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Aus dem Blutgruppeninstiwt der Tierzuchtforschung Miincben WissenschalftL. Leitung: Prof. Dr. A. Meyn Blutgruppenforschung beim Schwein Uber die Technik der Blutentnahme und Blutkoneervierung Von H. BUSCHMANN Mit einer Abbildwng (Eingegangen am 31. Jvli 296f) Die Blutgruppenforschung bei unseren Haustieren hat in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen. Ihre Nutzlichkeit bei der Klarung fraglicher Abstammungsfalle und zur Feststellung der Ein- und Mehrkigkeit von Zwillingen wird in der praktischen Tierzuht vieler Lander angewendet. Weiterhin stehen jedoch Fragen der Populationsgenetik und des erbbiologi- schen Zusammenhanges zwischen gewissen phanotypisch erkenmbaren Merk- malen und den genetisch fixierten Blutgruppeneigenshaften an erster Stelle der Forschung. Sind wir do& ersunals in der Genetik nach allen bisher beim Menschen und bei den Saugetieren vorliegendext Ergebnissen dazu berechtigt, von einem aui3erlich feststellbaren Merkmal, namlich der Blutgruppe eines Tieres, direkt auf das Erbgefiige, den Genotyp, schliegen zu durfen. Der bei allen genetischen Betrachtungen so wichtige und uberaus schwierig zu er- fassende Faktor Umwelt darf vernaddassigt werden (6). Nun sieht sich die immunogenetische Forschung beim Menschen und bei den groi3en Haustieren erheblichen Schwierigkeim gegenuber, die sich aus der geringen Zahl von Nachkommen und der langsamen Generationenfolge ergeben. Hier bieten sich bei den kleineren Haustieren, vor allem Schwein und Geflugel, bessere Moglichkeiten. So ist es nicht erstaunlich, dai3 die Blut- gruppenforschung beim Geflugel bereits weitgehende Aussagen uber das Wirken der Selektion in bestimmten Populationen, uber den genetischen Polymorphismus, das Wberwiegen der Heterozygmen und den Zusammen- hang zwischen Leistungsmerkmalen und Blutgruppen machen kann. Die Blutgruppenforschung beim Schwein stedct no& in den Anfangen. Es ist im wesentlichen das Verdienst des danischen Forschers E.ANDRESEN beim Schwein ein System von 16 Blutgruppenfaktoren, die neun genetischen Systemen zuzuordnen sind, aufgestellt zu haben. Wegen der grogen Zahl von Nachkommen einer Muttersau unld des in den Mastprufungsanstalten an- fallenden grof3en Untersuchungsmaterials bietet die Blutgruppenforschung beim Shwein verlodcende Aussichten fur populationsgenetische Studien. Ge-

Blutgruppenforschung beim Schwein Über die Technik der Blutentnahme und Blutkonservierung

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Page 1: Blutgruppenforschung beim Schwein Über die Technik der Blutentnahme und Blutkonservierung

Aus dem Blutgruppeninstiwt der Tierzuchtforschung Miincben WissenschalftL. Leitung: Prof. Dr. A. Meyn

Blutgruppenforschung beim Schwein Uber die Technik

der Blutentnahme und Blutkoneervierung

Von

H. BUSCHMANN

Mit einer Abbildwng

(Eingegangen am 31. Jvli 296f)

Die Blutgruppenforschung bei unseren Haustieren hat in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen. Ihre Nutzlichkeit bei der Klarung fraglicher Abstammungsfalle und zur Feststellung der Ein- und Mehrkigkeit von Zwillingen wird in der praktischen Tierzuht vieler Lander angewendet. Weiterhin stehen jedoch Fragen der Populationsgenetik und des erbbiologi- schen Zusammenhanges zwischen gewissen phanotypisch erkenmbaren Merk- malen und den genetisch fixierten Blutgruppeneigenshaften an erster Stelle der Forschung. Sind wir do& ersunals in der Genetik nach allen bisher beim Menschen und bei den Saugetieren vorliegendext Ergebnissen dazu berechtigt, von einem aui3erlich feststellbaren Merkmal, namlich der Blutgruppe eines Tieres, direkt auf das Erbgefiige, den Genotyp, schliegen zu durfen. Der bei allen genetischen Betrachtungen so wichtige und uberaus schwierig zu er- fassende Faktor Umwelt darf vernaddassigt werden (6).

Nun sieht sich die immunogenetische Forschung beim Menschen und bei den groi3en Haustieren erheblichen Schwierigkeim gegenuber, die sich aus der geringen Zahl von Nachkommen und der langsamen Generationenfolge ergeben. Hier bieten sich bei den kleineren Haustieren, vor allem Schwein und Geflugel, bessere Moglichkeiten. So ist es nicht erstaunlich, dai3 die Blut- gruppenforschung beim Geflugel bereits weitgehende Aussagen uber das Wirken der Selektion in bestimmten Populationen, uber den genetischen Polymorphismus, das Wberwiegen der Heterozygmen und den Zusammen- hang zwischen Leistungsmerkmalen und Blutgruppen machen kann.

Die Blutgruppenforschung beim Schwein stedct no& in den Anfangen. Es ist im wesentlichen das Verdienst des danischen Forschers E.ANDRESEN beim Schwein ein System von 16 Blutgruppenfaktoren, die neun genetischen Systemen zuzuordnen sind, aufgestellt zu haben. Wegen der grogen Zahl von Nachkommen einer Muttersau unld des in den Mastprufungsanstalten an- fallenden grof3en Untersuchungsmaterials bietet die Blutgruppenforschung beim Shwein verlodcende Aussichten fur populationsgenetische Studien. Ge-

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wisse Schwierigkeiten bieten jedoch die Blutentnahme und die Konser- vierung von Schweineblut uber Iangere Zeit. Auch ist die Gerinn- barkeit von Schweineblut wesent- lich starker als beim Rind.

Die Blutgruppenforschung be- notigt Schweineblut in wechseln- der Menge und zu verschiedenen Zwecken. Wahrend fur die Fest- stellung des Blutgruppenbildes eines Tieres bereits wenige Kubik- zentimeter Blut genugen, mochte man von einem Tier, welches ein hochwertiges Antiserum nach lan- gerer Immunisierungsdauer gebil- det hat, moglichst vie1 Blut ge- winnen. Desgleichen ist man be- strebt, von einem Schwein, dessen Blut fur die Absorption eines Rohserums geeignet ist, eine groi3e Menge Blut zu entnehmen.

Zur Blutgruppenuntersuchung eine Tieres geniigen schon etwa

3 ccm Blut. Die Entnahme gelingt meistens aus einer starkeren Ohrvene. Hierzu reinigt man das Ohr, staut am Ohrgrund mit einem Gummischlauch und kann die Vene dann entweder mit einer feinen Nadel punktieren oder mit einer Schere oder einem Skalpell anschneiden. Die Ausbeute kann noch erhoht werden, wenn das Ohr vorher mit einem in Xylol oder Alkohol getauchten Tupfer abgerieben wird. Anschlieflend soll man die Vene aber nur mit der Nadel punktieren und nicht anschneiden, da Blut, welches mit Xylol oder Alkohol in Beruhrung kam, der Hamolyse unterliegt und fur die Durch. fuhrung der Blutgruppenuntersuchung untauglich ist. Allerdings verdampft besonders Xylol sehr schnell.

Fur die Entnahme grof3erer Mengen von Blut mufl 4ias Schwein zunachst absolut sicher fixiert werden. Wir stellen das Tier mit der Langsseite an eine Bretterwaiid oder dergleichen, binden den Kopf mit der Oberkieferschlinge hoch und drucken das Tier, um Seitwartsbewegungen zu vermeiden, gegen die Bretterwand. Zur Hilfeleistung genugen zwei Personen, notfalls ist auch eirie Person hierzu in der Lage. Fur den Erfolg der Operation entscheidend ist, dai3 das Tier mit hochgebundenem Kopf gestreckt und alle Extremitaten gleich- mai3ig belastend dasteht. Sobald groi3ere Abwehrbewegungen des Tieres rnit Verrenkungen der Gliedmai3en einsetzen, ist der Erfolg der Blutentnahme bereits zweifelhaft. Zur Blutentnahme punktieren wir die vordere Hohlvene nach der im Schweizer Schrifttum angegebenen Technik an einer Stelle, die in der Mitte zwischen vorderer Brustbeinspitze und Schultergelenk liegt. Eine entsprechend lange Kanule (2 x 130 mm rnit abgeschliffener Spitze) wird nach Reinigung und Desinfektion durch die Haut g.estochen und sofort eine 30 ccm-Spritze aufgcsetzt. Unter dauernder Aspiration der Spritze wird die Kanule in dorsokaudaler Richtung vorgeschoben bis plotzlich Blut ein- zustromen beginnt. Palls jetzt eine gr6i3ere Biutmenge entnommen werden soll, wird eine evakuierte Glasflasche, wie sie z. B. in den Bluko-Flaschen des

Abbildung zeigt die Entnahme einer grol3eren Blutmenge am fixierten Schwein im Stall

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Asid-Institutes, Munchen, zur Verfugung steht, mittels des mitgelieferten und steril verpackten Entnahmebesteckes aus PVC angeschlossen. Fur die Ge- winnung von Blut fur Absorptionszwecke wird die Flasche vor der Evakuie- rung mit einem Anticoagulans gefullt, wahrend die Flaschen fur die Serum- gewinnung kcinen Inhalt haben. Wir gebrauchen die Flaschen mehrmals, indem wir nach erfolgter Reinigung mit einer Kaniile, die an eine Wasser- strahlpunipe angesschlossen ist, durch den GummiverschluB hindurch evaliuieren und den Verschlui3 ZUI Abdichtung in flussiges Paraffin tauchen. Eine Sterilisation halten wir fur unsere Zwecke fur uberflussig.

Auf diese Weise entnehmen wir von einem Schwein je nach GroRe bis zu 1 Liter Blut. Selbst bei trachtigen Sauen traten keine Komplikationen auf. Eventuell auftretende Nachblutungen sistieren meist augenblicklich nach den ersten Bewegungen des freigelassenen Tieres. Zur Serumgewinnung werden die Flaschen uiber Nacht im Kuhlschrank aufbewahrt. Am nachsten Tag hat sich der Blutkuchen meist gut abgesetzt. Wir giei3en das uberstehende Seruin ab und zentrifugieren anschlieflend die Flaschen zur Erhohung der Ausbeute noch 15 Minuten bei 2000 Umdrehungen pro Minute. Unter Beachtung einiger Vorsichtsmai3nahmen (Flussigksitsmantel, Gummieinsatze) lassen sich die Blutflaschen gut und ohne Bruch zentrifugieren. So gelingt es, von einem Liter Schweincblut ca 400 ccm Rohserum zu gewinnen.

Blutkonserven in den rnit dem Blutentnahmegerat des Asid-Institutes, Munchen, entnommenen sterilen Flaschen wurden von uns im Kuhlschrank bis zu 10 Tage lang aufbewahrt und waren anschliei3end fur Absorption und Test voll brauchbar. Die Qualitat der Blutkonserven war ausgezeichnet, sie liel3en sich leicht auswaschen, zeigten keinerlei Hamolyse und Blutgerinnsel. Wichtig zur Erreichung einer guten Qualitat der Blutkonserve ist a, die Flasche bei der Blutentnahme mit dem Verschluf3 nach unten zu halten. Das einstrijmende Blut mug so durch die in der Flasche befindliche Stabilisator: losung durchtreten, wodurch die Verklumpung des leidit gerinnbaren Schweineblutes vermieden wird. Die Firma Asid benutzte eine Stabilisator- losung folgender Zusammensetzung: 2,16 ”/. Natr. citric., 2,34 ‘4 Dextrose, 0,5 ”/. Acid. citric. pur.

ANDRESEN (3) benutzte fur seine Untersuchungen an Schweineblut folgende Stabilisatorlosung: 2 % Natr. citr., 0,5 % Natriumchlorid und 0,016 ‘/c Natriumcyanid. WROBLEWSKI (3) sammelte Schweineblutproben in Rohrchen, die eine Losung aus 4 ‘/. Natriumcitrat, 3 yi Glukose, 0,5 O/,,,,

Natriumalbucid und 0,3 o/oo Rivanol enthielten. Das Mengeiiverhaltnis war drei Teile Blut auf ein Teil der Losung.

Zu Beginn unserer eigenen Untersuchungen benutzten wir die von ANDP.ESEN angegebene Stabilisatorltisung. Jedoch lief3 die Qualitat der ent- nommenen Blutproben gelegentlich zu wunschen ubrig. Trotz guten Schiittelns kam es nach der Entnahme manchmal zu Verklumpungen, und die Haltbar- keit der Blutproben war infolge einsetzender bakterieller Zersetzungsvorgange gering. Zur Zeit benutzen wir deshalb eine ACD-Losung folgender Zu- sammensetzung und haben damit lbei der Entnahme von Schweineblutproben in kleiner und groi3er Menge gute Erfahrungen gemacht:

21 6 g Natr. citric. 234 g Dextrose

50 g Acidurn citricum 40ccm Formalin 4074

ad 10 1 destilliertes Wasser.

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Die Losung wird im gleichen Verhaltnis wie oben (1 Teil der Losung auf 3 Teiie Blut) angewendet. Die Haltbarkeit der Blutproben betragt mindestens eine Woche. Das zur Hemmumg bakterieller Zersetzungsvorgange zugesetzte Formalin hat weiterhin den Vorteil, nicht so gefahrlich zu sein wie das sehr giftige Natriumcyanid. Wird Blut zum Zwecke der Immunisierung von Schweinen oder anderen Tieren entnommen, so wird die Stabilisatorlosung obiger Zusammensetzung ohne Formalinzusatz angewendet. Die Haltbarkeit der Blutproben ist dann geringer, wir injizieren sie moglichst schon innerhalsb von 1-2 Tagen. Zur Hemmung bakterieller Zersetzungsvorgange kann statt Formalin auch das teuerere Streptomycin benutzt werden. Einen guten bakteriostatischen Effekt sol1 auch das Chemotherapeutikum Furacin (C. F. Boehringer, Mannheim) haben.

Um Blutproben uber langere Zeit als eine Woche aufheben zu konnen, bedarf es anderer, weit komplizierter Methoden. Geeignet fur eine langere Aufbewahrung ist Blut in gefrorenem Zustansd, welches vorher durch Zusatz bestimmter Losungen kaltebestandig gemacht wurde. Bei der Gewinnung kaltebestandigen Blutes ist es in erster Linie notwendig, die Menge des Wassers in seinen Zellelementen - Erythrozyten enthalten ungefihr 70 % Wasser - zu beriidtsichtigen, da die destruktiven Veranderungen h i m Einfrieren des Blutes s i h hauptkichlich in den zelligen Elementen abspielen.

Die Gewinnung kaltebestandigen Blutes fur die Bluttransfusion beim Menschen war das Ziel der Untersuchungen von A. D. BELJAKOW (5). Zum Anfertigen der Konservierungsmittel benutzte er solche Stoffe, die bei intra- \ enoser Anwendung in therapeutischer Dosierung anerkannt nichttoxisch sind. Er prufte anorganische Salze, organisdie Sauren, Kohlehydrate, Alkohole und kolloidale Stoffe pflanzlicher und tierischer Herkunft. Unsere eigenen Ver- suche an Schweineblut mit den von BELJAKOW angegebenen Losungen Nr. 31 - e und 31 - s c h verliefen enttauschend. Sowohl bei der Aufbewahrung im Kuhlschrank bei -1- 4" C uber 2 Wochen als auch bei Aufbewahrung in der Tiefkuhltruhe bei - 18" C uber eine Woche trat starke Hamolyse auf, die sich auch nach mehrfachem Auswaschen nicht beseitigen lie8. Die Zusammen- setzung der Losungen war folgende:

Nr. 31 - e Nr. 31 - s c h Natriumcitrat 1 YO Natriumcitrat 1 YO Glukose 3 ,o Glukose 3 ,o Furacilin oyol Sy ntomicin oyol Rektif. Alkohol 95 "r. 15,O Rektif. Alkohol 95 "j, 15,O Bromnatrium 032 Bromnatrium 092 Dest. Wasser 85,O 10 %ige Gelatine 50,O

Dest. Wasser 3 5 4 Bei unseren Versuchen ersetzten wir das FuraciIin in Losung 31 - e und

das Syntomicin in Losung 31 - sch durch 0,05 g Streptomycin. Bessere Erfolge erzielten wir mit der Tiefgefrierung von Schweineblut

unter Verwendung von Aethylenglykol (2). Auf ein Volumen dicht zentri- fugierter, gewaschener Schweineerythrozyten werden 2 Volumen folgender Losung langsam zugefiigt:

40 Voi. % Aethylenglykol 3 Gew. '% tert. Natriumcitrat.

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Die Suspension wird vorsichtig geschuttelt, anschlieflenld bei + 4" C eine Stunde au%ewahrt und dann in die Tiefkuhltruhe verbracht.

Besondere Vorsicht erfordert das Auftauen. Hierzu werden 4 Losungen Aethylenglykol ibenotigt, und zwar je eine mit 2O%, l o % , 5 % und 2 % Aethylenglykol in 3 %iger Trinatriumcitratlosung. Das gefrorene Blut wird bei Zimmertemperatur aufgetaut. Dann wind im Verhaltnis 2 ccp Blut zu 15 ccm Losung die 20 %ige Aethylenglykollosung dazugegeben, vermischt und wieder abzentrifugiert. Zum Erythrozytensediment ,gibt man nun in gleichem Verhdtnis nacheinander die 10 Pige, 5 %ige und 2 %ige Losung yon Aethylenglykol dam. Anschliei3end wird mit physiologischer Kochsalz- losung bis zum Verschwinden eingetretener Hamolyse ausgewaschen.

Der Materialverlust bei dieser Methode ist groi3, das aufgetaute Blut ist meist hamolytisch. Wir unternahmen den Versuch, Blut, das auf diese Weise in tiefgekuhltem Zustand langere Zeit konserviert worden war, fur die Immunisierung von Schweinen heranzuziehen. Hierzu wurde Blut von 20 Schweinen am Munchener Schlachthof entnomfnen und intramuskular in wochentlichem Abstand einer Gruppe von 20 Schweinen des Staatsgutes Hubschenried injiziert. Wahrend die erste Immunisierung rnit frischem Blut erfolgte, wurden die restlichen Immunisierungen mit tiefgekuhltem Blut, das auf oben angegebene Weise aufgetaut worden war, ldurchgefuhrt. Die appli- 2ierte Blutmenge entsprach 10 ccm Voll'blut. Nur durch die Tiefkuhlkonser- vierung waren wir in der Lage, jedem der 20 Recipienten iiber den fur eine Immunisierung und Reimmunisierung erforderlichen Zeitraum von mehreren Monaten stets dasselbe Donorblut zufuhren zu konnen.

Insgesamt wurden an den 20 Schweinen 5 Erstimmunisierungen in wochentlichem A'bstanLd durchgefuhrt. Die erste Immunisierung erfolgte rnit Frischblut, die restlichen vier mit Blut, das in tiefgekuhltem Zustand auf- bewahrt worden war. Nach einer Pause von 2 Monaten erfolgten erneut zwei lnjektionen mit tiefgekuhltem Blut desselben Donors in wochentlichem Ab- stand. Die Schweine wurden eine Woche nach der letzten Immunisierung gesdachtet, das Blut entnommen und das inaktivierte Serum gegen die Blut- proben von 15 Schweinen mit bekannter Blutgruppenstruktur auf Antikorper getestet. Hierbei zeigte sich, dai3 5 von den 20 Schweinen Immunantikorper gebildet hatten. Aus einem Rohserum konnte das Reinserum K, (Titer 1 : 4) nach einmaliger Absorption gewonnen wenden.

In einem anderen Versuch gelang es uns mit tiefgekuhltem Blut eines Schweines im Parallelversuch zu demselben, aber frisch entnommenem Blut, den gleichen Albsorptionseffekt bei einem Rohserum zu erzielen.

Diese Versuche zeigen, dai3 es moglich ist, Schweineblut uber langere Zeit ohne Verlust seiner blutgrupperuantigenen Eigenschaften zu konservieren und sowohl fur Immunisierungen a l s auch Absorptionen anzuwenden. So wird es vielleicht in Zukunft moglich sein, Blut von einem Tier mit besonderer Blut- gruppenstruktur uber langere Zeit zur Verfugung zu haben, auch wenn der Spender (bereits geschlachtet werden mui3te. Da die Lebensdauer uiiserer Schweine aus wirtschaftlichen Griinden beschriinkt ist, gewinnt dieses Ergebnis fur die Blutgruppenforschung beim Schwein grofle Bedeutung.

Zusammenfassung Es wird uber Methoden der Entnakme und Konservierung von Blut zum

Zwecke der Blutgruppenforschung beim Schwein berichtet. Hierbei wird die

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Brauchbarkeit verschiedener Stabilisatorlosungen diskutiert und iiber eigene Erfahrungen mit der Tiefkuhlkonservierung von Schweineblut berichtet.

Summary Blood group studies in pigs

The technique of blood sampling and preservation The methods of obtaining blood samples and storing them are described,

in relation to studies on blood groups in pigs. It was possible to store blood for long periods for use i n immunisation and absorption studies. Up to 2 litre of blood was taken from the pigs and it could be stored satisfactorily at - 18" C when suitable precautions were taken.

Resume Etude des groupes sanguins chez le porc

La technique de recolte et de conservation du sang L'auteur indique les mkthodes de rkcolte et de conservation du sang pour

les recherches sur les groupes sanguins chez le porc. I1 discute B ce propos les possibilitks d'utilisation de diverses solutions stabilisatrices et fait part de ses cxpkriences personnelles concernant la conservation du sang de porc par surcongClation.

Resumen Estudios sobre 10s grupos sanguineos del cerdo

La ticnica de la toma de sangre y conservaci6n de la misma Se informa sobre tkcnicas de la toma y conservaci6n de sangre para fines

de investigacibn de grupos sanguineos en el cerdo. A1 mismo tiempo se discute la utilidad de diversas soluciones de estabilizadores y sobre experiencia$ propias con la conservaci6n a temperaturas bajas de sangre porcina.

Literaturverzeichnis 1 . ANDRESEN, E., 1955: Svinets Blodtyper. Ugcskrift for Landmoend 3 5 ; * 2 ANDRESEN,

E., and M. R. IRWIN. 1959: The E Blood Group System of the Pig. I. Nord. Vet. Med. 11, 540. 3. ANDRESEN, E.,-and A. WROBLEWSKI, 1959: The E Blood Group System of the Pig. 11. Nord. Vet. Med. 11, 548. ' 4. ANDRESEN, E., B. LARSEN and A.NEIMANN-S~RENSEN: Blood Groups of Domestic Animals. X V I Congreso Mundial de Veterinaria. * 5. BELJAKOW, A. D., 1958: Losungen zum Konservieren von Blut und Geweben. Vestnik chirurgii im. Grekova, Moskva 83, 11-14. * 6. BUSCHMANN, H., 1961: Uber Blutgruppen und Krank- hcitsanfalligkeit. Mitt. des Landesverbandes bayer. Schweinezuchter 17. * 6. BUSCHMANN, H., 1962: Uber Methoden der Blutgruppcnbestimmung beim Schwcin. Zuchthygiene 6, 23. ' 8 . FARR, A. D., 1957: The Preservation of Red Cells at low Temperatures. J. Medical Laboratory Technology. July.

Anschrift des Verfassers: Dr. H. Buschmann, Blutgruppcninstitut der Tierzuchtforschung, Munchcn 15, Haydnstr. 1 1 .