs

zurückzuführen war (MOLNÁR et al., 2009). Bei den in dieser Arbeit hergestellten transgenen

C. reinhardtii Transformanden konnte ebenfalls ein hoher Anteil an Zelllinien identifiziert

werden, die unter artifiziell anaeroben Bedingungen einen verringerten FDX5-

Transkriptgehalt aufwiesen. Aus Zeitgründen war eine Untersuchung des Fdx5-

Proteingehaltes unter anaerob artifiziellen Bedingungen nicht mehr möglich. Da ein niedriger

FDX5-Transkriptgehalt jedoch auf einen niedrigen Fdx5-Proteingehalt schließen lässt, wurden

die zwei Stämme mit dem niedrigsten FDX5-Transkriptgehalt für weitere Untersuchungen

ausgewählt.

Dabei wurde zunächst ein Schwerpunkt auf die Analyse des Photofermentationsmetabolismus

gelegt. Die Beteiligung von Fdx5 an der Reduktion der Hydrogenase HydA1 mittels

Elektronen, die aus der photosynthetischen Elektronentransportkette stammen, kann bereits

ausgeschlossen werden, da NADP+-Photoreduktion und in vitro Analysen mit HydA1 gezeigt

haben, dass Fdx5 nicht von PSI reduziert wird und nicht mit HydA1 interagieren kann. Die

gemessene Wasserstoffakkumulation in der Gasphase der S-Mangel induzierten C. reinhardtii

amiRNA-Transformanden im Vergleich zum Wildtyp bestätigt die Vermutung, dass Fdx5

keine Funktion im Elektronentransfer zwischen PSI und HydA1 besitzt.

Auch die Formiat- und Ethanolproduktion der S-Mangel induzierten sowie artifiziell

anaerobisierten C. reinhardtii Stämme zeigte keine signifikanten Unterschiede zum Wildtyp.

Die Produktion von Formiat und Ethanol ist ein Hinweis auf die Aktivität der Pfl1-Reaktion

(HEMSCHEMEIER et al., 2008 a) Wie schon in der Einleitung beschrieben, gehört die Pfl1 zur

Klasse der sogenannten Glycylradikal-Enzyme und wird durch die Pfl-Aktivase, einem

Radikal-SAM-Protein, posttranslational aktiviert (FREY et al., 1994; HEMSCHEMEIER et al,

2008 a). Die Aktivität der Pfl-Aktivase ist dabei abhängig von SAM, Pyruvat und einem

externen Ein-Elektronendonator wie Flavodoxin (BLASCHKOWSKI et al., 1982). Da in C.

reinhardtii bislang noch keine Flavodoxine identifiziert werden konnten, besteht die

Möglichkeit, dass der benötigte Ein-Elektronenüberträger ein Ferredoxin ist. Wäre Fdx5 der

Ein-Elektronenübertrager, der für die Aktivierung der Pfl1 notwendig ist, müsste ein

Diskussion

64

verringerter Fdx5-Gehalt einen Einfluss auf den Gehalt an aktiver Pfl1 haben und damit auch

einen Einfluss auf die Produktion von Formiat und Ethanol.

Ein weiterer Ferredoxin-abhängiger Stoffwechselweg, in den Fdx5 involviert sein könnte, ist

die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA durch die Pfo. Die Expression

des PFO-Gens wird parallel zur Expression der Gene PFL und HYDA1 induziert, wie durch

semiquantitative RT-PCR gezeigt werden konnte. In Wasserstoff-produzierenden Bakterien

ist die Reduktion von Ferredoxin durch die Pfo die Elektronenquelle für verschiedene

Hydrogenasen (PIEULLE et al., 1997; STAL und MOEZELAAR, 1997). Bislang ist noch nicht

geklärt, ob durch die Pfo reduziertes Ferredoxin auch in C. reinhardtii ein Elektronendonor

für HydA1 sein könnte (HEMSCHEMEIER et al., 2008 a). Ebenfalls ungeklärt ist die Frage, ob

durch die Pfo produziertes Acetyl-CoA durch die AdhE zu Ethanol umgesetzt wird

(HEMSCHEMEIER et al, 2008 a). Eine weitere nennenswerte Funktion besitzt die Pfo von E.

coli, die vermutlich reduziertes Flavodoxin für die Aktivierung der Pfl durch die PflA

bereitstellt (BLASCHKOWSKI et al., 1982). Wäre Fdx5 ein Redoxpartner der Pfo, müsste sich

eine verringerte Fdx5-Konzentration, demnach eventuell in einer verringerten Ethanol- oder

auch Wasserstoffproduktion der S-Mangel induzierten oder artifiziell anaerobisierten

amiRNA-Transformanden zeigen. Eine solche Reaktion konnte jedoch nicht beobachtet

werden.

Zusammengefasst lassen die Untersuchungen an S-Mangel induzierten und artifiziell

anaerobisierten C. reinhardtii-Stämmen mit einem verringerten FDX5-Transkriptgehalt keine

Unterschiede in Wasserstoff-, Formiat- und Ethanolproduktion erkennen, so dass eine

Funktionalität von Fdx5 in diesen Stoffwechselwegen zunächst auszuschließen ist. Es könnte

jedoch auch sein, dass C. reinhardtii in der Lage ist, an einen geringen Fdx5-Gehalt zu

adaptieren und dass andere Elektronenüberträger die Funktion von Fdx5 übernehmen und

aufgrund dessen keine Unterschiede beobachtet werden können. Gleichwohl könnte auch der

Fdx5-Gehalt der Zellen trotz eines verringerten Transkriptgehaltes unter artifiziell anaeroben

Bedingungen unverändert sein. Western Blot Analysen geben einen ersten Hinweis darauf,

dass zumindest unter S-Mangel der Fdx5-Gehalt der amiRNA-Transformanden

gleichbleibend ist. Ein Grund hiefür könnte der artifizielle HSP70A/RBCS2-Promotor sein,

der die Expression der amiRNAs antreibt. Es ist bekannt, dass unter S-Mangel eine

Degradation der Rubisco eintritt (Zhang et al., 2002). Auf Transkriptebene kann eine

Abnahme des mRNA Levels des RBCS-Gens beobachtet werden (ZHANG et al., 2004,

HEMSCHEMEIER, Diplomarbeit, 2002). Es ist also nicht auszuschließen, dass gerade unter S-

Diskussion

65

Mangel die Aktivität des RBCS-Promotors inhibiert ist und deshalb die Expression der

amiRNAs nicht stattfindet. Aus zeitlichen Gründen war eine Untersuchung des FDX5-

Transkriptgehaltes der amiRNA-Transformanden unter S-Mangel nicht mehr möglich. Unter

artifiziellen anaeroben Bedingungen hingegen scheint die Aktivität des Promotors nicht

beeinflusst, wie das „Screening“ nach amiRNA-Transformanden mit verringertem FDX5-

Transkriptgehalt gezeigt hat.

Parallel zu dieser Arbeit durchgeführte Analysen des Transkriptoms von Cu-defizienten C.

reinhardtii Kulturen haben gezeigt, dass auch unter Cu-Mangel die Expression des FDX5-

Gens aktiviert wird und das FDX5 überdies die zweitstärkste Transkriptakkumulation unter

diesen Bedingungen zeigt (S. Merchant, persönl. Mitteilung). Wie schon eingangs bei der

Analyse der FDX5-Expression beschrieben, können in der Promotorsequenz des FDX5-Gens

die sogenannten CuRE-Motive gefunden werden, die eine Antwort auf Cu- als auch auf

Sauerstoffmangel vermitteln (QUINN et al. 2000; Quinn et al., 2002). So wird z.B. auch die

Expression des CYC6-Gens und des CPX1-Gens nicht nur unter Cu-Mangel, sondern auch

unter anaeroben Bedingungen aktiviert (QUINN et al. 2000; QUINN et al., 2002). Die

Gemeinsamkeiten, die hinter den Cu- und Sauerstoffmangel Antworten stehen, sind bislang

noch nicht geklärt, ein evolutionärer Zusammenhang zwischen Cu- und Sauerstoffmangel

Antwort kann jedoch nicht ausgeschlossen werden (QUINN et al., 2002), da Kupfer-Ionen

unter anaeroben Bdingungen extrem unlösliche und somit nicht bioverfügbare Cu(I)-Sulfide

bilden (ÖSTERBERG, 1974). Somit ist zumindest nicht auszuschließen, dass Fdx5 auch eine

Funktion im Cu-Mangel Metabolismus von C. reinhardtii besitzten könnte.

Die in C. reinhardtii am häufigsten vorkommenden Cu-haltigen Enzyme sind die Cytochrom

Oxidase der Mitochondrien (FERGUSON-M ILLER und BABCOCK, 1996) das Plastocyanin der

Chloroplasten (MERCHANT et al., 1991) und eine Multi-Kupfer Oxidase (HERBIK et al., 2002;

CHEN et al., 2008), die an der Assimilation von Eisen beteiligt ist. Neben diesen Enzymen

gibt es noch weitere kupferhaltige Proteine, wie z.B. Metalloproteinasen, Aminoxidasen oder

Ascorbat-abhängige Monooxygenasen (HEITZER und HALLMANN 2002; BUFFONI und IGNESTI

2000; MERCHANT et al., 2006) deren Anteil am intrazellulären Cu- Bedarf jedoch

wahrscheinlich nicht so hoch ist (MERCHANT et al., 2006). Kupfer ist folglich ein essentieller

Nährstoff für die Zelle, dessen Mangel zu einer weitreichenden Umstrukturierung des

Metabolismus führt. Diese Umstrukturierung führt zum einen zu einer erhöhten Cu-

Assimilation zum anderen zur Synthese von sogenannten „Back up“-Enzymen, welche die

Cu-haltigen Proteine unter Cu-Mangel ersetzen (MERCHANT et al., 2006).

Diskussion

66

Ein Beispiel für eines dieser Cu-freien „Back up“ Enzyme ist das Häm-enthaltende Cyt c6, das

in Cu-supplementierten Zellen nicht nachgewiesen werden kann und dessen Synthese durch

Cu-Mangel induziert wird (MERCHANT und BORGORAD, 1987). Cyt c6 ersetzt unter Cu-

Mangel das Plastocyanin der photosynthetischen Elektronentransportkette und übernimmt

seine Elektronentransferfunktion in der Übertragung von Elektronen vom Cytochtom-b6f-

Komplex zu PSI. Ein weiteres „Back up“ Enzym wird wahrscheinlich durch das Gen CRD2

kodiert. Wie bereits erwähnt, ist eine an der Eisen-Assimilation beteiligte Multi-Kupfer

Oxidase ein in C. reinhardtii häufig vorkommendes Protein. Unter Cu-Mangel können jedoch

keine Symptome beobachtet werden, die auf Eisenmangel zurückzuführen wären, was im

Umkehrschluss vermuten lässt, dass die Eisenaufnahme in Cu-freien Medium durch ein Cu-

freies „Ersatz“-Enzym aufrechterhalten wird (LA FONTAINE et al., 2002). Dies wurde an

Untersuchungen einer CRD2-Mutante bestätigt, die unter Cu-Mangel einen verringerten

Chlorophyllgehalt und ein verringertes Wachstum besitzt (ERIKSSON et al., 2004). Bislang ist

das Genprodukt von CRD2 jedoch noch unbekannt (MERCHANT et al., 2006). Zu den weiteren

Genen, die unter Cu-Mangel hochreguliert werden, gehören das Gen CPX1, das für die

Coprophoryrinogen III Oxidase und das Gen CRD1, das für eine Isoformen der aeroben

oxidativen Cyclase (Mg-Protoporphyrin-IX-Monomethyl-Ester Cyclase) kodiert.

Coprophoryrinogen III Oxidase und oxidative Cyclase sind Enzyme, die eine Funktion in der

Tetrapyrrol-Biosynthese der Zellen besitzen. Coprophoryrinogen III Oxidase katalysiert dabei

den fünften Schritt der Tetrapyrrol-Biosynthese, die Umsetzung von Coproporphyrinogen III

zu Protoporphyrinogen III, während die oxidative Cyclase an der Sauerstoff-abhängigen

Bildung von Protochlorophyllid beteiligt ist (TIMKO , 1998). Die metabolischen Hintergründe,

die eine Hochregulation von CPX1 und CRD1 notwendig machen, sind jedoch noch ungeklärt

(MERCHANT et al., 2006).

Gen Protein Metabolismus

CYC6 Cytochrom c6 (ersetzt Plastocyanin) Photosynthese

CPXI Coproporphyrinogen III Oxidase Tetrapyrrol-Biosynthese

CRD1 Oxidative Cyclase Tetrapyrrol-Biosynthese

CRD2 ? (ersetzt vermutlich eine Multi-Kupfer Oxidase) Eisenassimilation

FDX5 Ferredoxin Fdx5 ?

Tab. 4-1: Übersicht über Proteine, die unter Cu-Mangel akkumulieren. Unter Cu-Mangel wird die Synthese

diverser Proteine aktiviert, die an unterschiedlichen Stoffwechselwegen beteiligt sind. Einige dieser Proteine

fungieren als „Backup“-Enzyme für kupferhaltige Proteine, die nicht mehr gebildet werden können (MERCHANT

und BORGORAD, 1987; QUINN und MERCHANT, 1998; ERIKSSON et al., 2004, MERCHANT et al., 2006).

Diskussion

67

Interessanterweise konnte bei Untersuchungen der FDX5 amiRNA Transformanden unter Cu-

Mangel ein verringerter Chlorophyll- und Carotinoidgehalt der Transformanden im Vergleich

zum Wildtyp beobachtet werden. Dieser Unterschied zeigte sich sowohl unter

photoheterotrophen als auch unter photoautotrophen Bedingungen. Die Photosyntheseraten

der amiRNA-Transformanden sind gleichermaßen verringert. Western Blot Analysen gegen

Cyc6, von dem die auschließliche Bildung unter Cu-defizienten Bedingungen bekannt ist

(MERCHANT und BORGORAD, 1987) bestätigten die Cu-Mangel Induktion der Zellen, so dass

davon ausgegangen werden kann, dass der beobachtete Phänotyp wirklich auf eine Cu-

Defizienz zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu S-Mangel scheint sich die Reduktion des

FDX5-Transkriptgehaltes der amiRNA-Transformanden unter Cu-Mangel auch in einer

Reduktion des Fdx5-Proteingehaltes wiederzuspiegeln, was ein Hinweis darauf ist, dass der

Phänotyp der amiRNA Transformanden unter Cu-Mangel durch den „Knock down“ des

FDX5-Gens verursacht wird.

Ein stark verringerter Chlorophyllgehalt von pflanzlichen Zellen, sowie eine verringerte

Photosyntheserate sind oft Symptom für bestehende Eisendefizienz (SPILLER und TERRY,

1980). Dabei bedingt der Mangel an Eisen eine verringerte Akkumulation an

Photosynthesekomplexen, die sich auch in einer Abnahme der photosynthetischen Aktivität

äußert. Dieser Effekt konnte auch an Eisen-defizienten C. reinhardtii Zellen beobachtet

werden, die unter Eisenmangel eine Chlorose ausbilden und eine verringerte

photosynthetische Aktivität besitzen (MOSELEY et al., 2000). Der Grund für die verringerte

photosynthetische Aktivität liegt dabei in einer veränderten Zusammensetzung der

Photosynthesekomplexe und ihrer Lichtsammelantennen (MOSELEY et al., 2000; NAUMANN et

al., 2005). In Hefe und Säugetierzellen sind Cu-Metabolismus und Fe-Metabolismus

miteinander vernetzt, da Cu-Mangel auch zu einer sekundären Eisendefizienz führt (ASKWITH

und KAPLAN, 1998). Wie schon oben beschrieben, ist in C. reinhardtii vermutlich eine Multi-

Kupfer Oxidase an der Assimilation von Eisen beteiligt (LA FONTAINE, 2002), die unter Cu-

Mangel durch das noch unbekannte Genprodukt des Gens CRD2 ersetzt wird. Möglicherweise

ist Fdx5 ebenfalls in einen an der Eisenassimilation beteiligten Stoffwechselschritt involviert,

was die Ausbildung einer sekundären Eisendefizienz unter Cu-Mangel erklären würde.

Einen ähnlicher Phänotyp, wie von den amiRNA-Transformanden unter Cu-Mangel gezeigt,

weisen auch C. reinhardtii Mutanten mit einem Defekt im CRD1-Gen auf (MOSELEY et al.,

2002). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass der bei den CRD1-Mutanten aufgetretene

Phänotyp, ein verringerter Chlorophyllgehalt und eine verminderte Photosyntheseaktivität,

bedingt durch die geringe Akkumulation von PSI und einem veränderten Gehalt der

Diskussion

68

Lichtsammelkomplexe, nicht auf einer sekundären Eisendefizienz beruht. Gleichermaßen wie

die Expression von CYC6 und CPX1, ist die CRD1-Expression auch durch Sauerstoffmangel

induzierbar (MOSELEY et al., 2000). Wie schon oben beschrieben, kodiert CRD1 für das

Enzym oxidative Cyclase des Chlorophyll-Stoffwechsels. In C. reinhardtii kann noch eine

weitere Isoform dieser oxidativen Cyclase gefunden werden, die durch das Gen CTH1 kodiert

wird (MOSELEY et al., 2000). CRD1 und CTH1 werden unter Cu- und Sauerstoffmangel

differentiell exprimiert. So konnte nachgewiesen werden, dass CRD1 ausschließlich unter Cu-

und Sauerstoffmangel exprimiert wird, während CTH1 in Cu- und Sauerstoff

supplementierten Zellen aktiv ist (MOSELEY et al., 2002). Aufgrund der phänotypischen

Ähnlichkeiten zwischen CRD1-Mutante und den amiRNA-Transformanden wäre somit auch

eine Funktionalität von Fdx5 in einem Schritt des Chlorophyllbiosyntheseweges möglich, der

in vielen Schritten abhängig von Reduktionsäquivalenten ist, wie z.B. im Falle der NADPH

Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (Timko et al., 1998). Da bei den amiRNA-

Transformanden auch eine Reduktion des Carotinoidgehaltes zu beobachten ist, könnte die

Möglichkeit bestehen, dass bei den amiRNA-Transformanden ebenso wie bei den CRD1-

Mutanten eine Störung in der Akkumulation von PSI und Lichtsammelkomplexen vorliegt.

Abb.4-4: Schematische Darstellung von metabolischen Prozessen, die unter Cu-Mangel modifiziert

werden. Unter Cu-Mangel wird die Synthese diverser Proteine (rot markiert) aktiviert, die an verschiedenen

Stoffwechselwegen beteiligt sind. Cpx1 und Crd1 katalysieren Schritte der Tetrapyrrol-Biosynthese, während

Cyc6 das kupferhaltige Plastocyanin der photosynthetischen Elektronentransportkette ersetzt. Crd2 ist an der

Eisenassimilation beteiligt und ersetzt vermutlich eine Multi-Kupfer Oxidase (MERCHANT und BORGORAD,

Diskussion

69

1987; QUINN und MERCHANT, 1998; ERIKSSON et al., 2004, MERCHANT et al., 2006). Die genaue Funktion von

Fdx5 ist bislang ungeklärt. Diese Abbildung stellt eine Übersicht über die bisher untersuchten metabolischen

Adaptionen unter Cu-Mangel dar. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass es noch weitere, bislang nicht untersuchte

Stoffwechselprozesse gibt, die ebenfalls von Cu-Mangel beeinflusst werden.

Cyc6 = Cytochrom c6; Crd1 = oxidative Cyclase; Crd2 = bislang noch unbekannt Cyt b6f = Cytochrom-b6f-

Komplex, Cpx1 = Coproporphyrinogen Oxidase; Fd = Ferredoxin; Fdx5 = Ferredoxin5; Pc = Plastocyanin, Pq

= Plastochinon, PS II, I = Photosystem II, I,.

Um jedoch genaue Aussagen zur Funktionalität von Fdx5 tätigen zu können, muss noch eine

detailliertere Analyse des unter Cu-Mangel ausgebildeten Phänotyps der amiRNA-

Transformanden erfolgen. Wichtig wäre hierbei die Untersuchung der photosynthetischen

Aktivität, z.B. durch Chlorophyll-Fluoreszenz Messungen oder die Supplementation der Cu-

Mangelkulturen mit Eisen, um eine sekundäre Eisendefizienz der Zellen zu analysieren.

Interessant wäre zudem eine Untersuchung des Wachstumsverhaltens der amiRNA-

Transformanden unter anaeroben Bedingungen, um zu ermitteln, ob der Phänotyp auch durch

Hypoxie induzierbar ist, wie z.B. im Falle der CRD1-Mutanten.

Das „Silencing“ des FDX5-Gens mittels artifizieller miRNAs liefert somit die ersten

Hinweise auf die Funktion des Fdx5-Proteins und zeigt, dass eine Reduktion des Fdx5-

Gehaltes auch eine phänotypische Reaktion hervorruft. Genaue Analysen sind jedoch

notwendig, um den genauen Wirkungsort von Fdx5 zu bestimmen. Es scheint allerdings

naheliegend, dass Fdx5 ein spezialisiertes Ferredoxin ist, das an spezifischen

Stoffwechselprozessen beteiligt ist, die unter bestimmten Stressbedingungen wie Cu- und

Sauerstoffmangel in C. reinhardtii induziert werden.

Zusammenfassung

70

5 Zusammenfassung

Durch Homologievergleiche konnten im Genom von C. reinhardtii sechs Gene (PET, FDX2,

FDX3, FDX4, FDX5 und FDX6) identifiziert werden, die für (putative) Ferredoxine kodieren.

Semiquantitative RT-PCR-Analysen zeigten, dass diese Ferredoxin-kodierenden Gene in

belichteten, anaeroben S-Mangelkulturen sowie in artifiziell anaerobisierten C. reinhardtii

Kulturen differentiell exprimiert werden. Dabei war FDX5 das einzige der identifizierten

Gene, dessen Transkript unter beiden Bedingungen akkumulierte. Da dies eine vitale Funktion

des FDX5-Genproduktes in der veränderten Physiologie anaerober C. reinhardtii Zellen

andeutet, wurde FDX5 heterolog in E. coli exprimiert und das Fdx5-Protein via Strep-Tag

Affinitätschromatographie aufgereinigt. Das rekombinante Protein wurde für die Produktion

von polyklonalen Antikörpern verwendet, die mittels Immuno Blot Analysen erstmalig den

Nachweis einer Akkumulation von Fdx5-Protein in anaeroben C. reinhardtii Zellen

ermöglichten. Durch N-terminale Sequenzierung konnten die ersten fünf Aminosäuren des

aus C. reinhardtii in nativer Form aufgereinigten Proteins identifiziert und das Vorhandensein

eines N-terminalen Signalpeptides verifiziert werden. Mittels konfokaler

Fluoreszensmikroskopie und Zellfraktionierung konnten anschließend Hinweise auf eine

chloroplastidäre Lokalisation des Fdx5-Proteins ermittelt werden. Die biochemische

Charakterisierung des rekombinanten Proteins zeigte, dass Fdx5 ein [2Fe2S]-Ferredoxin des

Pflanzen-Typs ist. Seine Aminosäuresequenz unterscheidet sich jedoch signifikant von der

typischen Primärsequenz von Pflanzen-Typ Ferredoxinen, welche konservierte negativ

geladene Bereiche aufweist, die bedeutend für die Wechselwirkung des Ferredoxins mit

seinen Reaktionspartnern sind. Diese Abweichungen bedingen eine insgesamt positivere

Nettoladung des Fdx5-Proteins im Vergleich zu anderen Pflanzen-Typ Ferredoxinen. Um

einen ersten Eindruck von der Funktionalität von Fdx5 zu erhalten, wurden Ferredoxin-

abhängige Aktivitätstests durchgeführt. Diese zeigten, dass Fdx5 in vitro keine Elektronen auf

die Hydrogenase HydA1 übertragen und nicht von Photosystem I reduziert werden kann,

während eine Interaktion mit der Ferredoxin-NADP+-Oxidoreduktase möglich ist. Mittels

Gen-„Silencing“ durch artifizielle miRNAs konnte die FDX5-Transkriptakkumulation in zwei

C. reinhardtii Stämmen gehemmt werden. Die Charakterisierung dieser Stämme unter

anaeroben Bedingungen zeigte, dass eine Funktionalität von Fdx5 in typischen

Stoffwechselwegen des photofermentativen Metabolismus eher auszuschließen ist. Unter Cu-

Mangel konnten dabei eindeutige Unterschiede in Pigmentgehalt und photosynthetischer

Zusammenfassung

71

Aktivität der amiRNA-Transformanden im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden. Diese

Unterschiede deuten auf eine Beteiligung des Fdx5-Proteins an den unter Cu-Mangel

stattfindenden Stoffwechselprozessen hin.

Summary

72

6 Summary

BLAST-analyses revealed that the genome of the unicellular green alga C. reinhardtii

contains six genes encoding for (putative) ferredoxins (PET, FDX2, FDX3, FDX4, FDX5 and

FDX6). Semi-quantitative RT-PCR analyses showed that these genes were differentially

expressed in C. reinhardtii cultures that were either anaerobic in the light due to S-deprivation

or that had been artificially deprived of oxygen. Only the FDX5 transcript did accumulate

under both conditions, indicating a vital role of the encoded protein in the anaerobic

metabolism of the cells. For further analyses, FDX5 was heterologously expressed in E. coli

and the Fdx5-protein was purified via Strep-Tag affinity chromatography. Recombinant Fdx5

was used for the generation of polyclonal antibodies, whose application for the first time

demonstrated the accumulation of Fdx5 protein in anaerobic C. reinhardtii cells. N-terminal

sequencing allowed the identification of the first five amino acids of the mature protein,

which was purified from S-deprived C. reinhardtii cells, and verified the occurrence of an N-

terminal signal peptide. Results of confocal fluorescence microscopy and cell fractionation

analyses indicated a chloroplastic localisation of the Fdx5-protein. According to the

biochemical characterisation, Fdx5 is a typical plant-type [2Fe2S]-ferredoxin. However, its

amino acid sequence differs significantly from the typical sequence of plant-type ferredoxins.

These have conserved regions including several negatively charged amino acids which are

essential for the electrostatic interaction of the ferredoxin and its reaction partner. The

variations of the Fdx5-sequence result in a more positive net charge of Fdx5 compared to

other plant-type ferredoxins. Ferredoxin dependent activity assays showed that Fdx5 is not

able to transfer electrons to the hydrogenase HydA1 in vitro nor to accept electrons from PSI,

while it can interact with Fnr. Via gene silencing using artificial miRNAs two transgenic C.

reinhardtii strains were generated that showed significantly decreased FDX5 transcript levels

under anaerobic conditions. Under Cu-deficiency, these strains exhibited considerable

variations in pigment content and photosynthetic activity compared to the wild type. These

variations indicate a participation of the Fdx5-protein in the metabolic processes under Cu-

deficiency

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Anhang

83

8 Anhang

8.1 Auflistung der Ferredoxin-kodierenden Gene aus C. reinhardtii

Gene Protein ID (JGI4.0) Chromosom und Position (JGI4.0) GenBank Nr. (NCBI)

PETF 147787 14:2749384-2750217 P07839

FDX2 159161 16:1387337-1388874 ABC88601

FDX3 196707 6:7017104-7018511 ABC88602

FDX4 196705 7:3072834-3074762 ABC88603

FDX5 156833 17:702791-704769 ABC88604

FDX6 196703 3:4305938-4308048 ABC88605

Angegeben sind Protein ID der C. reinhardtii Datenbank JGI 4.0, die Lokalisation des Gens im Genom und die

Genbank Nr. der NCBI Datenbank.

8.2 Auflistung der verwendeten Arbeitsgeräte

Gerät Modell Hersteller

Anaerobzelt CLc Coy Laboratory, Grass

Lake, MI, USA

Autoklaven

VST 40/60

Varioklav 300/400/500 EP-Z

Zirbus, Bad Grund,

Deutschland

H+P Labortechnik AG,

Oberschleissheim,

Deutschland

Brutschränke

B 28

MBG

WTB

Binder, Tuttlingen,

Deutschland

Binder, Tuttlingen,

Deutschland

Binder, Tuttlingen,

Deutschland

Chemilumineszenz-Detektor FluorChem 8800 Alpha Innotech, San

Leandro, Ca, USA

Distille Cyclon Fistreem, Loughborough,

UK

Elektrophoreseapparaturen Mini-Protean Biorad, Hercules, Ca, USA

Feinwaage AW 320

P1200N

Shimadzu, Duisburg,

Deutschland

Mettler, Columbus, OH,

USA

Anhang

84

Gaschromatograph GC 2010 Shimadzu, Duisburg,

Deutschland

Geldokumentationsgerät Gel Max Intas, Göttingen,

Deutschland

Heizschüttler TM compact Eppendorf, Hamburg,

Deutschland

Impfbank HF 48 Gelaire, Sydney, Australien

Mikroskop 4379553 Carl Zeiss, Jena,

Deutschland

PCR-Geräte Mastercycler personal Eppendorf, Hamburg,

Deutschland

pH-Meter GC 822 Schott, Mainz, Deutschland

Protein-Blotkammer Fastblot B44 Biometra, Göttingen,

Deutschland

Sauerstoff-Elektrode: Elektrode und Kontrollbox

Schreiber

BD 40 Autofocus 3000 Hansatech, Norfolk,

England

Kipp & Zonen, Delft,

Niederlande,

Spektralphotometer Smart spec 3000

NanoDrop ND-1000

Biorad, Hercules, Ca, USA

Peqlab, Erlangen,

Deutschland

Ultraschallgerät Sonifier 250 Branson, Danbury, CT,

USA

Wasserbäder SW-20C

(Schüttelwasserbad)

Julabo, Seelbach,

Deutschland

Zentrifugen

Mini Spin

5417 R

5810 R

L8-M

Sorvall RC-5B

Eppendorf, Hamburg,

Deutschland

Eppendorf, Hamburg,

Deutschland

Eppendorf, Hamburg,

Deutschland

Beckmann Coulter, Krefeld,

Deutschland

DuPont Instruments,

Wilmington, DE, USA

Lebenslauf

85

9 Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Jessica Jacobs Geburtsdatum 22.06.1981 Geburtsort Wuppertal Staatsangehörigkeit deutsch Familienstand ledig

Hochschulstudium

12/2005 bis 10/2009 Promotionsstudium an der Ruhr-Universität Bochum am LS Biochemie der Pflanzen, AG Photobiotechnologie, Thema der Dissertation: „Biochemische und funktionelle Charakterisierung eines anaerob induzierten Ferredoxins aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii“

10/2000 bis 09/2005 Biologiestudium an der Ruhr-Universität Bochum, Thema der Diplomarbeit: „Der anaerobe Stoffwechsel von Chlamydomonas reinhardtii: Neue Erkenntnisse mit Real-Time PCR und heterologer Expression“ (Gesamtnote: 1,1)

Schulausbildung

09/1991-06/2000 Gymnasium Sedanstraße, Wuppertal, Abschluss mit Abitur (Gesamtnote: 2,3), Schwerpunkte: Biologie, Deutsch, Mathematik und Geographie

09/1987-07/1991 Grundschule Alarichstraße, Wuppertal Publikationen

Jacobs J., Pudollek S., Hemschemeier A. and Happe T. (2009) A novel, anaerobically induced ferredoxin in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett. 583(2):325-9. Epub 2008 Dec 26

Hemschemeier A., Jacobs J. and Happe T. (2008), Biochemical and Physiological Characterization of the Pyruvate Formate-Lyase Pfl1 of Chlamydomonas reinhardtii, a Typically Bacterial Enzyme in a Eukaryotic Alga. Eukaryotic Cell, March 2008, p. 518-526,

Vol. 7, No. 3

Lebenslauf

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Konferenzbeiträge

Jacobs J., Lambertz C., Hemschemeier A. and Happe T. (2009) The novel anaerobically induced ferredoxin of Chlamydomonas reinhardtii. Jahrestagung der VAAM, Bochum,

Deutschland. Poster

Jacobs J., Hemschemeier A. and Happe T. (2008) The novel anaerobically induced ferredoxin of Chlamydomonas reinhardtii. 17. Photosynthese-Workshop Nord-West,

Bochum. Poster

Jacobs J., Hemschemeier A. and Happe T. (2008) The novel anaerobically induced ferredoxin of Chlamydomonas reinhardtii. 13th International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas, Hyeres, Frankreich. Poster

Jacobs J., Hemschemeier A. and Happe T. (2008) The novel anaerobically induced ferredoxin of Chlamydomonas reinhardtii. Molecular Functions of Botanical Systems,

Bochum, Deutschland. Vortrag Jacobs J., Hemschemeier A., Winkler M., Lambertz C., Kamp C., Stripp S. and Happe T. (2007) The novel anaerobically induced ferredoxin of Chlamydomonas reinhardtii. SFB 480

Workshop, Velen, Deutschland. Vortrag

Jacobs J., Hemschemeier A. and Happe T. (2007) A novel anaerobically induced ferredoxin is involved in photosynthetic hydrogen production. The 8th International Hydrogenase

Conference, Breckenridge, USA, Poster

Hemschemeier A., Jacobs J., Rühle T., v. Abendroth G., Kamp C., Winkler M. and Happe T. (2007) The anaerobic life of Chlamydomonas reinhardtii – uncovering the molecular tools of algal hydrogen production. Solar H Meeting, Uppsala, Schweden. Vortrag Es wurde kein „Book of Abstracts“ veröffentlicht.

Jacobs J., Hemschemeier A. and Happe T. (2007) A novel anaerobically induced ferredoxin is involved in photosynthetic hydrogen production. 16. Photosynthese-Workshop Nord-West,

Mühlheim, Deutschland. Vortrag

Jacobs, J., Hemschemeier, A., and T. Happe (2006) Analysis of novel genes and proteins that are expressed under sulphur deprivation and anaerobic conditions. 12 th International

Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas, Portland, USA, Poster

Hemschemeier A., Jacobs J., Kamp C. and Happe T. (2006) [Fe]-hydrogenases and H2-metabolism in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Solar H Meeting,

Gelsenkirchen, Deutschland, Vortrag

87

Danksagungen

An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei allen Menschen bedanken, die mich im Laufe

meiner Promotion unterstützt haben.

Ein besonderer Dank gilt:

o Meinem akademischen Lehrer und Doktorvater Prof. Dr. Thomas Happe für die

interessante Themenstellung, das mir entgegengebrachte Vertrauen, sein stetiges

Interesse an dieser Arbeit und die damit verbundenen wertvollen wissenschaftlichen

Ratschläge.

o Prof. Dr. Elmar Weiler für die freundliche Übernahme des Korreferates.

o Dr. Anja Hemschemeier für die ständige Diskussionsbereitschaft und viele gute Ideen.

o Camilla Lambertz, mit der ich nicht nur viele wissenschafliche Gespräche geführt

habe, sondern auch ausserhalb des Labors viel Spaß hatte.

o Meinen Büronachbarn Sven Stripp und Miriam Pape.

o Allen weiteren Mitgliedern der AG Photobiotechnologie für das angenehme

Arbeitsklima, die tolle Zusammenarbeit, nette Gespräche und die vielen Feiern und

Grillabende.

o Natürlich auch meinen Eltern und Hubert, die immer für mich da waren.

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Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät

eingereicht habe und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe.

Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um fünf in Wort und Bild

völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 01.07.2009

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Jessica Jacobs

Documents

Biochemische und funktionelle Charakterisierung eines ... · Biochemische und funktionelle Charakterisierung eines anaerob induzierten Ferredoxins aus Chlamydomonas reinhardtii Dissertation