Biološka kontrola Biološka kontrola lekovalekova

Biološki testoviBiološki testoviprof.dr Mira Zečevićprof.dr Mira Zečević

Sterilnost• Primenjuje se na stupstance za koje

farmakopeje traže da budu sterilni• Ispitivani uzork ne sme da sadrži

kontaminirajući mikroorganizam pod uslovima testa

• Prenošenje rezultata testa na celu proizvedenu seriju zahteva dokaz da je proizvod proizveden u homogenim uslovima

• Potrebni fizički dokazi zasnovani na biološkim principima i automatski dokumentovani koji pokazuju korektan tretman cele proizvedene serije tokom sterilizacije i izrade u aseptičnim uslovima, (Imaju veću vrednost od testa sterilnosti).

• Test sterilnosti je jedini analitički metod koji postoji za ispitivanje kvaliteta proizvoda pripremljenih u aseptičnim uslovima

Mere predostrožnosti kontaminaciom

mikroorganizmima (MO)• Test sterilnosti se izvodi u aspetičnim

uslovima, npr. u komori sa laminarnim protokom vazduha

• Aseptični uslovi ne ometaju otkrivanje MO testom u proizvodu koji se ispituje

• Radni uslovi u kojima se test izvodi redovno se prate uzimanjem uzorka vazduha i sa radnih površina, kao i izvođenjem kontrolnih testova sa preparatima za koje se zna da su sterilni

Izbor hranljivih podloga• Biraju se u zavisnosti da li se rade

ispitivanja aerobnih i anaerobnih bakterija ili gljivica

• Podloga mora biti sterilna i da ima hranljiva svojstva za datu vrstu MO

Ispitivanje podloga• Sterilnost: Inkubiraju se podloge

za izolaciju bakterija na 30- 50°C, a za izolaciju gljivica na 20- 25°C najmanje 7 dana

• Rezultat: Ne treba da bude bilo kakvog rasta MO

• Hranljiva svojstva: inokuliše se izabrana hranljiva podloga sa otprilike 100 živih MO i inkubira na pomenutim temepraturama ne više od 7 dana.

• Rezultat: Podloge odgovaraju ukoliko dođe do ranog i obilnog porasta MO

Ispituju se na prisustvo: • Staphylococcus aureus (Aerobne)• Bacillus subtilis• Clostridium sporogenes

(Anaerobne)• Candida albicans

Efikasnost hranljivih podloga, ispitivanje proizvoda na

sterilnost

• Ispituju se: a) u prisustvu i odsustvu ispitivanog

proizvoda za bakterijsku sterilnost i

b) na isti način posebno za test sterilnosti na gljivice

a) za bakterijsku sterilnost:• 4 epruvete za svaku podlogu koja će se

koristiti u testu• U svaku se dodaje ispitivani proizvod• Inokuliše se polovina epruveta sa 0,1 ml

suspenzije odgovarajućeg soja aerobnog MO razblažene da sadrži oko 1000 živih MO po ml (odnosno inokulacija oko 100 MO) i na isti način inokuliše ostatak epruveta sa sporama odgovarajućrg soja anaerobnih MO

• Za antibiotike se biraju sojevi osetljivi na antibiotik

• Pripremi se isti komplet epruveta bez proizvoda koji se ispituje i inokuliše na isti način

• Inkubiraju se sve epruvete na 30-35°C ne više od 7 dana

b) Za sterilnost na gljivice

• Pripreme se najmanje dve epruvete sa podlogom koja se koristi u testu sterilnosti za izolaciju gljivica i u svaku doda ispitivani proizvod

• Inokulišu se epruvete sa 0,1 ml suspenzije odgovarajućeg soja Candide albicans razblažene da sadrži oko 1000 živih MO po ml (odnosno inokulacija oko 100 MO).

•

• na isti način pripreme se dve epruvete bez proizvoda, inokulišu na isti način.

• Inkubiraju se sve epruvete na 20-25°C ne više od 7 dana

• podloge namenjene u isto vreme za ispitivanje i gljivica i bakterija se ispituju na obe vrste MO

Tumačenje rezultata: • Ukoliko je tokom inkubacije, porast

MO u prisustvu i odsustvu proizvoda koji se ispituje sličan, proizvod nema antimikrobnu aktivnost i test na sterilnost se može izvesti bez modifikacije

• Ukoliko kulture koje sadrže proizvod koji se ispituje na sterilnost pokažu slabiji rast, odložen porast ili uopšte ne pokažu rast MO, kada se uporede sa kulturama koje ne sadrže ispitivani proizvod, PROIZVOD poseduje antimikrobnu aktivnost koja se mora otkloniti filtriranjem, razblaživanjem u podlozi ili neutralizacijom nekom supstncom pre ili tokom testa na sterilnost.

• Test se ponavlja i odredi se efikasnost ove eliminacije

Test sterilnosti• Dva načina izvođenja:

• a) Membranska filtracija (preporučljiva uvek kada priroda proizvoda to dozvoljava-vodeni, alkoholni uljani preparati)

• b) Direktna inokulacija hranljive podloge proizvodom koji se ispituje

Membranska filtracija

• koriste se menbranski filtri veličine pora do 45µm.

• celulozni nitratni filtri za vodene, uljane i razb. alkoholne rastvore i

• celulozni acetatni filtri za konc. alkoholne rastvore

• Aparat i membrana se sterilišu pomoću odgovarajućeg sredstva a napravljeni su tako da se rastvor koji se ispituje može uneti i filtrirati u aseptičnim uslovima

• U farmakopejama su date tačne količine proizvoda koji se ispituje na sterilnost a prema vrsti preparata.

Direktna inokulacija hranljive podloge

• Prenese se preporučena količina ispitivanog preparata direktno u hranljivu podlogu tako da odnos proizvod prema podlozi bude 1:10 za tečnosti i 1:100 za čvrste materije

• Posebno je propisan način ispitivanja za uljane tečnosti, masti kreme

• Podloge se inkubiraju najmanje 14 dana na propisanim temperaturama za bakterije i gljivice

• Kulture se posmatraju nekoliko puta u toku perioda inkubacije i svaki dan blago promešaju ako nisu potrebni anaerobni uslovi (podloga tioglikolat)

• Ukoliko nema dokaza u rastu proizvod je u skladu sa zahtevima sterilnosti

• Ukoliko postoji rast MO proizvod ne odgovara testu za sterilnost, pod uslovom da rezultat nije proizašao iz kontaminacije tokom izvođenja testa

Tumačeneje rezultata

Provera• Prvi ponovljeni test: Sprovodi se na

isti način kao prvi i ukoliko dođe do rasta MO, kontaminati uporede sa prvim testom. Ako kontaminati ne mogu odmah da se razlikuju, proizvod koji se ispituje nije u skladu sa zahtevima testa sterilnosti, a ako se kont. odmah diferenciraju može se uraditi drugi ponovljeni test.

• Drugi ponovljeni test: Upotrebi se dvostruko veći broj uzoraka od onog koji je testiran u prvobitnom testu na sterilnost

• Ukoliko nema dokaza o rastu MO, proizvod koji se ispituje je u skladu sa zahtevima testa na sterilnost

• Ukoliko dođe do rasta MO proizvod ne odgovara zahtevima za sterilnost preparata

Ispitivanja preparata• Farmakopeja posebno propisuje

primenu testa sterilnosti na preparate za parenteralnu upotrebu, oftalmološke i druge preparate neinjekcione preparate, hirurške zavoje.

• Propisan je minimalan broj uzoraka koji se preporučuje za testiranje a u vezi sa brojem pakovanja u seriji, da bi se dobio odgovarajući stepen pouzdanosti rezultata

• Uslov je isključena kontaminaciju prilikom proizvodnje i rukovanja

• Serija: homogena kolekcija zapečaćenih sudova pripremljenih na takav način da je rizik od kontaminacije isti za sve jedinice koje se u njoj nalaze

Preporučene hranljive podloge

• tečni tioglikolat - anaerobne bakterije, otkriva i aerobne bakterije

• hidrolizat kazeina i hidrolizovanog soinog zrna - za aerobne bakterije i gljivice

• Ove podloge su složenog sastava koji se navodi u farmakopejama i način njihove pripreme

Mikrobiološka čistoća preparata za koje se ne zahteva da budu

sterilni -ukupan broj živih aerobnih MO

• Odredi se ukupan broj živih aerobnih MO metodom:

• membranske filtracije, • brojanja na ploči ili • serijskih razblaženja

Postupak:• upotrebi se‚10g ili 10ml uzorka tako što

se pomeša nekoliko delova nasumice izabranih iz celog proizvoda, ako je potrebno rastvori, razblaži, suspenduje ili emulguje pomoću odgovarajuće tečnosti (zavisi od vrste proizvoda).

• Eliminišu se prethodno bilo kakva antimikrobna svojstva proizvoda koji se ispituje

Metoda membranske filtracije

• membrane prečnika 50mm, izvodi se u aseptičnim uslovima kao i uklanjanje membrane radi prenošenja u hranljivu podlogu.

• prenese se količina koja odgovara 1g proizvoda na svaki od dva membranska filtra i odmah filtrira.

• Ispere se svaka membrana 3 puta sa po 100ml odgovarajuće tečnosti, npr. puferovan rastvor NaCl ili peptona pH 7.0.

• Filtri se prenesu na odgovarajuće podloge za brojanje bakterija (agar B) i gljivica (agar C) i ploča inkubira 5 dana na preporučenim temperaturama.

• Prebroje se kolonije koje se pojave i izračuna se broj MO po gramu ili ml proizvoda.

Brojanje na ploči• Koriste se Petrijeve šolje 9-10cm u prečniku• U svaku šolju se doda 1ml pripremljenog

uzorka i 15ml otopljene podloge agara B, na temp. do 45°C

• Uzorak se ako je potrebno razblaži da broj kolonija ne bude veći od 300

• Koriste se dve petrijeve šolje, vrši se inkubiranje na 30-35°C 5 dana, ako se pouzdan broj ne pojavi pre

• Prebroje se kolonije i rezulati izračunaju koristeći podatak da je 300 kolonija po ploči

za gljivice:

• Postupak je isti ali se koristi agar C kao podloga, inkubacija vrši na temp. 20-25 °C 5 dana, uz razblaženje uzorka da broj kolonija koji se očekuje ne bude više od 100.

Serijsko razblaženje• Priprema se serija od 12 epruveta od kojih

svaka sadrži 9-10ml podloge A.• Na prethodno opisan način u prve tri

epruvete se napravi razblaženje ispitivanog proizvoda 1:10, u druge tri 1:100, a u treće tri 1:1000.

• U poslednje tri epruvete doda se samo razblaživač i one ne treba da imaju rast MO

• Inkubiraju se epruvete na 30-35 °C 5 dana

• Ukoliko se rezultati ne mogu jasno očitatai uzorak se preseje na tečnu ili čvrstu podlogu, inkubira i očita

• Odredi se broj MO po gramu ili ml proizvoda iz odgovarajuće tabele koja se nalazi u farmakopeji

Interpretacija rezultata• Ukoliko postoji limit u monografiji

treba ga interpretirati na sledeći način:

• 102 MO maksimalni prihvatljiv limit 5x102

• 103 MO maksimalni prihvatljiv limit 5x103 itd...

Mikrobiološka čistoća preparata za koji ne moraju da budu u skladu sa

testom za sterilnost -test na specifične MO

• Enterobakterije, Escherichia coli,Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Clostridija

• Za ove bakterije nije dozvoljeno prisustvo u farmaceutskim preparatima i sirovinama, a ispituju se prema pojedinačnim farmakopejskim propisima za svaku bakteriju

Bakterijski endotoksini• za neke preparate propisuje se

ispitivanje bakterijskih endotoksina pomoću LAL testa (lizat amebocita potkovičastog račića -Limulus polyphemus).

• Kada se uzorak koji sadrži endotoksine doda rastvoru lizata nastaje zamućenje, precipitacija ili

geliranje smeše.

• Ispitivanje se vrši prema graničnim vrednostima i preparat je ispravan ukoliko konc. endotoksina nije veća od granične vrednosti

Mikrobiološko određivanje antibiotika-određivanje

aktivnosti

• Procenjuje se poređenjem inhibicije rasta osetljivih MO pod dejstvom poznatih konc. ispitivanog antibiotika i standardnog rastvora

• Koncentracije standardne supstance se određuju na osnovu internacionalnih standarda (referentnih).

• Aktivnost mora biti u granicama 95-105% za verovatnoću P = 0.95

• A. Metoda difuzije• B. Metoda turbidmetrije

A. Metoda difuzije• Potrebna količina odgovarajuće podloge

se rastopi i zaseje na pogodnoj temperaturi: (npr. 48-50°C za vegetativne oblike), poznatom količinom suspenzije MO osetljivih na antibiotik.

• Pod dejstvom antibiotika potrebno je da se formiraju jasno definisane zone inhibicije

• Podloga se promeša i odmah razlije u Petrijeve šolje da se formira sloj podloge debljine 2-5mm.

• Druga mogućnost je upotreba dvoslojnih podloga kada se zasejava samo jedan sloj-gornji.

• Prema propisu pripreme se standardni i ispitivani rastvori u poznatim konc. pretpostavljajući da su istih aktivnosti

• Rastvori se nanose pomoću sterilnih cilindara od porcelana ili nerđajućeg čelika u rupe isečene u podlozi. U svaku rupu unosi se ista zapremina rastvora.

• Mogu se koristiti i papirnati diskovi od sterilnog apsorbujućeg papira koji se impregniraju rastvorima standardnog preparata ili ispitivanog antibiotika i ređaju na površinu zasejane hranljive podloge

• Za procenu validnosti određivanja koriste se najmanje tri doze standardnog preparata - za procenu linearnosti

• Pripremljeni rastvori se nanose u Petrijeve šolje prema određenom dizajnu

• Vreme inkubacije na propisanoj temperaturi je 18 h.

• Mere se‚ prečnici zona inhibicije sa preciznošću od 0.1mm.

B. metoda turbidimetrije

• Tečna hranljiva podloga se zaseje suspenzijom odgovarajućeg MO osetljivog na ispitivani AB.

• Period inkubacije 4h• Podloga se inokuliše neposredno

pred upotrebu

• Prema propisu pripreme se standardni i ispitivani rastvori u poznatim konc. pretpostavljajući da su istih aktivnosti

• Za procenu linearnosti koriste se najmanje tri doze standardnog preparata

• Stave se jednake zapremine od svakog rastvora u identične test-epruvete i u svaku epruvetu doda ista zapremina inokulisane hranljive podloge (npr. 1ml rastvora i 9ml podloge)

• U isto vreme se pripreme dve kontrolne epruvete koje ne sadrže antibiotik

• Epruvete se rasporede prema određenom dizajnu i prenesu u vodeno kupatilo na određenu temperaturu 3-4h inkubacije.

• Nakon inkubacije rast MO se zaustavlja dodatkom 0.5ml formaldehida R u svaku epruvetu ili pak zagrevanjem

• Meri se zamućenje na tri decimale• Određivanja moraju imati određen broj

ponavljanja radi preciznosti