5
Biomass monitoring by use of a continuous on-line optical sensor A.M. Salgado, R.O.M. Folly, B. Valdman * Departamento de Engenharia Quõ Âmica, Escola de Quõ Âmica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro C.T., B1E SL 211 Brazil Received 15 September 2000; received in revised form 25 November 2000; accepted 5 December 2000 Abstract An optical sensor for on-line biomass monitoring was developed and implemented with a ¯ow-through cell and a continuous sampling line to monitor cell concentrations in solutions of water and diluted molasses. Calibration curves, errors curve, ¯ow rate effects and measurements comparing obtained values using the optical sensor and dry cell weight method were analysed. The calibration curves using cell cultures in tap water and molasses present an exponential pro®le in the range 5±40 g cell l 1 corresponding to 0±250 mV output signal. The output signal for biomass free molasses solutions was used for reference and compensation effects. A simple correlation for molasses compensation was determined and good reproducibility was obtained between experimental and calculated values for a wide range of biomass±molasses±water solutions. # 2001 Elsevier Science B.V. All rights reserved. Keywords: Biomass; Optical sensor; On-line bioprocess monitoring; Saccharomyces cerevisiae; Molasses medium 1. Introduction The biochemical production processes in general require a control action to maintain their operating conditions in their optimum range, thus improving the yield and produc- tivity of this process [1]. The use of on-line measurements of their variables permits a rigorous monitoring and control of a biotechnological process [2]. In general in a fed-batch fermentation, the nutrients necessary for the cultivation are fed intermittently or continuously during the course of the process. The cell concentration measurements during a fed-batch culture permit for example, that an inferential control might be carried out, thus permitting an automatic regulation of the nutrients and substrate feed rate. Several techniques have been evaluated for continuous on-line measurement of cell densities and estimation of the cell concentration. Most of them are based in optical meth- ods of turbidimetry, ¯uorescence, or in the culture eletro- chemical properties where electrodes detect the resistance or capacitance of the microbiological culture. The optical sensors are the instruments used most frequently and most directly for on-line monitoring of cell densities. Optical sensors that use turbidimetric methods are based on light transmittance and/or scattering, and can detect the cell culture turbidity by different mechanisms: transmission detect lower turbidity values), backscattering or laser [3]. Another obstacle for carrying out in-tank measurements using these systems, is the tendency of the culture to deposit on the measuring cell [4]. Laser turbidimeter also has been used with most ef®ciency for cell density monitoring and control of Escherichia coli fed-batch fermentation [5]. Optical sensors based in the ¯uorescence measurements operate passing cells suspensions through a detector region. By controlling the cells with various dyes injected in the system, different cellular components can be monitored by detecting ¯uorescence and light scattering [6]. The biolu- minescence characteristics of determined cultures or of compounds were also explored and successfully applied to batch and continuous cultivation of recombinant biolu- minescent E. coli [7]. Sensors based on the capacitance measurement use the principle which measures the dieletric permittivity of micro- bial suspensions. An in situ steam sterilizable capacitance sensor was used for monitoring both homogeneous uni- cellular) and heterogeneous mycelial) cultures [8]. Recently a micromachined device has been developed for biomass monitoring by dieletric measurements of the bio- mass deposited over electrodes patterned on a membrane [9]. Commercially available instruments include optical tur- bidimetric sensors by transmission Wedgewood 650, Mon- itek FT3), backscattering Aquasant AF44S/R, Ingold FSC402) or laser ASRLT-300, Cerex 910-0006) for on-line measurements of cell density and were tested in microbio- logical fermentations [10]. Sensors and Actuators B 75 2001) 24±28 * Corresponding author. E-mail address: [email protected] B. Valdman). 0925-4005/01/$ ± see front matter # 2001 Elsevier Science B.V. All rights reserved. PII:S0925-400500)00692-4

Biomass monitoring by use of a continuous on-line optical sensor

Embed Size (px)

Citation preview

������� �������� �� �� �� � ������ � � ������� ������� �����

���� ������� ������ ������ �� ��������

����������� � ����� ���� ��������� ����� � ��������� ���������� ������ �� � ������� �� � ������ ����� � � !" # ���$��

�������� ! �������� "###$ ������� �� ������ ��� "! %������ "###$ �������� ! &������ "###

��������

�� ������� ����� �� ������� ������� �������� '�� ��������� ��� ����������� '��( � )�'��(� ( ���� ��� � ������ � � �������

���� �� ������ ���� ������������� �� ��� ����� �� '��� ��� ��� ��� ��������� *��������� � ���� ��� � ��� )�' ��� ������� ���

���� ������ ������� �������� ��� �� ��� �(� ������� ����� ��� �� ���� '��(� ���(�� '�� ��������� +(� ���������� � ��� ���

���� � �� �� �� ��� '��� ��� �������� ������ �� �,��������� ��-�� �� �(� ��� !./# ���� �� ���������� �� #."!# ��� �� � ������

+(� � �� � ����� �� ������� ��� �������� ��� ����� '�� ��� �� ������� ��� ������������ �������� � ������ ��������� �� ��������

������������ '�� ��������� ��� ��� ���� �������� '�� �������� ���'��� �,��������� ��� ���� ����� ��� �� �� � '��� ��� ��

�������.��������.'��� ��� ������ � "## 0������ ������� ���� ��� �(�� �������

%�&'��( �������$ ������� �����$ ������� ��������� ��������$ !��� ���&��� ����������$ �������� ���� �

� ���� ������

+(� ����(������ ��� ����� �������� �� ����� �1 ��

� ������ ������ �� �������� �(�� ������� ���������� ��

�(�� ����� � ���� �( � ������� �(� ����� ��� ��� ��

������ �� �(�� ������ 2 3� +(� �� �� ������� ���� ������ ��

�(�� �������� ������ � ��� � �������� ��� ������ �� �

������(�������� ������ 2"3� 4� ����� �� � ��������(

������������ �(� � ������ �������� �� �(� � ���������

�� ��� ������������� � ������ � ��� � �� �(� �� ��

�� �(� ������� +(� ���� ������������ ���� ������ � ��

� ��������( � �� � ����� �� �,������ �(�� �� ����������

������ ��(� �� ����� � �� �( � �������� �� � �������

� ������ �� �(� � ������ ��� � ������ ���� ����

������ ���(��1 �� (��� ���� ���� ���� �� ������ � �

������� ���� ����� �� ���� ��������� ��� ���������� �� �(�

���� ������������� ���� �� �(�� �� ����� �� ������� ���(�

��� �� � ��������� ) ��������� � �� �(� � �� � ������

�(������ �������� '(�� ��������� ������ �(� ��������� �

����������� �� �(� ������������� � �� �� +(� �������

������ �� �(� ���� ����� ��� ���� ��1 ����� ��� ����

������� �� ������� �������� �� ���� ���������� �������

������ �(�� �� � ��������� ���(��� �� ����� �� ��(�

������������ ���5� ��������� ��� ��� ������ �(� ����

� �� � � ������ �� �������� ���(������6 �����������

7������ ��'� � ������ ��� ��8� ���9�������� � ���� 2:3�

����(� �������� �� ����� � � ������9 ���� ������

��� �(��� �������� �� �(� �������� �� �(� � �� � �� �������

�� �(� ���� �� ���� 2/3� ;��� � �������� ���� (�� ����

��� '��( ���� ��-������ �� ���� ������� �������� ���

������ �� ��� ���� �� ��� ��������( ����������� 2!3�

������� ������ ����� �� �(� ) �������� ���� ������

������ ������ ����� � ��������� �(� ( � ������� �����

�� ��������� �(� ����� '��( ���� � ���� ��<����� �� �(�

������� �������� ���� �� ���������� ��� �� �������� ��

�������� ) �������� ��� ��(� �������� 2=3� +(� ���� �

���������� �(����������� �� ��������� � �� �� � ��

����� ��� '�� ���� �,����� ��� � ������ ��� �������

�� ����( ��� ������ � � � ��������� �� ���������� ���� �

��������� �� ��� 2>3�

������ ����� �� �(� ����������� ���� ����� �� �(�

�������� '(��( ���� �� �(� �������� ����������� �� �����

���� � ���������� �� �� ��� ����� ������?���� �����������

����� '�� ��� �� �������� ���( (������� � 7 ���

���� ��8 ��� (�������� � 7��������8 � �� �� 2@3�

�������� � �������(���� ������ (�� ���� ��������� ��

������� �������� �� �������� ���� ������ �� �(� ����

���� ��������� ��� ��������� �������� �� � �������

2A3�

*���������� ��������� ���� ����� ���� �� ������� � �

��������� ������ �� ����������� 7B���'��� =!#� ����

���9 �+:8� ���9�������� 7�1 ����� ��//�5�� 4����

��*/#"8 � ���� 7���;+�:##� *��, A #�###=8 �� �������

���� ������ �� ���� ������� ��� '�� ������ �� ��������

������ ������������ 2 #3�

������ ��� ��� ���� � >! 7"## 8 "/."@

� *��������� � �(��

�)���� �����6 �������C("���1� �<�� 7�� �������8�

#A"!�/##!5# 5D . ��� ���� ����� � "## 0������ ������� ���� ��� �(�� �������

E446 � # A " ! � / # # ! 7 # # 8 # # = A " � /

4� �(�� '�9 �� ������� � �������� ����� '�� ���������

�� ������� ��� ������ � � �������� �� ������� �������

������� 2 � "3� +(� ����� '�� ������ '��( ����� ������� ��

!��� ���&��� ���������� �� ��� '��� ��� �� ������� ��

�������� ������������� �� ��� ��� �������� ���� ����� ��

���� � ������ �� ����(�� ������������� +(� �� ���

�������� �� �������� ���� ��� ������� �� �(� ����� ����

�� ������ �� �(� ������ � � ������� ���� ��� � ���������

�� ���� �� ��� �� �������� �� ���� ������������� '��( �(�

������� ����� ��� �� ���� '��(� ������� ���(��� +(�

��) ���� �� )�' ��� ��� �(� �������� �� �(� )�'��(� (

���� �� ����� ���� � �� � ���������� '�� ���� ������������ +�

����� �(� ���������� �� �(� �������� ���� �� �(� �������

������������ ���������� � ��������� �� �(� ��������

������������ '�� ����������� �� �������� �(� ��� ����

�������������

� ������������

#� � ���� ������� �� ������� �����

���� ������ !� ���������� 7�����(��� F ������ G��

����8� '�� ��� �� ���� � �� � ��� ��� ��� �� ��������

��� ����� �� �(� ��� #./# ���� �� � +(� �������� ��� �

����� ���� '�� ��� ��� �� ��� '��� �� �(� ��� / �� /���,����������� �� �������� ��� ����� �� /: �� /A ��+ �� �

#�#� *������ ����� �� +�')� ��� ����

+(� ������� ����� �� ������������ �� ������� �������

������� ��� � '�� ����� ���� ��� � �(������� 7��� @!=�

E(�������� ���� ������� /�@ ��� 0�����8� � )�' �(����

����� ���� �� ���� �� )������� ������� ��� '��( ! ��

�������� � ���� �� " �5/ B 7E(������ ��?��8 ��� � ������

���� �� (��� ������������ ������� ����������� �� �(�

����� ������ +(� )�'��(� ( �(���� �������� �� ���

��'� ������� �(� ������� ��� � �� �(� ������ � � �������

)�'� '(��( ������� ���9 �� �(� ���� ���9� ��� ��������� �(�

���� ��� �� �������� ������ �� �(� ��(� ���(� ��'��� � ���

+(� '(��� ���� � '�� ������ �� � ������ HH����9 ��,II

������� �(� ������� �� �������� ��(� ��� �(� � � ���

���� ��� �(� ���� � �� �(� ������ ��� ��� ���� �� ��� �

+(���� �(� ��(� ������� �� �(� ���� ������ �(� ( �(�

��1 �� ��������� �� �(� )�' �(���� ��� ���(�� �(�

�(����������� �������� �(� �(�������� �� ��������� B(�����

��� ����� ��������� �(� �(������� �� �(� ���� �����

��������� '�� ��� ��� �(� �� ���� ����� �� ��������� '��

�������� �� � #.!## ��5/."# �� ��������� 7���� ���

��J�?��(�� ��?��8�

#�,� �������� �������� ����

+(� �������� ��(��� �� �(� ������ � � ������� ����

��� �� �(� �,�������� '��( �(� ������� ����� �� ��������

�� ��� "� +(�� �� �������� �� �'� ! � ������ ��� ����� ���9��

�'� �(���'�� ������ ��� �� �������� �(� �������� ��� �

������ ������� � ��� 7 = �� �������8� ���������� � ��

70�, ��� ��J� E� ��� ��?��8 ���������� �� �(� ������

������ � � )�'� ������� 7G������� %�' K�9� L��8�

�(� ������� ������ �(� ��������� 7���8 �� ���� �� �

��������� �������� 7*&�=## ���8 �� � � ������ �����

���� 74+�"����8 ��� �(�� �� � � �� ���� �� � ��������

� �� 7E���� � "##� 4����� L��8� 4� �(� �������� �� �

� ������� ������ ����'�� 7����,B�� ������ :� �

����� L��8 '�� ���- �� ��� �(� (�������� ���� ��

�(� �,�� ����� �� �� �� �������� ������� �� �(� ������ +(�

�� �� �(�� ������ ����'�� �(� ���� ���� �� ���� ������

����9� �� �(� ���������� � �� ��� �(� �������� ���������

�� �(� ����������� ������������ ����� �� �(� �������

������

#�-� *++)���� ����&��� + ���� ����������� �� �������

�����������

+(� �������� �������� �� �(� ���� ������������� '��

����� � � �� ���� ��� �(� �� ���� '��(� �������

���(��� ����� ��� ��� �� �(� �������� ��� ����� '��

������ �� �� # ��� �� @##� � ��� '��(�� �(�� �����

������������

��+ ����� �� ��� � �� 7 �� 8

. �������� ������ �� �������� ������������

7 ���� �� 8

� ������� ������������ 7 ���� �� 8

�� �������� ��� ���� ������������ 7���,8�� ����� � �� � ����� �� �������.

��������.'��� ��� ����� 7��8

��� ����� � �� � ����� �� ������� ���

��������.'��� ��� ����� 7��8

��� � +(� ������� ������� ����� ���� �� ��6 �(�������$ ;6 ����$ ��6

����9 ��,$ *�6 ���' �(����$ �6 ���������$ 0�6 ��������� ��� ���

/�0� !���� �� ��� 1 !����� �� /������� � 23 4#55 6 #-7#8 "!

'��( '��� 7�� ������� �� ���� �� ��������8� ��� �(� ����

���� �������� �������� �� � ������ '��(�� ����� ���

��� ���� �� A!�* �� /@ (� ���� �(�� ���� �(� �� ���� ����

'�� '��(�� �������� �(� ������ ������������ �� ���� ��

��� ����� +(� �������� ��� ����� ������������� '�� ����

� �� �� ���, ��� � ��������� ����(������ 7����������

��� "=!� G�����8�

� ������� �� ����������

,� � ����.������ �������� �� ���� ������ '��

.�����7'����

��� ����� �� ����� ������������� ������ �� '��� 7!.

/# ���� �� 8 '�� ��� �� �(� ���������� �� �(� �������

����� ������� '��( �(� ������ � � ������� ����� +(� )�'

�� �(� ������ '�� ���������� �� ":# �� ���� � ������� �

��� ����� ��� �� �� ���( ��� ���� '�� ">�* ��� " ��

������������ ��� : �(�'� �(� ���������� � �� ���������

�������� �� �,��������� �(���������� '��( � ���������

����� �� #�A!� +(� � �� � ����� '�� ������� �� �� �����

���� ���������� �� ������� ������������ ��� ��� ���������

'�� ����������� �� # ��� ##M �������������� ������

������� �� � �� ��������� �(� #M ������������ '�� ��� �

����� )�'�� � � '��� � �� � ���� ������� �� : (� ���

�'���(�� ��� �(� ���� �� �(� ������� ��� ����� �(� ##M

����� ������� 7?�� � �� �8�

+� ���-� �(� ���������� �� �(� ������� ������ ����

������������ ��� �� �������� '��( �(� ����� '�� ����

���� �� �(� �������� �� ���� '��(� ���(��� +(� � �� ��

��� /� '��( � ��������� ����� �� #�A= ���-�� �(� �����

������ �� �(� �������

+(� ���� �� ������ �� ��� �� �(� ������� ������

��� !� '�� ���� ����� �� �(� '(��� ���� ����� ����

+(��� ��� '�� ���� ����� '��( �(� ����� �� ���

������� �� ��� ����� ���� ����� ��� ��������� +(�

��������� ���'��� �(� ���� �� �,��������� ��� �(� �����

��� �� 7���� -���� �,��������� � ��� ��� :8 ������ �� �(�

��� � ������ �� ������������ ��� �� �(� ����������

� ��� �� ���� �� � ��,�� � ��� � �� /�>M �� �(� �����

������� ���

��� "� ��(������ �� �(� ������ � � ������� ����� ��6 ������� �����$ E6 � ��$ �6 ������ ��� �����$ �6 �������$ �6 �(���'�� ������$ 46 ��������$ +�6

���������$ *6 ��������$ *�6 ���� ���

��� :� *��������� � �� �� �(� ������� ����� �� �������.'���

��� ������

��� /� ������� ������������� �������� �� �(� �� ���� '��(� ���(��

��� �(� ������� ������

"= /�0� !���� �� ��� 1 !����� �� /������� � 23 4#55 6 #-7#8

,�#� ��' �++����

+(� ��) ���� �� �(� ���� ����� ������� )�' �� �(�

����� � �� � ����� '�� ���� ���� �� ���-� �� ��'� ��� ��

�������� ���������� ������� �� �(� ����� �� �(� �����

�(���� ��� �� �� ������� �� )�' ��� ��� ��� ����������

�� �(� � �� � ������ � -,�� ���� ������������ ��� ����

7:#�#@ ���� �� 8 �� " � ��� �� '�� ������ �� ��� '���

�� ">�* ��� '�� ��� ����� �(� ( �(� ������ �� )�'�

���� ���'��� !.:## �� ���� � ��� = �(�'� �(� �� ���

�������� �� �(� ����� � �� � ����� ��� �� ������� �� )�'

�(�'�� � ����� ��������� �� #�=M� � � ������� �� � ��(�

�������� ��� �(� ���� �������� �� ������� +(�� ���������

��� �� ��������� ������-���� ��� �(� � ����� �����

������ )�' �� �� �� �(���� ���'��� �(� ��� #/.

":# �� ���� '(�� �(� ����� ������� ��������� �� ��'�

��� �� �(� ������ �� ���� ���������� '�� ��� �������� � �

������ �� �(� ������� )�' ������ �� �(� ) �� �(� ( �(�

)�'��(� ( �����

,�,� ����.����� ����� '�� .�����7�������7'����

+(� ��� ����� ����(�� ����������� ������ ��� �� � ��

����� �� ��� � � ���� < ��� � ��� ��� � � ���� ��������

�(�� (��� ��� � !#M � ��� �� �(�� ����� �� '�� ��������

�� ���� �(� ������� ����� �� ���� �������� ��� ��� ��� ������

���� ��������� �� �(� ����� �� ���1 ��� �� ��������

������� ������������� ������ �� �(��� �������� +(�� '���

����� �(� �� �� ������� ������� �������� �� ����(��

����������� ��� ����� ��������� +(� ��' ����������

� ��� �� �(� ������� ����� '�� �������� ��� �������

�� ��� ��� ���� �������� ��� ����� �� '��� �� �(� �������

������� =� @ ��� #���, '��( ���� ������������� ���'���

#./# ���� �� �� ">�* ��� � )�' �� ":# �� ���� � +(�

���������� � ��� ��������� �(�'� �� ��� >� ������ ���� ��

�,��������� ��-��� ��� '��( ��������� ������ �� #�AA ��� �

����� ��������� ���� ��

�� � ��� �,���.�� 7 8

+(� �������� ������� ���� (�� � ��� ���� ���� �� �(�

����� � �� � ������ ���� �� �(� ���� ����� �������� ��

����� �� �(� ������� ���� �(� �������� ������ ����

�(���� �(� ��������� �� ��(� ��� �(� ����� � �� ��

��� > �(�' �(�� �(� ����� ���������� � �� �(���� ��

��������� '��( �(� �������� ������������ ���� �������

'��( �(� ���������� � �� �������� ��� � � '��� ����

��� ������ +� ������� ��� ���������� �(� �������� ����

������� � ���������� ���������� � �� �� � � ��������

��� ����� '�� ��������� ��� @ �(�'� �(� � �� � ����� �� �

��� �� /. /���,� �� ">�* ��� ":# �� ���� � ��� � �����

������ '��( � ��������� ����� #�A@ ��� �(� ����������

������� ���� ��

��� � "#=�:� �"=�� 7"8

,�-� �������� + � � ��������� ����� ������

4� ��� �� ���������� ���������� ������� �� �(� ����

�� �(� �������� ������ �� �(� ����� � �� � ������ �

���(�������� ��������� '�� ��������� �� � � ������ ��

�(� ���������� � ��� �������� �� �(� ������� ����� ���

��������.������� ��� ����� 7��� >8 ��� � � ��������

��� ����� 7��� @8�

��� !� E����� �� ��� � �� �� �(� ������� ����� ���� ������ �� �(�

��� ! �� /# ���� �� �

��� =� 4��� ���� �� �������� ���' ���� �(� ������� ����� ����� �� �(�

���� ������� �������������

��� >� *��������� � ��� �� �(� ������� ����� �� �������.��������.

'��� ��� �����6 7�8 =���,$ 7�8 @���,$ 7�8 #���,�

/�0� !���� �� ��� 1 !����� �� /������� � 23 4#55 6 #-7#8 ">

������� � �����(��� ������� �� 01� 7 8

����

���

� �� �.� 7:8

� � �

.��

��

���

� �7/8

� ����� ��� ��� �� 01� 7"8 �� 01� 7/8

� � �

.��

��

"#=�:� �"=��

� �7!8

�� ���� �� ��� >� �(� �������� . �� ��������� �� ��������

������������ ��� � ��������� �� � ������ �� �(� ��������

������������ ������� ��� ��� �� ��� ���

. � #�##> A>� #�##: !!�� 7=8

��� ������� '� �������� �(� ��� ������������ �� ������� �

�� � ������ �� �(� ���� �� � �� � ����� ��� �(� ��������

������������ �������

� � �

�#�##> A>� #�#: !!��� ����

"#=�:� �"=��

� �

7>8

L��� 01� 7>8 �� �� �������� �� �������� �(� �����������

������� ������������ �� �(� ����������� ������� �� �(�

�������� ���� �� �(� ����� � �� � ������

� �����������

+(� ������� ����� ��������� �� ������� ������� ����

����� ��� �� ��� �� ������� ������� ������������� �� �(�

��� !./# ���� �� '��( ��� ����������� +(� ����� '��

'��� ������� �� � ������ � � ������� ���� ��� �� � ����

������ ��������� '��( �� � �� � ����� �� �(� ���

/."# ��� +(� ������ �� ��� �� �(� ���� ������

�� ���� �� � ��,�� � ��� � �� /�>M �� ��� ��� � ����

+(� ���� ����� ������� )�'��(� ( �(� ����� �� �� ��

�(���� ���'��� �(� ��� #/.":# �� ���� '��(� � ���

������� ��) ���� �� �(� � �� � ������

� ���� ��) ���� �� �(� � �� � ����� '�� ������� � �

�� �(� �������� ������ �� ����������� ����� '(�� �(�

����� '�� ��� '��( �������.'���.�������� ��� ������ 4�

��� �� ���� � ������� ������������� �� �(��� ��� ������

�� �1 ����� '�� ��������� �� �������� �(� ��� �������

������������ ����������� �(� ���������� ������� �� �(�

�������� ���� �� �(� ����� � �� � ������

����������

2 3 E� ��������� 0� B��9���� ��������� �� ������ � � ���������

������(���� ������ /: 7 AA/8 "="."==�

2"3 ���� ������� ������ ������ �� �������� �� ������ &���������� ��

� � ���� ��?������ ��������� ������(���� +��(�� " 7 AA@8 :#!.

:#>�

2:3 G� ������(���� B��� ����� N��� ;��� �� � �(������ �������

���� ����� �� (������� �'�( �� � �� � �� ��������� ����

���(���� +��(�� 7 A@>8 " :." @�

2/3 �� ����� ��0� O ����� %��� ������� ����(������ 0�������� "��

0������� ���� � �������� E���� %�' K�9� A>:� �� /::�

2!3 +� K������ B� O������ P� 4�(�(��� K� P�������� �� P�������� ���

����( � �� � � ������� �� ��� �� ������ � ��� ���� �� ����

������������ ��� � �� � ��� ��� ������(���� ������ :A 7 AA"8

!!#.!!!�

2=3 �� ����K� �� *����(������ ������(����� Q +(� E���������

������������� ��� �� ������� �� ������(����� �� 4�� ����

��� �� � ��� ��������� �� 0������� ���� "� E����� E����

%�' K�9� A@!� �� =: �

2>3 �� P��������� P������������ E� &( <���� +� ��� &�9� B� ��<����� ��

;������� ��������� ������������ �� �(� ���� ����� ������ �� (�(�

������� ���� ��������� � �� ��� ������(���� ������ /" 7 AA:8

A#. A@�

2@3 �� ��(�����9� �� *�������(� N��� E�R��� ������� �������

�������� �� ����������� ���� ������ N� ������(���� ": 7 AA 8

:#:.: /�

2A3 +� P�����'�9�� S��� ��������� B� �����9�� N� ������ �� ��������

�������(���� ����������� �������� ������� ����� ��� ���� �

=@ 7 .:8 7"###8 "@ ."@!�

2 #3 E� B � ���� �?� 9� N�&� ����9��� N�*� +(���� *� �� ���� &� %���(�

0��� ������ ��� ������������ �� ������� ���� ������� ����� ��

��������� ���� ���������� ������(���� ������ /: 7 AA!8 "="."==�

2 3 �� �������� ���� ������ ������� �������� ��� ������ �� ��

������� ������ � � ������ ��6 =�( 0 ����� *����� �� ������(����

��� ����?�� 4����� AA:� ���� 44� �������� +L =#��

2 "3 ��E� E��(���� �� �������� �� �������� ����� �T���� ��� �������

�� ��������9�J�� ����� #�� ���� 4��� ��� E��� ����� ��?���

AA:� ��� :=@.:>A�

��� @� *��������� � �� �� �(� ������� ����� �� ��������.'���

��� ������

"@ /�0� !���� �� ��� 1 !����� �� /������� � 23 4#55 6 #-7#8