Avec la collaboration d'ABBOi-T DIAGNOSTIC Moc~rat~ur. Ph. CALESTREME (Agen)

Biologie mol culaire: apport de l'automatisation dans la pratique quotidienne du diagnostic des Chlamydia

B. de B A R B E Y R A C et C. BI~BI~AR (Bordeaux)

Introduction

La mise en ~vidence de Chlamydia trachomatis, bact~rie fl multiplication intracellulaire obligatoire, est d~licate. L'isole- ment en culture cellulaire fl partir de pr~l~vements urog~ni- taux constitue la m~thode diagnostique de r~f~rence mais demeure r~serv~ fl des laboratoires specialists. De nouvelles approches de diagnostic rapide non bas~es sur la culture se sont largement d~velopp~es ces dix derni~res ann~es. Elles sont axles sur la raise en ~vidence des antig~nes bact~riens par immunofluorescence directe avec anticorps monoclo- naux ou par des tests immunoenzymatiques et apparent~s mais aussi sur la d~tection des acides nucl~iques bact~riens par hybridation mol~culaire avec ou sans amplification g~nique. L'appr~ciation des performances de ces tests en terme de sensibilit~ et de sp~cificit~ pose des probl~mes. En effet les deux techniques, culture et immunofluorescence directe, g~n~ralement retenues comme m~thodes de r~f~- rence en raison de leur sensibilit~ et de leur sp~cificit~ p~chent par leur manque de standardisation et /ou leur sub- jectivit& Les tests immunoenzymatiques g~n~ralement auto- matis~s manquent de sensibilit& Les tests d'amplification g~nique du fait de leur tr&s grande sensibilit~ exigent une parfaite standardisation et des contr61es stricts, crit~res aux- quels peut r~pondre une automatisation.

I. C. trachomatis : caract~ristiques et pr~l~vements

1. La bact~rie

Les Chlamydia se pr~sentent sous forme de corps ~l~men- taires (CE) ou de corps r~ticul~s (CR) selon l'~tape du cycle. Seule la forme CE extracellulaire est capable d'infecter une cellule saine. En culture cellulaire, c'est la vacuole pleine de CE, appel~e inclusion, qui est raise en ~vidence. Le CE est d~limit~ par deux membranes, une membrane externe for- m~e de LPS comme les bact~ries fl Gram n~gatif et de pro- t~ines dont une est en grande quantitY, appel~e PMME pour prot~ine majeure de membrane externe ou MOMP pour les Anglo-Saxons, et une membrane cytoplasmique. Cette PMME est le support des antig~nes d~finissant les 18 s~ro- vars connus chez C. trachomatis. LPS et PMME sont les antig~nes mis en ~vidence par les tests immunoenzyma- tiques ou par immunofluorescence. A l'int~rieur de la mem- brane cytoplasmique, I'ADN bact~rien est libre, constitu~ d'un ADN chromosomique de 1045 kb (l'un des plus petits g~nomes de procaryotes) et d'un ADN plasmidique de 7,5 kb present en 7 fl 10 copies, tous deux servant de cible dans les techniques d'hybridation.

2. Les pr~l~vements

C. trachomatis est responsable suivant le s~rovar de tra- chome, d'infections oculog~nitales et de lymphogranuloma-

tose v~n~rienne (LGV). Quelle que soit l'infection et quel que soit le type de technique de d~tection utilis~, il est indispen- sable de recueillir des cellules soit par grattage des muqueuses soit naturellement dans les urines. Chez la femme, C. trachomatis est responsable de cervi- cites, d'endom~trites, voire de salpingites. II s'agira donc le plus souvent d'~couvillonnages de l'endocol mais ~galement de biopsies de l'endom~tre ou des trompes et de liquide recueilli dans le cul de sac de Douglas. Pr~l~vements urn- traux et urines, qui semblent donner de bons r~sultats avec certaines techniques, sont encore & ~valuer. Chez l 'homme, C. trachomatis est responsable d'ur~trites et le pr~l~vement recommand~ est un ~couvillonnage de l'ur~tre bien que de plus en plus l'urine du premier jet semble pouvoir le remplacer. Pour les deux sexes, en cas de conjonctivite, un pr~l~vement obtenu par grattage des conjonctivites inf~rieures ou sup~rieures sera n~cessaire. Chez, le nouveau-n~, C. trachomatis est responsable de conjonctivites mais ~galement de pneumopathies tardives. Dans ce dernier cas, le pr~l~vement consistera en un pr~l~- vement pharyng~ ou une aspiration endotrach~ale. Dans le cas de la LGV, le chancre indolore est souvent m~connu et la maladie se pr~sente souvent au stade de l'ad~nite inguinale volontiers suppur~e. Le pr~l~vement consister~i en une ponction du ganglion. Les milieux de transport et les conditions de transport du pr~l~vement sont adapt~s fl la technique de d~tection utili- s~e. Seule la culture exige des conditions strictes de trans- port, d~lai et temperature, de mani~re fl ne pas affecter la viabilit~ de la bact~rie.

2. M~thodes de d~tection classiques

Ces m~thodes servent de r~f~rence pour l'appr~ciation des techniques de biologie mol~culaire et seront bri~vement rap- pel~es ici.

1. La culture cellulaire ~

Des facteurs affectant le r~sultat de la culture cellulaire peu- vent @tre individualis~s & plusieurs ~tapes : le pr~l~vement (qualit~ de l'~couvillon, du milieu de transport, conditions du transport du pr~l~vement et de sa conservation), les modali- t~s d'utilisation de la culture cellulaire (choix de la lign~e, preparation des cellules, quantit~ de pr~l~vement ense- menc~, vitesse et temperature de centrifugation) et la r~v~la- tion des inclusions. La culture cellulaire reste la m~thode de r~f~rence avec une sp~cificit~ de 100 % mais u n e sensibilit~ extr~mement variable d'un laboratoire fl l'autre en raison de l'impossibilit~ de standardiser toutes ces ~tapes. Elle est dans les meilleurs cas de 80 fl 90 % mais elle peut descendre fl 50 %. II faut noter ~galement que certains pr~l~vements se r~v~lent inad~quats pour la culture comme les spermes et les urines

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et souvent les liquides p6riton6aux. Toutes ces raisons expli- quent la n6cessit6 de d6finir un nouveau "gold standard", Iors de l'4valuation d'un nouveau test, comprenant la culture et un autre test capable de r6soudre les r6sultats discordants, ce que les Anglo-Saxons appellent un "expansed gold stan- dard".

2. Tests de d~tection des antig~nes

Parmi les tests de d~tection des antig~nes, on distingue le test direct sur frottis et les tests ELISA et apparent6s (10). La sp4cificit6 de ces tests d~pend de la nature monoclonale ou polyclonale des anticorps utilis6s et des antig6nes vers lesquels ils sont dirig6s, PMME (sp6cificit6 d'esp~ce) e t /ou LPS (sp6cificit6 de genre). Dans le test direct, les anticorps fluorescents r6v61ent des CE extracellulaires, exceptionnellement des inclusions, sur un tapis de cellules 6pith61iales, t6moin de la qualit6 du pr61&ve- ment. L'inconv6nient majeur est la subjectivit6 de la lecture. La sensibilit6 du test d6pendra du seuil retenu, 10, 5 ou 1 CE par frottis et de l 'exp6rience de l 'examinateur. II est souvent utilis6 c o m m e m6thode d'analyse des discordances entre une m6thode ~ ~valuer et la culture cellulaire. Le frottis est effectu6 & partir du culot de centrifugation du pr616ve- ment pour la culture, avec les al6as li6s ~ la centrifugation. A la diff6rence du test direct, l 'automatisation de la lecture de la plupart des tests ELISA et apparent6s permet un r6sul- tat objectifo Les inconv6nients majeurs de ces tests sont leur manque de sensibilit6 et parfois leur manque de sp6cificit~. Un test de confirmation devrait ~tre syst6matiquement prati- qu6. Les tests sur membrane ont l 'avantage d'@tre simple d'utilisation et rapide (30 min), mais ils sont r6serv6s aux pr616vements endocervicaux.

3. Les tests de d~tection des acides nucl~iques

Les premi6res techniques de biologie mol6culaire appliqu6es la d6tection de C. trachomatis ont 6t6 les techniques

d'hybridation mol6culaire, puis les techniques d'amplifica- tion se sont d6velopp4es. Ces derni~res, extr~mement sen- sibles, pallient aux insuffisances de la culture en cas de mau- vais transport, d'antibioth6rapie intercurrente, ou encore de pr616vements cytotoxiques. Les 6chantillons pr61ev4s en milieu de transport sp6cifique n 'exigent pas de conditions particuli&res de transport et peuvent ~tre conserv6s

+ 4 °C, pendant moins d 'une semaine. Pour un d61ai sup6- rieur, ils doivent 6tre maintenus & - 20 °C. Les caract6ris- tiques des diff6rentes techniques d6crites sont rassembl~es dans le tableau I.

1. Technique d'hybridation mol~culaire

Un syst~me commercialis6 par Gen-Probe (San-Diego, CA, USA) utilise le principe de l 'hybridation en milieu liquide pour le diagnostic direct de C. trachomatis. II s'agit de la sonde Pace 2, Direct Probe Assay. La sonde est compl6- mentaire des ARNr, cible naturellement amplifi6e dans la bact6rie et elle est marqu6e par un ester d'acridinium. La r4alisation du test Pace 2 se d6roule en quatre 6tapes : 1. pr6paration de l'6chantillon : l'4chantillon est directement utilisable dans le milieu de transport fourni dans le kit ; 2. hybridation de la cible pr6sente dans l'6chantillon en pr6- sence de la sonde : la r6action se d6roule dans des tubes sp6- ciaux d6pos6s dans des portoirs adapt6s pendant 1 h 60 °C ; 3. s6paration des hybrides form6s apr6s avoir ajout6 une solution de s6paration (incubation 10 min ~ 60 °C), & l'aide d 'un portoir magn6tique (5 rain). Echantillon et sondes libres, sont 61imin6s par re tournement du portoir et lavage (20 min); 4. d6tection de la chimioluminescence dans un luminom6tre tube par tube. Le temps total de la r6action est d 'environ 2 h. Le mat6riel n6cessaire est le luminom6tre.

La sensibilit6 de la sonde Pace 2 varie de 60 h 95 % selon les auteurs et la m6thode de r6f6rence, culture ou PCR (1). Ce test n ' appor te par un gain de sensibilit6 par rapport & la culture. Sa sensibilit6 est de l 'ordre de celle des tests immu- noenzymatiques. De r6centes modifications vont permettre d 'en augmenter la sensibilit~ et la sp6cificit6. Elles concer- nent le kit de pr616vement, la qualit6 du luminom~tre et la raise en place d 'un test de confirmation (PCA ou probe com- petition assay), bas6 sur le principe de blocage des r6actions positives sp6cifiques par comp6tition avec une sonde homo- Iogue de C. trachomatis non marqu6e.

La soci6t6 Gen-Probe d4veloppe & l 'heure actuelle un nou- veau proc6d6 de d6tection de C. trachomatis, d6j& utilis4 pour les mycobact6ries, la TMA pour transcription-mediated amplification (5). II s'agit d 'un syst6me isotherme qui utilise une amplification enzymatique et une d6tection par chimio- lunescence dans un seul tube. La cible est 6galement I'ARNr. Le temps total est de 2 h 30. Les r6sultats pr41iminaires montrent une excellente corr61ation avec la culture.

TABLEAU ! Comparaison des caract~ristiques des techniques de biologie mol~culaire d~crites

Principe

N6cessit6 d'un amplificateur

Nbre de sondes ou amorces n6cessaires

Nbre d'enzymes n6cessaires

Mat4riel de lecture

Temps de r6action

R6v61ation automatique

Sensibilit6 & la contamination

Protection vis-&-vis de la contamination

hybridation

n o n

I

0

luminom6tre

2h

oui

n o n

n o n

amplification

oui

2

1

~lectrophor6se transfert

four & hybridation

24-48 h

n o n

oui

suivant les auteurs

amplification

oui

2

I

photocolorim&tre

4-5 h

n o n

oui

UNG

amplification

oui

4

2

LCx

3h

oui

oui

circuit ferm~

Pr~l~vements autoris6s E, Ur, Cj E, Ur, Cj E, Ur E, Ur, urines Met F urines M urines M et F

autres

E : endocol ; Ur : ur&tre m a s c u l i n ; Cj : conjonctive ; urines M : masculines, F : f~minines

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2. Technique d'amplification par PCR

Parmi les methodes d'amplification, la plus ~tudi&e et la plus largement utilis&e est la polymerase chain reaction ou PCR dont le principe consiste ~ hybrider I'ADN cible denature deux amorces oligonucleotidiques qui permettent la copie de chaque brin d'ADN en presence de d&soxyribonucl&otides et d'une ADN polym~rase. Les brins neosynthetis&s servant eux-m&mes de matrices pour initier l'etape de polymerisa- tion du cycle suivant, la repetition des trois Crapes (denatura- tion, hybridation, extension) aboutit ~ une amplification de la sequence cible. De ires nombreuses ~quipes ont mis au point des syst&mes de PCR. Cependant, l'interpretation d'un resultat de PCR exige la standardisation de nombreuses etapes comme la pr@aration de l'&chantillon, les para- metres d'amplification, le choix des oligonucleotides amorces dont vont d&pendre la sensibilite et la specificite de la reaction, l'analyse et le contr61e des produits d'amplifica- tion.

2.1. PCR convent ionnel le a) Preparation de l'~chantillon

La pr@aration de l'echantillon peut aller du simple chauf- fage & 95 °C & la lyse par un detergent, en presence de pro- teinase K et & la purification de I'ADN par extraction par des methodes plus ou moins Iongues dont la plus connue est l'extraction au ph&nolchloroforme et la precipitation &thano- lique. La Iourdeur de la technique limite le n0mbre d'&chan- tillons & analyser.

b) Param#tres d'amplification

II s'agit essentiellement de la composition du melange reac- tionnel et des cycles d'amplification. Dans le melange reac- tionnel, la qualite de la Taq DNA polymerase, la concentra- tion en ions Mg++ sont des param&tres non n&gligeables. D'autre part, la dur&e des cycles, en particulier celui de l'elongation et la temperature d'hybridation des amorces leur cible, sont des facteurs qui influencent la specificit&. La temperature d'hybridation doit tenir compte de la tempe- rature de dissociation des amorces donc de leur composition en bases.

c) Choix des oligonucl#otides

Pour C. trachomatis, les genes les plus utilises comme cible d'amplification sont ceux qui codent pour les ARNr, le g&ne ompl qui code pour la PMME et les sequences du plasmide cryptique. L'avantage des genes de ARNr et du plasmide est qu'ils sont presents en multicopie d'oO une augmentation de la sensibilite. Les inconvenients sont dans le cas du plasmide

un defaut possible de la technique par perte ou absence du plasmide, et dans le cas des genes des ARNr, un manque &ventuel de specificite. L'avantage d'un gene unique sp&ci- fique est d'assurer une parfaite specificite du systeme.

d) Analyse et contr61e des produits d'amplification

La methode traditionnelle d'analyse des echantillons de PCR est la methode d'electrophorese en gel d'agarose ou d'acry- lamide qui permet de visualiser le produit amplifie et d'apprecier sa taille. La specificit& du produit amplifi& est contr61&e par raise en evidence de sites de restriction atten- dus et /ou hybridation avec une sonde interne apr~s transfert du gel sur une membrane. Les &tapes d'electrophor~se, d'hydrolyse de restriction, d'hybridation par Southern-blot sont Iongues et delicates, d'autant plus que la sonde est le plus souvent marquee au 32p.

II est difficile de comparer les r&sultats d'&tudes publiees n'utilisant pas les m~mes reactifs ni les m&mes protocoles. Dans une etude de comparaison des resultats de PCR sur les m&mes echantillons, avec des reactifs et des protocoles stan- dardis&s et en utilisant un deuxieme couple d'amorces pour contr61er les resultats positifs, les resultats sont en concor- dance dans 96,6 %, objectivant une bonne reproductibilite de la technique (8).

2.2. Amplicor C. trachomatis Roche Molecular Systems, RMS Le seul syst&me d'amplification actuellement commercialise est celui de RMS, Amplicor C. trachomatis. Le principe de la technique est celui de la PCR, suivi d'une revelation colo- rometrique apr&s hybridation (schema 1). Ce test presente deux particularites :

- la premiere est son syst&me de revelation des amplifiats qui associe la. sensibilite et la specificite de l'hybridation & la facilite de lecture d'une reaction enzymatique color&e. Les amorces choisies dans le plasmide cryptique sont biotiny- lees. Le produit d'amplification biotinyle est hybride & une sonde interne fixee sur le puits d'une microplaque. La reac- tion coloree fait intervenir une enzyme, l'avidine-peroxydase et son substrat. Le resultat est interprete en fonction d'une lecture de densite optique ;

- la deuxi&me est son systeme de protection vis-&-vis des contaminations qui est celui de l'uracile-N-glycosylase (UNG) ou AmpErase. Au cours de la reaction d'amplification, des dUTP sont incorpores & la place des dTTP. Les amplifiats contaminants contenant de l'uracile sont detruits par l'AmpErase rajout&e en debut de reaction alors que la matrice contenant des residus thymine reste intacte.

SCHEMA 1

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La r&alisation du test Amplicor C. trachomatis se fait en quatre &tapes : 1. pr&paration de l'&chantillon. Elle consiste ~ rajouter un tampon de dilution pr&t ~ l'emploi au milieu de transport dont l'&couvillon a &t& retir& et de laisser incuber 15 min temperature ambiante. Les urines sont centrifug&es 2 500 g, le culot est repris successivement par deux tam- pons, l'un incub& 1 h, l'autre 15 rain ; 2. amplification dans un amplificateur Cetus 9600, apr&s r@artition du m~lange r&actionnel, puis des &chantillons dans les tubes (1 h 30) ; 3. hybridation (1 h) des amplifiats biotinyl&s, d&natur&s, avec une sonde sp~cifique fix&e sur les puits d'une microplaque. Le transfert des amplifiats des tubes d'amplification ~ la plaque de d~tection est manuel ; 4. d&tection par addition du couple avidine-peroxydase et du substrat (30 min). Des lavages assurent l'&limination des r&actifs. La lecture de la densit& optique est effectu&e dans un photocolorim&tre.

Ce test est adapt& a la recherche d'acides nucl&iques dans les pr&l&vements endocervicaux et ur&traux et dans les &chan- tillons de premier jet d'urines masculines. La d&tection dans les pr&l&vements conjonctivaux n'est pas clairement valid&e. Le milieu de transport 2SP (saccharose-phosphate), g&n&ra- lement utilis& pour la culture, semble tout ~ fait adapt& ~ la recherche de C. trachomatis par la technique Amplicor (12). A partir du m&me pr&l&vement, il est donc possible de rechercher C. trachomatis par culture et PCR. Cette possi- bilit& offre les avantages d'&viter les discordances dues l'&couvillonnage Iors des &valuations et d'ouvrir le champ d'investigation de cette technique a tous les pr&l&vements effectu&s en milieu 2SP.

SCHEMA 2 Gap-LCR

2 couples , , m de sondes m

c c Hybridation des sondes avec I'ADN apr~s refroidissement

CC

Espace combl& par les dNTPs + polym&rase

cc 1 I I O o ~ l l

~ o o l ] cc ]

La ligase r e l i e

les sondes adjacentes

cc ] I GG

GG ] CC ]

SCHEMA 3 D~tection/lecture des amplifiats LCR

uP

Le risque de contamination post-PCR est limit& par l'emploi du syst&me de I'UNG. Cependant l'utilisation de trois zones s&par&es, une pour la pr&paration des &chantillons, une pour la pr&paration du tampon d'amplification, une pour la d&tec- tion, est recommand&e. La partie d&tection exige des lavages soigneux et le respect des temps d'incubation. Dans un futur proche, ces inconv&nients seront lev&s par l'utilisa- tion d'un automate (Cobas) capable de r&aliser amplification et r&v&lation.

En termes de sp&cificit&, des valeurs sup&rieures ~ 98 % sont d&crites. D'apr&s la litt&rature et notre propre exp&rience (2), le test Amplicor est plus sensible que la culture. Cependant, un petit nombre de pr&l&vements positifs en cul- ture sont n&gatifs en Amplicor. Ceci est sans doute dfi ~ la prTsence dans certains pr&l&vements d'inhibiteurs de la Taq DNA polym&rase.

II serait n&cessaire de pallier 8 cet inconv&nient par la raise au point d'un contrTle interne capable de distinguer un n~gatif par d&faut de cible d'un faux n&gatif par pr&sence d'un inhibiteur de polymerase.

Le test Amplicor pr&sente l'int&r~t majeur de d&tecter C. tra- chomatis dans les urines masculines (4) aussi bien que dans le pr&l&vement ur&tral, en particulier chez les sujets asympto- matiques (7).

3. Technique d 'ampl i f ica t ion par L C R Les laboratoires Abbott ont d&velopp& un syst&me de d&tection de C. trachomatis, bas& sur le principe de la LCR ou ligase chain reaction. Cette technique est encore en &valuation.

La LCR met en oeuvre deux couples de sondes sp&cifiques et compl&mentaires de la s&quence nucl&ique & rechercber, deux enzymes thermo-r&sistantes, une po/ym&rase et une ligase. Les sondes sont choisies de telle sorte qu'une fois fix&es sur leur s&quence cible, elles soient s~par&es par une trois bases. Cet espace (gap) pourra ensuite &tre combl& par des nucl&otides triphosphates & l'aide d'une ADN polym&- rase. La ligase soude les deux sondes et le produit de ligation ou amplicon aura alors une longueur de 40 & 60 nucl&otides (schema 2). Le syst&me fonctionne selon une alternance cyclique de temp&ratures & savoir une temp&rature de 94 °C pour d&naturer I'ADN cible, puis une temp&rature de 55 °C pour l'hybridation et de 62 °C pour la polym&risation-liga- tion. La LCR, comme la PCR, n&cessite un thermocycler pour g&n&rer les amplicons. Cette m~thode se diff&rencie cependant de la PCR sur plusieurs points :

- une ligase thermor&sistante est utitis&e en plus de I'ADN polym&rase,

- la LCR n&cessite 4 oligonucl&otides par cible, la PCR en utilise 2,

- l'analyse des amplicons met en oeuvre un syst&me d'immu- nocapture (schema 3). Deux hapt&nes diff&rents sont utili s&s. Celui fix& & l'extr&mit& 5' de la premi&re sonde permet l'immunocapture. Le deuxi&me est fix& & l'extr&mit& 3' de la seconde sonde. Les amplicons portent donc les deux types d'hapt&nes, un & chaque extr~mit&. Apr&s lavage, les ampli- cons captur&s fixeront le conjugu& marqu& & la phosphatase alcaline catalysant l'hydrolyse de la 4-methylombelliferyl phosphate en 4-methylombelliferone. Techniquement, le test LCR se d&roule en trois &tapes : 1. pr&paration des &chantillons qui consiste en un simple chauffage de 15 rain & 95 °C pour les &couvillons dans leur milieu de transport, et pour les urines en une centrifugation de 10 min ~ 13 000 g, reprise du culot en tampon de resus- pension et chauffage 15 rain ~ 95 °C ; 2. amplification apr&s r&partition des &chantillons dans des tubes unitaires pr~ts ~ l'emploi, contenant tousles r&actifs n&cessaires (2 h) ; 3. d&tection automatis&e dans un IMx modifi&, LCx, capable de pr&lever des aliquots d'amplifiats directement dans les tubes (30 rain).

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Les avantages du test LCR sont nombreux. La partie d&tec- tion est enti~rement automatis&e, elle a lieu en circuit fermi, emp@chant tout risque de contamination et elle est plus rapide que celle de la PCR (30 min versus 1 h 30). Concernant les pr&l~vements autoris&s, en plus des ur~traux et endocervicaux, ce test donne des r&sultats int~ressants non seulement sur les urines masculines mais &galement sur les urines f~minines. Comme pour la PCR, l'exigence d'un contr61e interne s'impose. Les premieres ~valuations am~ricaines montrent une sensi- bilit~ de la technique de 94 % versus 65 % pour la culture sur 2 132 pr~l~vements d'endocol (9) au cours d'une ~tude multicentrique et une sensibilit~ de 96 % dans les urines f~minines et masculines (6). Dans l'~valuation frangaise que nous avons effectu~e & Bordeaux (3), la comparaison des trois m~thodes, LCR (Abbott), PCR (Roche) et culture sur des pr~l~vements urog~nitaux f~minins et masculins, montre des performances identiques entre LCR et PCR, avec une sensibilit~ meilleure que celle de la culture (100 % versus 85 % pour la culture) et une sp~cificit~ de 99,6 %.

4. Validation des m~thodes d'amplification g~nique Qu'elles soient manuelles ou automatis6es, les m~thodes d'amplification doivent @tre 6valu6es par rapport aux autres m6thodes. Le probl~me se pose de l'interpr~tation des r~sul- tats discordants avec la m6thode de r6f6rence. Si la m6thode de r~f6rence est la culture, sa sp6cificit~ 6tant par d6finition de 100 %, tout r6sultat d'amplification n6gatif pour un ~chantillon culture positive sera consider6 comme faux n6gatif. Or, il est connu que la PCR et probablement la LCR sont sensibles aux inhibiteurs des enzymes de la r6action (polym6rase ou ligase). L'existence de ces faux n6gatifs (FN), qui n'est pas li6e & un d~faut de sensibilit6, implique soit de faire syst6matiquement une autre technique en parall~le, soit d'analyser les 6chantillons en double, purs et dilu6s ou apr~s cong61ation, car il semble que ces deux facteurs, dilution et cong61ation, inactivent les inhibiteurs, soit d'utiliser un contr61e interne qui reste & d6finir. Cette derni~re solution est certainement la meilleure et la moins on6reuse. La pr6sence de FN, dans notre ~tude LCR versus PCR et culture, en premiere analyse a ~t~ constat~e. Trois ~chan- tillons n6gatifs par PCR et un par LCR se sont positives apr~s dilution ou apr~s d6cong~lation. De m~me, SCHACHTER (9) a montr6 que sur 13 FN par LCR, 7 se sont positiv6s au deuxi~me essai et 1 apr~s dilution. Pour les cinq autres, il peut s'agir de probl~mes li6s aux variations d'6couvillonnage. Du fait de l'extr@me sensibilit6 de la technique, un r~sultat positif non confirm6 par la m6thode de r6f6rence est fr6- quent. La plupart des 6valuations montrent qu'il ne s'agit pas, le plus souvent, de faux positifs (FP). La confirmation est apport~e g~n6ralement par l'utilisation d'oligonucl~o- tides choisis dans un autre g&ne, en l'occurence le g~ne de la PMME dans une deuxi~me r~action de PCR ou de LCR. Dans notre 6tude, nous avons conclu ~ un FP de PCR et un FP de LCR sur pros de 500 ~chantillons. Dans celle de SCHACHTER, deux FP de LCR, seulement, sur 2 132 6chantillons ont 6t6 retenus. Le risque d'erreur, dans les deux sens, FN ou FP, existe donc mais il reste tr~s faible et certainement inf6rieur toutes les autres techniques disponibles.

Conclusion et perspectives

Les techniques d'amplification, LCR et PCR, apportent un b~n~fice certain au diagnostic des infections ~ C. t rachoma- tis. Cependant, leur extreme sensibilit~ exige un syst~me de prevention des contaminations possibles pr~ ou post-amplifi- cation, et un contr61e interne d'absence d'inhibiteurs des enzymes de la r~action, de mani~re ~ ~viter les faux positifs et les faux n~gatifs.

La PCR conventionnelle est Iongue et fastidieuse et ne peut se concevoir que dans un laboratoire exp~riment~. Elle a l'avantage d'etre moins on,reuse que les techniques com- mercialis~es. Ces derni~res ouvrent le champ d'action de ces techniques sophistiqu~es au plus grand nombre. Seule une automatisation compl~te des deux ~tapes, amplification et d~tection, sans intervention humaine entre les deux, sera le garant des r~sultats. D'autres perspectives apparaissent. La soci~t~ Gene-Track (11) met au point un syst~me d'amplification isotherme en presence d'une enzyme, la QI~ replicase, qui pr~senterait l'avantage de n'@tre pas sensible aux inhibiteurs de la Taq polymerase et d'etre quantitative.

B I B L I O G R A P H I E

1. ALTWEGG M., BURGER D., LAUPER U., SHAR G. - Comparison of Gen-Probe Pace-2, Amplicor Roche, and a conven- tional PCR for the detection of Chlamydia trachomatis in genital spe- cimens. Med. Microbiol. Lett., 1994, 3 : 181-187.

2. B A R B E Y R A C de B., PELLET I., DUTILH B., BEBEAR C., DUMON B., GENIAUX M., BEBEAR Ch. - Evaluation of the Amplicor Chlamydia trachomatis test versus culture in genital samples in various prevalence populations. Genitourin. Med., 1994, 70 : 162-166.

3. B A R B E Y R A C de B., RODRIGUEZ P., DUTILH B., FERNAN- DEZ M.P., BEBEAR C. - D~tection de C. trachomatis chez l 'homme et la femme, au cours d'infections g~nitales, par culture cellulaire, PCR et LCR. 11 e colloque CORATA, Grenoble, Octobre 1994.

4. BIANCHI A., SCIEUX C., B R U N A T N., VEXIAU D., KERMA- N A C H M., PEZIN P., JANIER M., MOREL P., LAGRANGE Ph. - An evqluation of the polymerase chain reaction Amplicor Chlamydia trachomatis in male urine and female urogenital speci- mens. Sex. Transm. Dis., 1994, 21 : 196-200.

5. BURNS J., CARLSON J., ELSNER D., L A W L O R R., M c C A R T H Y A., SMITH T., WHITMIRE R., YAGASAKI IV[., BOTT M. - Detection of C. trachornatis in urogenital swab speci- mens using transcription-mediated amplification (TMA). Abstract of the 34th ICAAC, Orlando, Octobre 1994.

6. C H E R N E S K Y M.A., JANG D., LEE H., BURCZAK J.D., HU H., SELLORS J., TOMAZIC-ALLEN S.J., M A H O N Y J,B. - Diagnosis of C. trachomatis infections in men and women by tes- ting first-void urine by ligase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 1994, 3 2 : 2682-2685.

7. DOMEIKA M., BASSIRI M., MARDH P.A. - Diagnosis of geni- tal C. trachomatis in asymptomatic males by testing urine by PCR. J. Clin. Microbiol., 1994, 3 2 : 2350-2352.

8. M A H O N Y J.B., LUINSTRA K.E., WANER J., MCNAB G., HOBRANZSKA H., GREGSON D., SELLORS J. W. - Interlabo- ratory agreement study of a double set of PCR plasmid primers for detection of Chlamydia trachomatis in a variety of genitouri- nary specimens. J. Clin. Microbiol., 1994, 3 2 : 87-91.

9. SCHACHTER J., STAMM W.E., QUINN T.C., A N D R E W S W.W., BURCZAK J.D., LEE H.H. - Ligase chain reaction to detect Chlamydia trachomatis infection of the cervix. J. Clin. Microbiol., 1994, 3 2 : 2540-25~ .

10. SCIEUX C., EB F., B A R B E Y R A C de B., BUFFET-JAN- VRESSE C., CASIN I., DEWILDE A., L A Y A N I M.P., LE FAOU A., LEFEBVRE J.C., ORFILA J., S A N S O N LE PORS M.J., THOUVENOT D., BEBEAR C. - D e s c r i p t i o n des tests rapides applicables au diagnostic direct des infections uro-g~nitales Chlamydia trachomatis commercialis~s en France en 1994. Rev. Fr. Lab., 1994, 2 7 1 : 63-70.

11. S H A H J.S., LIU J., SMITH J., POPOFF S., RADCLIFFE G., O'BRIEN W., SERPE G., OLIVE D.M., KING W. - Novel, ultra- sensitive, Q-beta replicase-amplified hybridization assay for detec- tion of Chlamydia trachomatis. J. Clin. Microbiol., 1994, 3 2 : 2718-2724.

12. WRAFORD A.L., MATHIE S., MARGESSON H., D'SOUZA H. - Comparison of culture and polymerase chain reaction for detection of Chlamydia trachomatis from swabs transported in iris and sucrose phosphate buffers. - Abstract of the 94th general Meeting of ASM, Las Vegas, May 1994.

210 Revue franqaise des laboratoires, avril/rnai 1995, N ° 275